JPH01262797A - 抗ヒト膵リパーゼモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は主として、ヒト膵リパーゼ（以下ｈ　Ｐ■、と
いう）の定量用試薬として作用な抗ｈ　Ｐ　Ｌモノクロ
ーナル抗体に関する。

従来技術と解決課題 血清の如きヒト体液中のｈＰＬの増減を知ることは種々
の疾患、特に膵疾患の診断に任用である。

ｈ　Ｐ　Ｌの測定は高頻度に実施される臨床検査項目の
一つとなりつつある。

従来、ｈＰＬの定量は、その酵素活性を測定することに
より行われていた。例えば、特公昭５７−２１９９８号
公報には２．３−ジメルカプト−１−プロパツール　ト
リブチレート（これはＢＡＬＢと略称されるｈｌ’Ｌの
合成基質である）を用いてｈｐＬ活性を測定することが
開示されている。この方法はｈ　Ｐ　Ｌそのものを定量
するものではなく、単にその酵素活性を測定するもので
ある。また、特開昭０２−２５０３（ｉ３号公報には抗
ｈ　Ｐ　Ｌモノクローナル抗体を用いる酵＝７免疫定量
法（ＥＩＡ法）の可能性について開示されている。

定量原理を異にするｈＰＬの定量方法を確立することは
、ｈＰＬの生化学的研究や膵医忠の診断の観点から要請
されている。特にＥＩＡ法の場合よりも単純な試薬を用
いる簡便なｈＰＬ定舟法の確立が望まれている。

Ｂ題を解決するための手段 本発明は下記の性質を存する抗ｈＰＬモノクローナル抗
体に関する： ■　作用；　ｈＰＬを認識する、 ■　抗原抗体反応後の抗原活性； 抗原たるｈＰＬａの反応後においてもｈＰＬの活性が実
質的に阻害されない、 Ｏ＠類；　ＩｇＧＩ Ｏ競合性； 標識されたｈＰＬと標…されていないｈｐＬに対する反
応が非競合的である。

ｈＰＬの定量用試薬として任用な本発明のモノクローナ
ル抗体は、細胞融合技法により製造できる。更に詳細に
は、本発明のモノクローナル抗体は次の（１ｊ〜（４）
の工程、すなわち、（１）　抗体生産細胞調製工程、 （２）　　混合・スクリーニング・クローニング工程、
（３）　　ハイプリドーマ培養工程、および（４）　　
必要に応じて行われる精製工程、を実施することにより
得られる。以下、各工程について説明する。

（１）　　抗体生産細胞調製工程 抗体生産細胞は抗原たるｈＰＬで十分免疫した動物の肺
臓より採取できる。

抗原たるｈＰＬは高純度のものを大量に用いるのが最も
好ましい、しかし、ｈＰＬの純度はそれ程高いものでな
くとも目的は達成できる。ｈ　Ｐ　Ｌはヒトの膵液から
得られる。ヒト膵液からのｈｐＬの精製は、例えばヒト
膵液をタフバク分解酵素阻害剤たるフェニルメチルスル
ホ二ルフルオＩＪ　Ｖの存在下、ＤＡＬＩＩ法によるリ
パーゼ活性を（ｈ標とする５ｅｐｈａｄｅｘＧ−２５に
よるゲル濾過に付し、次いでＤＥＡＥセルロースおよび
ＣＭ　５ｅｐｈａｄｅにに仮性・溶出後、５ｅｐｈａｄ
ｅｘ　Ｇ−２００のカラムに通し、最終的には凍結乾燥
することにより行え、１００ｍ１　　のヒト膵液からゲ
ル濾過において単一バンドを示スｈＰＬが約１０１得ら
れる。

免疫は、抗原たるｈＰＬをマウスやラットの如き吐乳動
物に投与することにより行える。免疫条件、例えば抗原
たるｈＰＬの使用量、投与部位、アジュバントの種類や
その使用量などの条件は、従来の抗血１ｎを得る場合の
条件がそのまま採用される。通常、免疫はフロイント完
全アジュバントとｈＰＬを含む乳濁液をマウスの如き哺
乳動物に非経口投与し、２週間後に抗原量を半分にする
ほかは同様にして追加免疫をすることにより行われる。

最終免疫から２〜５日後に十分免疫した吐乳動物の肺臓
から抗体生産細胞を採取する。

（２）　融合・スクリーニング・クローニア　’Ｉ工ｔ
″ｉ融合は、融合促進剤の存在下、上記抗体生産細胞な
らびに公知の弁償Ｕ細胞（以下ミエローマ細胞という）
を公知の融合用無血１青培地に懸濁し、混合することに
より行える。

