JPH02150294A - モノクローナル抗体およびその使用法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、主に臨床検査の分野で利用することを目的と
した抗人膵リパーゼモノクローナル抗体および抗人膵リ
パーゼ酵素活性阻害モノクローナル抗体、さらにそれら
の使用法に関する。

〔従来技術〕

膵リパーゼ（Ｅ、Ｃ，３，１，１，３）は主として膵臓
に存在する酵素であ°す、膵管の狭窄、閉塞や膵臓組織
の炎症等の膵疾患で血液中に逸脱し、その値が上昇する
。特に、急性膵炎においてその上昇が著しく、血液中の
膵リパーゼを定量測定することは、臨床上膵炎の診断に
有用とされている。

従来リパーゼは酵素化学的に測定され、その方法として
１）アルカリ滴定法、２　）　Ｃｏｐｐｅｒ−５ｏａｐ
法、３）比濁法、４　）　Ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ法
により測定され、その基質としてグリセロールやオリー
ブ油の様な高級脂肪酸が用いられる。

また、これら高級脂肪酸に代わってｎａｐｈｔｈｏｌｅ
ｓ　Ｌｅｒやｔｒｙｂｕｔｙｒｉｎｅ等の反応性の高い
基質を用いた測定法が開発されている。

一方、免疫学的な測定も開発がすすめられた。

これはポリクローナル抗体である抗人膵リパーゼ抗血清
を用いたもので、酵素免疫測定法（Ｅｎｚｙｍｅｌｉｎ
ｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ　：
　ＥＬＩＳＡ）法として知られている。

〔発明が解決しようとする課題］ しかし、リパーゼを酵素化学的に測定するアルカリ滴定
法、Ｃｏｐｐｅｒ−５ｏａｐ法、比濁法およびＬｉｐｏ
ｘｙｇｅｎａｓｅ法においては、その基質が疎水性であ
るため、その基質をｅｍｕｌｓｉｏｎの状態にする必要
性があり、またｃｏｌｉｐａｓｅがリパーゼの活性発現
に大きく影響することが知られている。

その基質としてオリーブ油等の高級脂肪酸を用いた場合
、反応生成物の定量が難しく、低レベルの活性測定には
長時間を必要とするのみならず、操作が煩雑であるうえ
に低値での測定感度が低く、測定上の再現性にも大きな
問題を生じている。

また、ｎａｐｈｔｏｌ　ｅｓｔｅｒやｔｒｙｂｕｔｙｒ
ｉｒｌ等の基質を用いた場合反応性が高い反面、リパー
ゼ以外のエステラーゼによっても加水分解を受けること
から真のリパーゼの活性を示さないことがあると言われ
ている。

一方、抗人膵リパーゼ抗血清を用いたＥＬＩＳＡ法は、
抗原・抗体反応による高い特異性が期待されたが、ここ
で用いている抗血清は、動物を免疫して調製しているた
めロフト差が大きく、品質の一定した抗血清を調製する
ことが難しく、抗血清を用いたＥＬＩＳＡ法においても
常に再現性のよい試薬を提供するには至っていない。

ところが、１９７５年にＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉ
ｎは、細胞融合法によるモノクローナル抗体の調製方法
を報告して以来、均一でロフト差が無く、ポリクローナ
ル抗体よりも更に特異性の高い抗体を半永久的に、しか
も大量に調製することができるようになり、リパーゼ測
定系においてもこのようなモノクローナル抗体の出現が
期待されている。

従って、本発明の目的は、リパーゼを感度良く、節便に
、迅速に測定することができる測定法に適用しうる抗体
を提供することである。

〔課題を解決するための手段〕

上記目的は本発明、即ち （１）人膵リパーゼと特異的に反応するが、リパーゼの
酵素活性を全く阻害しないモノクローナル抗体（抗人膵
リパーゼモノクローナル抗体）および人膵リパーゼと反
応し、人膵リパーゼの酵素活性を特異的に阻害するモノ
クローナル抗体（抗人膵リパーゼ酵素活性阻害モノクロ
ーナル抗体）から選ばれるモノクローナル抗体。

（２）上記（１）のモノクローナル抗体の少なくとも一
種を使用することによる人膵リパーゼの測定法。

（３）上記（１）のモノクローナル抗体の少なくとも一
種を使用することによる膵ＶｉＡ組織の特異染色の方法
。

によって解決される。

本発明のモノクローナル抗体は、いわゆる細胞融合によ
って製造されたハイプリドーマから製造される、即ち、
抗体産生細胞と骨髄細胞との間に、融合ハイブリドーマ
を形成させ、当該ハイブリドーマをクーロン化し、上記
特定抗原に対して特異性を示す抗体を生産するクーロン
を選択することによって製造される。その操作は、免疫
原としてヒト膵液由来のリパーゼを使用する以外は、従
来既知の手段を使用すればよい。

