JP2005145837A

JP2005145837A - アルツハイマー病の診断方法

Info

Publication number: JP2005145837A
Application number: JP2003382374A
Authority: JP
Inventors: Shinobu Kitatsume; しのぶ北爪; Yuriko Tatsuta; 由里子立田; Ritsuko Oka; 律子岡; Yasuhiro Hashimoto; 康弘橋本; Takaomi Nishimichi; 隆臣西道
Original assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 2003-11-12
Filing date: 2003-11-12
Publication date: 2005-06-09
Also published as: WO2005047897A1

Abstract

【課題】 βセクレターゼ活性の上昇を検出し、孤発性アルツハイマー病の診断を行う方法を提供すること。
【解決手段】ヒト由来の試料に含まれるβ−セクレターゼにより切断される分泌型シアル酸転移酵素を検出又は測定することを含む、アルツハイマー病の診断方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、アルツハイマー病の診断方法、β−セクレターゼにより切断されたヒト由来の分泌型シアル酸転移酵素を特異的に認識することができる抗体、並びに上記抗体を含むアルツハイマー病の診断キットに関するものである。

アルツハイマー病は広汎な神経変性痴呆を伴う疾患である。アミロイドβペプチド（Ａβ）の生成は、アルツハイマー病の病因の一つである（非特許文献１）。Ａβの形成の際、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）はβ−セクレターゼにより切断されて可溶性のＮＨ₂末端断片（ＡＰＰｓβ）および１２ｋＤａのＣＯＯＨ末端断片（Ｃ９９）が生成し、後者は膜に結合したままである。Ｃ９９はさらにγ−セクレターゼによって切断されて、病原性のＡβが生成する（非特許文献２、及び非特許文献３）。別の経路では、ＡＰＰはα−セクレターゼによってＡβ配列内で切断されて、可溶性のＮＨ₂末端断片（ＡＰＰｓα）および１０ｋＤａの膜結合型ＣＯＯＨ末端断片（Ｃ８３）が生成する（非特許文献４、及び非特許文献５）。

アルツハイマー病と相関関係を示すマーカーは多数報告されているが、その多くは病理変化との関係が不明であり、診断的価値が必ずしも確立していない。病理変化と直接関連する髄液マーカーとしては、42アミノ酸からなるアミロイドβペプチドの一種(Aβ1-42)の減少および（リン酸化）タウの上昇が挙げられる。しかし、Aβ1-42は、アルツハイマー病後期の重篤化によく相関するものの、発病直前の病期（mild cognitive impairment: MCI）や病初期においては正常と差が認められていない。この点、リン酸化タウはMCIにおいても上昇が認められ、最も優れたバイオマーカーと考えられている。しかし、リン酸化タウが上昇している時期には神経細胞死がすでに進行しており、この時期に治療を開始しても完全な神経機能の回復は望めない。理想的なマーカーとしては、神経細胞が死に至る前に診断できることが望ましいが、このようなマーカーは現在のところ報告がない。

本発明者らのこれまでの研究により、ヒトβセクレターゼがラットα2,6シアル酸転移酵素を切断することが実証されており、この切断によって生じた産物である可溶性のシアル酸転移酵素を検出する抗体は、新たに生じたN-末端（切断端）を特異的に認識する抗体である。この抗体を用いることにより試験管内あるいは培養細胞実験レベルにおいてはβセクレターゼ活性を評価することが可能であった（非特許文献６）。また、この評価系を用いてβセクレターゼ阻害剤のスクリーニングを行うことが可能である。

Selkoe,D.J. (2001) Physiol.Rev. 81, 741-766；及び Iwata, N.,他、(2001) Science 292, 1550-1552） De Strooper, B.,他、(1998) Nature(London) 391, 387-390 Wolfe, M.S., 他、(1990) Nature(London) 398, 513-517 Buxbaum, J.D.,他、(1998) J.Biol.Chem. 273, 27765-27767 Lammich, S., 他、(1999) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96, 3922-3927 S. Kitazume,他、(2001) Proc.Natl.Acad.Sci.USA, Vol. 98, No.24, 13554-13559

