JP2516011B2 - モノクロ−ナル抗体 - Google Patents
モノクロ−ナル抗体Info
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- JP2516011B2 JP2516011B2 JP62085338A JP8533887A JP2516011B2 JP 2516011 B2 JP2516011 B2 JP 2516011B2 JP 62085338 A JP62085338 A JP 62085338A JP 8533887 A JP8533887 A JP 8533887A JP 2516011 B2 JP2516011 B2 JP 2516011B2
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- hpl
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- antibody
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、定量用ないし膵疾患診断用の試薬として有
用な抗ヒト膵リパーゼ モノクローナル抗体（以下、抗
hPLモノクローナル抗体という）に関する。
用な抗ヒト膵リパーゼ モノクローナル抗体（以下、抗
hPLモノクローナル抗体という）に関する。
従来技術および本発明が解決せんとする問題点 血清の如きヒトの体液中のヒト膵リパーゼ（以下、hP
Lという）の増減を知ることは種々の疾患、特に膵疾患
の診断に有用である。hPLの測定は高頻度に実施される
臨床検査項目の一つとなりつつある。
Lという）の増減を知ることは種々の疾患、特に膵疾患
の診断に有用である。hPLの測定は高頻度に実施される
臨床検査項目の一つとなりつつある。
従来、hPLの定量は、その酵素活性を測定することに
より行われていた。例えば、特公昭57−21998号公報に
はBALBと略称される合成基質を用いてhPL活性を測定す
ることが開示されている。このような方法はhPLそのも
のを定量するものではなく、単にその酵素活性を測定す
るものである。
より行われていた。例えば、特公昭57−21998号公報に
はBALBと略称される合成基質を用いてhPL活性を測定す
ることが開示されている。このような方法はhPLそのも
のを定量するものではなく、単にその酵素活性を測定す
るものである。
血清の如きヒト体液においてhPLは、ときとして、そ
の酵素活性が阻害された状態で存在することがある。こ
のような阻害状態のhPLの存在理由やその酵素活性復元
の可能性などは明らかでない。BALBの如きhPLの酵素活
性を測定する方法では、当然、このような阻害状態にあ
るhPLは定量できない。従って、阻害状態にあるhPLを含
む血清についての定量結果は、必ずしも疾患の程度を反
映するものではない。従来、このような血清は異常検体
として扱われている。
の酵素活性が阻害された状態で存在することがある。こ
のような阻害状態のhPLの存在理由やその酵素活性復元
の可能性などは明らかでない。BALBの如きhPLの酵素活
性を測定する方法では、当然、このような阻害状態にあ
るhPLは定量できない。従って、阻害状態にあるhPLを含
む血清についての定量結果は、必ずしも疾患の程度を反
映するものではない。従来、このような血清は異常検体
として扱われている。
このような事情から酵素活性を指標としないでhPLそ
のものを定量することが望まれている。
のものを定量することが望まれている。
問題を解決するための手段 本発明者らは酵素活性以外の指標としての免疫学特異
性に注目し、本発明を完成した。
性に注目し、本発明を完成した。
本発明は下記の性質を有する抗hPLモノクローナル抗
体に関する： （ａ）hPLを認識する、 （ｂ）IgクラスがIgGである、 （ｃ）酸素標識hPLと非標識hPLの双方との競合性に優れ
