JP4993065B2 - 肝細胞癌の診断方法 - Google Patents
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Description
(1)ヒトα2,6シアル酸転移酵素を認識する抗体、及びそれを用いたヒトα2,6シアル酸転移酵素の検出方法
本発明によるヒトα2,6シアル酸転移酵素の検出方法は、ヒトα2,6シアル酸転移酵素のアミノ酸配列中のSer-Ser-Ala-Gly-Ser-Leu-Lys-Ser-Ser-Gln-Leu-Gly-Arg-Glu-Ile(配列番号1)、又はAsn-Ser-Gln-Leu-Val-Thr-Thr-Glu-Lys-Arg-Phe-Leu-Lys-Asp-Ser-Leu(配列番号2)で表されるアミノ酸配列を認識することができる抗体と、ヒトα2,6シアル酸転移酵素のアミノ酸配列中のCys-Asp-Gln-Val-Asp-Ile-Tyr-Glu-Phe-Leu-Pro-Ser-Lys-Arg-Lys-Thr-Asp-Val(配列番号3)で表されるアミノ酸配列を認識することができる抗体とを組み合わせて用いてサンドイッチ酵素免疫測定(ELISA)法を行うことを特徴とする方法である。
本発明による肝細胞癌の診断方法は、ヒト由来の試料に含まれるヒトα2,6シアル酸転移酵素を検出又は測定することを特徴とする方法である。本発明の方法により、ヒトα2,6シアル酸転移酵素を検出又は測定することにより、肝細胞癌の診断(発症危険度の予測などを含む)を行うことができる。
さらに本発明は、ヒトα2,6シアル酸転移酵素のアミノ酸配列中のSer-Ser-Ala-Gly-Ser-Leu-Lys-Ser-Ser-Gln-Leu-Gly-Arg-Glu-Ile(配列番号1)、又はAsn-Ser-Gln-Leu-Val-Thr-Thr-Glu-Lys-Arg-Phe-Leu-Lys-Asp-Ser-Leu(配列番号2)で表されるアミノ酸配列を認識することができる抗体と、ヒトα2,6シアル酸転移酵素のアミノ酸配列中のCys-Asp-Gln-Val-Asp-Ile-Tyr-Glu-Phe-Leu-Pro-Ser-Lys-Arg-Lys-Thr-Asp-Val(配列番号3)で表されるアミノ酸配列を認識することができる抗体とを少なくとも含む、肝細胞癌の診断キットにも関する。本発明の診断キットを用いることにより、ヒト由来の試料に含まれるヒトα2,6シアル酸転移酵素を検出又は測定することができ、これにより肝細胞癌を診断することができる。
DMEM及びLipofectin等の組織培養培地及び試薬はInvitrogenから購入した。DNA精製用カラムはQiagenから得た。タンパク質分子量標準はBio-Radから購入した。
抗原合成ペプチドとしては、Ser-Ser-Ala-Gly-Ser-Leu-Lys-Ser-Ser-Gln-Leu-Gly-Arg-Glu-Ile(配列番号1)、Asn-Ser-Gln-Leu-Val-Thr-Thr-Glu-Lys-Arg-Phe-Leu-Lys-Asp-Ser-Leu(配列番号2)、及びCys-Asp-Gln-Val-Asp-Ile-Tyr-Glu-Phe-Leu-Pro-Ser-Lys-Arg-Lys-Thr-Asp-Val(配列番号3)で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを使用した。それぞれの抗原合成ペプチドをマレイミド法でウシ血清サイログロブリンに結合する。この抗原(100 micro gram)をFreund complete adjuvantと混合してウサギの皮下および皮内に免疫する。追加免疫のために抗原(100micro gram)をFreund incomplete adjuvantとともに2週ごとに8回皮下および皮内に接種する。得られた抗血清を抗原アフィニティカラムで精製する。アフィニティーカラムは抗原ペプチドをActivated Thiol Sepharose4Bゲルに結合したものである。D-PBSバッファーで吸着後、0.2Mグリシンバッファー(pH2.5)で溶出する。これよって特異性の高いポリクローナル抗体を得た。
一過性トランスフェクション実験のために、ヒト、ラット、マウスST6Gal I-pSVL及びST6Gal I FLAG-pSVLを既報の通り構築した(Kitazume-Kawaguchi,他、(1999) Glycobiology 9, 1397-1406)。
沈降させたM2アガロースゲルをLaemmli緩衝液中にとり、4〜20%勾配SDS/PAGEに付し、ニトロセルロース膜に移した。ブロットした膜をそれぞれの精製ポリクローナル抗体(1:500)と一緒にインキュベートし、適当な2次抗体、HRP標識抗ウサギIgG(Cappel)とインキュベートし、化学発光基質(Pierce)を用いて可視化した。図2に示されるようにこれらの抗体は可溶性分泌型シアル酸転移酵素に対して高い反応性を示した。