上記の通り、アルツハイマー病の９５％以上を占める孤発性アルツハイマー病では、βセクレターゼの活性が上昇し、この酵素によるアミロイド前駆体タンパク質の切断が増加することによって、最終産物であるアミロイドβペプチド(Aβ)の産生が増加し、脳内に沈着する。この沈着物が老人班と呼ばれアルツハイマー病の初期病変となっている。すなわち、βセクレターゼの活性上昇が孤発性アルツハイマー病の引き金になっている。このβセクレターゼ活性の上昇を検出することができれば、アルツハイマー病を発病以前に診断をすることができ、効果的な予防が可能になる。しかしながら、従来においては、この活性上昇を診断する方法は存在しなかった。本発明者らは、βセクレターゼがアミロイド前駆体タンパク質のみならず、α2,6シアル酸転移酵素を生理的な基質として切断することを世界で初めて発見した。本発明では、βセクレターゼによって切断されたシアル酸転移酵素を特異的に認識する抗体を利用してβセクレターゼ活性の上昇を検出し、孤発性アルツハイマー病の診断を行う方法を提供することを解決すべき課題とした。さらに本発明は、βセクレターゼによって切断されたヒト由来の分泌型シアル酸転移酵素を特異的に認識する抗体及び該抗体を用いた診断キットを提供することを解決すべき課題とした。

本発明者らの先の特許出願である特願２００２−１４１４３８号においては、β−セクレターゼとシアル酸転移酵素とを接触させた後に、β−セクレターゼの酵素活性により切断されたラット由来の分泌型シアル酸転移酵素を、該酵素を特異的に認識する抗体を用いて検出又は測定することによってβ−セクレターゼのシアル酸転移酵素切断活性を測定する方法が記載されている。一方、ヒトα2,6シアル酸転移酵素のβセクレターゼによる切断端はラットの酵素とアミノ酸配列が異なることが示されている。そこで、本発明においては、ヒトα2,6シアル酸転移酵素の切断端を認識する抗体を新たに作製したところ、該抗体はヒトの可溶性酵素（分泌型シアル酸転移酵素）に強い反応性を示すことが明らかとなった。ヒトの試料を用いて診断を行う際には、ヒトα2,6シアル酸転移酵素の切断端を認識する抗体の使用が必須である。この抗体を用いることにより、ヒト血清や脳脊髄液中における可溶性シアル酸転移酵素を検出又は測定することが初めて可能となった。可溶性酵素量はβセクレターゼ活性を反映しており、これによって発症前あるいは発症の初期におけるアルツハイマー病の診断が可能になる。

即ち、本発明によれば、ヒト由来の試料に含まれるβ−セクレターゼにより切断される分泌型シアル酸転移酵素を検出又は測定することを含む、アルツハイマー病の診断方法が提供される。

好ましくは、分泌型シアル酸転移酵素を特異的に認識する抗体を用いて分泌型シアル酸転移酵素を検出又は測定する。
好ましくは、分泌型シアル酸転移酵素を特異的に認識する抗体として、アミノ酸配列Glu-Phe-Gln-Val-Leu-Lys-Cysを有するペプチドを抗原として動物に免疫することにより得られる抗体を用いる。
好ましくは、ヒト由来の試料は脳由来の試料である。
好ましくは、分泌型シアル酸転移酵素を検出又は測定することにより、アルツハイマー病の発症危険度を予測する。

本発明の別の側面によれば、β−セクレターゼにより切断された、ヒト由来の分泌型シアル酸転移酵素を特異的に認識することができる抗体が提供される。
好ましくは、本発明の抗体は、アミノ酸配列Glu-Phe-Gln-Val-Leu-Lys-Cysを有するペプチドを抗原として動物に免疫することにより得られる抗体である。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の抗体を含む、アルツハイマー病の診断キットが提供される。

本発明によれば、アルツハイマー病を診断するための新規方法が提供される。本発明によるアルツハイマー病の診断方法は、βセクレターゼ活性の検出又は測定に基づくものであり、発症前あるいは発症の初期におけるアルツハイマー病を診断することができる。即ち、本発明の方法によれば、特に、アルツハイマー病を発病以前に診断をすることができ、効果的な予防が可能になると同時に、人格の変化、言葉の発声の困難、記憶喪失、物体の置忘れ、又は人名の忘却などのアルツハイマー病の初期症候を呈する患者についても発症の初期においてアルツハイマー病を診断することが可能である。さらに、本発明の診断方法により、アルツハイマー病と類似の症候を呈する他の疾病と、アルツハイマー病とを区別することが可能になる。さらに、本発明の診断方法では、ヒト由来の試料として腰椎性脳脊髄液を使用することができるため、生きている被験者において危険度の低いアッセイにより簡便に診断を行うことができる。

