JP4385149B2

JP4385149B2 - 血清糖蛋白質をバイオマーカーとするアルツハイマー病の診断薬

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Publication number: JP4385149B2
Application number: JP2005138070A
Authority: JP
Inventors: しのぶ北爪; 律子岡; 康弘橋本; 雄治佐藤; 玉夫遠藤; 真人樋口; 啓行荒井; 隆臣西道
Original assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 2005-05-11
Filing date: 2005-05-11
Publication date: 2009-12-16
Anticipated expiration: 2025-05-11
Also published as: EP1901066A4; WO2006121099A1; US20110076704A1; EP1901066B1; US8609346B2; EP1901066A1; JP2006317210A

Description

本発明は、アルツハイマー病の診断薬及び診断方法に関する。より詳細には、本発明は、α2,6シアル酸含有糖蛋白質をマーカーとして使用するアルツハイマー病の診断薬及び診断方法に関する。

アルツハイマー病は広汎な神経変性痴呆を伴う疾患である。アミロイドβペプチド（Ａβ）の生成は、アルツハイマー病の病因の一つである（非特許文献１）。Ａβの形成の際、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）はβ−セクレターゼにより切断されて可溶性のＮＨ₂末端断片（ＡＰＰｓβ）および１２ｋＤａのＣＯＯＨ末端断片（Ｃ９９）が生成し、後者は膜に結合したままである。Ｃ９９はさらにγ−セクレターゼによって切断されて、病原性のＡβが生成する（非特許文献２、及び非特許文献３）。別の経路では、ＡＰＰはα−セクレターゼによってＡβ配列内で切断されて、可溶性のＮＨ₂末端断片（ＡＰＰｓα）および１０ｋＤａの膜結合型ＣＯＯＨ末端断片（Ｃ８３）が生成する（非特許文献４、及び非特許文献５）。

アルツハイマー病と相関関係を示すマーカーは多数報告されているが、その多くは病理変化との関係が不明であり、診断的価値が必ずしも確立していない。病理変化と直接関連するマーカーとしては、脳脊髄液中の42アミノ酸からなるアミロイドβペプチドの一種(Aβ1-42)の減少および（リン酸化）タウ蛋白質の上昇があげられる。しかし、本来Aβペプチドは凝集しやすく、沈着物を作るために病気の原因となっている。従って、遊離のAβ量は極微量であり、これを診断マーカーとするのは論理的にも難しい。事実、Aβペプチドはアルツハイマー病が重篤化した後に初めてその値が変動することが知られており、早期の診断マーカーとしては使用できない。一方、リン酸化タウは病初期にも上昇が認められ最も優れたバイオマーカーと考えられている。しかし、リン酸化タウが上昇している時期には神経細胞死がすでに進行しており、この時期に治療を開始しても完全な神経機能の回復は望めない。また、これらのマーカーは脳脊髄液（腰椎穿刺液）で測定することから、その材料採取には特殊な手技が必要であり、患者への負担も大きくマス・スクリーニングの方法とはなり得ない。

本発明者らは、βセクレターゼがアミロイド前駆体蛋白質以外にも、α2,6シアル酸転移酵素を切断することを見いだした。この発見に基づき、切断された遊離のα2,6シアル酸転移酵素を測定し、βセクレターゼ活性の上昇のマーカーとして診断に応用できることについて先に特許出願した（特願２００３−３８２３７４号：本願出願時には未公開）。この出願では、ヒト可溶性α2,6シアル酸転移酵素の切断端を特異的に認識する抗体を利用している。この抗体を用いることにより、ヒト血中や脳脊髄液中で可溶性α2,6シアル酸転移酵素の定量が可能となり、βセクレターゼ活性のモニター方法が提供された。しかし、一般に体液中の糖転移酵素は微量であり、その検出効率は必ずしも高くない。また、その検出には切断端抗体が必要であった。

