JP5749643B2 - 診断及び予後の方法を実施するためのirapタンパク質の使用 - Google Patents
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Description
IRAPと推定されるタンパク質の未特定アイソフォームの分泌部分が、血中で、メチオニンの存在下に非特異的合成基質L-ロイシン-ニトロアニリドを用いる酵素的方法によりアッセイされた(Mizutani, S., Yoshino, M.及びOya, M. (1976) Clin Biochem 9(1), 16-18)。
2型糖尿病で、筋肉及び脂肪組織におけるGLUT4発現の減少及び原形質膜へのGLUT4転位の減少の両方が見出されている(Kahn, B. B. (1992) J Clin Invest 89(5), 1367-1374)。
本発明の目的の1つは、哺乳動物の血清又は血漿又は組織中のIRAPタンパク質、具体的にはIRAPタンパク質の細胞外ドメインの濃度をアッセイするインビトロ法を提供することである。
本発明の別の目的は、IRAPタンパク質濃度の過剰又は減少が関与する病状の診断方法を提供することである。
最後の目的は、治療観点から、IRAPタンパク質の異なるアイソフォームの細胞外ドメインに特異的なモノクローナル抗体及びそれらの酵素活性の阻害剤を提供することである。
これら異なる名称は、本明細書中の残りの部分で互換的に使用し得、同じタンパク質を指称する。
上記のように、細胞外ドメインは切断され、分泌され得る。
結果的に、表現「細胞外ドメイン」は、細胞膜に依然として結合しておりその結果として組織中に見出される細胞外ドメインと、血液循環中に見出される循環性細胞外ドメイン(すなわち、切断及び分泌後の細胞外ドメイン)との両方を含む。
− 血清又は血漿中を循環している細胞外ドメイン、又は
− 組織(赤血球を含む)中で膜に結合している細胞外ドメイン
の特異的アッセイを可能にするというものである。
本明細書を通じて、用語IRAPは、単独で使用することもあるが、そのアイソフォーム及び/又は変形体も含む。
「インビトロ予後」とは、疾患の重篤度及びその後の進展(転帰を含む)のインビトロ評価を意味する。
上記のように、IRAPはGLUT4グルコース輸送体と共存し、化学量論的にGLUT4と同時転位する。
したがって、本発明のアッセイ法の別の利点は、グルコース輸送欠損の判定であり、その結果としての、病状の原因若しくは重篤度の同定又は病状及びその進展のモニタリングである。
グルコース輸送欠損に関係する病状は、インスリン抵抗性、2型糖尿病、妊娠糖尿病であり得るがこれらに限定されない。1つのより有利な実施形態によれば、上記のIRAPタンパク質及び/又は上記のその1つのアイソフォーム及び/又は上記のその1つの変形体の細胞外ドメインの使用により、健常個体と比ベてIRAP及び/又はそのアイソフォーム及び/若しくは変形体の原形質膜での過剰発現及び/又はその原形質膜への転位の増加に関連する病状のインビトロ診断及び/又は予後或いは健常個体と比ベて患者におけるIRAP及び/又はそのアイソフォーム及び/若しくは変形体の過剰発現に関連する病状のインビトロモニタリングが可能になる。
患者におけるIRAPタンパク質の過剰発現及び/又はその原形質膜への転位の増加に関連する病状のモニタリングに関して、本発明のアッセイ法により前記患者で治療中に測定したIRAPタンパク質細胞外ドメインの濃度が、治療前に測定したIRAPタンパク質細胞外ドメインの濃度に比べて減少していることにより、当該治療の効果の証明が可能になる。
結果として、上記分泌又は未分泌のIRAPタンパク質の濃度の最大値が患者で25%以上増加しているとき、個体において、IRAPタンパク質の原形質膜での過剰発現及び/又はその原形質膜への転位増加が存在すると考えられる。
患者におけるIRAPタンパク質の原形質膜での過少発現及び/又はその原形質膜への転位の減少に関連する病状のモニタリングに関して、本発明のアッセイ法により前記患者で治療中に測定したIRAPタンパク質細胞外ドメインの濃度が、治療前に測定したIRAPタンパク質細胞外ドメインの濃度に比ベて増加していることにより、当該治療の効果の証明が可能になる。
上記IRAPタンパク質の濃度の最大値が25%以上減少しているとき、IRAPタンパク質の過少が存在すると考えられる。
用語「化学療法抵抗性」とは、抗癌剤での化学療法の間の抗癌治療に対する感受性の減少又は完全な欠如を意味し、これは後天的又は先天的であり、抗癌治療の効果を制限するか又は完全に消失させる。
結果として、IRAP及び/又は上記のその1つのアイソフォーム及び/又は上記のその1つの変形体の細胞外ドメインのアッセイ(特に上記IRAPタンパク質の濃度の最大値が患者において25%以上増加しているとき、個体におけるIRAPタンパク質の原形質膜での過剰発現及び/又はその原形質膜への転位の増加を示す)により、化学療法に対する抵抗性の診断及び/又は予後が可能になる。