免疫原は、たとえば完全フロインドアジュバントと混和
後、動物の免疫用として使用される。動物としては、た
とえばマウス、ラント、ウサギ等が例示される。免疫は
動物の皮下、筋肉内、腹腔内に約５〜２００μｇ／回を
注射することによって行われる。初回免疫から約１〜２
週間毎に１〜４度免疫を行い、さらに約１〜４週間後に
最終免疫を行う。最終免疫より約３〜５日後、免疫動物
から抗体産生細胞を分取する。抗体産生細胞としては、
牌細胞、リンパ節細胞等があげられる。

骨髄細胞としては、たとえばマウス、ラット、ヒト由来
のものが使用される。たとえばマウスミエローマＰ３・
Ｘ６３・Ａｇ８．Ｐ３・Ｘ６３・Ａｇ８−Ｕｌ、　　Ｐ
３　　・ＮＳｌ−Ａｇ４．　　ＳＰ２１０−Ａｇ１４．
Ｘ６３−Ａｇ３・６５３等が例示される。抗体産生細胞
と骨髄細胞とは同種動物由来であることが好ましい。

細胞融合は、たとえばネーチャー、第２６６巻、５５０
頁（１９７７）に記載の方法またはこれに準じる方法に
よって行われる。この際、３０〜５０％ポリエチレング
リコール（平均分子ｉｌｌ　、　０００〜４．０００）
を用いて３０〜４０°Ｃの温度下、約１〜２週間毎度反
応させることによって行われる。

細胞融合によって得られた細胞は目的とするモノクロー
ナル抗体を産生ずるクローンのスクＩＪ−ニングに付さ
れる。即ち、当該細胞を、たとえばマイクロプレート中
で培養し、増殖の見られたウェルの培養上清中の抗体価
を、たとえば酵素抗体法等によって測定し、適切な抗体
を産生じているウェルを得る。このようなウェルから、
更にたとえば限界希釈法によってクローニングを行って
クローンを得る０本発明のモノクローナル抗体は、当該
ハイブリドーマ細胞クローンを通常の培養方法、高密度
培養培養方法あるいはスピンナーフラスコ培養方法等の
培養上清よりプロティンＡ結合担体あるいは抗マウスイ
ムノグロブリン結合担体を用いたアフィニティークロマ
トグラフィーにより精製することにより得られる。

また、培養したハイブリドーマ細胞を、予めブレステン
処理した同系マウス腹腔に注射することにより腹水とし
て得られ、これを硫安塩析した後ＤＥＡＥイオン交換ク
ロマトグラフィーにより１ｇＧ１１！ｉｉ分として精製
し調製することができる。

本発明のモノクローナル抗体を用いて、臨床検査の分野
で有用な膵リパーゼの測定や膵臓組織の特異染色を行う
ことができる。

本発明のモノクローナル抗体を用いるヒト膵リパーゼの
測定は、通常法のようにして行われる。

即ち、当該測定にはワンステップ法とツーステップ法が
あり、ワンステンプアッセイでは抗体をウェル等に固定
化した固相と検体および酵素標識抗体とを同時に反応さ
せ、一定時間後反応しなかった標識抗体を洗浄により除
去し、固相の酵素活性を測定するものである。またツー
ステンブアンセイでは上記の反応においてまず抗体固定
化物と検体を反応させ、一定時間後に未反応の検体中の
抗原を洗浄により除去し、次に酵素標識抗体を反応させ
、一定時間後に洗浄により未反応の標識抗体を除去し、
固相の酵素活性を測定するものである。

より具体的には次の通りである。

抗リパーゼモノクローナル抗体感作抗体のウェル等の固
相への固定化法は本発明の目的を達成しうる限り特に制
限されるものではないが、たとえば溶媒（例えばアジ化
ナトリウムを含むリン酸緩衝液）に本発明のモノクロー
ナル抗体を溶解し、これをマイクロプレートのウェル中
に注油し、感作させる。およそ２〜４８時間で感作され
る。感作した後、適当な緩衝液などでウェルを洗浄し、
さらに、ブロッキングしておくことが好ましい。