Selkoe,D.J. (2001) Physiol.Rev. 81, 741-766；及び Iwata, N.,他、(2001) Science 292, 1550-1552） De Strooper, B.,他、(1998) Nature(London) 391, 387-390 Wolfe, M.S., 他、(1990) Nature(London) 398, 513-517 Buxbaum, J.D.,他、(1998) J.Biol.Chem. 273, 27765-27767 Lammich, S., 他、(1999) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96, 3922-3927

アルツハイマー病の９５％以上を占める孤発性アルツハイマー病では、アルツハイマー病βセクレターゼの活性が上昇し、この酵素によるアミロイド前駆体蛋白質の切断が増加することによって、最終産物であるアミロイドβペプチド(Aβ)の産生が増加し脳内に沈着する。この沈着物が老人班と呼ばれアルツハイマー病の初期病変となっている。すなわち、βセクレターゼの活性上昇が孤発性アルツハイマー病の引き金になっている。このβセクレターゼ活性の変化を検出することができれば、発病以前に診断をすることができ、効果的な予防が可能になる。しかし、従来この活性上昇を簡便に感度よく検出する方法は存在しなかった。

本発明では、血中のα2,6シアル酸残基を持つ糖蛋白質の代謝変化を検出して、孤発性アルツハイマー病の診断薬及び診断方法を提供することを解決すべき課題とした。

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討し、βセクレターゼがアミロイド前駆体蛋白質以外にも、α2,6シアル酸転移酵素を切断し、その酵素産物であるα2,6シアル酸残基を持つ糖蛋白質の代謝が変化することを見いだした。そして、α2,6シアル酸残基に特異的に結合するレクチン（SNA, SSA, TJAレクチン等）を用いてアルツハイマー病患者の血中での糖蛋白質の変化を調べたところ、複数の糖蛋白質の量が変化していることを見いだした（実施例１を参照）。この結果により、α2,6シアル酸含有糖蛋白質をマーカーとしてアルツハイマー病の診断ができることが示された。

即ち、本発明によれば、α2,6シアル酸含有糖蛋白質を検出するためのレクチンを含む、アルツハイマー病の診断薬が提供される。
好ましくは、α2,6シアル酸含有糖蛋白質は、180kD-糖蛋白質、95kD-糖蛋白質又は40kD-糖蛋白質である。

本発明の別の側面によれば、α2,6シアル酸を含有する40kD-糖蛋白質を検出するための抗ハプトグロビン抗体を含む、アルツハイマー病の診断薬が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、レクチンと抗ハプトグロビン抗体とを含む、アルツハイマー病の診断キットが提供される。

本発明のさらに別の側面によれば、ヒト由来の試料に含まれる、α2,6シアル酸含有糖蛋白質を検出又は測定することを含む、アルツハイマー病の診断方法が提供される。

好ましくは、α2,6シアル酸含有糖蛋白質が、180kD-糖蛋白質、95kD-糖蛋白質又は40kD-糖蛋白質である。
好ましくは、レクチンを用いてα2,6シアル酸含有糖蛋白質を検出又は測定する。
好ましくは、抗ハプトグロビン抗体を用いてα2,6シアル酸を含有する40kD-糖蛋白質を検出又は測定する。
好ましくは、レクチンと抗ハプトグロビン抗体とを用いたサンドイッチアッセイによりα2,6シアル酸を含有する40kD-糖蛋白質を検出又は測定する。
好ましくは、ヒト由来の試料は血液試料である。

本発明では、血中に大量に存在するα2,6シアル酸含有糖蛋白質をマーカーとして利用するため、ごく微量の血液サンプルによって診断が可能である。脳脊髄液や大量の血液を使用する診断方法に比べて被験者への負担が少ない。また、特殊な抗体を必要することなく、安価に大量調製できるレクチンや作製の容易な抗体（抗ハプトグロビン抗体など）を用いるため、多検体の高感度スクリーニング方法を容易に確立することができる。

以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明によるアルツハイマー病の診断薬及び診断方法は、α2,6シアル酸含有糖蛋白質をマーカーとして用いることを特徴とする。より具体的には、シアル酸を含有する180kD-糖蛋白質、95kD-糖蛋白質又は40kD-糖蛋白質をマーカーとして用いることができる。これらの糖蛋白質は何れもレクチンを用いて検出することができ、また、40kD-糖蛋白質については、抗ハプトグロビン抗体を用いて検出することができる。