ている。
体に関する： （ａ）hPLを認識する、 （ｂ）IgクラスがIgGである、 （ｃ）酸素標識hPLと非標識hPLの双方との競合性に優れ
ている。
本発明のモノクローナル抗体は、細胞融合技法により
製造できる。更に詳細には、本発明のモノクローナル抗
体は次の（１）〜（４）の工程、すなわち、 （１）抗体生産細胞調製工程、 （２）融合・スクリーニング・クローニング工程、 （３）ハイブリドーマ培養工程、および （４）必要に応じて行われる精製工程、 を実施することにより得られる。以下、各工程について
説明する。
製造できる。更に詳細には、本発明のモノクローナル抗
体は次の（１）〜（４）の工程、すなわち、 （１）抗体生産細胞調製工程、 （２）融合・スクリーニング・クローニング工程、 （３）ハイブリドーマ培養工程、および （４）必要に応じて行われる精製工程、 を実施することにより得られる。以下、各工程について
説明する。
（１）抗体生産細胞調製工程 抗体生産細胞は抗原たるhPLで十分免疫した動物の脾
臓より採取できる。
臓より採取できる。
抗原たるhPLは高純度のものを大量に用いるのが最も
好ましい。しかし、hPLの純度はそれ程高いものではな
くとも目的は達成できる。hPLはヒトの膵液から得られ
る。ヒト膵液からのhPLの精製は、例えば、ヒト膵液を
タンパク分解酵素阻害剤たるフェニルメチルスルホニル
フルオリド（通常PMSFと略称される）の存在下、BALB法
によるリパーゼ活性を指標とするSephadexG−25による
ゲル濾過に付し、DEAEセルロースおよびCM Sephadexに
吸着・溶出後、Sephadex G−200のカラムに通し、最終
的には凍結乾燥することにより行え、100mlのヒト膵液
からゲル濾過において単一バンドを示すhPLが約10mg得
られる。
好ましい。しかし、hPLの純度はそれ程高いものではな
くとも目的は達成できる。hPLはヒトの膵液から得られ
る。ヒト膵液からのhPLの精製は、例えば、ヒト膵液を
タンパク分解酵素阻害剤たるフェニルメチルスルホニル
フルオリド（通常PMSFと略称される）の存在下、BALB法
によるリパーゼ活性を指標とするSephadexG−25による
ゲル濾過に付し、DEAEセルロースおよびCM Sephadexに
吸着・溶出後、Sephadex G−200のカラムに通し、最終
的には凍結乾燥することにより行え、100mlのヒト膵液
からゲル濾過において単一バンドを示すhPLが約10mg得
られる。
免疫は、抗原たるhPLをマウスやラットの如き哺乳動
物に投与することにより行える。免疫条件、例えば抗原
たるhPLの使用量、投与部位、アジュバントの種類やそ
の使用量などの条件は、従来の抗血清を得る場合の条件
がそのまま採用される。通常、免疫は、フロインド完全
アジュバントとhPLを含む乳濁液をマウスの如き哺乳動
物に非経口投与し、２週間後に抗原量を半分するほかは
同様にして追加免疫をすることにより行われる。最終免
疫から２〜５日後に十分免疫した哺乳動物の脾臓から抗
体生産細胞を採取する。
物に投与することにより行える。免疫条件、例えば抗原
たるhPLの使用量、投与部位、アジュバントの種類やそ
の使用量などの条件は、従来の抗血清を得る場合の条件
がそのまま採用される。通常、免疫は、フロインド完全
アジュバントとhPLを含む乳濁液をマウスの如き哺乳動
物に非経口投与し、２週間後に抗原量を半分するほかは
同様にして追加免疫をすることにより行われる。最終免
疫から２〜５日後に十分免疫した哺乳動物の脾臓から抗
体生産細胞を採取する。
（２）融合・スクリーニング・クローニング工程 融合は、融合促進剤の存在下、上記抗体生産細胞なら
びに公知の骨髄腫細胞（以下ミエローマ細胞という）を
公知の融合用無血清培地に懸濁し、混合することにより
行える。
びに公知の骨髄腫細胞（以下ミエローマ細胞という）を