ウェル中のモノクローナル抗体と試料中の抗原との反応
は該反応が容易に進行する状態（たとえば、温度２０〜
４０’Ｃ，湿度７０〜１００％の湿潤箱内）で反応が完
結するまで約３０分〜２時間反応させる６反応終了後、
ウェル中の未反応物を除去するか、除去することなく２
次抗体を加え、反応が容易に進行する状Ｂ（たとえば温
度２０〜４０’Ｃ，湿度７０〜１００％の湿潤箱内）で
反応が完結するまで約１０分〜２時間反応さセる０反応
残香を除去し、さらにリン酸覆衝液、蒸留水等でウェル
を洗浄する。

２次抗体、例えば抗リパーゼモノクローナル抗体−酵素
標識抗体は通常の方法、即ちグルタルアルデヒド架橋法
、過ヨーソ酸架橋法、マレイミド架橋法などの方法にて
作製することができる。

抗体に結合させる標識酵素としては、パーオキシダーゼ
、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼなど
が例示される。

次いで、反応に関与した２次抗体を測定する。

測定方法としては２次抗体に結合させた＋ｊ！ｍに応じ
た自体既知の方法が採用される。たとえば標識としてパ
ーオキシダーゼを結合させた場合、０フエニレンジアミ
ンと過酸化水素とを作用させて発色させ、主波長４９２
ｎｍ、副波長６９０ｎｍの波長にて吸光度を測定するこ
とができる。

また、本発明のモノクローナル抗体を用いて、膵臓組織
を特異的に染色することができる。当該染色は、通常酵
素抗体法によって行われる。

酵素抗体法は、＆ＩＩ織、細胞中にある抗原物質の局在
を、それに対応する特異抗体を作製し、さらにその抗体
に酵素＆Ｉ１ｗＸ化学で局在観察が可能な酵素を標識（
ラベル）し、この酵素標識特異抗体をｕｍ、細胞内の抗
原に作用させ、その局在を特異抗体に標識されている酵
素を染色することにより観察するものである。この観察
法の実施にあたり、事実上、直接法と間接法の２つがあ
る。

（１）　　直接法：ある組織、細胞中の抗原物質に対す
る特異抗体（通常ＩｇＧを精製しこれを用いる）を作製
し、これに西洋ワサビ由来パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）
やアルカリホスファターゼ等の様な酵素を標識した標識
抗体を、直接抗原を含む組織切片あるいは細胞の上に作
用させるものである。

この抗原抗体反応終了後、標識された酵素を、酵素組織
化学的に染色することにより、抗原の局在は、光学顕微
鏡下で観察できるようになる。標識酵素にＰＯＤ酵素を
用いた場合、その染色に３−アミノ−９−エチルカルバ
ゾール（ＡＢＣ）や３゜３゛−ジアミノベンチジン（Ｄ
ＡＢ）等の基質を過酸化水素存在下に加え、呈色反応に
より抗原を検出することができる。

本発明においては、上記抗原物質に対する特異抗体とし
て、本発明のモノクローナル抗体が使用される。

（２）間接法：間接法では観察目的の抗原に対応する特
異抗体、即ち第一抗体には酵素の標識を行わず、第一抗
体に対する第二抗体に標識を行うことを特徴としている
。

つまり、組織、細胞中の抗原に対する特異抗体を一次抗
体として反応させ、次に一次抗体に対するＰＯＤ標識抗
体を二次抗体として反応させる。

さらに、結合したＰＯＤに基１ＡＥｃを過酸化水素存在
下に加えて呈色反応より抗原を検出することができる。

本発明においては、上記抗原物質に対する特異抗体およ
び／または標識抗体として、本発明のモノクローナル抗
体が使用される。

〔実施例〕

実施例１ マウス 近交系Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃ系マウス雌５退会を入手
し、動物飼育チェンバー内（２３＋１°Ｃ５湿度７０％
）で、標準ペレットを使用して飼育し、給水は任意に行
った。

免疫原 大膵液由来の精製リパーゼを使用した。大陸リパーゼは
、ダルベツコＰＢＳで１ｍｇ／ｄとなるように調製し、
１００μｇずつ試験管に分注し、使用するまで一８０°
Ｃで凍結保存した。

免疫方法 大陸リパーゼ１００　ｕ　ｇ　１０．５−と同量のＦｒ
ｅｕｎｄ’ｓ　−ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ａｄｊｕｖａｎｔ
を混合し、乳化状にした抗原２０μｇを５匹の５週令雌
のＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスの腹腔および背中の皮
下十数カ所に２週間毎に２ヶ月間投与した。２ケ月間の
免疫の後、抗体価を測定し、抗体価の高いマウスを選ん
でさらに１週間毎に５０μｇ、１００μｇ、２００μｇ
を腹腔内投与し追加投与を行った。