子癇前症は、動脈性高血圧、蛋白尿及び浮腫を伴う体重増加の組合せによって特徴付けられる疾患である。
早期分娩のリスクは、子宮頸の短縮及び開口(妊娠36週目終了前の分娩を引き起こすことがある)を生じる子宮収縮により特徴付けられる。
1つの有利な実施形態では、本発明の方法による文献WO 2005/038462で言及された癌の検出は、血清中で、また血漿中又は赤血球上でも行われる。
自己免疫疾患とは、その生物中に通常存在する物質又は組織に対する免疫系の活動亢進に起因する疾患、例えば自己免疫性甲状腺炎、慢性関節リウマチ、強直性脊椎炎、グジュロー‐シェーグレン症候群を意味する。
慢性関節リウマチ、エリテマトーデス、シェーグレン症候群、強皮症(全身性硬化症)、皮膚筋炎、多発性筋炎、リウマチ性多発性筋痛、変形性関節症、化膿性関節炎、痛風、偽痛風、脊椎関節症、強直性脊椎炎、ライター症候群、乾癬性関節症、腸疾患に基づく脊椎炎(spondylite enteropathique)、反応性関節症(arthropathie reactive)、クローン病、サルコイドーシスなど。
用語「抗体」は、IRAPタンパク質の1つのアイソフォームの細胞外ドメインに特異的なポリクローナル又はモノクローナルの抗体を指称するために使用し、IRAPタンパク質の細胞外ドメインに特異的なモノクローナル抗体を模倣するフラグメント又は分子、特にエピトープに結合するフラグメントもまた含む。
フラグメント又分子は、モノクローナル抗体から、組換えDNA技術又は酵素的若しくは化学的方法により誘導することができ、抗原フラグメントに関するモノクローナル抗体の結合特性に類似する結合特性を有し得る。
抗体フラグメントの例には、Fab、Fab'及びF(ab')2、Fd、単鎖Fv(scFv)、単鎖抗体、ジスルフィドブリッジで連結されたFv及びVL又はVH領域のいずれかを含んでなるフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。エピトープ結合性フラグメント(単鎖抗体を含む)は、可変領域を単独で又は以下のエレメントの全て若しくは一部との組合せで含んでなることができる:ヒンジ領域、CH1、CH2及びCH3ドメイン。
Fab及びF(ab')2フラグメントは、酵素、例えばパパイン(Fabフラグメント)又はペプシン(F(ab')2フラグメント)を使用するタンパク質分解性切断により製造することができる。
1つの有利な実施形態によれば、上記抗体はポリクローナル抗体である。
1つの有利な実施形態では、上記ポリクローナル抗体は、インスリン抵抗性又は癌に関しては哺乳動物、特にヒトからの血清、血漿又は赤血球中、或いはインスリン抵抗性に関しては哺乳動物からの組織中の上記IRAPタンパク質及び/又は上記のその1つのアイソフォーム及び/若しくは変形体の濃度のインビトロアッセイ法を実施するために使用する。
「モノクローナル抗体」とは、単一細胞クローン、すなわちハイブリドーマを起源とする抗体を意味する。
1つの有利な実施形態では、上記モノクローナル抗体は、インスリン抵抗性又は癌に関しては哺乳動物、特にヒトからの血清、血漿、赤血球又は組織中の上記IRAPタンパク質及び/又は上記のその1つのアイソフォーム及び/又はその1つの変形体の濃度のインビトロアッセイ法を実施するために使用する。
「ハイブリドーマ」とは、抗体を継続的に産生する融合細胞、すなわち無限に再生産することができ、哺乳動物の細胞と融合している腫瘍細胞を意味する。
同様に、IRAPタンパク質は上記のように抗癌剤に対する感受性の減少に関与するので、本発明の抗体により、IRAP濃度の減少又はその活性及び/又は原形質膜への転位の部分的若しくは完全な阻害が可能になり、したがって抗癌剤に対する感受性の減少をなくすことができる。このため、化学療法に対する抵抗性の処置及び結果的に抗癌剤の効果の向上が導かれる。
1つの有利な実施形態によれば、上記抗体はモノクローナル抗体である。
− CNCM(Collection Nationale de Culture de Microorganismes, Institut Pasteur, Paris, France)に2009年7月2日、アクセッション番号CNCM I-4181で寄託されたハイブリドーマにより分泌されるモノクローナル抗体、
− CNCMに2009年7月2日、アクセッション番号CNCM I-4182で寄託されたハイブリドーマにより分泌されるモノクローナル抗体、
− CNCMに2009年7月2日、アクセッション番号CNCM I-4183で寄託されたハイブリドーマにより分泌されるモノクローナル抗体、