以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明のアルツハイマー病の診断方法は、ヒト由来の試料に含まれるβ−セクレターゼにより切断される分泌型シアル酸転移酵素を検出又は測定することを特徴とする方法である。本発明の方法により、分泌型シアル酸転移酵素を検出又は測定することにより、アルツハイマー病の発症危険度を予測することができる。

なお、本出願当時の糖転移酵素の専門家の間ではα2,6シアル酸転移酵素の脳における発現量は低く、可溶性の酵素量は検出感度以下であると考えられていた。従って、ヒト由来の試料に含まれるβ−セクレターゼにより切断される分泌型シアル酸転移酵素を特異的に認識する抗体をたとえ取得できたとしても、脳脊髄液中に可溶性のシアル酸転移酵素が検出可能な量だけ存在するか否かは不明であったが、本発明により分泌型シアル酸転移酵素を検出又は測定できることが初めて実証された。

また、孤発性アルツハイマー病の患者ではβセクレターゼ活性が上昇しているとの報告がある。しかし、全例で上昇しているわけではなく、一部の患者では活性が正常域にとどまっているものがある。この患者ではβセクレターゼ活性の上昇以外の原因でアミロイドβペプチドの産生が上昇している可能性や、アミロイドβペプチドの産生は変化せず分解が低下しているために蓄積が起きている可能性が考えられる。この場合、前者ではβセクレターゼ阻害剤が原因を根本から正常化する根治療法となる。一方、後者では別の治療薬を用いる必要が考えられる。以上のようにアミロイドβペプチドが沈着し痴呆を引き起こすという点においては共通であるが、根本原因が異なるアルツハイマー病を区別して診断・治療できる可能性がある。なお、従来のアルツハイマー病患者におけるβセクレターゼ活性の測定は、剖検（死後の解剖）によって得られた脳組織を用いて行われたものである。生存中の患者で脳内のβセクレターゼ活性を測定する方法は未だ報告されておらず、本発明の方法が初めての測定法となる。

本発明の診断方法の一例においては、被験者由来の試料中に存在するβ−セクレターゼにより切断される分泌型シアル酸転移酵素の量を、対照被験者の試料中に存在するβ−セクレターゼにより切断される分泌型シアル酸転移酵素の量と比較することにより、アルツハイマー病の診断を行うことができる。

分泌型シアル酸転移酵素を検出又は測定は、分泌型シアル酸転移酵素を特異的に認識する抗体を用いるイムノアッセイにより行うことができる。即ち、分泌型シアル酸転移酵素と上記抗体との結合の分析は、上記抗体、あるいは上記抗体又は上記分泌型シアル酸転移酵素と結合する二次抗体に酵素標識、発色標識、放射標識又は発光標識などの標識を結合し、この標識を検出又は測定することにより行うことができる。本発明で行うことができるイムノアッセイとしては、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、免疫沈降、スロット或いはドットブロットアッセイ、免疫組織染色、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ、アビジン−ビオチン又はストレプトアビジン−ビオチン系を用いるイムノアッセイなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

本発明の診断方法においては、ヒト由来の試料を使用することができる。ヒト由来の試料としては、β−セクレターゼにより切断される分泌型シアル酸転移酵素を検出又は測定できる試料であれば特に限定されず、血清、尿、唾液などの体液を使用することもできるが、好ましくは脳由来の試料を使用することができる。脳由来の試料としては、腰椎性脳脊髄液、脳室性脳脊髄液、脳組織のホモジェネート、又は脳組織の薄切片などが挙げられるが、これらに限定されない。腰椎性脳脊髄液の使用は、生きている被験者から得られた試料を用いて本発明の診断方法を行うことができるので特に有用である。

本発明はさらに、β−セクレターゼにより切断されたヒト由来の分泌型シアル酸転移酵素を特異的に認識することができる抗体にも関する。本発明の抗体は、例えば、アミノ酸配列Glu-Phe-Gln-Val-Leu-Lys-Cys（配列番号１）を有するペプチドをＫＬＨタンパク質に共有結合させた複合体を抗原として動物に免疫することにより得ることができる。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体の何れでもよい。本発明の抗体の作製は常法により行なうことができる。