一般にミエローマ細胞は、工程（１）で用いた被免疫動
物と同種の動物由来のものであってハイブリドーマ選択
培地で生育できず、かつ、それ自身が抗体を分泌しない
ものが好ましい。このようなミエローマ細胞としては、
例えば市販されているマウスミエローマ細胞Ｐ３−Ｘ６
３−八ｇ８−０１あるいはこれと同等物が挙げられる。

両細胞の混合比は、通常ミエローマ細胞１に対し抗体生
産細胞１〜２０である。細胞融合技法剤としては、例え
ばポリエチレングリコールが用いられ、分子ｆｆ１１，
０００〜７，５００のものが好ましい。

融合細胞、すなわちハイプリドーマの培養は、融合促進
剤を洗浄除去しミエローマ細胞用培地に懸濁したハイプ
リドーマの０．１〜０．２　Ｉｌずつを９６穴培養皿（
以下穴ということもある）にまき、約３７℃において５
％炭酸ガス−空気中で装置することにより行える。培養
中、ＨＡＴＪｌ！Ｆ池の如き公知のハイプリドーマ選択
培地を添加し、その割合を徐々に高める。このような培
地交換によりハイプリドーマ以外の細胞は死滅する。

目的とするハイプリドーマのスクリーニングは、培養液
中の抗体価を調べることにより行える。すなわち、培養
液の一部に酵素で標…されたｈ　Ｉ）　Ｌおよび不溶化
第２抗体を加えて装置し、遠心し、得られるベレット中
の酵素活性を測定することによりその抗体価を知ること
ができる。

スクリーニングしたハイプリドーマについて限界希釈法
を適用することにより目的とする抗ｈｐＬモノクローナ
ル抗体を生産するクローン化／１イブリドーマが創製で
きる。このハイプリドーマは継代培養または凍結により
半永久的に保存できる。

（３）　　ハイプリドーマの培養工程 前工程で得たクローン化ハイプリドーマを■１ｔｒｏま
たは　ｉｎ　ｖ＋ｖｏで培養すれば目的のモノクローナ
ル抗体が生産できる。

ｉｎ　ｖ＋ｔｒｏでの培養は、９６穴培養皿中での数個
のハイプリドーマの培養から始め、徐々にスケールアッ
プすることにより行える。またｉｎ　Ｖ’ｉＶＯでの培
養は、融合細胞の増殖を容易にさせるためのプリスタン
（ｐｒｉｓｔａｎｅ）処理をしたマウスに７１イブリド
ーマを腹腔内に接種することにより実施でき、１０〜２
０日後にはモノクローナル抗体を含む腹水が蓄積される
。

一般にｓ　　ｉｎ　ｖ＋ｔｒｏでの培養は高純度のモノ
クローナル抗体を得たいときに行われ、１０ＶｉＶＯで
の培養は大量のモノクローナル抗体を得たいときに行わ
れる。１通常＋ｎ　ｖｉｖｏでの培養により、マウス１
匹あたり１０〜１００■ｇの抗ｈＰＬモノクローナル抗
体が得られる。ｈＰＬの定量にはｉｎ　　ＶｉＶＯでの
培養でＭ積された腹水をそのまま利用することもできる
が、必要に応じ更に精製してもよい。

（４）　　精製工程 必要に応じて行われるｉｎ　Ｖｉｔｒｏでの培養物また
は）ｎ　Ｖｉｖｏの培養で蓄積された腹水からのモノク
ローナル抗体の分離精製は、通常の物理化学的手段、例
えば塩析、遠心分離、透析、不溶性担体と結合している
プロティ／Ａを用いるアフィニティークロマトグラフィ
ーの如き各種カラムクロマトグラフィー等の手段を合理
的に組み合せることにより行える。

また、本発明はモノクローナル抗体を利用する非競合的
反応によりｈＰＬを定量するための牛。

トに関するものであり、このキットは少くとも次の試薬
から構成されている： ■　不溶化された抗ｈＰＬモノクローナル抗体■　ｈｌ
’Ｌ活性測定用試薬。

試薬■は抗ｈＰＬモノクローナル抗体と不溶性担体との
結合物である。不溶性担体としては、この分野で通常用
いられるものであればいずれでもよいが、米国特許４，
１６０，７０７に開示の細菌細胞壁片が特に好ましい。