公知の融合用無血清培地に懸濁し、混合することにより
行える。
一般的にミエローマ細胞は、工程（１）で用いた被免
疫動物と同種の動物由来のものであってハイブリドーマ
選択培地で成育できず、かつ、それ自身が抗体を分泌し
ないものが好ましい。このようなミエローマ細胞として
は、例えば市販されているマウスミエローマ細胞P3−X6
3−Ag8−U1あるいはこれと同等物が挙げられる。
疫動物と同種の動物由来のものであってハイブリドーマ
選択培地で成育できず、かつ、それ自身が抗体を分泌し
ないものが好ましい。このようなミエローマ細胞として
は、例えば市販されているマウスミエローマ細胞P3−X6
3−Ag8−U1あるいはこれと同等物が挙げられる。
両細胞の混合比は、通常、ミエローマ細胞１に対し抗
体生産細胞１〜20である。細胞融合促進剤としては、例
えばポリエチレングリコールが用いられ、分子量1,000
〜7,500のものが好ましい。
体生産細胞１〜20である。細胞融合促進剤としては、例
えばポリエチレングリコールが用いられ、分子量1,000
〜7,500のものが好ましい。
融合細胞、すなわちハイブリドーマの培養は、融合促
進剤を洗浄除去しミエローマ細胞用培地に懸濁したハイ
ブリドーマの0.1〜0.2mlずつを96穴培養皿（以下穴とい
うこともある）にまき、約37℃において５％炭酸ガス−
空気中で温置することにより行える。培養中、HAT培地
の如き公知のハイブリドーマ選択培地を添加し、その割
合を徐々に高める。このような培地交換によりハイブリ
ドーマ以外の細胞は死滅する。
進剤を洗浄除去しミエローマ細胞用培地に懸濁したハイ
ブリドーマの0.1〜0.2mlずつを96穴培養皿（以下穴とい
うこともある）にまき、約37℃において５％炭酸ガス−
空気中で温置することにより行える。培養中、HAT培地
の如き公知のハイブリドーマ選択培地を添加し、その割
合を徐々に高める。このような培地交換によりハイブリ
ドーマ以外の細胞は死滅する。
目的とするハイブリドーマのスクリーニングは、培養
液中の抗体価を調べること及び競合性の有無を調べるこ
とにより行える。すなわち、培養液の一部に後述の酵素
標識hPLおよび不溶化第二抗体を加えて温置し、遠心
し、得られるペレット中の標識酵素活性を測定すること
によりその抗体価を知ることができる。
液中の抗体価を調べること及び競合性の有無を調べるこ
とにより行える。すなわち、培養液の一部に後述の酵素
標識hPLおよび不溶化第二抗体を加えて温置し、遠心
し、得られるペレット中の標識酵素活性を測定すること
によりその抗体価を知ることができる。
また、抗体価の高いハイブリドーマについて、酵素標
識hPLと非標識hPLの双方と競合的に反応するかどうかを
検討することにより、それが競合性に優れたものかどう
かを知ることができる。
識hPLと非標識hPLの双方と競合的に反応するかどうかを
検討することにより、それが競合性に優れたものかどう
かを知ることができる。
スクリーニングしたハイブリドーマについて限界希釈
法を適用することにより目的とする抗hPLモノクローナ
ル抗体を生産するクローン化ハイブリドーマが創製でき
る。このハイブリドーマは継代培養または凍結により半
永久的に保存できる。
法を適用することにより目的とする抗hPLモノクローナ
ル抗体を生産するクローン化ハイブリドーマが創製でき
る。このハイブリドーマは継代培養または凍結により半
永久的に保存できる。
（３）ハイブリドーマの培養工程 前工程で得たクローン化ハイブリドーマをin vitro
またはin vivoで培養すれば目的のモノクローナル抗体
が生産できる。in vitroでの培養は、96穴培養皿中での数個のハイブ
リドーマの培養から始め、徐々にスケールアップするこ
とにより行える。またin vivoでの培養は、融合細胞の
増殖を容易にさせるためのプリスタン（pristane）処理