本発明の診断方法の一例においては、被験者由来の試料中に存在するα2,6シアル酸含有糖蛋白質の量を、対照被験者の試料中に存在するα2,6シアル酸含有糖蛋白質の量と比較することにより、アルツハイマー病の診断を行うことができる。

α2,6シアル酸含有糖蛋白質（好ましくは、180kD-糖蛋白質、95kD-糖蛋白質又は40kD-糖蛋白質）の検出又は測定は、レクチン、又はα2,6シアル酸含有糖蛋白質を特異的に認識する抗体（例えば、40kD-糖蛋白質については、抗ハプトグロビン抗体を使用することができる）を用いるアッセイにより行うことができる。

即ち、α2,6シアル酸含有糖蛋白質と、レクチン又は上記抗体との結合の分析は、レクチン、上記抗体、あるいは二次抗体に、酵素標識、発色標識、放射標識又は発光標識などの標識を結合し、この標識を検出又は測定することにより行うことができる。本発明で行うことができるイムノアッセイとしては、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、免疫沈降、スロット或いはドットブロットアッセイ、免疫組織染色、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ、アビジン−ビオチン又はストレプトアビジン−ビオチン系を用いるイムノアッセイなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

本発明の診断方法においては、ヒト由来の試料を使用することができる。ヒト由来の試料としては、α2,6シアル酸含有糖蛋白質（好ましくは、180kD-糖蛋白質、95kD-糖蛋白質又は40kD-糖蛋白質）を検出又は測定できる試料であれば特に限定されず、血液（血清、又は血漿など）、尿、唾液、脳由来試料などを使用することができるが、好ましくは、血液（血清又は血漿）である。

本発明で用いるレクチンの種類としては、α2,6シアル酸含有糖蛋白質を認識して検出できるものであれば特に限定されず、例えば、ＳＮＡレクチン（ニワトコレクチン）、ＳＳＡレクチン（日本ニワトコ樹皮レクチン）、ＴＪＡレクチン（キカラスウリレクチン）などを使用することができる。本発明で用いるレクチンは、必要に応じて標識されていてもよい。なお、標識物質としては、標識抗体について本明細書中後記するものを使用することができる。

本発明で用いる抗体の一例としては、抗ハプトグロビン抗体を挙げることができる。ハプトグロビンは急性炎症や溶血性貧血の際に変動することが知られている。従って、これらの疾患との鑑別診断が必要になる。急性炎症の存在はC reactive protein値などの一般的な血液生化学検査で鑑別ができる。溶血性貧血の場合は黄疸や高ビリルビン血症などの一般的な検査で鑑別が可能である。溶血性貧血の場合は、赤血球寿命の測定や鉄代謝回転の測定などの高度検査が必要になることがあるが、これらは極めて例外的な症例である。すなわち、通常の血液生化学検査によって上記疾患との鑑別は容易であり、アルツハイマー病の診断に障害とはならない。

また、180kD-糖蛋白質、及び95kD-糖蛋白質については、当該糖蛋白質を精製し、当該糖蛋白質又はその部分ペプチドを抗原として動物に免疫することにより得ることができる。本発明で用いる抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体の何れでもよく、抗体の作製は常法により行なうことができる。

例えば、ポリクローナル抗体は、上記タンパク質又はその部分ペプチドを抗原として哺乳動物を免疫感作し、該哺乳動物から血液を採取し、採取した血液から抗体を分離・精製することにより得ることができる。例えば、マウス、ハムスター、モルモット、ニワトリ、ラット、ウサギ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ウシ等の哺乳動物を免疫することができる。免疫感作の方法としては、当業者に公知の通常の免疫感作の方法を用いて、例えば抗原を１回以上投与することにより行うことができる。