例えば、分泌型シアル酸転移酵素を特異的に認識することができるポリクローナル抗体は、上記したアミノ酸配列Glu-Phe-Gln-Val-Leu-Lys-Cysを有するペプチドを抗原として哺乳動物を免疫感作し、該哺乳動物から血液を採取し、採取した血液から抗体を分離・精製することにより得ることができる。例えば、マウス、ハムスター、モルモット、ニワトリ、ラット、ウサギ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ウシ等の哺乳動物を免疫することができる。免疫感作の方法としては、当業者に公知の通常の免疫感作の方法を用いて、例えば抗原を１回以上投与することにより行うことができる。

抗原投与は、例えば、７から３０日、特に１２から１６日間隔で２または３回投与することができる。投与量は１回につき、例えば抗原約０．０５から２ｍｇ程度を目安とすることができる。投与経路も特に限定されず、皮下投与、皮内投与、腹膜腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与等を適宜選択することができるが、静脈内、腹膜腔内もしくは皮下に注射することにより投与することが好ましい。また、抗原は適当な緩衝液、例えば完全フロイントアジュバント、ＲＡＳ〔MPL(Monophosphoryl Lipid A)+TDM(Synthetic Trehalose Dicorynomycolate)+CWS(Cell Wall Skeleton) アジュバントシステム〕、水酸化アルミニウム等の通常用いられるアジュバントを含有する適当な緩衝液に溶解して用いることができるが、投与経路や条件等によっては、上記したアジュバントは使用しない場合もある。ここでアジュバントとは抗原とともに投与したとき、非特異的にその抗原に対する免疫反応を増強する物質を意味する。

免疫感作した哺乳動物を０．５から４ケ月間飼育した後、該哺乳動物の血清を耳静脈等から少量サンプリングし、抗体価を測定することができる。抗体価が上昇してきたら、状況に応じて抗原の投与を適当回数実施する。例えば１０μｇ〜１０００μｇの抗原を用いて追加免疫を行なうことができる。最後の投与から１〜２ケ月後に免疫感作した哺乳動物から通常の方法により血液を採取して、５６℃で３０分間処理して補体系を不活性化した後、アフィニティークロマトグラフィーで特異抗体の精製を行なう。アフィニティー担体としては、例えば、抗原ペプチドをAffigelなどに固相化したものを用いることができる。該血液を、例えば遠心分離、硫酸アンモニウムまたはポリエチレングリコールを用いた沈澱、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等のクロマトグラフィー等の通常の方法によって分離・精製することにより、ポリクローナル抗血清として、本発明のポリクローナル抗体を得ることができる。なお血清は、たとえば、５６℃で３０分間処理することによって補体系を不活性化してもよい。

また、本発明の抗体がモノクローナル抗体の場合、該モノクローナル抗体のグロブリンタイプは特に限定されず、例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ等が挙げられる。また、本発明のモノクローナル抗体は、ヒト化抗体又はヒト抗体でもよい。

本発明のモノクローナル抗体を産生する細胞株は特に制限されないが、例えば、抗体産生細胞とミエローマ細胞株との細胞融合によりハイブリドーマとして得ることができる。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、以下のような細胞融合法によって得ることができる。

抗体産生細胞としては、免疫された動物からの脾細胞、リンパ節細胞、Ｂリンパ球等を使用する。抗原としては、ポリクローナル抗体の場合と同様のペプチド（即ち、アミノ酸配列Glu-Phe-Gln-Val-Leu-Lys-Cysを有するペプチド）を使用することができる。免疫される動物としてはマウス、ラット等が使用され、これらの動物への抗原の投与は常法に従って行う。例えば完全フロインドアジュバント、不完全フロインドアジュバントなどのアジュバントと抗原ペプチドとの懸濁液もしくは乳化液を調製し、これを動物の静脈、皮下、皮内、腹腔内等に数回投与することによって動物を免疫化する。免疫化した動物から抗体産生細胞として例えば脾細胞を取得し、これとミエローマ細胞とをそれ自体公知の方法（G.Kohler et al .,Nature,256 495(1975)）により融合することにより、ハイブリドーマを作製することができる。

細胞融合に使用するミエローマ細胞株としては、例えばマウスではＰ３Ｘ６３Ａｇ８、Ｐ３Ｕ１株、Ｓｐ２／０株などが挙げられる。細胞融合を行なうに際しては、ポリエチレングリコール、センダイウイルスなどの融合促進剤を用い、細胞融合後のハイブリドーマの選抜にはヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（ＨＡＴ）培地を常法に従って使用することができる。細胞融合により得られたハイブリドーマは限界希釈法等によりクローニングすることができる。更に、酵素免疫測定法等によりスクリーニングを行なうことにより、β−セクレターゼにより切断されたヒト由来の分泌型シアル酸転移酵素を特異的に認識することができるモノクローナル抗体を産生する細胞株を得ることができる。