M2抗体とSTC抗体を用いてサンドイッチELISA法を開発した。ELISA用のプレートにあらかじめSTC抗体(2 micro gram/ウェル)を固相化しておき、血清(10〜20 micro liter)を加えて37度で1時間インキュベーションすることによりシアル酸転移酵素を選択的にトラップする。phosphate buffered saline (PBS)などの洗浄液で7回洗浄する。horse radish peroxidate(HRP)でラベル化したM2抗体のFab フラグメントとともに4度で30分間インキュベーションする。(ラベル化Fabフラグメントはマレイミド法でHRPと結合しゲル濾過法にて精製した。)洗浄液で9回洗浄した後にHRPの発色基質(TMB: Tetra Methyl Benzidineなど)を加えて発色させたのち、1規定硫酸で反応を停止する。発色度を吸光光度計を用いて測定する。既知の濃度のα2,6シアル酸転移酵素含む標準試料によってあらかじめ検量線を作製しておき、これによって定量値を算出する(図3)。ラット血清中のα2,6シアル酸転移酵素(βセクレターゼ産物)を定量する類似の方法は既報である(特開2003-334071号公報)。しかし、ヒトとラットでは切断部位近傍のアミノ酸配列が異なるために従来の方法ではヒト試料の定量は困難であった。今回の方法によりはじめてヒト血清中のα2,6シアル酸転移酵素量を正確に測定することが可能となった。従来も酵素の活性量を指標としてα2,6シアル酸転移酵素量を推測する方法は存在したが、この方法では酵素活性を失った転移酵素の存在を検出することができない。また、活性測定のためには放射性アイソトープでラベルされた糖供与体(CMP-シアル酸)を用いた煩雑な実験操作が必要であり、スクリーニング方法として利用するのは困難である。さらに、血清中には同じ糖供与体(CMP-シアル酸)を基質とするα2,3シアル酸転移酵素が存在し、α2,6シアル酸転移酵素の活性との区別には複雑な実験操作が必要である。すなわち、本発明によって血清α2,6シアル酸転移酵素のタンパク質量を簡便に測定することが可能となり、肝細胞癌の新たなスクリーニング法が開発された。
STC抗体とHRP-ラベル化M2 Fab フラグメントを用いた実施例(測定例)を示す(図4)。正常コントロールに比べて肝硬変患者で若干の増加が認められるが、有意差は認められない。一方、肝細胞癌発症例では有意に増加することがしめされた(p = 0.013)。
SEQUENCE LISTING
<110> RIKEN
<120> A method for diagnosing hepatocellular carcinoma
<130> A61401A
<160> 6
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> human
<400> 1
Ser Ser Ala Gly Ser Leu Lys Ser Ser Gln Leu Gly Arg Glu Ile
1 5 10 15
<210> 2
<211> 16
<212> PRT
<213> human
<400> 2
Asn Ser Gln Leu Val Thr Thr Glu Lys Arg Phe Leu Lys Asp Ser Leu
1 5 10 15
<210> 3
<211> 18
<212> PRT
<213> human
<400> 3
Cys Asp Gln Val Asp Ile Tyr Glu Phe Leu Pro Ser Lys Arg Lys Thr
1 5 10 15
Asp Val
<210> 4
<211> 406
<212> PRT
<213> human
<400> 4
Met Ile His Thr Asn Leu Lys Lys Lys Phe Ser Cys Cys Val Leu Val
1 5 10 15
Phe Leu Leu Phe Ala Val Ile Cys Val Trp Lys Glu Lys Lys Lys Gly
20 25 30
Ser Tyr Tyr Asp Ser Phe Lys Leu Gln Thr Lys Glu Phe Gln Val Leu
35 40 45
Lys Ser Leu Gly Lys Leu Ala Met Gly Ser Asp Ser Gln Ser Val Ser
50 55 60
Ser Ser Ser Thr Gln Asp Pro His Arg Gly Arg Gln Thr Leu Gly Ser
65 70 75 80
Leu Arg Gly Leu Ala Lys Ala Lys Pro Glu Ala Ser Phe Gln Val Trp
85 90 95
Asn Lys Asp Ser Ser Ser Lys Asn Leu Ile Pro Arg Leu Gln Lys Ile
100 105 110
Trp Lys Asn Tyr Leu Ser Met Asn Lys Tyr Lys Val Ser Tyr Lys Gly
115 120 125
Pro Gly Pro Gly Ile Lys Phe Ser Ala Glu Ala Leu Arg Cys His Leu