− CNCMに2009年7月2日、アクセッション番号CNCM I-4184で寄託されたハイブリドーマにより分泌されるモノクローナル抗体、及び
− CNCMに2009年7月2日、アクセッション番号CNCM I-4185で寄託されたハイブリドーマにより分泌されるモノクローナル抗体。
試験で使用する特定の標識又は検出可能基は、一般的には、アッセイに使用する抗体の特異的結合を妨げない限り、本発明の重要な観点ではない。検出可能基は、検出可能な物理的又は化学的性質を有する任意の物質であり得る。このような検出可能な標識は、免疫学的アッセイの分野で十分に開発されており、一般には、本発明の方法に適用可能な方法で有用であるほとんど全ての標識である。
蛍光化合物としては、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロンなどが挙げられる。化学発光化合物としては、ルシフェリン及び2,3-ジヒドロフタラジンジオン(例えばルミノール)及び量子ドットが挙げられる。標識又は他のシグナル生成系の概説は、米国特許第4,391,904号で入手可能である。
同様に、酵素標識は、該酵素に適切な基質を提供し、生じる反応産物を検出することにより検出することができる。最後に、単純な比色標識は、標識に関連する色を観察することによって直接検出することができる。
「ヒト化抗体」とは、マウス抗体の最小限の部分がヒト抗体に組み込まれている遺伝子改変抗体を意味する;一般に、ヒト化抗体は、5〜10%のマウス抗体及び90〜95%のヒト抗体を含んでなる。
ヒト化抗体は、マウス又はキメラ抗体の使用で観察されるHAMA(ヒト抗-マウス抗体)及びHACA(ヒト抗-キメラ抗体)応答をブロックするという利点を有する。ヒト化抗体に対するヒト免疫系の応答は最小限にしか示されないか又は全く示されない。
本発明の別の有利な観点は、下記から選択する上記ハイブリドーマに関する:
- CNCMに2009年7月2日、アクセッション番号CNCM I-4181で寄託されたハイブリドーマ、
- CNCMに2009年7月2日、アクセッション番号CNCM I-4182で寄託されたハイブリドーマ、
- CNCMに2009年7月2日、アクセッション番号CNCM I-4183で寄託されたハイブリドーマ、
- CNCMに2009年7月2日、アクセッション番号CNCM I-4184で寄託されたハイブリドーマ、及び
- CNCMに2009年7月2日、アクセッション番号CNCM I-4185で寄託されたハイブリドーマ。
これらハイブリドーマの製造は実施例に記載されている。
IRAPタンパク質の細胞外ドメインのアッセイは、酵素抗体アッセイ(実施例3)、又は免疫組織化学アッセイ(実施例4)、RIA(ラジオイムノアッセイ)若しくはIRMA(免疫放射線アッセイ)により行うことができる。後者の場合、アッセイは、ヨウ素125又は他の任意の適切な放射性同位体で標識した、抗体若しくはタンパク質又はそれらのフラグメントを用いて行う。
a.哺乳動物において、上記抗体を用いて、IRAPタンパク質の循環性細胞外ドメイン(すなわち、赤血球の原形質膜で発現するものも)及び/又はその1つのアイソフォーム及び/若しくはその1つの変形体の濃度をインビトロ測定する工程、
b.工程a.で得られた濃度を健常哺乳動物でインビトロで得られた濃度と比較する工程、
c.工程a.で得られた濃度が工程b.の濃度より低いとき、哺乳動物はインスリン抵抗性を有しているという事実を工程b.から推論する工程。
a.哺乳動物において、上記抗体を用いて、IRAPタンパク質の循環性細胞外ドメイン(すなわち、赤血球の原形質膜で発現するものも)及び/又はその1つのアイソフォーム及び/若しくはその1つの変形体の濃度をインビトロ測定する工程、
b.工程a.で得られた濃度をコントロール哺乳動物でインビトロで得られた濃度と比較する工程、
c.工程a.で得られる濃度が工程b.の濃度より高いとき、哺乳動物は癌を有しているという事実を、工程b.から推論する工程。
1つの好ましい実施形態では、上記キットはまた、IRAPタンパク質の基質及び抗体により認識されるペプチド又はIRAPのフラグメントを含んでなる。
基質の例は、L-ロイシン-ニトロアニリド、バソプレッシン、オキシトシン、メト-エンケファリンなどであるが、これらに限定されない。
「抗体により認識されるペプチド」とは、抗体により認識される、組換えIRAPタンパク質又はそのフラグメントを意味する。
a.上記モノクローナル抗体の少なくとも1つ、優先的には上記モノクローナル抗体の2つ、特に抗体17H10及び4G6又は40C10を使用して、哺乳動物においてIRAPタンパク質及び/又はその1つのアイソフォーム及び/若しくはその1つの変形体の循環性細胞外ドメインの濃度をインビトロ測定する工程、
b.工程a.で得られた濃度をコントロール哺乳動物でインビトロで得られた濃度と比較する工程、