抗原投与は、例えば、７から３０日、特に１２から１６日間隔で２または３回投与することができる。投与量は１回につき、例えば抗原約０．０５から２ｍｇ程度を目安とすることができる。投与経路も特に限定されず、皮下投与、皮内投与、腹膜腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与等を適宜選択することができるが、静脈内、腹膜腔内もしくは皮下に注射することにより投与することが好ましい。また、抗原は適当な緩衝液、例えば完全フロイントアジュバント、ＲＡＳ〔MPL(Monophosphoryl Lipid A)+TDM(Synthetic Trehalose Dicorynomycolate)+CWS(Cell Wall Skeleton) アジュバントシステム〕、水酸化アルミニウム等の通常用いられるアジュバントを含有する適当な緩衝液に溶解して用いることができるが、投与経路や条件等によっては、上記したアジュバントは使用しない場合もある。ここでアジュバントとは抗原とともに投与したとき、非特異的にその抗原に対する免疫反応を増強する物質を意味する。

免疫感作した哺乳動物を０．５から４ケ月間飼育した後、該哺乳動物の血清を耳静脈等から少量サンプリングし、抗体価を測定することができる。抗体価が上昇してきたら、状況に応じて抗原の投与を適当回数実施する。例えば１０μｇ〜１０００μｇの抗原を用いて追加免疫を行なうことができる。最後の投与から１〜２ケ月後に免疫感作した哺乳動物から通常の方法により血液を採取して、５６℃で３０分間処理して補体系を不活性化した後、アフィニティークロマトグラフィーで特異抗体の精製を行なう。アフィニティー担体としては、例えば、抗原ペプチドをAffigelなどに固相化したものを用いることができる。該血液を、例えば遠心分離、硫酸アンモニウムまたはポリエチレングリコールを用いた沈澱、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等のクロマトグラフィー等の通常の方法によって分離・精製することにより、ポリクローナル抗血清として、ポリクローナル抗体を得ることができる。なお血清は、たとえば、５６℃で３０分間処理することによって補体系を不活性化してもよい。

モノクローナル抗体は、例えば、抗体産生細胞とミエローマ細胞株との細胞融合により得られるハイブリドーマを用いて作製することができる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、以下のような細胞融合法によって得ることができる。

抗体産生細胞としては、免疫された動物からの脾細胞、リンパ節細胞、Ｂリンパ球等を使用する。抗原としては、ポリクローナル抗体の場合と同様のタンパク質又はペプチドを使用することができる。免疫される動物としてはマウス、ラット等が使用され、これらの動物への抗原の投与は常法に従って行う。例えば完全フロインドアジュバント、不完全フロインドアジュバントなどのアジュバントと抗原ペプチドとの懸濁液もしくは乳化液を調製し、これを動物の静脈、皮下、皮内、腹腔内等に数回投与することによって動物を免疫化する。免疫化した動物から抗体産生細胞として例えば脾細胞を取得し、これとミエローマ細胞とをそれ自体公知の方法（G.Kohler et al .,Nature,256 495(1975)）により融合することにより、ハイブリドーマを作製することができる。

細胞融合に使用するミエローマ細胞株としては、例えばマウスではＰ３Ｘ６３Ａｇ８、Ｐ３Ｕ１株、Ｓｐ２／０株などが挙げられる。細胞融合を行なうに際しては、ポリエチレングリコール、センダイウイルスなどの融合促進剤を用い、細胞融合後のハイブリドーマの選抜にはヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（ＨＡＴ）培地を常法に従って使用することができる。細胞融合により得られたハイブリドーマは限界希釈法等によりクローニングすることができる。更に、酵素免疫測定法等によりスクリーニングを行なうことにより、α2,6シアル酸含有糖蛋白質を特異的に認識することができるモノクローナル抗体を産生する細胞株を得ることができる。

このようにして得られたハイブリドーマから目的とするモノクローナル抗体を製造するには、通常の細胞培養法や腹水形成法により該ハイブリドーマを培養し、培養上清あるいは腹水から該モノクローナル抗体を精製すればよい。培養上清もしくは腹水からのモノクローナル抗体の精製は、常法により行なうことができる。例えば、硫安分画、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどを適宜組み合わせて使用できる。