このようにして得られたハイブリドーマから目的とするモノクローナル抗体を製造するには、通常の細胞培養法や腹水形成法により該ハイブリドーマを培養し、培養上清あるいは腹水から該モノクローナル抗体を精製すればよい。培養上清もしくは腹水からのモノクローナル抗体の精製は、常法により行なうことができる。例えば、硫安分画、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどを適宜組み合わせて使用できる。

また、上記したような各種抗体の断片も本発明の範囲内である。抗体の断片としては、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント等が挙げられる。

本発明の抗体は標識抗体として使用することもできる。標識抗体を作製することにより、β−セクレターゼにより切断されたヒト由来の分泌型シアル酸転移酵素の検出や測定を簡便に行うことができる。また、本発明の抗体、又はその抗原である分泌型シアル酸転移酵素と結合する二次抗体を標識して使用することもできる。本発明の抗体またはその二次抗体の標識の種類及び標識方法は当業者に知られているものから適宜選択することができる。

標識として酵素を使用する場合には、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、炭酸アンヒドラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、リゾチーム、マレートデヒドロゲナーゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ等を標識として使用することができる。これらの酵素を本発明の抗体又はその二次抗体又はその断片（Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント等）に標識する方法としては、酵素の糖鎖を過ヨウ素酸で酸化し、生成したアルデヒド基に該抗体などのアミノ酸を結合させる方法や、酵素にマレイミド基あるいはピリジルスルフィド基等を導入し、該抗体のＦａｂ’フラグメントに存在するチオール基と結合させる方法等を挙げることができる。

標識として酵素を使用する場合、試験試料と標識抗体とをインキュベートした後、遊離した標識抗体を洗浄して除去してから、上記の標識酵素の基質を作用させて発色等で反応を測定することによって標識抗体を検出することができる。例えば、ペルオキシダーゼで標識される場合には、基質として過酸化水素、発色試薬としてジアミノベンジジンまたはＯ−フェニレンジアミンと組み合わさって褐色または黄色を生じる。グルコースオキシダーゼで標識される場合には、基質として、たとえば２，２’ −アシド−ジ−（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ）等を用いることができる。

標識として蛍光色素を使用する場合には、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）又はＴＲＩＴＣ（テトラメチルローダミンＢイソチオシアネート）等の蛍光色素で本発明の抗体又はその二次抗体を標識することができる。本発明の抗体又はその二次抗体と蛍光色素との結合は常法によって行うことができる。

標識として呈色標識物質を使用する場合には、例えば、コロイド金属および着色ラテックスなどを標識として使用できる。コロイド金属の代表例としては、金ゾル、銀ゾル、セレンゾル、テルルゾルおよび白金ゾルなどのそれぞれの分散粒子である金属コロイド粒子を挙げることができる。コロイド金属の粒子の大きさは、通常は、直径３〜６０nm程度とされる。また、着色ラテックスの代表例としては、赤色および青色などのそれぞれの顔料で着色されたポリスチレンラッテクスなどの合成ラテックスを挙げることができる。ラテックスとして天然ゴムラテックスのような天然ラッテクスを使用することができる。着色ラテックスの大きさは、直径数十nm〜数百ｎｍ程度から選択することができる。これらの呈色標識物質は市販品をそのまま使用することができるが、場合によりさらに加工し、または、それ自体公知の方法で製造することもできる。

本発明の抗体又はその二次抗体と呈色標識物質との結合は常法によって行うことができる。例えば、呈色標識物質が金ゾルの分散粒子である金コロイド粒子の場合には、通常は、抗体と金ゾルとを室温下で混合することによって両者を物理的に結合することが可能である。

なお、標識としては、上記以外にもアフィニティー標識（例えば、ビオチン等）、又は、同位体標識（例えば、¹²⁵Ｉ等）等を使用することもできる。

本発明の抗体を用いたβ−セクレターゼにより切断される分泌型シアル酸転移酵素の検出又は測定は、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、免疫沈降、スロット或いはドットブロットアッセイ、免疫組織染色、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ、アビジン−ビオチン又はストレプトアビジン−ビオチン系を用いるイムノアッセイなどにより行うことができ、これらの分析は当業者に周知の方法である。