c.工程a.で得られた濃度が工程b.の濃度より高いとき、哺乳動物は癌を有しているという事実を工程b.から推論する工程。
a.上記モノクローナル抗体の少なくとも1つ、優先的には上記モノクローナル抗体の2つ、特に抗体17H10及び4G6又は40C10を使用して、哺乳動物において、IRAPタンパク質及び/又はその1つのアイソフォーム及び/若しくはその1つの変形体の循環性細胞外ドメインの濃度をインビトロ測定する工程、
b.工程a.で得られた濃度を健常哺乳動物でインビトロで得られた濃度と比較する工程、、
c.工程a.で得られた濃度が工程b.の濃度より低いとき、哺乳動物はインスリン抵抗性を有しているという事実を、工程b.から推論する工程。
図1Aは、抗体4G6の濃度の関数として、IRAPタンパク質(■)又はIRAP His(◆)の検出を測定したグラフを示す。
図1Bは、抗体14H4の濃度の関数として、IRAPタンパク質(▲)又はIRAP His(X)の検出を測定したグラフを示す。
図1Dは、抗体38E1の濃度の関数として、IRAPタンパク質(+)又はIRAP His(−)の検出を測定したグラフを示す。
図1Eは、抗体40C10の濃度の関数として、IRAPタンパク質(◆)又はIRAP His(--)の検出を測定したグラフを示す。
実施例1:IRAPタンパク質の製造
1.クローニング:
昆虫ペプチドシグナル及びTEVプロテアーゼで切断可能なN末端6ヒスチジンタグに融合したIRAPの細胞外ドメインをコードする配列を含有する発現ベクターを構築し、Swiss-Protデータベース(Q9UIQ6)中の配列(pGTPb302-mel-His-Tev-PLAPextra, reference C640-CAP-06)との一致を配列決定により検証した。
組換えバクミド(bacmid)を製造し、作製したバクミド中での発現カセットの存在をPCRによりチェックした。
ウイルス増幅後、第2世代ウイルスをアッセイし、昆虫/バキュロウイルス細胞系における一連の発現試験に使用した。
− 第1の方法:適切なE. coli株によりIRAPタンパク質又はその1つのアイソフォームを発現。次いで、分泌されたIRAPタンパク質又はその1つのアイソフォームをNi++又はCo++マトリクス上でのアフィニティーにより精製する。
最後に、ポリ-His配列を、特異的プロテアーゼを用いて切断する。
次いで、分泌されたIRAPタンパク質又はその1つのアイソフォーム若しくはその1つの変形体を、Ni++又はCo++マトリクス上でのアフィニティーにより精製する。最後に、ポリ-His配列を、特異的プロテアーゼを用いて切断する。
一般的ポイント
プロトコルはハイブリドーマ技術(Kohler and Milstein protocol, 1976)に由来し、5つの工程に分割される:
- 工程1− 免疫:IRAPのアイソフォーム又はその1つの変形体の細胞外部分に共通する特異配列に対応する幾つかのペプチドをマウスへ皮下注射。これらペプチド配列は、哺乳動物の他のアミノペプチダーゼ中には見出されない。
精製組換えIRAPタンパク質又はその1つのアイソフォームに対して抗血清をELISAにより試験する。応答するマウスの脾臓をハイブリドーマの作製に使用する。次いで、ハイブリドーマにより産生された抗体を、IRAPタンパク質又はその1つのアイソフォーム並びに妊娠及び非妊娠女性の血清に対してELISAにより再試験する。
− 工程4− クローニング及び特徴付け:細胞クローンを得るために抗体産生ハイブリッド細胞を継代培養。液体窒素中で各クローンのコピーを保存。作製された抗体をイソタイプ決定。
o 細胞をインビトロ培養(培養培地中で抗体を産生)
o マウス腹腔内への細胞の注射によるインビボ培養。これにより、注射域での腫瘍、炎症及び腹水産生の出現が引き起こされる。抗体を含有する腹水を採取(1〜10mg/mL)。
1− 免疫
6匹の雌性OF1 Charles Riverマウス(18〜20g)に、配列番号7〜11のペプチドの混合物を、静脈内及び皮下注射により免疫した。5つのペプチドは、フロイント完全アジュバントの存在下で、KLH(キーホールリンペットヘモシアニン)にカップリングさせた。3匹のマウス(マウス1〜3)には50μgのペプチド混合物を注射し、2匹のマウス(マウス4及び5)には15μgのペプチド混合物を注射した。
第1の注射の3週間後、マウスに、フロイント不完全アジュバントの存在下に2つのペプチドの混合物を再注射した(第1の追加免疫)。
第2の注射の3週間後、マウスに、フロイント不完全アジュバントの存在下に2つのペプチドの混合物を再注射した(第2の追加免疫)。
全てのマウスの血清が、少なくとも1つのペプチドを認識する抗体を有していた。よって全ての血清を保存した。