モノクローナル抗体と不溶性担体との結合は、例えばグ
ルタルアルデヒドの如き結合剤を用いることにより行え
る。

また試薬■としでは、ＢＡＬＢの如きｈＰＬのＩＸ質や
緩衝液、酵素反応停止剤、発色剤［例えば、Ｓ１１基発
色剤であるＤＴＮＢ：　５．５’−ジチオビス（２−二
トロ安息香酸）］、ｈＰＬの活性化剤たるコリパーゼな
どが挙げられる。

このキットを用いてｈＰＬを定量するには、やや過剰量
の試薬■と検体とを反応させて、検体中のｈＰＬの全部
を沈殿（抗原抗体複合物）とじて補足し、沈殿を洗浄後
、沈殿中のｈＰＬ活性を試薬■を用いて測定することに
より実施できる。

具体例 次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。

なお、以下では次の培地を用いた。

ＲＰＭＩ−１０４０培地に以下を添加した培地。

５０υｈｌペニシリンＧ ５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン ■　ＩＩ　Ａ　Ｔ培地 ＲＰＭＩ　−１８４０培地に以下を添加した培地。

１５％ウシ胎児血ｔＷ　（非必須アミノ酸含有）２１Ｍ
グルタミン １　ｍＭピルビン酸すＦリウム ５０１１／ｍｊ　ヘニ７　リンＧ ５０μｇ／冨！ストレプトマイシン ０１輌ヒボキサンチン ０．４ｕ　Ｍアミノブテリン １６℃Ｍチミジン また、以下で用いる緩衝液への組成は次のとおりである
。

緩衝液Ａ（ｐＨ７，０） ０．１％ウシ血清アルブミン ０．９％塩化ナトリウム ０．０４　Ｍリン酸ナトリウム ０．１％アジ化ナトリウム 実施例１　　　モノクローナル抗体の製造（１）　　　
ハイブリドーマの創製 抗体生産細胞の調製 タンパク量として１００μｇのｈＰＬを含む生理食塩水
０．１２５＋［に等量のフロイント完全アジュバント（
デイフコ社）を加えて乳化したもの０．０５■！をＢＡ
ＬＢ／　ｃマウス（静岡実験動物協同組合）の皮内およ
び皮下の５ケ所に投与し、２週間後に抗原量を半分にす
るほかは同様にして免疫する。３日後に肺臓を取り出し
て抗体生産細胞を採屯する。

融合−スクリーニンク愉クローニング 対数増殖期にあるマウスミエローマ１ｍ　ＦＪ　Ｉ’３
−ＸＧ３−八ｇ８−０１（へＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ
Ｉ５９７　＞の５ＸＩＯ’個と抗体生産細胞のｉｘ＋ｏ
”個を混合し、０．９％塩化ナトリウム１０．１　　Ｍ
リン酸暖衝液（ｐ　１１７．４　）で遠心（４００Ｘ　
ｇ　、　１０分）洗浄後、３７℃に保温した０、５　ｍ
ｌ　　のポリエチレングリコール＋５００　（和光紅葉
）　−ＲＩ’ＭＩ−１（ｉ４０培地（１：　１）を徐々
に加え、ゆっくり撹拌する。９０秒後、３７℃に保温し
たＩｏｎ　１の■培地を同様にして加える。１０分後、
更にＩｏｎ　ｇの■培地を加えた後、遠心　（４００Ｘ
　　ｇ１１０分）し、Ｊ：１７を除去する。得られるペ
レットに５０１１の■培地を徐々に加える。この０．１
箇βずつを、予めマウス胛細胞をフィーダー層として添
加した９６穴培養皿にまき、３７℃において６％炭酸ガ
ス−空気中で培養する。５．１０．１５日後に新らしい
■培地０．０５　ｍｌずつを穴に加える。培養開始後７
日目にハイブリドーマの生育が始り、　１５５日目は８
０％の穴に生育が認められる。

