KR102143190B1

KR102143190B1 - 파킨슨병 치매의 진단 방법 및 이를 위한 진단 키트

Info

Publication number: KR102143190B1
Application number: KR1020190053978A
Authority: KR
Inventors: 안성수; 심규환; 백유진
Original assignee: 주식회사 피플바이오
Priority date: 2019-05-08
Filing date: 2019-05-08
Publication date: 2020-08-11
Also published as: KR20190053159A

Abstract

본 발명은 시누클레인병증의 진단 방법 및 이를 위한 진단 키트에 관한 것이다. 본 발명을 이용하면 신속·정확하게 시누클레인병증의 진단 및 예후 분석을 할 수 있다.

Description

파킨슨병 치매의 진단 방법 및 이를 위한 진단 키트{Diagnostic Method for Parkinson's disease with dementia and Diagnostic Kit therefor}

본 발명은 시누클레인병증의 진단 방법 및 이를 위한 진단 키트에 관한 것이다.

시누클레인병증은 뉴런 및 신경교에 대해 선택적으로 취약한 집단에서 불용성 α-시누클레인 단백질의 응집체로 구성된 일반적인 병적 병변을 공유하는 다양한 그룹의 신경변성 장애이다. 이러한 장애는 파킨슨병, 파킨슨병 치매, 알츠하이머 질환 및 알츠하이머 질환의 루이소체 변이체를 포함한다. 임상적으로, 이들은 병변의 분포에 따라, 운동, 인지, 행동 및 자율신경 기능의 만성적 및 진행적 저하로 특징지어진다.

알파-시누클레인(α-syn)은 신피질, 해마, 치아이랑, 후각망울, 선조체, 시상 및 소뇌에서 광범위하게 발현되는 140개의 아미노산 단백질이다. α-syn은 또한 B-세포, T-세포, 및 NK 세포를 포함하는 조혈 세포뿐만 아니라, 단핵구 및 혈소판에서 고도로 발현된다.

시누클레인병증의 대표적인 질환인 파킨슨병(Parkinson's disease, PD)은 60세 이상의 노인의 1% 정도가 앓고 있는 것으로 알려졌으며, 알츠하이머 다음으로 가장 많은 퇴행성 뇌병이다. 파킨슨병 환자의 신경세포에서 루이소체(lewy body)가 관찰되는데, 이의 주요 구성성분은 α-syn이며, 이는 신경세포에서 시냅스 가소성과 신경 세포 분화에 중요한 역할을 한다. α-syn은 환경에 따라 올리고머 및 피브릴(fibril)을 형성할 수 있다. 최근 연구에서는 올리고머 형태의 α-syn은 신경세포에 손상을 일으키며, 루이소체는 이러한 독성 메커니즘의 방어 기작으로서의 결과물일 수 있다고 보고했다(Winner B et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 108(10):4194-9, 2011).

α-syn은 파킨슨병에서 가장 중요한 단백질로 알려져 있으며, α-syn을 이용하여 파킨슨병을 진단하려는 연구들이 진행되고 있다. 현재 신경촬영법(neuroimaging)과 후각검사(olfaction test)가 파킨슨병을 진단하는데 사용되고 있으나, 아직 많은 정보가 부족하며 가격대비 다른 신경퇴행성 파킨슨증(neurodegenerative parkinsonism)과 구별하는데 적합하지 않다. 다른 대표적인 방법은 ELISA로 혈액과 뇌척수액(cerebrospinal fluid)에 존재하는 α-syn의 양을 측정하는 것이다. 혈액과 뇌척수액에는 모노머, 올리고머 및 인산화된 형태 등 여러 이형태(isoform)의 α-syn이 존재한다. 지금까지의 연구 결과, 혈액에서의 경우 모든 이형태를 전부 검출하는 전체 α-syn(total α-syn)은 환자군과 정상군에서 유의적인 차이가 나타나지 않았다(Park MJ et al. J Clin Neurol. 7(4):215-22, 2011). 뇌척수액의 경우 실험실마다 결과가 다르게 나왔지만, 대부분 정상군에 비해 파킨슨병 환자에서 전체 α-syn은 감소하고, α-syn 올리고머는 증가하는 것으로 확인하였다. 그러나, 뇌척수액의 경우 환자에게 위험부담이 있으며, 혈액의 경우 민감도나 정확도가 파킨슨 환자를 구별하기에 충분하지 않아 현재까지도 파킨슨 환자를 특이적으로 구별할 수 있는 획기적인 바이오마커나 진단방법이 확립되지 않은 상태이다. 최근에는 알츠하이머병, 루게릭병, 헌팅턴병 등 다른 퇴행성 뇌질환과의 연관성이 제시되면서 이 질병간의 차이를 구별할 수 있는 실험법도 필요한 상황이다.