血清試験の10日後、3匹のマウスに、20μgのペプチド混合物を、腹腔内及び静脈内に追加免疫した。追加免疫の3日後に、脾臓を取り出した。
血清試験の1ヵ月後、残る3匹のマウスに、15μgのペプチド混合物を、腹腔内及び静脈内に追加免疫した。追加免疫の3日後に、脾臓を取り出した。
マウスを放血させ、DMEMで滅菌様式に脾臓を取り出した。脾臓を破砕し、グリッドを通して濾過した。
並行して、マウスの腹腔をDMEMで洗浄し、マクロファージを含むDMEMを回収した。マクロファージをMalassez cell中で計数し、以下の培地中に104マクロファージ/mlの溶液を調製した:DMEM HAT 20% FCS ATB (DMEM、4mMグルタミン、HAT(ヒポキサンチン100μM、アミノプテリン0.4μM、チミジン16μM)、20%補体除去胎仔ウシ血清、1%抗生物質(ペニシリン/ストレプトマイシン))。
並行して、BalB/c Sp2/O Ag14マウスのミエローマ細胞(ATCC No. CRL 1581)をDMEM中で3回洗浄する。
脾臓細胞及びミエローマ細胞を5/1の脾臓細胞/ミエローマ比で混合し、244gで7分間遠心分離した。
上清を取り出し、1mlのPEG(37℃に加温した、ポリエチレングリコール(MW1500)の40%溶液)を添加した。
細胞を1200rpm(244g)で7分間遠心分離し、上清を取り出し、容量vのDMEM HAT 20% FCS培地を加え、
v(ml) = 脾臓細胞の数/107(すなわち107細胞/ml)
となるようにペレット化した。試験管を周囲温度にて1時間放置した後、注意深く倒置して細胞を再懸濁させた。
希釈率1/10:105脾臓細胞/ウェルで3プレート
希釈率1/20:5×104脾臓細胞/ウェルで5プレート(2×50ml)
希釈率1/40:2.5×104脾臓細胞/ウェルで2プレート
プレートを37℃、5% CO2のオーブン中に10日間置いた。
10日間の融合産物の培養後、2つの選択試験を行う:
− 試験1:細胞がコンフルエンスに達したウェルを分析する:
− 最初の3匹のマウスの脾臓細胞を起源とする融合物については、1017ウェルを分析し、
− 最後の3匹のマウスの脾臓細胞を起源とする融合物については、714ウェルを分析した。
これらウェルの各々から100μlの上清を取り出し、ELISA試験を用いて上清を試験し、配列番号7〜11の1以上のペプチドに対する抗体を検出した(抗-IRAPハイブリドーマの上清のスクリーニングを参照)。
細胞が増殖し始めたら(24〜48時間)、1mlの培地:15% DMEM HAT FCS 1% HCF ATB(DMEM、4mMグルタミン、HAT(ヒポキサンチン100μM、アミノプテリン0.4μM、チミジン16μM)、15%補体除去胎仔ウシ血清、1% HCF(ハイブリドーマクローニングファクターマクロファージ-様起源)、1%抗生物質(ペニシリン/ストレプトマイシン))を添加した。
111クローンを同様に選択して凍結させた
− 最初の3匹のマウスの脾臓細胞を起源とする融合物については、24-ウェルプレートの39ウェルを分析し、
− 最後の3匹のマウスの脾臓細胞を起源とする融合物については、24-ウェルプレートの72ウェルを分析した。
23クローンを同様に選択して凍結させた。
使用した抗原(Ag):KLH-ペプチド 配列番号7〜11(第1のスクリーニング)及びHigh Five昆虫細胞で発現した組換えIRAPの分泌ドメイン(第2のスクリーニング)。
抗体のイソタイプを、SouthernBiotech SBA Clonotyping System/HRPキット(Cliniscience, Montrouge, France)を用いて下記のように決定した:
マウス抗-免疫グロブリン抗体を5μg/mlの濃度に希釈する。ウェルあたり50μlを堆積させ、37℃で1時間又は周囲温度で16時間インキュベートする。
2.洗浄
200μl/ウェルのPBS-Tween20 0.05%(v/v)で1回リンスする。
3.ブロッキング
各ウェルに150μlのPBS-乳2.5%(w/v)を加え、37℃で1時間インキュベートする。
4.洗浄
PBS-Tween20 0.05%(v/v)緩衝液で1回リンスする。
5.試験する抗体サンプルの準備
ハイブリドーマ培養上清をPBS-Tween20 0.05%(v/v)-BSA 0.5%(w/v)で1/10に希釈する。ウェルあたり50μlを堆積させ、周囲温度で2時間インキュベートする。
PBS-Tween20 0.05%(v/v)緩衝液で3回リンスする。
7.二次抗体
50μl/ウェルのペルオキシダーゼ(HRP)に接合した抗-マウスIgA、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3又はIgM抗体(PBS-Tween20 0.05%(v/v)-BSA 0.5%(w/v)で1/2000に希釈)を堆積し、周囲温度で1時間インキュベートする。