本発明で用いる抗体は標識抗体として使用することもできる。標識抗体を作製することにより、α2,6シアル酸含有糖蛋白質の検出や測定を簡便に行うことができる。また、本発明の抗体、又はその抗原であるα2,6シアル酸含有糖蛋白質と結合する二次抗体を標識して使用することもできる。本発明の抗体またはその二次抗体の標識の種類及び標識方法は当業者に知られているものから適宜選択することができる。

標識として酵素を使用する場合には、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、炭酸アンヒドラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、リゾチーム、マレートデヒドロゲナーゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ等を標識として使用することができる。これらの酵素を本発明の抗体又はその二次抗体又はその断片（Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント等）に標識する方法としては、酵素の糖鎖を過ヨウ素酸で酸化し、生成したアルデヒド基に該抗体などのアミノ酸を結合させる方法や、酵素にマレイミド基あるいはピリジルスルフィド基等を導入し、該抗体のＦａｂ’フラグメントに存在するチオール基と結合させる方法等を挙げることができる。

標識として酵素を使用する場合、試験試料と標識抗体とをインキュベートした後、遊離した標識抗体を洗浄して除去してから、上記の標識酵素の基質を作用させて発色等で反応を測定することによって標識抗体を検出することができる。例えば、ペルオキシダーゼで標識される場合には、基質として過酸化水素、発色試薬としてジアミノベンジジンまたはＯ−フェニレンジアミンと組み合わさって褐色または黄色を生じる。グルコースオキシダーゼで標識される場合には、基質として、たとえば２，２’ −アシド−ジ−（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ）等を用いることができる。

標識として蛍光色素を使用する場合には、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）又はＴＲＩＴＣ（テトラメチルローダミンＢイソチオシアネート）等の蛍光色素で本発明の抗体又はその二次抗体を標識することができる。本発明の抗体又はその二次抗体と蛍光色素との結合は常法によって行うことができる。

標識として呈色標識物質を使用する場合には、例えば、コロイド金属および着色ラテックスなどを標識として使用できる。コロイド金属の代表例としては、金ゾル、銀ゾル、セレンゾル、テルルゾルおよび白金ゾルなどのそれぞれの分散粒子である金属コロイド粒子を挙げることができる。コロイド金属の粒子の大きさは、通常は、直径３〜６０nm程度とされる。また、着色ラテックスの代表例としては、赤色および青色などのそれぞれの顔料で着色されたポリスチレンラッテクスなどの合成ラテックスを挙げることができる。ラテックスとして天然ゴムラテックスのような天然ラッテクスを使用することができる。着色ラテックスの大きさは、直径数十nm〜数百ｎｍ程度から選択することができる。これらの呈色標識物質は市販品をそのまま使用することができるが、場合によりさらに加工し、または、それ自体公知の方法で製造することもできる。

本発明の抗体又はその二次抗体と呈色標識物質との結合は常法によって行うことができる。例えば、呈色標識物質が金ゾルの分散粒子である金コロイド粒子の場合には、通常は、抗体と金ゾルとを室温下で混合することによって両者を物理的に結合することが可能である。

なお、標識としては、上記以外にもアフィニティー標識（例えば、ビオチン等）、又は、同位体標識（例えば、¹²⁵Ｉ等）等を使用することもできる。

本発明の方法におけるα2,6シアル酸含有糖蛋白質の検出又は測定は、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、免疫沈降、スロット或いはドットブロットアッセイ、免疫組織染色、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ、アビジン−ビオチン又はストレプトアビジン−ビオチン系を用いるイムノアッセイなどにより行うことができ、これらの分析は当業者に周知の方法である。