본 발명자들은 파킨슨병을 포함한 시누클레인병증을 신속하고 정확하게 분자진단 할 수 있는 진단 방법을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 인간으로부터 채취한 혈액으로부터 항응고제를 이용하여 혈장을 분리하고, 분리된 혈장에 존재하는 전체 α-syn의 양, α-syn 올리고머의 양 또는 이들의 비 값을 측정하는 것으로, 시누클레인병증의 진단 및 예후 판정이 가능함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 시누클레인병증의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 파킨슨병 치매의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 파킨슨병의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 시누클레인병증의 진단 또는 예후 분석용 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 시누클레인병증(synucleinopathy)의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다:

(a) 인간으로부터 분리된 혈액 및 항응고제를 포함하는 시료를 얻는 단계; 및

(b) 상기 시료에 있는 전체 α-시누클레인(total α-synuclein)의 양을 측정하는 단계로서, 측정된 전체 α-시누클레인의 양이 정상 대조구 시료의 것보다 낮을 경우 시누클레인병증으로 판단한다.

본 명세서에서 용어, "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)(예컨대, 파킨슨병의 단계 결정 또는 치료에 대한 회복 가능성 예측, 전-전이성 또는 전이성 암 상태의 동정, 암의 단계 결정 또는 치료에 대한 암의 반응성 결정)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)를 포함한다.

본 명세서에서 용어, 시누클레인병증은 α-syn의 형성, 침착, 축적, 지속 또는 응집과 관련된 질환을 의미한다. 이러한 질환에는 파킨슨병, 초기 파킨슨병, 파킨슨병 치매, 가족성 파킨슨병, 루이소체 질환, 알츠하이머 질환, 알츠하이머 질환의 루이소체 변이체, 루이 소체 치매, 다계통 위축 및 괌 파킨슨증-치매 복합을 포함한다.

바람직하게는, 상기 시누클레인병증은 파킨슨병, 초기 파킨슨병, 파킨슨병 치매 또는 알츠하이머 질환이다.

본 발명의 단계 (a)에서는 인간으로부터 채취된 혈액과 항응고제를 포함하는 분석대상 시료를 얻는다. 예를 들면, 상기 분석대상 시료는 시누클레인병증 의심 환자로부터 혈액을 채취하고, 이를 항응고제를 포함하는 용기 등에 담는 과정을 통하여 얻을 수 있다. 또는, 혈액 및 항응고제를 포함하는 시료를 제3자로부터 구입 또는 입수함으로써 얻을 수 있다.

바람직하게는, 본 발명에서는 상기 혈액 및 항응고제를 포함하는 시료에 있는 혈장을 분석대상 시료로 이용한다. 혈액에 항응고제를 넣어 저온에 방치해두면 위쪽에는 혈장이, 아래쪽에는 혈구 등의 유형성분으로 나뉘는데, 본 발명에서는 상기 혈장을 이용하는 것이다. 또한, 상기 혈액 및 항응고제를 포함하는 시료를 원심분리 하여 혈장을 분리할 수도 있다.

본 발명자들은 인간의 혈액으로부터 항응고제를 이용하여 분리된 혈장을 시료로 사용하면, 시료 내에 존재하는 본 발명의 마커(전체 α-syn)를 검출함으로써 시누클레인병증의 발병 여부를 신속하고 정확하게 진단할 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 바람직한 하나의 구현예에 따르면, 본 발명의 항응고제는 헤파린, 헤파린염, 와파린, 옥살산염, 시트레이트염디에틸렌트리아민 펜타아세트산(DTPA), 1,2-디아미노시클로헥산 테트라아세트산(DCTA) 및 에틸렌비스(옥시에틸렌니트릴로) 테트라아세트산(EGTA)으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상이다.