8.洗浄
PBS-Tween20 0.05%(v/v)緩衝液で3回リンスする。
9.基質との反応
50μl/ウェルのテトラメチルベンジジン(KPL, Inc.)を堆積させ、プレートを周囲温度で10分間インキュベートする。
10.反応の停止
50μlのH2SO4を各ウェルに加え、450nmでの吸光度をマイクロプレートリーダー(Dynex)で読み取る。
図1A〜Eに示されるように、配列番号7〜11のペプチドの1つ及び組換えIRAPの分泌ドメインに関して優秀なアフィニティーのために、5つのハイブリドーマを保存した:17H10、14A4、4G6、38E1、40C10。
1mg/mLのIRAP又は2mg/mLの6Hisタグを付したIRAPを固相化したプレート上で、抗体17H10、14A4、4G6、38E1、40C10の各々をELISAにより試験した。抗体をプレート中でインキュベートし、モノクローナル抗体の定常部分を認識するペルオキシダーゼ(HRP)カップリング二次抗体を用いて検出を可視化した。標識IRAP-モノクローナル抗体-抗体免疫複合体を、TMB(3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン)、ペルオキシダーゼ色素原基質(この色は、過酸化水素の存在下で青色に変わり、硫酸の存在下(反応の停止)で黄色になる)を用いて可視化する。この反応は、450nmでの検出により定量化することができる。
クローンを貯蔵し、96-ウェルプレートにおいて平均でウェルあたり10、5、3、1又は5細胞を含有する限界希釈物を作製することによりクローニングした。
クローニング産物を以下の培地DMEM HT FCS 15% HCF 1% ATB (2)中で凍結させた:10% DMSO(ジメチルスルホキシド)を備えた、DMEM、4mMグルタミン、HAT(ヒポキサンチン100μM、チミジン16μM)、15%補体除去胎仔ウシ血清、1% HEF(ハイブリドーマ増強サプリメント)、1%抗生物質(ペニシリン/ストレプトマイシン)。
血清又は血漿中で探索されるIRAPタンパク質及び/又はその1つのアイソフォームを、マルチ-ウェルプレート上に吸着させた特異抗体に結合させる。次いで、結合したIRAPタンパク質及びそのアイソフォーム(その1以上の変形体でさえ)を可視化し、20mMのL-メチオニンの存在下でL-ロイシン-パラニトロアニリドを基質として使用して酵素活性を測定することによって定量化する。定量化により、可能性のある他のアミノペプチダーゼによる夾雑物との交差反応を回避することができる(Yamahara, N., Nomura, S., Suzuki, T., Itakura, A., Ito, M., Okamoto, T., Tsujimoto, M., Nakazato, H.及びMizutani, S. (2000) Life Sci 66(15), 1401-1410)。
しかしながら、この高い検出閾値は、血清中のIRAPの検出には然程適合しない。
また、非常に特異的なモノクローナル抗体を使用してIRAPを精製することは、検出限界を低下させるために不可欠である。
モノクローナル抗体の効力を確証するために、抗体17H10及び4G6を用いてサンドイッチELISAを行った。
結果を図2に示す。
この使用条件下で、抗体17H10-4G6-抗IgG2a/HRPの組合せにより、IRAPタンパク質の分泌ドメインを濃度0.1μg/mlまで検出することが可能になる。
この組合せは、試験した希釈率では、これら血漿中でのIRAPの検出を可能にしない。第4のアルカリホスファターゼ接合抗-HRP抗体の使用により、感度を1ng/mlまで増大させることができる。
アビジン-ビオチン免疫ペルオキシダーゼ技術を用いて免疫組織化学的アッセイを行った。事前に採取したヒト組織の4μm厚切片を作製し、ストレプトアビジン/ビオチン/ペルオキシダーゼ法を用いて染色した。
パラフィンを除去した切片を0.01Mクエン酸緩衝液に入れ、マイクロ波オーブン中で90℃にて750Wで各回5分間3回処理した。
次いで、切片を過酸化水素中で20分間インキュベートした後、二次抗体の動物宿主の10%血清と10分間インキュベートして、内因性ペルオキシダーゼ活性及び非特異的免疫グロブリンへの結合をブロックした。
抗体の結合を、ビオチン化マウス抗-Ig抗体に続く西洋ワサビペルオキシダーゼ接合ストレプトアビジンにより可視化した。
切片を3-アミノ-9-エチルカルバゾールに浸漬させることにより色素原発色を行った。
マイアーのヘマトキシリン対比染色により写真を分析した。
化学療法抵抗性はIRAPの過剰発現の結果である。したがって、これは、実施例3若しくは4に従って又はRIA若しくはIRMAによりアッセイすることができる。