抗体価の検定 培養１５日後の培養液の抗体価を次のようにして調べた
。

特公昭５５−６１９３号公報に開示の結合剤ｍ−Ｍｎ５
を用いて調製したβ−ガラクトシダーゼ（大腸菌由来；
ベーりンガーマンハイム社）（以下、β−Ｇａｌという
）標ｍｈＰＬ溶液０．２　ｍ　ｌおよび培養液５０μｌ
を混合し、３７℃で３０分間温前置後不溶化抗マウスＩ
ｇＧウサギ抗体の懸濁液０．２　ｍ　ｌを加え、混和後
更に３７℃で１５分間潟置市る。その後、４■！の生理
食塩水を加え、遠心して上清をずてる。ペレットに０．
５■！の緩衝液Ａおよび０．１■！の基質溶液（０，８
％２−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド−１
璽ＭＭｇＣ１ｚ−４０％エチレングリコール）を混和後
、３７℃で６０分間温置市る。これに１．５　ｍ　ｌの
０．１Ｍリン酸カリウム溶液（ｐｉ−１１１）を加えて
反応を停止しこれを４１０μｍにおける吸光度を光路１
ｃｍのキュベフトで測定する。

特に抗体価が高いＦＸｈＰＬモノクローナル抗体産生ハ
イプリドーマを選び、９６穴培養皿に１個／穴になるよ
うにハイブリドーマを■培地で希釈し、培養する。この
ような限界＠釈培養をくりかえすコトによりクローニン
グを行い、クローン化ハイブリドーマを得る。

■　　モノクローナル抗体の製造 前項で得たバイブリドーマのｌＸｌ０’　　個を、予め
ブリスタン（アルドリッチ社）　０．５ｍ［を腹腔的投
与した　ＢへＬ［ｌ／ｃマウスの腹腔内にＩ　ＩＩする
。１５５日目目的とする本発明のモノクローナル抗体を
含む腹水４　ｍｌ　／マウスを得る。

（３）　　　モノクローナル抗体の性質かくして得られ
る本発明のモノクローナル抗体の性質は次のと勿りであ
る。

■　作用 本発明のモノクローナル抗体はｈＰＬを認識する。

■　抗原抗体反応後の抗原活性 本発明のモノクローナル抗体は抗原たる＋Ｉ　Ｐ　！。

との反応後に右いてもｈ　Ｐ　Ｌの活性が実質的に阻害
されない。このことは以下の実験から明らかである。

すなわち、後記実施例３に皇じて、ｈＰＬと不溶化抗ｈ
　Ｐ　Ｌモノクローナル抗体とを反応させ、形成する抗
原抗体複合物中のｈＩ’Ｌ活性を測定し、その測定価と
最初に用いたｈＰＬの活性との比較から、本発明のモノ
クローナル抗体に上るｈｌ’Ｌ　（坑口）の活性の阻害
の程度を調べ、次の結果を得た。

モノクローナル抗体の希釈率を一定（１０００倍（以下
余白） 抗原（ｈＰＬ）量を一定（５０ｍｇ／試験管）前装に示
すように本発明の抗ｈＰＬモノクローナル抗体は、抗原
抗体反応後において、ｈＰＬ活性を阻害しない。

■　モノクローナル抗体の種類 免疫拡散法による検定によれば、本発明のモノクローナ
ル抗体はＩｇＧ１に属する。

０　競合性 本発明のモノクローナル抗体と標識されたｈＰＬおよび
標識されていないｈＰＬとの反応は非競合的である。す
なわち、本発明モノクローナル抗体は酵素で標識された
ｈＰＬとより一月強く反応する。従って、本発明のモノ
クローナル抗体はＥＩＡ法における試薬として利用でき
ない。このことは、種々９度のｈＰＬ溶液について本発
明のモノクローナル抗体、酵素ｌｆｆ１ｍ抗原たるβ−
Ｇａｌ−ｈＰＬ結合物、不溶性化抗マウスＩｇＧウサギ
抗体および＃！Ａ識酵素β−〇ａｌのＪＡＭたる４−メ
チルウ／ペリフェリルー　β−ガラクトピラ７シドを用
いる２抗体ＥＩＡ法を実施し、第２図の結果を得たこと
からも明らかである。

実施１’／ｌ　　２　　不溶化モノクローナル抗体のｒ
Ａ！！！ラクトバチルス　プランタラム　＾ＴＣＣ８０
１４の細菌細胞壁片０．５ｇを水５０■！に均一に！濁
し、これに０．６　ｍｌのＩＭｌ’！）＋酸緩衝液（ｐ
Ｈ４）および実施例１で得た抗ｈｌ’Ｌモノクローナル
抗体を含む腹水１■！を加え、更に５０■ｇ／−１６度
の水溶性カルボジイミド溶液１．２　ｍｌとグルタルア
ルデヒド０．２ｍ　ｌを加え、室潟で１時間撹拌する。