바람직하게는, 본 발명의 항응고제는 헤파린 또는 헤파린염이고, 보다 바람직하게는 헤파린이다.

본 발명의 바람직한 하나의 구현예에 따르면, 본 발명의 시료는 혈액 1 ㎖ 당 항응고제 0.02-0.28 mg의 양을 포함한다.

상기 "진단용 마커, 진단하기 위한 마커 또는 진단 마커(diagnosis marker)"란 시누클레인병증을 진단할 수 있는 물질로, 정상인에 비하여 시누클레인병증이 발병한 개체에서 감소 양상을 보이는 단백질과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명의 목적상, 상기 시누클레인병증 진단 마커는 전체 α-syn이다.

본 명세서에서 용어, "전체 α-syn"은 천연형 모노머 α-syn과 이의 이형태(isoform) 모두를 포괄하는 의미이며, 140개의 아미노산으로 이루어진 천연형의 α-syn, 얼터너티브 스플라이싱(alternative splicing)에 의하여 생성된 126개의 아미노산으로 이루어진 α-syn과 112개의 아미노산으로 이루어진 α-syn, 이들의 모노머형의 α-syn, 이들의 올리고머형의 α-syn, 및 이들의 인산화된 형태의 α-syn을 포함한다. 인간 α-syn의 아미노산 서열은 문헌 및 관련 데이터베이스로부터 검색될 수 있다(Ueda et al. ibid. GenBank swissprot: locus SYUA_HUMAN, accession number P37840 참조). 본 발명에서는 시료 내에 존재하는 상기 여러 이형태의 α-시누클레인의 양을 측정하고 정상 대조구 시료의 값과 비교한다.

바람직하게는, 상기 전체 α-syn은 모노머형의 α-syn(140개, 126개 및/또는 112개의 아미노산으로 이루어진 α-syn), 이들의 올리고머형의 α-syn 및/또는 이들의 인산화된 형태의 α-syn이다.

하기 실시예에서 입증된 바와 같이, 파킨슨병 환자, 초기 파킨슨병 환자, 파킨슨병 치매 환자 및 알츠하이머 환자로부터 헤파린을 이용하여 채취한 혈장을 이용하여 상기 전체 α-syn의 양을 측정한 결과, 정상 대조군과 비교할 때 매우 적은 양이 검출되었으며, 통계적으로 유의성이 있었다(도 1 참조).

상기 단계 (b)에서는 시료에 있는 전체 α-syn의 양을 측정하고 정상 대조구 시료의 값과 비교하여 시누클레인병증으로 판단한다. 본 명세서에서 마커의 양을 측정하는 것에는 마커의 존재여부에 대한 확인도 포함된다.

바람직하게는, 상기 전체 α-syn의 양은 혈장에 존재하는 전체 α-syn의 양이다.

본 발명의 바람직한 하나의 구현예에 따르면, 본 발명은 면역분석 방식, 즉 항원-항체 반응 방식으로 실시될 수 있다. 이 경우, 전체 α-syn 양의 측정은, α-syn의 전체 서열 또는 일부 서열을 에피토프로 인식하는 항체를 이용하여 실시된다.

본 발명에서 용어, "항체"란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 또한, 본 발명에서는 2종 이상의 항체를 조합하여 사용할 수도 있다.

α-syn의 전체 서열이 규명되었으므로, 이를 이용하여 α-syn의 전체 서열 또는 일부 서열을 에피토프로 인식하는 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.

상기 다클론 항체는 상기한 마커 단백질을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.

상기 단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler 및 Milstein, European Jounral of Immunology 6:511-519, 1976 참조) 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al. Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al. J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다.

상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전지영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제할 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

본 발명의 방법을 항체를 이용하여 실시하는 경우, 본 발명은 통상적인 면역분석 방법에 따라 실시하여 시누클레인병증을 진단하는데 이용될 수 있다.