IRAPの濃度は妊娠中に増加する。したがって、これは、実施例3若しくは4に従って又はRIA若しくはIRMAによりアッセイしたIRAPの循環濃度が低下した場合、予想することができる。
本発明の抗体の特異性を確証するために、IRAP-抗体相互作用の測定を、希釈血清又は未希釈血清の存在下に行った。
抗体-IRAP相互作用は、組換えIRAP濃度の関数又は男性若しくは妊娠女性の1/100希釈血清中で希釈した組換えIRAPの関数として、抗体17H10及び40C10を使用するELISAサンドイッチにより測定した。
結果を図3に示す。
これら結果は、IRAPが希釈血清中0.1μg/mLの濃度で検出可能であり、血清中に含まれる他のアミノペプチダーゼとの干渉がないことを示している。
これら結果は、モノクローナル抗体がIRAPに非常に特異的であることを示している。
Claims (22)
- IRAPタンパク質(「インスリン応答性アミノペプチダーゼ」)の細胞外ドメインの、哺乳動物の血清、血漿又は組織における分泌されたIRAPタンパク質細胞外ドメインの濃度のインビトロアッセイ法を実施するための使用であって、該インビトロアッセイが、配列番号7〜11の配列により規定されるIRAPタンパク質の循環性細胞外ドメイン及び/又はその1つのアイソフォーム及び/又はその1つの変形体を特異的に認識するモノクローナル抗体を用いて実施される、使用。
- 前記哺乳動物がヒトである、請求項1に記載のIRAPタンパク質及び/又はそのアイソフォーム及び/又はその変形体の細胞外ドメインの使用。
- GLUT4グルコース輸送体又は関連タンパク質の転位欠損に関連する病状のインビトロ診断及び/若しくは予後又はインビトロモニタリングを補助するデータを取得するための、請求項1又は2に記載のIRAPタンパク質及び/又はそのアイソフォーム及び/又はその変形体の細胞外ドメインの使用。
- 健常個体と比ベて患者におけるIRAP及び/又はそのアイソフォーム及び/又はその変形体の原形質膜での過剰発現及び/又はその原形質膜への転位の増加に関連する病状のインビトロ診断及び/又は予後或いは健常個体と比べて患者におけるIRAP及び/又はそのアイソフォーム及び/又はその変形体の原形質膜での過剰発現及び/又はその原形質膜への転位の増加に関連する病状のインビトロモニタリングを補助するデータを取得するための、請求項3に記載のIRAPタンパク質及び/又はそのアイソフォーム及び/又はその変形体の細胞外ドメインの使用。
- 健常個体と比ベて患者におけるIRAP及び/又はそのアイソフォーム及び/又はその変形体の原形質膜での過少発現及び/又はその原形質膜への転位の減少に関連する病状のインビトロ診断及び/又は予後或いは健常個体と比ベて患者におけるIRAP及び/又はそのアイソフォーム及び/又はその変形体の原形質膜での過少発現及び/又はその原形質膜への転位の減少に関連する病状のインビトロモニタリングを補助するデータを取得するための、請求項3に記載のIRAPタンパク質及び/又はそのアイソフォーム及び/又はその変形体の細胞外ドメインの使用。
- 抗癌剤に対する化学療法抵抗性のインビトロ診断及び/又は予後を補助するデータを取得するための、請求項3に記載のIRAPタンパク質の細胞外ドメインの使用。
- 病状がインスリン抵抗性、2型糖尿病、妊娠糖尿病、妊娠誘発性高血圧(子癇前症)及び早期分娩のリスクに関連する病状からのものである、請求項1〜3及び5のいずれか1項に記載のIRAPタンパク質及び/又はそのアイソフォーム及び/又はその変形体の細胞外ドメインの使用。
- 病状が、卵巣腺癌、子宮内膜癌、絨毛上皮腫、膵臓癌、乳癌、前立腺癌、胃癌、直腸癌若しくは頭頸部癌のようなIRAP及び/又はそのアイソフォーム及び/又はその変形体が過剰発現し及び/又はそれらの膜への転位が増加する増殖性疾患、自己免疫疾患又は炎症性疾患である、請求項1〜4のいずれか1項に記載のIRAPタンパク質及び/又はそのアイソフォーム及び/又はその変形体の細胞外ドメインの使用。
- 前記モノクローナル抗体がハイブリドーマにより産生される、請求項1〜8に記載のIRAPタンパク質及び/又はそのアイソフォーム及び/又はその変形体の細胞外ドメインの使用。
- IRAP(インスリン応答性アミノペプチダーゼ)タンパク質及び/又はその1つのアイソフォームの及び/又はその1つの変形体の循環性細胞外ドメイン又は細胞外ドメインのエピトープの1つを特異的に認識するモノクローナル抗体であって、前記細胞外ドメインが配列番号7〜11の配列により規定される抗体。
- 医薬として使用するため、卵巣腺癌、子宮内膜癌、絨毛上皮腫、膵臓癌、乳癌、前立腺癌、胃癌、直腸癌若しくは頭頸部癌のようなIRAP及び/又はそのアイソフォーム及び/又はその変形体が過剰発現し及び/又はそれらの膜への転位が増加する癌、自己免疫疾患又は炎症性疾患の治療のため或いは化学療法への抵抗性の処置のための請求項10に記載のモノクローナル抗体。