また、別の２匹のマウスには同様に２ケ月の免疫の後１
ケ月あけて１００μｇを腹腔内に投与し、さらに１週間
後１００１１ｇを静脈注射し追加免疫を行った。上記免
疫スケジュールについては、表１に示した。

細胞融合 最終免疫から３日後にＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスの
摘牌を行い、ＥＭＥＭ培養液中で牌細胞の浮遊液を作製
した。ついで、牌細胞をＥＭＥＭ培養液で４回洗浄した
後、細胞数を算定した。

細胞融合は、２−ａｍｉｎｏ−６−ｏｘｙ−８ａｚａｐ
ｕｒａｉｎｅ　　（８Ａｚａｇｕａｎｉｎｅ）耐性のＢ
　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウス骨髄腫由来培養細胞株（Ｐ
３−Ｘ６３−Ａｇ８・６５３以後Ｘ６３細胞と略す）を
親細胞株として用いた。

Ｘ６３！！ｌ胞は、非動化したｆｅｔａｌ　ｃａｌｆ　
５ｅｒｕｓ＋　（Ｆｅ２）　５％を含むＲＰＭＩ−１６
４０培養液（２０ｔｔｇ／ｄ、８−ａｚａｇｕａｎｉｎ
ｅ含有）で継代培養し、対数増殖期のＸ６３細胞を用い
ＲＰＭｌ−１６４０培養液で３回洗浄した後、細胞数を
算定した。

細胞融合は、ポリエチレングリコール−４０００をＲＰ
ＭＩ−１６４０培養液で５０（ｗ／ｖ）％濃度となるよ
うに溶解して使用した。

牌細胞とＸ６３細胞の比が１０１となるように混合し、
１５００ｒｐｍ、５分間遠心後、上清を除去し、細胞の
ペレットをよく解し、ポリエチレングリコールを用いて
、にｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎの方法に準じて細胞
融合を行った。その後、牌細胞が３．５Ｘ１０’個／ｄ
となるように、ＨＡ　Ｔ選択培地（１０％ＦＣ３を添加
したＲＰＭＩ−１６４０培養液にＩ　Ｘ　１０−’Ｍ　
　ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ、　４　Ｘ　１０−’Ｍ　
　ａｓｉｎｏｐｔｅｒｉｎおよび１．６　Ｘｌ０−’Ｍ
　ｔｈｙｓｉｄｉｎｅを含有）に浮遊した。ついで、細
胞浮遊液の１００μＰずつを９６穴マイクロテストプレ
ートの各式に分注した後、炭酸ガスインキュヘータ（３
７℃、湿度９５％、８％炭酸ガス）で培養を行った。培
養開始後、１日目と２日目にＨＡＴ培地を各式に１滴ず
つ、また培養開始後７日目と９日目にＨＡＴ培地を各式
に２滴ずつ添加してさらに培養を行った。

スクリーニング 培養開始後、■００日目り細胞のクローンが出現し、抗
体産生の有無をｉＩ　Ｌｆｆｌするため、ハイブリドー
マの培養上清を用いて、膵リパーゼの吸収試験を行った
。

すなわち、ハイブリドーマの培養上清と膵リパーゼ抗原
液（３００ｎｇ／ｄ）とを５０μｊ２ずつＵボトムノマ
イクロタイタープレートに入れ、さらに抗マウスイムノ
グロブリン抗体を結合させた５ｅｐｈａｒｏｓｅ　４　
Ｂの２０％懸濁液を５０ｔｔｌを加えＪ室温で１時間撹
拌した後１０分間静置する０次に抗マウスイムノグロブ
リン抗体結合５ｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂがウェルの底に
完全に沈むのを確認した後、この上清を２０μ！とりこ
の上清中に残存する膵リパーゼの濃度を膵リパーゼＥＬ
ＩＳＡ系で測定した。

このとき、ハイブリドーマの培養上清中に人膵リパーゼ
に対する抗人膵リパーゼモノクローナル抗体が存在する
場合には、膵リパーゼと抗人膵リパーゼモノクローナル
抗体とが反応し、さらに抗マウスイムノグロブリン抗体
結合５ｅｐｈａｒｏｓｅ　４　Ｂとが抗原抗体複合体を
介して沈降し、上清中に残存する膵リパーゼの濃度が減
少し、抗人膵リパーゼモノクローナル抗体の存在が証明
されるわけである。