130 135 140
Arg Asp His Val Asn Val Ser Met Val Glu Val Thr Asp Phe Pro Phe
145 150 155 160
Asn Thr Ser Glu Trp Glu Gly Tyr Leu Pro Lys Glu Ser Ile Arg Thr
165 170 175
Lys Ala Gly Pro Trp Gly Arg Cys Ala Val Val Ser Ser Ala Gly Ser
180 185 190
Leu Lys Ser Ser Gln Leu Gly Arg Glu Ile Asp Asp His Asp Ala Val
195 200 205
Leu Arg Phe Asn Gly Ala Pro Thr Ala Asn Phe Gln Gln Asp Val Gly
210 215 220
Thr Lys Thr Thr Ile Arg Leu Met Asn Ser Gln Leu Val Thr Thr Glu
225 230 235 240
Lys Arg Phe Leu Lys Asp Ser Leu Tyr Asn Glu Gly Ile Leu Ile Val
245 250 255
Trp Asp Pro Ser Val Tyr His Ser Asp Ile Pro Lys Trp Tyr Gln Asn
260 265 270
Pro Asp Tyr Asn Phe Phe Asn Asn Tyr Lys Thr Tyr Arg Lys Leu His
275 280 285
Pro Asn Gln Pro Phe Tyr Ile Leu Lys Pro Gln Met Pro Trp Glu Leu
290 295 300
Trp Asp Ile Leu Gln Glu Ile Ser Pro Glu Glu Ile Gln Pro Asn Pro
305 310 315 320
Pro Ser Ser Gly Met Leu Gly Ile Ile Ile Met Met Thr Leu Cys Asp
325 330 335
Gln Val Asp Ile Tyr Glu Phe Leu Pro Ser Lys Arg Lys Thr Asp Val
340 345 350
Cys Tyr Tyr Tyr Gln Lys Phe Phe Asp Ser Ala Cys Thr Met Gly Ala
355 360 365
Tyr His Pro Leu Leu Tyr Glu Lys Asn Leu Val Lys His Leu Asn Gln
370 375 380
Gly Thr Asp Glu Asp Ile Tyr Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Pro Gly
385 390 395 400
Phe Arg Thr Ile His Cys
405
<210> 5
<211> 403
<212> PRT
<213> rat
<400> 5
Met Ile His Thr Asn Leu Lys Lys Lys Phe Ser Leu Phe Ile Leu Val
1 5 10 15
Phe Leu Leu Phe Ala Val Ile Cys Val Trp Lys Lys Gly Ser Asp Tyr
20 25 30
Glu Ala Leu Thr Leu Gln Ala Lys Glu Phe Gln Met Pro Lys Ser Gln
35 40 45
Glu Lys Val Ala Met Gly Ser Ala Ser Gln Val Val Phe Ser Asn Ser
50 55 60
Lys Gln Asp Pro Lys Glu Asp Ile Pro Ile Leu Ser Tyr His Arg Val
65 70 75 80
Thr Ala Lys Val Lys Pro Gln Pro Ser Phe Gln Val Trp Asp Lys Asp
85 90 95
Ser Thr Tyr Ser Lys Leu Asn Pro Arg Leu Leu Lys Ile Trp Arg Asn
100 105 110
Tyr Leu Asn Met Asn Lys Tyr Lys Val Ser Tyr Lys Gly Pro Gly Pro
115 120 125
Gly Val Lys Phe Ser Val Glu Ala Leu Arg Cys His Leu Arg Asp His
130 135 140
Val Asn Val Ser Met Ile Glu Ala Thr Asp Phe Pro Phe Asn Thr Thr
145 150 155 160
Glu Trp Glu Gly Tyr Leu Pro Lys Glu Asn Phe Arg Thr Lys Val Gly
165 170 175
Pro Trp Gln Arg Cys Ala Val Val Ser Ser Ala Gly Ser Leu Lys Asn