이러한 면역분석은 종래에 개발된 다양한 정량적 또는 정성적 면역분석 방법에 따라 실시하여 시누클레인병증을 진단하는데 이용될 수 있다. 상기 면역분석 포맷은 웨스턴 블랏, 엘라이자(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 캡처-엘라이자, 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 상기 예에 의해 본 발명의 분석방법이 제한되는 것은 아니다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzymelinked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C¹⁴, I¹²⁵, P³²및 S³⁵)로 레이블링된 항체가 본 발명의 마커 분자를 검출하는 데 이용될 수 있다.

본 발명의 방법이 ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (ⅰ) 분석하고자 하는 미지의 시료(예컨대, 혈액, 혈장 또는 혈청)를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 일차항체로서의 마커에 대한 항체와 상기 세포 분해물을 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 효소가 결합된 이차항체와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 포함한다.

상기 고체 기질로 적합한 것은 탄화수소 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 젤이며, 가장 바람직하게는 마이크로타이터 플레이트이다.

상기 이차항체에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 및 사이토크롬 P450을 포함한다. 상기 이차항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-ASB1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate)과 같은 기질이 이용될 수 있다.

본 발명의 방법이 캡처-ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (ⅰ) 포획항체(capturing antibody)로서, α-syn에 대해 결합능이 있고 고상의 매트릭스에 고정화된 단일클론 항체에 시료를 접촉시키는 단계; (ⅱ) 상기 단계 (ⅰ)의 결과물에 α-syn에 대해 결합능이 있는 다클론 항체(검출 항체, detecting antibody)를 접촉시키는 단계; 및 (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)에서 형성된 항원-항체 복합체를 검출하는 단계를 포함한다.

본 발명의 바람직한 하나의 구현예에 따르면, 상기 단일클론 항체는 인간 α-시누클레인의 일부 아미노산 서열에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 이용할 수 있고, 상기 다클론 항체는 인간 α-시누클레인의 전장 서열을 에피토프로 하여 제조된 다클론 항체를 이용할 수 있으며, 바람직하게는 상기 단일클론 항체는 LB509 항체이며, 상기 다클론 항체는 FL140 항체이다.

상기 검출 항체는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블을 가지고 있다. 상기 레이블은 화학물질(예컨대, 바이오틴), 효소(알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P450), 방사능물질, 형광물질(예컨대, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질(chemiluminescent) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다양한 레이블 및 레이블링 방법은 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있다.

상기 ELISA 방법 및 캡처-ELISA 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 이러한 시그널이 검출은 본 발명의 마커의 정성적 또는 정량적 분석을 가능하게 한다. 만일, 레이블로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 이용된 경우에는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.

본 발명의 다른 변형예에 따르면, 항체 대신에 α-syn에 특이적으로 결합하는 앱타머를 이용할 수 있다. 앱타머는 올리고핵산 또는 펩타이드 분자, 바람직하게는 펩타이드 분자이며, 앱타머의 일반적인 내용은 Bock LC et al. Nature 355(6360):5646(1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R. "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24):142727(1998)에 상세하게 개시되어 있다.

상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석함으로써, 시누클레인병증을 진단할 수 있다. 즉, 시료에서 본 발명의 마커에 대한 시그널이 정상 시료 보다 약하게 나오는 경우에는 시누클레인병증으로 진단된다.

본 발명의 다른 하나의 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 파킨슨병 치매의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다:

(b) 상기 시료에 있는 올리고머형의 α-시누클레인(α-synuclein oligomers)의 양을 측정하는 단계로서, (ⅰ) 측정된 올리고머형의 α-시누클레인의 양이 파킨슨병 환자 시료의 것보다 낮을 경우 파킨슨병 치매로 판단하거나, 또는 (ⅱ) 측정된 올리고머형의 α-시누클레인의 양이 전두측두엽성 치매(frontotemporal dementia) 환자 시료의 것보다 낮을 경우 파킨슨병 치매로 판단한다.

상기 파킨슨병 치매의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하는 방법과 시누클레인병증의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하는 방법 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 회피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 명세서에서 용어, "파킨슨병 치매"는 치매의 하위질병으로서, 치매의 직/간접적인 원인이 파킨슨병인 질병 또는 치매를 동반한 파킨슨병을 의미한다.