こうして、膵リパーゼに対して特異的に反応する抗人膵
リパーゼモノクローナル抗体がスクリーニングされたな
らば、次に膵リパーゼの酵素活性を阻害するかどうかの
試験を行った。

つまり、一定の酵素活性を有する膵リパーゼ溶液と培養
上清を等量ずつ混合し、３７°Ｃで１時間反応させた後
、残存する酵素活性をリパーゼ酵素活性測定用試薬で測
定した。

合計２回の細胞融合の結果を表２に示した。また表３に
は、膵リパーゼの吸収試験及び膵リパーゼ酵素活性阻害
試験の結果を示した。

すなわち膵リパーゼ吸収試験で、膵リパーゼと反応する
クローンが１１５株得られた。このうち膵リパーゼの酵
素活性を強く阻害するクローンが１０株、中程度に阻害
するクローンが１３株、また、弱く阻害するクローンが
１２株得られた。その他のクローンでは、リパーゼの酵
素活性阻害は全く認められなかった。

これらのクローンのうち、膵リパーゼの酵素活性を強く
阻害するクローンを９株、中程度の阻害を認めるクロー
ンを６株、膵リパーゼとは強く反応するがこの酵素活性
をまったく阻害しないクローンを１０株選択し、限界希
釈法によるクローニングを９６穴マイクロテストプレー
トを用いて３回行った。各クローニング毎にＦｅｅｄｅ
ｒ　ｃｅｌｌ　として、Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウス
より調製した脚線細胞をＨＴ培地に浮遊して１穴あたり
ｌＸｌ０’個となるように加えた。

最終的に、膵リパーゼの酵素活性を強く阻害するクロー
ンが７株、中程度の阻害を認めるクローンが５株、膵リ
パーゼと反応するがこの酵素活性をまったく阻害しない
クローンが７株樹立することができ、その結果を表４に
示した。

マウスイムノグロブリンサブクラスの同定得られたハイ
ブリドーマ細胞の産生ずるモノクローナル抗体のイムノ
グロブリンサブクラスを決定するため、ハイブリドーマ
細胞の培養上清を濃縮し、ウサギ由来の抗マウスＩｇＧ
１、Ｉ　ｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、１ｇＧ３、［ｇＡＳ　
ＩｇＭ、ｘ鎖およびλ鎖抗血清を用いて０ｕｃｈｔｅｒ
ｌｏｎｙの寒天内二重拡散法で行った。

その結果、各クローンのマウスイムノグロブリンサブク
ラスは、Ｈ１ｍについては、Ｌ−５６７Ｍが抗マウスＩ
ｇＧ２ａ抗血清とのみ反応した以列すべで抗マウスＩｇ
Ｇ１抗血清とのみ反応した。

また、Ｌ鎖については、全てのクローンにおいて抗マウ
スに鎖抗血清とのみ反応した（表４参照）。

腹水の採取 高濃度のモノクローナル抗体を得るため各クローンのハ
イブリドーマ細胞をＥＭＥＭ培養液で３回洗浄した後、
あらかじめ２，６，１０．１４テトラメチルペンタデカ
ン（ρｒｉｓｔａｎｅ）を７日前と４日前に０．５　ｄ
ずつ腹腔内投与したＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔へ注射し
た。ハイブリドーマ細胞を腹腔内投与してから、７〜１
４日後に腹水を得た。

培養上清及び腹水中のモノクローナル抗体濃度の測定 各クローンの培養上清および腹水中に含まれるモノクロ
ーナル抗体の濃度を検定するため、マウスＩｇＧ測定用
ＥＬＩＳＡ系により測定し、その結果を表４に示した。

各クローンの培養上清中のモノクローナル抗体のＩｇＧ
１度は、１．６〜２０　ｔｔ　ｇ／ｒｄＯ）範囲であり
、平均５μｇ／ｄの濃度であった。また、それらクロー
ンの腹水中に含まれるモノクローナル抗体の濃度は１．
１〜５．３■／ＩＬ１の範囲であり、平均ＩｇＧＪ度ハ
３．７１ｇ　／　ｄ　テアッｋ。