をしたマウスにハイブリドーマを腹腔内に接種すること
により実施でき、10〜20日後にはモノクローナル抗体を
含む腹水が蓄積される。
またはin vivoで培養すれば目的のモノクローナル抗体
が生産できる。in vitroでの培養は、96穴培養皿中での数個のハイブ
リドーマの培養から始め、徐々にスケールアップするこ
とにより行える。またin vivoでの培養は、融合細胞の
増殖を容易にさせるためのプリスタン（pristane）処理
をしたマウスにハイブリドーマを腹腔内に接種すること
により実施でき、10〜20日後にはモノクローナル抗体を
含む腹水が蓄積される。
一般に、in vitroでの培養は高純度のモノクローナ
ル抗体を得たいときに行われ、in vivoでの培養は大量
のモノクローナル抗体を得たいときに行われる。通常in
vivoでの培養により、マウス１匹あたり10〜100mgの
抗hPLモノクローナル抗体が得られる。免疫分析にはin
vivoでの培養で蓄積された腹水をそのまま利用するこ
ともできるが、必要に応じ更に精製してもよい。
ル抗体を得たいときに行われ、in vivoでの培養は大量
のモノクローナル抗体を得たいときに行われる。通常in
vivoでの培養により、マウス１匹あたり10〜100mgの
抗hPLモノクローナル抗体が得られる。免疫分析にはin
vivoでの培養で蓄積された腹水をそのまま利用するこ
ともできるが、必要に応じ更に精製してもよい。
（４）精製工程 必要に応じて行われるin vitroでの培養物またはin
vivoの培養で蓄積された腹水からのモノクローナル抗
体の分離精製は、通常の物理化学的手段、例えば塩析，
遠心分離，透析，不溶性担体と結合しているプロテイン
Ａを用いるアフィニティークロマトグラフィーの如き各
種カラムクロマトグラフィー等の手段を合理的に組み合
わせることにより行える。
vivoの培養で蓄積された腹水からのモノクローナル抗
体の分離精製は、通常の物理化学的手段、例えば塩析，
遠心分離，透析，不溶性担体と結合しているプロテイン
Ａを用いるアフィニティークロマトグラフィーの如き各
種カラムクロマトグラフィー等の手段を合理的に組み合
わせることにより行える。
かくして得られる本発明のモノクローナル抗体は酵素
標識hPLと非標識hPLの双方との競合性に優れたものであ
り、hPLの酵素免疫定量法（EIA）に用いる試薬として有
用である。
標識hPLと非標識hPLの双方との競合性に優れたものであ
り、hPLの酵素免疫定量法（EIA）に用いる試薬として有
用である。
なお本発明の抗hPLモノクローナル抗体は、hPLを精製
するためのアフィニティー クロマトグラフィー用の試
薬としても、または生体組織標本中のhPLの局在を検討
するための蛍光抗体法用の試薬としても、生化学の分野
において有用である。
するためのアフィニティー クロマトグラフィー用の試
薬としても、または生体組織標本中のhPLの局在を検討
するための蛍光抗体法用の試薬としても、生化学の分野
において有用である。
具体例 次に実施例ならびに参考例を挙げて本発明を更に詳細
に説明する。
に説明する。
なお、以下では次の培地を用いた。
細胞融合用無血清培地（フロー社） MEMイーグル培地に以下を添加した培地 100U/mlペニシリンＧ 100μg/mlストレプトマイシン HAT培地 RPMI−1640培地に以下を添加した培地 15％ウシ胎児血清（非必須アミノ酸含有） 2mMグルタミン、 1mMピルビン酸ナトリウム、 100U/mlペニシリンＧ、 100μg/mlストレプトマイシン 0.1mMヒポキサンチン、 0.4μＭアミノプテリン、および 16μＭチミジン また、以下で用いる緩衝液Ａの組成は次のとおりであ
る。
る。