例えば、ウェスタンブロット法による抗ヒトE44抗体を用いた可溶性シアル酸転移酵素の検出については、本明細書の実施例２に記載した方法に準じて行なうことができる。また、実施例２の場合と同様の試料を用いて、サンドイッチELISA法により定量することができると考えられる。ELISA用のプレートにあらかじめC末抗体をコートしておき、試料中の可溶性シアル酸転移酵素をプレート上にトラップする。よく洗浄した後に、トラップされたシアル酸転移酵素を抗ヒトE44抗体と反応させる。２次抗体としてホースラディッシュ・パーオキシダーゼでラベルした抗ウサギIgG(Cappel)を反応させる。発色基質を加えて発色させ、その濃度を吸光光度計を用いて測定する。あらかじめ既知の濃度の可溶性シアル酸転移酵素を含む標準試料によって検量線作製しておき、これによって定量値を算出することができる。

さらに本発明は、上記したβ−セクレターゼにより切断されたヒト由来の分泌型シアル酸転移酵素を特異的に認識することができる抗体を含む、アルツハイマー病の診断キットにも関する。本発明の診断キットは用いることにより、ヒト由来の試料に含まれるβ−セクレターゼにより切断される分泌型シアル酸転移酵素を検出又は測定することができ、これによりアルツハイマー病を診断することができる。

本発明の診断キットには、例えば、（１）β−セクレターゼにより切断されたヒト由来の分泌型シアル酸転移酵素を特異的に認識することができる本発明の抗体（一次抗体）、及び（２）シグナルを発生させることができる標識物質が結合した二次抗体を含めることができる。ここで用いる二次抗体としては、前記一次抗体と結合できる抗体、あるいは前記分泌型シアル酸転移酵素を認識して結合できる抗体（但し、一次抗体の結合部位とは異なる部位を認識して結合する抗体である）を使用することができる。二次抗体として、前記分泌型シアル酸転移酵素を認識して結合できる抗体を使用する場合には、サンドイッチイムノアッセイ（例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡなど）を行うことができる。

本発明の診断キットにおいては、本発明の一次抗体はあらかじめ固相化されていてもよく、あるいは本発明の一次抗体は予め標識されていてもよい。本発明の診断キットにおいて用いることができる固相としては特に限定されず、例えば、ポリスチレン等のポリマー、ガラスビーズ、磁性粒子、マイクロプレート、イムノクロマトグラフィー用濾紙、グラスフィルター等の不溶性担体を挙げることができる。

本発明の診断キットには、更に他の任意成分を含めることができる。他の任意成分としては、例えば、標識に用いる酵素、その基質、放射性同位元素、発光物質、蛍光物質、着色物質、緩衝液、プレート等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。

また、本発明の診断キットの形態も特に限定されないが、迅速かつ簡便に診断を行うことを目的として、本発明の診断キットの構成成分が一体となった一体型の診断キットとすることができる。一体型の診断キットの形態も特に限定されないが、例えば、イムノクロマトグラフィー法を用いるカセット型、又は競合イムノアッセイを行うためのカートリッジ型等を挙げることができる。

以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。

実施例１：抗体の作製
（１）可溶性のヒトα2,6シアル酸転移酵素のN-末端に対する抗体
ヒトα2,6シアル酸転移酵素がβセクレターゼによって切断され、新たに生じたアミノ末端配列（EFQVL・・・）に対応するペプチドプラスシステイン残基（Glu-Phe-Gln-Val Leu-Lys-Cys）を化学合成し、KLHをMBS（m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester）で活性化したキャリアタンパク質に結合させる。これをFreund adjuvandとともにウサギに免疫し抗血清を得る。得られた抗血清を抗原ペプチド・アフィニティー・カラムにかけ結合した抗体のみを溶出する。アフィニティー担体としては、Affigen10または15を用いる。ハプテンペプチド1mgを100 mM HEPES緩衝液(pH 7.5)に溶解しておく。次に、1〜2ml のAffigwlをグラスフィルター上で吸引濾過、蒸留水にて洗浄後にペプチド溶液を加え、一昼夜4℃で回転攪拌の後、フリーのペプチドをのぞくために再度グラスフィルター上で吸引濾過する。30%酢酸や20%エタノールを用いて完全に洗浄し、最後にPBSで平衡化し、4℃で保存する。アフィニティー担体をカラムに詰め、PBSで洗浄する。非動化抗血清10mlを同量のPBSで希釈し、フィルター（0.45μM）に通した後に、カラムに添加する。その後、50mlのPBSで洗浄する。5mlの50mMのクエン酸バッファー(pH 3.0)でアフィニティーゲルから抗体を溶出させ、速やかに2M Trisバッファー(pH 9.5)で中和する。溶出液は、20%グリセロールーPBSで透析し、最後に280nmの吸収を測定することで抗体濃度を調べる。得られた抗体を抗ヒトE44抗体と名付けた。