180 185 190
Ser Gln Leu Gly Arg Glu Ile Asp Asn His Asp Ala Val Leu Arg Phe
195 200 205
Asn Gly Ala Pro Thr Asp Asn Phe Gln Gln Asp Val Gly Ser Lys Thr
210 215 220
Thr Ile Arg Leu Met Asn Ser Gln Leu Val Thr Thr Glu Lys Arg Phe
225 230 235 240
Leu Lys Asp Ser Leu Tyr Thr Glu Gly Ile Leu Ile Val Trp Asp Pro
245 250 255
Ser Val Tyr His Ala Asp Ile Pro Lys Trp Tyr Gln Lys Pro Asp Tyr
260 265 270
Asn Phe Phe Glu Thr Tyr Lys Ser Tyr Arg Arg Leu Asn Pro Ser Gln
275 280 285
Pro Phe Tyr Ile Leu Lys Pro Gln Met Pro Trp Glu Leu Trp Asp Ile
290 295 300
Ile Gln Glu Ile Ser Ala Asp Leu Ile Gln Pro Asn Pro Pro Ser Ser
305 310 315 320
Gly Met Leu Gly Ile Ile Ile Met Met Thr Leu Cys Asp Gln Val Asp
325 330 335
Ile Tyr Glu Phe Leu Pro Ser Lys Arg Lys Thr Asp Val Cys Tyr Tyr
340 345 350
His Gln Lys Phe Phe Asp Ser Ala Cys Thr Met Gly Ala Tyr Asp Pro
355 360 365
Leu Leu Phe Glu Lys Asn Met Val Lys His Leu Asn Glu Gly Thr Asp
370 375 380
Glu Asp Ile Tyr Leu Phe Gly Lys Ala Thr Leu Ser Gly Phe Arg Asn
385 390 395 400
Ile Arg Cys
<210> 6
<211> 403
<212> PRT
<213> mouse
<400> 6
Met Ile His Thr Asn Leu Lys Arg Lys Phe Ser Cys Phe Val Leu Val
1 5 10 15
Phe Leu Leu Phe Ala Ile Ile Cys Val Trp Lys Lys Gly Ser Asp Tyr
20 25 30
Glu Ala Leu Thr Leu Gln Ala Lys Val Phe Gln Met Pro Lys Ser Gln
35 40 45
Glu Lys Val Ala Val Gly Pro Ala Pro Gln Ala Val Phe Ser Asn Ser
50 55 60
Lys Gln Asp Pro Lys Glu Gly Val Gln Ile Leu Ser Tyr Pro Arg Val
65 70 75 80
Thr Ala Lys Val Lys Pro Gln Pro Ser Leu Gln Val Trp Asp Lys Asp
85 90 95
Ser Thr Tyr Ser Lys Leu Asn Pro Arg Leu Leu Lys Ile Trp Arg Asn
100 105 110
Tyr Leu Asn Met Asn Lys Tyr Lys Val Ser Tyr Lys Gly Pro Gly Pro
115 120 125
Gly Val Arg Phe Ser Val Glu Gly Leu Arg Cys His Leu Arg Asp His
130 135 140
Val Asn Val Ser Met Ile Glu Ala Thr Asp Ser Pro Phe Asn Thr Thr
145 150 155 160
Glu Trp Glu Gly Tyr Leu Pro Lys Glu Thr Phe Arg Thr Lys Ala Gly
165 170 175
Pro Cys Thr Lys Cys Ala Val Val Ser Ser Ala Gly Ser Leu Lys Asn
180 185 190
Ser Gln Leu Gly Arg Glu Ile Asp Asn His Asp Ala Val Leu Arg Phe
195 200 205
Asn Gly Ala Pro Thr Asp Asn Phe Gln Gln Asp Val Gly Thr Lys Thr
210 215 220
Thr Ile Arg Leu Val Asn Ser Gln Leu Val Thr Thr Glu Lys Arg Phe
225 230 235 240