緩衝液Ａで３回遠心洗浄する。沈殿を５０ｗＮの緩衝液
Ａに懸濁し超音波処理後、さらに５０■ｌの緩衝液へを
加えて不溶化抗ｈＰＬモノクローナル抗体溶液を得る。

実施例　３　　　　　　　ｈＰＬの定量試薬 標準ｈｌ’Ｌ溶液： ｈＰＬを緩衝液Ａに溶解し、倍数希釈したものであって
、ｈＰＬのタンパク濃度がＯないし＋０００　ｎｇ／■
！のもの。

不溶化抗ｈＰＬモノクローナル抗体Ｂ溶液：実施例２で
調製した溶液。

ＤＴＮＢｉＳ液： Ｄ　Ｔ　Ｎ　０２４ｍｇならびにマンニトール２１Ｇｍ
（からなる混合物を２．４ｍ　ｌのトリス緩衝液（トリ
ス３．０２８ｇとアジ化ナトリウム５０ｍｇを水に溶解
し２５ｍ　ｌとなしたもの）および水２．２　ｍｌに溶
解し、この２．２　園ｌに同トリス緩衝液２．２−ｊお
よび水１７．６■ｌを加えた溶液。

コリパーゼ溶液： ８００μ巳のコリパーゼ（ベーリンガーマンハイム社）
を０．０２％ラウリル［１５？ナトリウム（以下、ＳＤ
Ｓという）１．６■！に溶解した溶液。

ＢＡＬＩ３溶液： ｎ　Ａ　Ｌ　Ｂ　１４７．２　ｍｇおよびＳ　Ｄ　Ｓ　
１２Ｂ　ｍｇをエタノールに溶解し全量を２２−１とな
した溶液。

酵素反応停止液： ５０■ｇのＳＤＳおよびクエン酸１５．７５ｍｇを水に
溶解し、全量を５１１となした溶液。

操作 標準ｈＰＬ溶液または検体の１００μ！、不溶化抗ｈＰ
Ｌモノクローナル抗体溶液１．２菖！を混合し、３７℃
で３０分間温置市る。これに０．９％ＮａＣ１の４■！
を加えてよく撹拌した後、傾斜して上清を除去する。沈
殿にＤＴＮｎ溶液１　ｍ　ｌ　、コリパーゼ溶液５μ！
を加え、３７℃で５分間二数する。これに１３ＡＬＢ溶
液１００μｌを加え、同温度で理数する。１５分後、酵
素反応停止液１■！を加え、４１２ｎｗにおける吸光度
を測定する。

標準溶液のｈＰＬ濃度と殴光度をプフロトして第１図の
検ｆ１１ｔｌａを作成した。

実施例　４　　　　血清中のｈＰＬの定量実施例３に記
俄の方法（水洗）およびｌ３ＡＬ、方法によりヒト血７
ｉ′？中のｈＰＬを定量し、次の結果を得た。

【図面の簡単な説明】

第１図はｈＰＬの検ｆｆ１ｔａを示し、第２図は本発明
の抗モノクローナル抗体を用いる２抗体ＥＩＡ法を実施
したときの標識酵素（β−Ｇａｌ）の活性と抗原（ｈＰ
Ｌ）ｉＱ度との関係を示す。 特許出願人　　大日本製薬株式会社 代　　理　　人　　　　　小　　島　　　　−晃第　　
１　　図 ヒト膵リパーゼ濃度（ｎｇ／閣ｌ） 第　　２　　図 ０　　　　　　　　３１．３　　　６２．５　　　１２
５　　　２５０　　　５００　　　　１０００ヒト膵リ
パーゼ濃度（ｎｇ／ｍｆ）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記の性質を有する抗ヒト膵リパーゼモノクロー
   ナル抗体： ［ａ］作用；ヒト膵リパーゼを認識する、 ［ｂ］抗原抗体反応後の抗原活性； 抗原たるヒト膵リパーゼとの反応後においてもヒト膵リ
   パーゼの活性が実質的に阻害されない、 ［ｃ］種類；ＩｇＧ１ ［ｄ］競合性； 標識されたヒト膵リパーゼと標識されていないヒト膵リ
   パーゼに対する反応が非競合的である。
2. （２）少なくとも下記試薬からなる非競合的免疫反応に
   もとずくヒト膵リパーゼ定量用キット：［１］不溶化さ
   れた請求項１記載の抗体、 ［２］ヒト膵リパーゼ活性測定用試薬。