緩衝液Ａ（pH7.0） 0.1％ウシ血清アルブミン 0.9％塩化ナトリウム 0.04Mリン酸ナトリウム 0.1％アジ化ナトリウム 実施例１ 抗hPLモノクローナル抗体の製造 （１）ハイブリドーマの創製 抗体生産細胞の調製 タンパク量として100μｇのhPLを含む生理食塩水0.12
5mlに等量のフロインド完全アジュバント（ディフコ
社）を加えて乳化したもの0.05mlをBALB/cマウス（静岡
実験動物協同組合）の皮内および皮下の５ケ所に投与
し、２週間後に抗原量を半分にするほかは同様にして免
疫する。３日後に脾臓を取り出して抗体生産細胞を採取
する。
5mlに等量のフロインド完全アジュバント（ディフコ
社）を加えて乳化したもの0.05mlをBALB/cマウス（静岡
実験動物協同組合）の皮内および皮下の５ケ所に投与
し、２週間後に抗原量を半分にするほかは同様にして免
疫する。３日後に脾臓を取り出して抗体生産細胞を採取
する。
融合・スクリーニング・クローニング 対数増殖期にあるマウスミエローマ細胞P3−X63−Ag8
−U1（ATCCカタログ番号CRL1597）の５×107個と抗体生
産細胞の１×108個を混合し、0.9％塩化ナトリウム/0.1
Mリン酸緩衝液（pH7.4）で遠心（400×ｇ、10分）洗浄
後、37℃に保温した0.5mlのポリエチレングリコール150
0（和光純薬）−MEM培地（1:1）を徐々に加え、ゆっく
り撹拌する。90秒後、37℃に保温した10mlの培地を同
様にして加える。10分後、更に10mlの培地を加えた
後、遠心（400×ｇ、10分）し、上清を除去する。得ら
れるペレットに50mlの培地を徐々に加える。この0.1m
lずつを、予めマウス脾細胞をフィーダー層として添加
した96穴培養皿にまき、37℃において５％炭酸ガス−空
気中で培養する。5,10,15日後に新らしい培地0.05ml
ずつを穴に加える。培養開始後７日目にハイブリドーマ
の成育が始り、15日目には80％の穴に生育が認められ
る。
−U1（ATCCカタログ番号CRL1597）の５×107個と抗体生
産細胞の１×108個を混合し、0.9％塩化ナトリウム/0.1
Mリン酸緩衝液（pH7.4）で遠心（400×ｇ、10分）洗浄
後、37℃に保温した0.5mlのポリエチレングリコール150
0（和光純薬）−MEM培地（1:1）を徐々に加え、ゆっく
り撹拌する。90秒後、37℃に保温した10mlの培地を同
様にして加える。10分後、更に10mlの培地を加えた
後、遠心（400×ｇ、10分）し、上清を除去する。得ら
れるペレットに50mlの培地を徐々に加える。この0.1m
lずつを、予めマウス脾細胞をフィーダー層として添加
した96穴培養皿にまき、37℃において５％炭酸ガス−空
気中で培養する。5,10,15日後に新らしい培地0.05ml
ずつを穴に加える。培養開始後７日目にハイブリドーマ
の成育が始り、15日目には80％の穴に生育が認められ
る。
抗体価の検定 培養15日後の培養液の抗体価を次のようにして調べ
た。
た。
後記参考例１−（Ｂ）で調製したβ−ガラクトシダー
ゼ（大腸菌由来；ベーリンガーマンハイム社（標識hPL
溶液0.2mlおよび培養液50μｌを混合し、37℃で30分間
温置後、後記参考例１−（Ａ）で調製した不溶化第二抗
体の懸濁液0.2mlを加え、混和後更に37℃で15分間温置
する。その後、4mlの生理食塩水を加え、遠心して上清
をすてる。ペレットに0.5mlの緩衝液Ａおよび0.1mlの基
質溶液（10mlの緩衝液Ａに1mgの４−メチルウンベリフ
ェリル−β−ガラクトピラノシド及び1mMの塩化マグネ
シウムを溶解したもの）を混和後、37℃で20分間温置す
る。1.5mlの0.1Mリン酸カリウム溶液（pH11）を加えて
反応を停止し、励起波長365nm、蛍光波長450nmで蛍光強
度を測定する。
ゼ（大腸菌由来；ベーリンガーマンハイム社（標識hPL
溶液0.2mlおよび培養液50μｌを混合し、37℃で30分間
温置後、後記参考例１−（Ａ）で調製した不溶化第二抗