본 명세서에서 용어, "전두측두엽성 치매"는 대뇌의 앞부분인 전두엽(frontal lobe)과 옆부분인 측두엽(temporal lobe)의 변화로 인해 행동 및 성격 변화가 주로 나타나는 퇴행성 치매를 의미한다.

본 발명자들은 인간의 혈액으로부터 항응고제를 이용하여 분리된 혈장을 시료로 사용하면, 시료 내에 존재하는 본 발명의 마커(올리고머 형태의 α-syn)를 검출함으로써 파킨슨병 치매의 발병 여부를 신속하고 정확하게 진단할 수 있음을 확인하였다.

상기 "진단용 마커, 진단하기 위한 마커 또는 진단 마커(diagnosis marker)"란 파킨슨병 치매를 진단할 수 있는 물질로, 파킨슨병 환자 또는 전두측두엽성 치매 환자에 비하여 파킨슨병 치매가 발병한 개체에서 감소 양상을 보이는 단백질과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명의 목적상, 상기 파킨슨병 치매 진단 마커는 α-syn 올리고머이다.

본 명세서에서 용어, "올리고머형의 α-syn" 또는 "α-syn 올리고머"는 α-syn의 이형태 중 하나로서, 2이상의 모노머형의 α-syn이 응집(aggregation)하여 만들어진 소중합체를 의미한다. 본 발명에서는 α-syn 올리고머의 양을 측정하고 파킨슨병 환자 시료의 값 또는 전두측두엽성 치매 환자 시료의 값과 비교한다.

하기 실시예에서 입증된 바와 같이, 파킨슨병 치매 환자로부터 헤파린을 이용하여 채취한 혈장을 이용하여 상기 α-syn 올리고머의 양을 측정한 결과, 파킨슨병 환자 시료의 값 및 전두측두엽성 치매 환자 시료의 값과 비교할 때 적은 양이 검출되었으며, 통계적으로 유의성이 있었다(도 2 참조).

바람직하게는, 상기 α-syn 올리고머의 양은 혈장에 존재하는 α-syn 올리고머의 양이다.

본 발명의 바람직한 하나의 구현예에 따르면, 본 발명은 면역분석 방식, 즉 항원-항체 반응 방식으로 실시될 수 있다. 이 경우, α-syn 올리고머의 존재여부 또는 양의 측정은, α-syn 올리고머에 대한 항체 또는 α-syn에 대한 항체를 이용하여 실시된다.

예를 들어, 본 발명의 방법이 캡처-ELISA 방식으로 실시되는 경우, 동일한 단일클론 항체를 포획항체 및 검출항체로 사용하여 α-syn 올리고머의 양을 측정할 수 있다. 구체적으로, (ⅰ) 포획항체로서, α-syn에 대해 결합능이 있고 고상의 매트릭스에 고정화된 단일클론 항체에 시료를 접촉시키는 단계; (ⅱ) 상기 단계 (ⅰ)의 결과물에 상기 포획항체와 동일한 항체를 검출 항체로서 접촉시키는 단계; 및 (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)에서 형성된 항원-항체 복합체를 검출하는 단계를 포함한다. 이와 같은 방법을 이용하면, 상기 검출항체가 α-syn 올리고머에만 결합할 수 있어 α-syn 올리고머의 양을 측정할 수 있다.

본 발명의 바람직한 하나의 구현예에 따르면, 상기 단일클론 항체는 211 항체이다.

상기 검출항체는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블을 가지고 있으며, 상기 ELISA 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다.

본 발명의 다른 변형예에 따르면, 항체 대신에 α-syn 올리고머에 특이적으로 결합하는 앱타머를 이용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 파킨슨병의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다:

(b) 상기 시료에 있는 전체 α-시누클레인의 양에 대한 올리고머형의 α-시누클레인의 양의 비(올리고머/전체 α-시누클레인 비)를 구하는 단계로서, (ⅰ) 상기 올리고머/전체 α-시누클레인 비 값이 파킨슨병 치매 환자 시료의 것보다 높을 경우 파킨슨병으로 판단하거나, 또는 (ⅱ) 상기 올리고머/전체 α-시누클레인 비 값이 알츠하이머 질환 환자 시료의 것보다 높을 경우 파킨슨병으로 판단한다.