例えば、ウェスタンブロット法による糖蛋白質の検出については、本明細書の実施例２に記載した方法に準じて行なうことができる。

また、ハプトグロビンのように抗体が使用できる場合には以下に示すサンドイッチ・レクチン・ELISA法あるいは通常のサンドイッチELISA法による定量が可能である。ELISA用のプレートにあらかじめ抗ハプトグロビン抗体をコートしておき、試料中のハプトグロビンをプレート上にトラップする。サンドイッチ・レクチン・ELISA法ではトラップされたハプトグロビンをビオチン化レクチン（SNA, SSA, TJA等）と反応させる。検出のためにstreptavidin-horse radish peroxidate（HRP）と反応させる。一方、通常のサンドイッチELISA法では検出のためにプレートにコートしたものとは異なる抗体を使用することができる。この場合は検出のための抗体（あるいはFabフラグメント化したもの）にホースラディッシュ・パーオキシダーゼを直接標識したものを反応させる。（あるいはホースラディッシュ・パーオキシダーゼでラベルした２次抗体を使用することができる。）いずれのELISA法でも発色基質を加えて発色させ、その濃度を吸光光度計を用いて測定する。既知の濃度のハプトグロビンを含む標準試料によってあらかじめ検量線作製しておき、これによって定量値を算出することができる。

本発明のアルツハイマー病の診断薬は、診断キットの形態で提供することもできる。診断キットには、例えば、（１）α2,6シアル酸含有糖蛋白質を検出するためのレクチン、及び／又は（２）α2,6シアル酸を含有する180kD-糖蛋白質、95kD-糖蛋白質又は40kD-糖蛋白質に対する抗体（例えば、40kD-糖蛋白質を検出するための抗ハプトグロビン抗体など）を含めることができ、これに加えてさらに、シグナルを発生させることができる標識物質が結合した二次抗体を含めることもできる。ここで用いる二次抗体としては、前記一次抗体と結合できる抗体、あるいはα2,6シアル酸含有糖蛋白質を認識して結合できる抗体（但し、一次抗体の結合部位とは異なる部位を認識して結合する抗体である）を使用することができる。二次抗体として、α2,6シアル酸含有糖蛋白質を認識して結合できる抗体を使用する場合には、サンドイッチイムノアッセイ（例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡなど）を行うことができる。

本発明の診断キットにおいては、本発明の一次抗体はあらかじめ固相化されていてもよく、あるいは本発明の一次抗体は予め標識されていてもよい。本発明の診断キットにおいて用いることができる固相としては特に限定されず、例えば、ポリスチレン等のポリマー、ガラスビーズ、磁性粒子、マイクロプレート、イムノクロマトグラフィー用濾紙、グラスフィルター等の不溶性担体を挙げることができる。

本発明の診断キットには、更に他の任意成分を含めることができる。他の任意成分としては、例えば、標識に用いる酵素、その基質、放射性同位元素、発光物質、蛍光物質、着色物質、緩衝液、プレート等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。

また、本発明の診断キットの形態も特に限定されないが、迅速かつ簡便に診断を行うことを目的として、本発明の診断キットの構成成分が一体となった一体型の診断キットとすることができる。一体型の診断キットの形態も特に限定されないが、例えば、イムノクロマトグラフィー法を用いるカセット型、又は競合イムノアッセイを行うためのカートリッジ型等を挙げることができる。

以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。

実施例１：レクチン・ブロット法α2,6シアル酸含有糖蛋白質の検出
ヒト血清あるいは血漿試料（20μgの蛋白質に相当）はLaemmli sample bufferと混合して加熱した後に4/20％グラジェントポリアクリルアミドゲルを用いたSDS/PAGEに供する。40mAの定電流で55分電気泳動する。分離された蛋白質はPVDF膜に260mAの定電流で50分間電気的に転写する。膜を1％ bovine serum albumin (BSA)-phosphate buffered saline (PBS)で１時間以上ブロッキングする。1％ BSA-PBSにて希釈したビオチン化レクチン（ＳＳＡ）とPVDF膜を１時間反応させる（本実験ではbiotin-SSA;生化学工業＃300442を1μg/mlの濃度で使用している）。0.05％ Tween 20（界面活性剤）in PBSで膜を１５分ずつ３回洗浄する。1％ BSA-PBSで希釈したstreptavidin-horse radish peroxidase conjugate（HRP）(Amersham、＃RPN1231V)とともに１時間反応させる。再び洗浄液で膜を１５分ずつ３回洗浄する。化学発光基質（PierceSuperSignal West DuraExtended Duration Substrate）を用いてα2,6シアル酸含有糖蛋白質のバンドをルミノイメージアナライザー（LAS-1000plus:富士フィルム）で検出し、定量する。結果を図１に示す。α2,6シアル酸を含有する180kD-糖蛋白質、95kD-糖蛋白質、40kD-糖蛋白質がアルツハイマー病患者で増加していることが示された。