体の懸濁液0.2mlを加え、混和後更に37℃で15分間温置
する。その後、4mlの生理食塩水を加え、遠心して上清
をすてる。ペレットに0.5mlの緩衝液Ａおよび0.1mlの基
質溶液（10mlの緩衝液Ａに1mgの４−メチルウンベリフ
ェリル−β−ガラクトピラノシド及び1mMの塩化マグネ
シウムを溶解したもの）を混和後、37℃で20分間温置す
る。1.5mlの0.1Mリン酸カリウム溶液（pH11）を加えて
反応を停止し、励起波長365nm、蛍光波長450nmで蛍光強
度を測定する。
抗体価の高いものについて、前述した抗体価検定の実
験系に標準hPL溶液を加えたものを同時に準備し、該標
準hPL溶液の添加により標識酵素活性が阻害されるかど
うかを検討することにより、酵素標識hPLと標準hPLの双
方との競合性の有無を判断した。すなわち、全部で216
個の穴においてハイブリドーマの良好な発育が見られ、
これらの中からhPLに対する抗体価の高い14種のハイブ
リドーマを選択した。これらについて再度限界希釈培養
を行い、良好な発育が認められた穴から10種のハイブリ
ドーマを選択し、競合性の有無を検討して次の結果を得
た。
験系に標準hPL溶液を加えたものを同時に準備し、該標
準hPL溶液の添加により標識酵素活性が阻害されるかど
うかを検討することにより、酵素標識hPLと標準hPLの双
方との競合性の有無を判断した。すなわち、全部で216
個の穴においてハイブリドーマの良好な発育が見られ、
これらの中からhPLに対する抗体価の高い14種のハイブ
リドーマを選択した。これらについて再度限界希釈培養
を行い、良好な発育が認められた穴から10種のハイブリ
ドーマを選択し、競合性の有無を検討して次の結果を得
た。
以上の結果より、ハイブリドーマ番号１−5C10の１種の
みが競合性に優れた抗hPLモノクローナル抗体を産生す
るものであり、残りの９種は酵素標識hPLとの結合が非
標識hPLとのそれよりも強く、実質的に競合性を欠くも
のであった。従って、競合性に優れたハイブリドーマと
してハイブリドーマ番号１−5C10を選択した。このハイ
ブリドーマが産生するモノクローナル抗体は免疫拡散法
による検定によればIgG1に属するものであった。
みが競合性に優れた抗hPLモノクローナル抗体を産生す
るものであり、残りの９種は酵素標識hPLとの結合が非
標識hPLとのそれよりも強く、実質的に競合性を欠くも
のであった。従って、競合性に優れたハイブリドーマと
してハイブリドーマ番号１−5C10を選択した。このハイ
ブリドーマが産生するモノクローナル抗体は免疫拡散法
による検定によればIgG1に属するものであった。
（２）モノクローナル抗体の製造 前項で得たハイブリドーマの内、競合性モノクローナ
ル抗体産生ハイブリドーマ（１−5C10）１×107個を、
予めプリスタン（アルドリッチ社）0.5mlを腹腔内投与
したBALB/cマウスの腹腔内に接種する。15日目に目的と
するモノクローナル抗体を含む腹水4ml/マウスを得る。
ル抗体産生ハイブリドーマ（１−5C10）１×107個を、
予めプリスタン（アルドリッチ社）0.5mlを腹腔内投与
したBALB/cマウスの腹腔内に接種する。15日目に目的と
するモノクローナル抗体を含む腹水4ml/マウスを得る。
参考例１ 免疫定量法（EIA）への応用 （Ａ）不溶化第二抗体の調製 米国特許第4,166,767号明細書の実施例１の方法に準
じて調製する。すなわち、ラクトバチルスプランタラム
ATCC 8014の細胞壁片の水懸濁液（20mg/2ml）に抗マウ
スIgGラビット抗体（生化学工業）、すなわち、第二抗
体をタンパク量として5.8mg加え、攪拌しながら1M酢酸
ナトリウム−HC1緩衝液（pH4）30μl,5％水溶性カルボ
ジイミド水溶液［（株）ペプチド研究所］60μｌおよび
25％グルタールアルデヒド水溶液10μｌをこの順序で添