実施例２ リパーゼ測定用ＥＬＩＳ＾系の検討 １、抗すパーゼモノクローナル抗体−ＰＯＤ標識抗体の
調製 上記、実施例１に示した如くリパーゼ測定用ＥＬＩＳＡ
法への応用検討のためＬ−４４８クローンの腹水を硫酸
ナトリウム（２０％ｗ　／　ｖ　）で塩析し、ＤＥＡＥ
イオン交換クロマトグラフィーにより抗すパーゼモノク
ローナル抗体１ｇＧ画分を精製した０次に、このＩｇＧ
画分を約ｌＯ■／ｄに′ａ縮し、０．２ＭのＮａＣ１を
含む０．１　Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４，３）で
透析し、ペプシン消化によってＦ（ａｂ’）＝フラグメ
ントを得た。このＦ（ａｂ’）ｘフラグメントを用いて
マレイミド法により抗人膵リパーゼＦａｂ’　−ＰＯＤ
標識抗体を調製した（以下、抗すパーゼーＰＯＤｔ！！
識抗体と略す）。

２、抗すパーゼモノクローナル抗体感作抗体プレートの
調製 また、固相用のモノクローナル抗体として、クローンＬ
−６９５１腹水より同様にＩｇＧ画分を精製し、０．１
％のアジ化ナトリウムを含む０．１　Ｍリン酸緩衝液ｐ
Ｈ７，５を用いて５０ｇｇ／ｄの濃度に調製した。

次に、この溶液をＥＬＩＳＡ用９６六マイクロタイター
プレートの各人に１００μＥずつ分注し、４°Ｃで一晩
感作した後Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５％含むリン酸生理
緩衝液（以下洗浄液と略す）で３回洗浄した。さらに、
１％ＢＳＡを含むリン酸１７ｉ　ｄｉ液ｐＨ７，０を各
人に分注し４　”Ｃでさらに一晩ブロフキングし抗リパ
ーゼモノクローナル抗体感作抗体プレート（以下抗リパ
ーゼ抗体プレートと略す）を調製した。

３、リパーゼ測定用ＥＬＩＳＡ系の検討上記のごとく調
製した抗リパーゼ抗体プレートのブロンキング液を捨て
、１％ＢＳＡを含むリン酸緩衝液２００μＰを各人に分
注した後、リパーゼをそれぞれ３．１２５．６．２５．
１２．５．２５．５０．１００および２００ｎｇ／ｄに
調製した標準抗原液をそれぞれの穴に２０μ２ずつ加え
混和し室温で１時間反応させた後、各人を洗浄液で３回
洗浄した。さらに、至適濃度に調製した抗すパーゼーＰ
ＯＤ標識抗体を１００μｌずつ添加し、室温で３００分
間反応せた後、洗浄液で各人を３回洗浄した。次に、Ｏ
ＰＤ基質液（０，１Ｍリン酸クエン酸緩衝液に０−フェ
ニレンジアミン２１ｇ／ｄ及び４ｍＭＨｚｏｚを含む）
を１００μｆ加え３分間反応させた後、２Ｎ　　Ｈ２Ｓ
Ｏ，を各人にｌｐｌずつ加えて反応を止め、主波長４９
２ｎｍ副波長６９０ｎｍとしてＥＬＩＳＡ用プレート、
リーダーにて吸光度を測定した。

その結果、得られた膵リパーゼ検量線を第１図に示した
。リパーゼの濃度に依存して吸光度が上昇し、この検量
線を用いることにより検体（血清）中の膵リパーゼ濃度
を正確に読み取ることができる。また、第１図からも明
らかなように膵リパーゼ濃度が、数ｎ　ｇ　／　ｄの低
値においても再現よく、その濃度を測定し得ることが判
明し、膵リパーゼ濃度測定用ＥＬＩＳＡ系に充分応用可
能であることが示された。

実施例３ 酵素抗体法による膵ｇ＆ｌＩｍの特異染色への応用例実
施例１により得た抗人膵リパーゼモノクローナル抗体は
、ＥＬＪＳＡ法のみならず膵Ｗ４組織中のリパーゼの局
在あるいは分布を間接酵素抗体法により特異的に染色す
ることができる。また、実施例２で調製した抗すパーゼ
ーＰＯＤ標識抗体を用いた場合には、直接酵素抗体法に
よりより短時間で膵臓＆ｌｌ織を特異的に染色すること
ができる。