Leu Lys Asp Ser Leu Tyr Thr Glu Gly Ile Leu Ile Leu Trp Asp Pro
245 250 255
Ser Val Tyr His Ala Asp Ile Pro Gln Trp Tyr Gln Lys Pro Asp Tyr
260 265 270
Asn Phe Phe Glu Thr Tyr Lys Ser Tyr Arg Arg Leu His Pro Ser Gln
275 280 285
Pro Phe Tyr Ile Leu Lys Pro Gln Met Pro Trp Glu Leu Trp Asp Ile
290 295 300
Ile Gln Glu Ile Ser Pro Asp Leu Ile Gln Pro Asn Pro Pro Ser Ser
305 310 315 320
Gly Met Leu Gly Ile Ile Ile Met Met Thr Leu Cys Asp Gln Val Asp
325 330 335
Ile Tyr Glu Phe Leu Pro Ser Lys Arg Lys Thr Asp Val Cys Tyr Tyr
340 345 350
His Gln Lys Phe Phe Asp Ser Ala Cys Thr Met Gly Ala Tyr His Pro
355 360 365
Leu Leu Phe Glu Lys Asn Met Val Lys His Leu Asn Glu Gly Thr Asp
370 375 380
Glu Asp Ile Tyr Leu Phe Gly Lys Ala Thr Leu Ser Gly Phe Arg Asn
385 390 395 400
Asn Arg Cys
Claims (4)
- ヒトα2,6シアル酸転移酵素のアミノ酸配列中のSer-Ser-Ala-Gly-Ser-Leu-Lys-Ser-Ser-Gln-Leu-Gly-Arg-Glu-Ile(配列番号1)、又はAsn-Ser-Gln-Leu-Val-Thr-Thr-Glu-Lys-Arg-Phe-Leu-Lys-Asp-Ser-Leu(配列番号2)で表されるアミノ酸配列を認識することができる抗体と、ヒトα2,6シアル酸転移酵素のアミノ酸配列中のCys-Asp-Gln-Val-Asp-Ile-Tyr-Glu-Phe-Leu-Pro-Ser-Lys-Arg-Lys-Thr-Asp-Val(配列番号3)で表されるアミノ酸配列を認識することができる抗体とを組み合わせて用いてサンドイッチ酵素免疫測定(ELISA)法を行うことを含む、ヒトα2,6シアル酸転移酵素の検出方法。
- (1)ヒトα2,6シアル酸転移酵素のアミノ酸配列中のCys-Asp-Gln-Val-Asp-Ile-Tyr-Glu-Phe-Leu-Pro-Ser-Lys-Arg-Lys-Thr-Asp-Val(配列番号3)で表されるアミノ酸配列を認識することができる抗体を固定化した固相にヒトα2,6シアル酸転移酵素を含む試料を接触させて上記抗体にヒトα2,6シアル酸転移酵素を結合させる工程:及び(2)上記工程(1)で結合したヒトα2,6シアル酸転移酵素にヒトα2,6シアル酸転移酵素のアミノ酸配列中のSer-Ser-Ala-Gly-Ser-Leu-Lys-Ser-Ser-Gln-Leu-Gly-Arg-Glu-Ile(配列番号1)、又はAsn-Ser-Gln-Leu-Val-Thr-Thr-Glu-Lys-Arg-Phe-Leu-Lys-Asp-Ser-Leu(配列番号2)で表されるアミノ酸配列を認識することができる抗体を反応させて、結合したヒトα2,6シアル酸転移酵素を検出する工程を含む、請求項1に記載のヒトα2,6シアル酸転移酵素の検出方法。
- ヒトα2,6シアル酸転移酵素のアミノ酸配列中のSer-Ser-Ala-Gly-Ser-Leu-Lys-Ser-Ser-Gln-Leu-Gly-Arg-Glu-Ile(配列番号1)、又はAsn-Ser-Gln-Leu-Val-Thr-Thr-Glu-Lys-Arg-Phe-Leu-Lys-Asp-Ser-Leu(配列番号2)で表されるアミノ酸配列を認識することができる抗体。
- ヒトα2,6シアル酸転移酵素のアミノ酸配列中のSer-Ser-Ala-Gly-Ser-Leu-Lys-Ser-Ser-Gln-Leu-Gly-Arg-Glu-Ile(配列番号1)、又はAsn-Ser-Gln-Leu-Val-Thr-Thr-Glu-Lys-Arg-Phe-Leu-Lys-Asp-Ser-Leu(配列番号2)で表されるアミノ酸配列を認識することができる抗体と、ヒトα2,6シアル酸転移酵素のアミノ酸配列中のCys-Asp-Gln-Val-Asp-Ile-Tyr-Glu-Phe-Leu-Pro-Ser-Lys-Arg-Lys-Thr-Asp-Val(配列番号3)で表されるアミノ酸配列を認識することができる抗体とを少なくとも含む、肝細胞癌の診断キット。
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