加し、室温で１時間攪拌する。この混液を遠心（1500×
g,10分）し、上清をすて、沈殿に5mlの緩衝液Ａを加
え、超音波処理（20KHz,5秒）を２回行い、再び沈殿を
遠心分離する。沈殿に10mlの緩衝液Ａおよび20mlの上記
細菌細胞壁片の懸濁液（2.5mg/ml）を加えて再懸濁した
ものを不溶化第二抗体とする。
じて調製する。すなわち、ラクトバチルスプランタラム
ATCC 8014の細胞壁片の水懸濁液（20mg/2ml）に抗マウ
スIgGラビット抗体（生化学工業）、すなわち、第二抗
体をタンパク量として5.8mg加え、攪拌しながら1M酢酸
ナトリウム−HC1緩衝液（pH4）30μl,5％水溶性カルボ
ジイミド水溶液［（株）ペプチド研究所］60μｌおよび
25％グルタールアルデヒド水溶液10μｌをこの順序で添
加し、室温で１時間攪拌する。この混液を遠心（1500×
g,10分）し、上清をすて、沈殿に5mlの緩衝液Ａを加
え、超音波処理（20KHz,5秒）を２回行い、再び沈殿を
遠心分離する。沈殿に10mlの緩衝液Ａおよび20mlの上記
細菌細胞壁片の懸濁液（2.5mg/ml）を加えて再懸濁した
ものを不溶化第二抗体とする。
（Ｂ）酵素標識hPLの調製 タンパク量として175μｇのhPLを含む、300μｌの0.0
5Mリン酸ナトリウム溶液（pH7.4）にＮ−（ｍ−マレイ
ミドベンゾイルオキシ）サクシンイミド（MBSと略称さ
れる）のジオキサン溶液（100μg/50μｌ）を加え、室
温で30分間攪拌後、0.5M Tris−HC1緩衝液（pH7.5）の2
00μｌを加え、更に10分間攪拌する。この反応液に0.05
M Tris−HC1緩衝液（Ph7.5）1mlを加え、YM−５限外濾
過膜（アミコン社）で濾過する。残渣を更に同じ緩衝液
2mlで２回洗浄し、これを同じ緩衝液中に懸濁して液量
を0.4mlとなす。これに大腸菌由来のβ−Ｄ−ガラクト
シダーゼ／硫安飽和液（2mg/0.4ml）を加え室温で２時
間攪拌する。この溶液を、緩衝液Ａで緩衝化したセファ
ロース6B（ファルマシア社）カラム（1.2×72cm）にか
けて2.5mlずつ分画する。（Ａ）と同様にして調製した
不溶化抗hPLモノクローナル抗体と結合し、かつ、β−
Ｄ−ガラクトシダーゼ活性を有する分画（16.7ml）を集
める。この分画を緩衝液Ａで50倍希釈したものを酵素標
識hPL溶液とした。
5Mリン酸ナトリウム溶液（pH7.4）にＮ−（ｍ−マレイ
ミドベンゾイルオキシ）サクシンイミド（MBSと略称さ
れる）のジオキサン溶液（100μg/50μｌ）を加え、室
温で30分間攪拌後、0.5M Tris−HC1緩衝液（pH7.5）の2
00μｌを加え、更に10分間攪拌する。この反応液に0.05
M Tris−HC1緩衝液（Ph7.5）1mlを加え、YM−５限外濾
過膜（アミコン社）で濾過する。残渣を更に同じ緩衝液
2mlで２回洗浄し、これを同じ緩衝液中に懸濁して液量
を0.4mlとなす。これに大腸菌由来のβ−Ｄ−ガラクト
シダーゼ／硫安飽和液（2mg/0.4ml）を加え室温で２時
間攪拌する。この溶液を、緩衝液Ａで緩衝化したセファ
ロース6B（ファルマシア社）カラム（1.2×72cm）にか
けて2.5mlずつ分画する。（Ａ）と同様にして調製した
不溶化抗hPLモノクローナル抗体と結合し、かつ、β−
Ｄ−ガラクトシダーゼ活性を有する分画（16.7ml）を集
める。この分画を緩衝液Ａで50倍希釈したものを酵素標
識hPL溶液とした。
（Ｃ）hPLのEIA 試薬 標準hPL溶液； hPLを緩衝液Ａに溶解し、倍数希釈したものであっ
て、hPLのタンパク濃度が０ないし1000ng/mlのもの。
て、hPLのタンパク濃度が０ないし1000ng/mlのもの。
抗hPLモノクローナル抗体の溶液； 実施例１で得た腹水を緩衝液Ａで10万倍希釈したも
の。
の。
酵素標識hPLの溶液；（Ｂ）で調製したもの。
不溶化第二抗体の懸濁液；（Ａ）で調製したもの。