以下、間接酵素抗体法の例を示す。つまり、膵臓組織の
パラフィンまたは凍結切片をスライドグラス上に固定し
、脱パラフィンあるいはブロンキングした後、至適濃度
に調製した抗すバーゼモノクｏ−ナル抗体（ＩｇＧｆｉ
度：　５　ｕ　ｇ／ｄ　〜１００μｇ　／ｄ）を１次抗
体として室温で１時間、湿潤相中で反応させた後、リン
酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回、５分間ずつ洗浄し
た９次に、抗マウスイムノグロブリン−ＰＯＤ標識抗体
を２次抗体として３０分間、湿潤相中で反応させ同様に
洗浄した後、３−アミノ−９−エチルカルバゾール基質
溶液を過酸化水素存在下に加えてさらに３００分間反応
せた０反応終了後、ＰＢＳでスライドグラスを洗浄し、
グリセロール等を用い、スライドグラスで封入して顕微
鏡で染色された部位を調べた。

その結果を写真として第２図（ａ）、第３図（ａ）、第
４図（ａ）および第５図（ａ）、ならびにそれぞれ上記
第２図（ａ）〜第５図（ａ）の概略図である第２図（ｂ
）、第３図（ｂ）、第４図（ｂ）および第５図（ｂ）に
示した。第２図（ｂ）〜第５図（ト））において斜線で
示した部分が、即ち膵臓組織中の膵リパーゼの局在分布
が茶褐色に染色されていることが示される。即ち、本発
明のモノクローナル抗体はＥＬＩＳＡ系のみならず酵素
抗体法による膵臓組織の組織染色にも応用可能であるこ
とが判明した。

実施例４ 先の実施例２で抗すパーゼモノクローナル抗体−ＰＯＤ
標識抗体の調製に使用したリパーゼ酵素活性を全く阻害
しないクローンであるＬ−４４８クローンの代わりに、
リパーゼ酵素活性を阻害するクローンであるＬ−６９５
１を用いて同様の方法で抗すパーゼモノクローナル抗体
−ＰＯＤＩ識抗体を調製した。

更に、ここで抗リパーゼモノクローナル抗体感作抗体プ
レートの調製に用いたリパーゼ酵素活性を阻害するクロ
ーンであるＬ６９５１の代わりに、同じくリパーゼ酵素
活性を阻害するクローンであるＬ６１２＋を用いて同様
の方法で抗リパーゼモノクローナル抗体感作抗体プレー
トを調製した。

これらを用いて同様にしてリパーゼ測定用ＥＬＩＳＡ系
の検討を行い、そこで得られた膵リパーゼ検量線を第６
図に示した。この結果、先の実施例２と同様のことが示
され、先の実施例２ではリパーゼ酵素活性を全く阻害し
ないクローンと阻害するクローンの組合せであるが、こ
こで行ったようにリパーゼ酵素活性を阻害するクローン
同士を組合わせた場合でも同じ結果が得られることが判
った。なお、リパーゼ酵素活性を阻害しないクローン同
士を組み合わせた場合でも、同様な結果が得られた。

〔発明の効果〕 本発明の抗人膵リパーゼ酵素活性阻害モノクローナル抗
体は、リパーゼ抗原分子を特異的に認識しかつリパーゼ
の酵素活性部位あるいは酵素活性部位付近を認識し結合
することによってリパーゼの酵素活性を阻害するモノク
ローナル抗体である。

また、抗人膵リパーゼモノクローナル抗体は、膵リパー
ゼの抗原分子に対して反応するがリパーゼの酵素活性を
全く阻害せず酵素活性部位以外の抗原エピトープを認識
するモノクローナル抗体である。

以上のことから、これら２種類のモノクローナル抗体は
、互いにリパーゼ抗原分子上の異なる抗原エピトープを
認識することは明らかであり、これら２種類のモノクロ
ーナル抗体を組合わせたＥｎｚｙｍｅ−１ｉｎｋｓｄ　
　ｉ＋＋ｎｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　　ａｓｓａｙ　　（
ＥＬＩＳＡ）　　法により膵リパーゼを高感度に再現良
く測定する試薬を調製することを可能にした。

また、リパーゼ酵素活性を阻害するモノクローナル抗体
同士の組み合わせやリパーゼ酵素活性を阻害しないモノ
クローナル抗体同士の組み合わせの場合でも、同様な測
定試薬の調製が可能である。

さらにまた、リパーゼ測定用ＥＬＩＳＡ系のみならず、
膵ｍｕ織のリパーゼ局在部位あるいは分布をもｍ織染色
において検索することができることが可能となり検討の
応用範囲がさらに広がり、臨床検査の分野に貢献するこ
とが期待される。