（２）ヒトα2,6シアル酸転移酵素のC-末端側に対する抗体
シアル酸転移酵素の触媒ドメインはC-末端側に存在する。この中で動物種間でよく保存されている18アミノ酸からなる配列（Cys-Asp-Gln-Val-Asp-Ile-Tyr-Glu-Phe-Leu-Pro-Ser-Lys-Arg-Lys-Thr-Asp-Val）（配列番号２）を選び抗原ペプチドとした。作製法は抗ヒトE44抗体と同様である。これをC末抗体と名付けた。

実施例２：抗ヒトE44抗体を用いた可溶性シアル酸転移酵素の検出（ウェスタンブロット法）
ヒト血清試料（２００μｇ分のタンパク量に相当する分）は多量のアルブミンを含むので、あらかじめアルブミン除去キットを用いてアセトン沈殿により脱脂、濃縮を行い、アルブミンを除いておく。ヒト髄液は通常の腰椎穿刺により得られた試料を用いる。試料として用いる髄液には血液による汚染がないことを確認する。これらの試料（５０〜１００μｇのタンパク量に相当する分）をＰＢＳＴ溶液（50mMリン酸バッファー（pH7.2）、0.15M NaCl、0.1％ Tween20）に溶解した後に、Laemmli sample bufferと混合し加熱後SDS/PAGEに供する。分離されたタンパク質はニトロセルロース膜に電気的に転写する。膜を、5％ミルクin ＴＴＢＳバッファー（50mM Tris-HCl（pH7.2）、0.15M NaCl、0.1％ Tween20）でブロッキングした後に抗ヒトE44抗体（１μg/ml）あるいはC末抗体（５μg/ml）と反応させる。２次抗体としてホースラディッシュ・パーオキシダーゼでラベルした抗ウサギIgG(Cappel)を反応させる。化学発光基質（Pierce社、スーパーシグナル）を用いてシアル酸転移酵素のバンドを可視化する。結果を図１及び図２に示す。

また、既知の濃度の可溶性シアル酸転移酵素を含む標準試料に対する反応性をルミノイメージアナライザー（LAS-1000plus:富士フィルム）で検出し、定量した。その結果を図３に示す。

図１は、抗ヒトE44抗体を用いてウェスタンブロット法によりヒト髄液中の可溶性シアル酸転移酵素を検出した結果を示す。図２は、抗ヒトE44抗体を用いてウェスタンブロット法によりヒト血清中の可溶性シアル酸転移酵素を検出した結果を示す。図３は、抗ヒトE44抗体又はC末抗体端を用いて可溶性シアル酸転移酵素を定量した結果を示す。

Claims

ヒト由来の試料に含まれるβ−セクレターゼにより切断される分泌型シアル酸転移酵素を検出又は測定することを含む、アルツハイマー病の診断方法。
分泌型シアル酸転移酵素を特異的に認識する抗体を用いて分泌型シアル酸転移酵素を検出又は測定する、請求項１に記載の方法。
分泌型シアル酸転移酵素を特異的に認識する抗体として、アミノ酸配列Glu-Phe-Gln-Val-Leu-Lys-Cysを有するペプチドを抗原として動物に免疫することにより得られる抗体を用いる、請求項２に記載の方法。
ヒト由来の試料が脳由来の試料である、請求項１から３の何れかに記載の方法。
分泌型シアル酸転移酵素を検出又は測定することにより、アルツハイマー病の発症危険度を予測する、請求項１から４の何れかに記載の方法。
β−セクレターゼにより切断された、ヒト由来の分泌型シアル酸転移酵素を特異的に認識することができる抗体。
アミノ酸配列Glu-Phe-Gln-Val-Leu-Lys-Cysを有するペプチドを抗原として動物に免疫することにより得られる抗体、請求項６に記載の抗体。
請求項６又は７に記載の抗体を含む、アルツハイマー病の診断キット。