基質溶液； 10mlの緩衝液Ａに1mgの４−メチルウンベリフェリル
−β−ガラクトピラノシドおよび1mMの塩化マグネシウ
ムを溶解したもの。
−β−ガラクトピラノシドおよび1mMの塩化マグネシウ
ムを溶解したもの。
反応停止液;0.1Mリン酸カリウム溶液（pH11） 操作 標準hPL溶液50μｌに抗hPLモノクローナル抗体溶液の
200μｌを混和し、室温で１夜放置後、酵素標識hPL溶液
200μｌを加え、更に37℃で１時間温置する。これに不
溶化第二抗体懸濁液200μｌを加え37℃で15分間温置
し、直ちに生理食塩水3mlを加えて沈殿を遠心分離（150
0×g,10分）する。沈殿に500μｌの緩衝液Ａと基質溶液
100μｌを加え、37℃で20分間温置する。反応停止液1.5
mlを加え均一に混和後、励起波長365nm、蛍光波長450nm
で蛍光強度を測定する。
200μｌを混和し、室温で１夜放置後、酵素標識hPL溶液
200μｌを加え、更に37℃で１時間温置する。これに不
溶化第二抗体懸濁液200μｌを加え37℃で15分間温置
し、直ちに生理食塩水3mlを加えて沈殿を遠心分離（150
0×g,10分）する。沈殿に500μｌの緩衝液Ａと基質溶液
100μｌを加え、37℃で20分間温置する。反応停止液1.5
mlを加え均一に混和後、励起波長365nm、蛍光波長450nm
で蛍光強度を測定する。
標準溶液の濃度と蛍光強度をプロットして第１図の検
量線を得る。
量線を得る。
第１図はhPLの検量線を示す。
Claims (1)
- 【請求項１】下記の性質を有する抗ヒト膵リパーゼ モ
ノクローナル抗体： （ａ）ヒト膵リパーゼを認識する、 （ｂ）IgクラスがIgGである、 （ｃ）酵素標識ヒト膵リパーゼと非標識ヒト膵リパーゼ
の双方との競合性に優れている。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62085338A JP2516011B2 (ja) | 1987-04-07 | 1987-04-07 | モノクロ−ナル抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62085338A JP2516011B2 (ja) | 1987-04-07 | 1987-04-07 | モノクロ−ナル抗体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63250399A JPS63250399A (ja) | 1988-10-18 |
| JP2516011B2 true JP2516011B2 (ja) | 1996-07-10 |
Family
ID=13855857
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62085338A Expired - Fee Related JP2516011B2 (ja) | 1987-04-07 | 1987-04-07 | モノクロ−ナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2516011B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0745520B2 (ja) * | 1988-08-31 | 1995-05-17 | 国際試薬株式会社 | モノクローナル抗体およびその使用法 |
-
1987
- 1987-04-07 JP JP62085338A patent/JP2516011B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63250399A (ja) | 1988-10-18 |
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