表１　膵リパーゼ免疫スケジュール スケジュール１ ２０μｇ＋ＦＣＡ。

２０μｇ＋ＦＣＡ。

１　　２０７７ｇ＋ＦＣＡ ４０μｇ ４０μｇ ５０μｇ、　ｉ、ｐ。

１００μｇ、　ｉ、ｐ。

２００μｇ、ｉ、ｐ。

細胞融合　Ｉ スケジュール２ ｓ、ｃ、、　ｉ、ｐ。

ｓ、ｃ、、ｉ、ｐ。

ｓ、ｃ、、ｉ、ｐ。

ｉ、ｐ。

ｉ、ｐ。

１００μｇ。

１、ｐ。

１００μｇ。

細胞融合 ｉ、ｖ。

■ ｉ、ｐ、　：　ｌｔＩ腔内注射

【図面の簡単な説明】 第１図は膵リパーゼ検量線、即ち、膵リパーゼ抗原分子
の上の異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体
を用いた膵リパーゼ測定用ＥＬＩＳ＾系における検量線
の一例である。 第２図（ａ）は、モノクローナル抗体として６９５■を
使用した場合の生物の形態であ組織の組織染色像を示す
写真である。 第３図（ａ）は、モノクローナル抗体として６４９を使
用した場合の生物の形態である織の組織染色像を示す写
真である。 第４図（ａ）は、モノクローナル抗体として２３４を使
用した場合の生物の形態である織の組織染色像を示す写
真である。 第５図（ａ）は、モノクローナル抗体として５２７Ｍを
使用した場合の生物の形態であ組織の組織染色像を示す
写真であるや 第２図（ｂ）は第２図（ａ）の概略図であるゆ第３図（
ｂｌは第３図（ａｌの概略図である。 第４図（１））は第４図（ａ）の概略図である。 第５図［有］）は第５図（ａ）の概略図である。 第６図は同一反応特性を示すモノクローナル抗体同士を
組み合わせた場合の膵リパーゼ測定用ＥＬＩＳＡ系にお
ける検量線の一例である。 第５、〕図び）〕 第、３図、・、１） 第・Ｌ　Ｅで、′）； 第；］［、図（６ｊ 第２図（ｂ） 第３図（ｂ） 第４図（ｂ） 第５図（ｂ）

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. （１）人膵リパーゼと特異的に反応するが、リパーゼの
   酵素活性を全く阻害しないモノクローナル抗体および人
   膵リパーゼと反応し、人膵リパーゼの酵素活性を特異的
   に阻害するモノクローナル抗体から選ばれるモノクロー
   ナル抗体。
2. （２）請求項（１）記載のモノクローナル抗体の少なく
   とも一種を使用することを特徴とする人膵リパーゼの測
   定法。
3. （３）請求項（１）記載のモノクローナル抗体を固定化
   した固相と検体および当該モノクローナル抗体の酵素標
   識抗体とを同時に反応させた後、反応しなかった標識抗
   体を除去し、固相の酵素活性を測定することを特徴とす
   る請求項（２）記載の人膵リパーゼの測定法。
4. （４）請求項（１）記載のモノクローナル抗体を固定化
   した固相と検体を反応させた後、未反応の検体中の抗原
   を除去し、次に当該モノクローナル抗体の酵素標識抗体
   を反応させた後、未反応の標識抗体を除去し、固相の酵
   素活性を測定することを特徴とする請求項（２）記載の
   人膵リパーゼの測定法。
5. （５）人膵リパーゼと特異的に反応するが、リパーゼの
   酵素活性を全く阻害しないモノクローナル抗体を酵素標
   識抗体とし、人膵リパーゼと反応し、人膵リパーゼの酵
   素活性を特異的に阻害するモノクローナル抗体を固相固
   定抗体とすることを特徴とする請求項（２）記載の人膵
   リパーゼの測定法。
6. （６）請求項（１）記載のモノクローナル抗体の少なく
   とも一種を使用することを特徴とする膵臓組織の特異染
   色の方法。
7. （７）請求項（１）記載のモノクローナル抗体と当該モ
   ノクローナル抗体に対する標識抗体を、膵臓組織切片あ
   るいは膵臓細胞に作用させた後、標識された酵素を酵素
   組織化学的に染色することを特徴とする請求項（６）記
   載の膵臓組織の特異染色の方法。
8. （８）請求項（１）記載のモノクローナル抗体を膵臓組
   織切片あるいは膵臓細胞に作用させ、次に当該モノクロ
   ーナル抗体に対する酵素標識抗体を作用させた後標識さ
   れた酵素を酵素組織化学的に染色することを特徴とする
   膵臓組織の特異染色の方法。