- 以下:
− CNCM(Collection Nationale de Culture de Microorganismes, Institut Pasteur, Paris, France)に2009年7月2日、アクセッション番号CNCM I-4181で寄託されたハイブリドーマにより分泌されるモノクローナル抗体、
− CNCMに2009年7月2日、アクセッション番号CNCM I-4182で寄託されたハイブリドーマにより分泌されるモノクローナル抗体、
− CNCMに2009年7月2日、アクセッション番号CNCM I-4183で寄託されたハイブリドーマにより分泌されるモノクローナル抗体、
− CNCMに2009年7月2日、アクセッション番号CNCM I-4184で寄託されたハイブリドーマにより分泌されるモノクローナル抗体、及び
− CNCMに2009年7月2日、アクセッション番号CNCM I-4185で寄託されたハイブリドーマにより分泌されるモノクローナル抗体
から選択される請求項10又は11に記載のモノクローナル抗体。 - 放射性核種、蛍光体、量子ドット、酵素標識、酵素基質、酵素補助因子、酵素阻害剤又はハプテンから選択される化合物で標識されている、請求項10〜12に記載のモノクローナル抗体。
- ヒト化抗体である、請求項10〜13のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体。
- 請求項10〜14に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
- a.CNCMに2009年7月2日、アクセッション番号CNCM I-4181で寄託されたハイブリドーマ、
b.CNCMに2009年7月2日、アクセッション番号CNCM I-4182で寄託されたハイブリドーマ、
c.CNCMに2009年7月2日、アクセッション番号CNCM I-4183で寄託されたハイブリドーマ、
d.CNCMに2009年7月2日、アクセッション番号CNCM I-4184で寄託されたハイブリドーマ、及び
e.CNCMに2009年7月2日、アクセッション番号CNCM I-4185で寄託されたハイブリドーマ
から選択される請求項15に記載のハイブリドーマ。 - 哺乳動物の血清、血漿、赤血球又は組織においてIRAPタンパク質及び/又はその1つのアイソフォーム及び/又はその1つの変形体の細胞外ドメインの濃度を測定する工程を含んでなる、哺乳動物におけるIRAPタンパク質及び/又はその1つのアイソフォーム及び/又はその1つの変形体の濃度のインビトロアッセイ法。
- 酵素抗体法若しくは免疫組織化学法、又はRIA若しくはIRMAにより実施される、請求項17に記載のアッセイ法。
- 以下:
a.請求項10又は12〜14のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体を使用して、哺乳動物においてIRAPタンパク質及び/又はその1つのアイソフォーム及び/又はその1つの変形体の循環性細胞外ドメインの濃度をインビトロ測定する工程、
b.工程a.で得られた濃度を健常哺乳動物でインビトロで得られた濃度と比較する工程、
を含んでなる、インスリン抵抗性、2型糖尿病、妊娠糖尿病、妊娠誘発性高血圧(子癇前症)及び早期分娩のリスクに関連する病状のインビトロ診断を補助するデータの取得法。 - 以下:
a.請求項10又は12〜14のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体を使用して、哺乳動物においてIRAPタンパク質及び/又はそのアイソフォーム及び/又はその変形体の循環性細胞外ドメインの濃度をインビトロ測定する工程、
b.工程a.で得られた濃度をコントロール哺乳動物でインビトロで得られた濃度と比較する工程、
を含んでなる、卵巣腺癌のようなIRAP及び/又はその1つのアイソフォーム及び/又はその1つの変形体が過剰発現し又はそれらの膜への転位が増加する癌、自己免疫疾患又は炎症性疾患に関連する病状或いは化学療法への抵抗性のインビトロ診断を補助するデータの取得法。 - 少なくとも1つの緩衝液及び少なくとも1つの請求項10又は12〜14のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体を含んでなる、哺乳動物においてIRAPタンパク質及び/又はそのアイソフォーム及び/又はその変形体の1つの循環性細胞外ドメインの濃度をインビトロ測定するためのキット。
- IRAPタンパク質の基質及び前記モノクローナル抗体により認識されるペプチドも含んでなる請求項21に記載のキット。
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