実施例２：ウェスタンブロット法
α2,6シアル酸を含有すること、及び分子量を考慮に入れて、180kD-糖蛋白質、95kD-糖蛋白質、40kD-糖蛋白質の同定を試みた。候補となるヒト血清糖蛋白質に対する抗体を購入して調べたところ、40kD-糖蛋白質がハプトグロビンであることが判明した。以下に検出方法を記載する。

ヒト血清あるいは血漿試料（0.04μgの蛋白質に相当）はLaemmli sample bufferと混合して加熱した後に4/20％グラジェントポリアクリルアミドゲルを用いたSDS/PAGEに供する。40mAの定電流で55分電気泳動する。分離された蛋白質はPVDF膜に260mAの定電流で50分間電気的に転写する。膜を5％スキムミルク-0.1％ Tween 20 in Tris buffered saline (TBS)で１時間以上ブロッキングする。3％スキムミルク-TBSに1:1000で希釈したrabbbit anti-human Haptoglobin抗体（Sigma H-8636）(12μg/ml)とニトロセルロース膜を１時間反応させる。0.1％ Tween 20（界面活性剤）in TBSで膜を１５分ずつ3回洗浄する。3％スキムミルク-TBSに1:1000で希釈したAnti-rabbit IgG,Horseradish Peroidase(Amersham, #NA934V) (1 μg/ml)とともに１時間反応させる。再び洗浄液で膜を１５分ずつ3回洗浄する。化学発光基質（PierceSuperSignal West DuraExtended Duration Substrate）を用いてα2,6シアル酸含有糖蛋白質のバンドをルミノイメージアナライザー（LAS-1000plus:富士フィルム）で検出し、定量する。図２に抗ハプトグロビン抗体によるウェスタンブロットの結果を示す。アルツハイマー病でハプトグロビンの増加が確認された。なお、正常人ヒト血清あるいは既知の濃度のHaptoglobin(Sigma, #H0138)を含む標準試料によってあらかじめ検量線作製しておき、これによって定量値を算出することができる。

図１は、ヒト血清のＳＳＡレクチン染色を示す。図２は、ハプトグロビン抗体による40kD-糖蛋白質の検出を示す。

Claims

α2,6シアル酸含有糖蛋白質を検出するためのレクチンを含む、アルツハイマー病の診断薬。
α2,6シアル酸含有糖蛋白質が、180kD-糖蛋白質、95kD-糖蛋白質又は40kD-糖蛋白質である、請求項１に記載の診断薬。
40kD-糖蛋白質を検出するための抗ハプトグロビン抗体をさらに含む、請求項１に記載のアルツハイマー病の診断薬。
ヒト由来の試料に含まれる、α2,6シアル酸含有糖蛋白質を検出又は測定することを含む、アルツハイマー病のスクリーニング方法。
α2,6シアル酸含有糖蛋白質が、180kD-糖蛋白質、95kD-糖蛋白質又は40kD-糖蛋白質である、請求項４に記載の方法。
レクチンを用いてα2,6シアル酸含有糖蛋白質を検出又は測定する、請求項４又は５に記載の方法。
抗ハプトグロビン抗体を用いて40kD-糖蛋白質を検出又は測定する、請求項４又は５に記載の方法。
レクチンと抗ハプトグロビン抗体とを用いたサンドイッチアッセイによりα2,6シアル酸を含有する40kD-糖蛋白質を検出又は測定する、請求項４に記載の方法。
ヒト由来の試料が血液試料である、請求項４から８の何れかに記載の方法。