상기 파킨슨병의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하는 방법과 시누클레인병증의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하는 방법 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 회피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 명세서에서 용어, "파킨슨병"은 뇌의 흑질(substantia nigra)에 분포하는 도파민의 신경세포가 점차 소실되어 발생하며 안정떨림, 경직, 운동완만(운동느림) 및 자세 불안정성이 특징적으로 나타나는 신경계의 만성 진행성 퇴행성 질환을 의미한다. 파킨슨병 환자는 60세 이상에서 인구의 약 1% 정도로 추정된다.

본 발명자들은 인간의 혈액으로부터 항응고제를 이용하여 분리된 혈장을 시료로 사용하면, 시료 내에 존재하는 본 발명의 마커(올리고머/전체 α-syn 비)를 검출함으로써 파킨슨병의 발병 여부를 신속하고 정확하게 진단할 수 있음을 확인하였다.

상기 "진단용 마커, 진단하기 위한 마커 또는 진단 마커(diagnosis marker)"란 파킨슨병 치매를 진단할 수 있는 물질로, 파킨슨병 치매 환자 또는 알츠하이머 질환 환자에 비하여 파킨슨병이 발병한 개체에서 증가 양상을 보이는 단백질과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명의 목적상, 상기 파킨슨병 진단 마커는 올리고머/전체 α-syn 비이다.

본 발명에서는 올리고머/전체 α-syn 비를 구하고 파킨슨병 치매 환자 시료의 값 또는 알츠하이머 질환 환자 시료의 값과 비교한다.

하기 실시예에서 입증된 바와 같이, 파킨슨병 환자로부터 헤파린을 이용하여 채취한 혈장을 이용하여 상기 올리고머/전체 α-syn 비를 측정한 결과, 파킨슨병 치매 환자 시료의 값 및 알츠하이머 질환 환자 시료의 값과 비교할 때 높은 양이 검출되었으며, 통계적으로 유의성이 있었다(도 3 참조).

바람직하게는, 상기 올리고머/전체 α-syn 비는 혈장에 존재하는 전체 α-syn 및 α-syn 올리고머의 양을 이용하여 구한다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 시누클레인병증(synucleinopathy)의 진단 또는 예후 분석용 키트를 제공한다:

(a) 항응고제;

(b) α-시누클레인의 전체 또는 일부 아미노산 서열에 결합하는 결합제, 또는 올리고머형의 α-시누클레인에 결합하는 결합제;

상기 결합제는 항체 또는 앱타머이다.

상기 시누클레인병증의 진단 또는 예후 분석용 키트와 시누클레인병증의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하는 방법 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 회피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 바람직한 하나의 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 본 발명의 진단 또는 예후 분석에 필요한 정보를 제공하는 방법에 사용된다.

본 발명의 바람직한 하나의 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 면역분석(immunoassay)용 키트이며, 바람직하게는 상기 면역분석용 키트는 루미넥스 분석 키트, 단백질 마이크로어레이 키트 또는 ELISA 키트이고, 보다 바람직하게는 ELISA 키트이다.

본 발명의 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 추가적으로 포함할 수 있다. ELISA 키트는 마커 단백질 항원에 대한 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 항체는 마커 단백질 항원에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 키트는 복합 마커를 동시에 분석하기 위하여 단백질 마이크로어레이를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 추가적으로 포함할 수 있다. 마이크로어레이 키트는 고체상에 결합된 마커 단백질 항원에 대한 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 단백질 마이크로어레이 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 루미넥스(Luminex) 어세이를 수행할 수 있는 루미넥스 키트는 마커 단백질 항원에 대한 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 루미넥스 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 상기 항체는 미소입자(micro particle)와 접합된 항체(conjugated antibody)일 수 있으며, 또한 상기 미소입자는 착색된 라텍스(colored latex) 또는 콜로이드성 금 입자(colloidal gold particle)일 수 있다.

본 발명의 키트는 상기한 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 시누클레인병증에 대한 신규한 진단 방법 및 키트를 제공한다.

(ⅱ) 본 발명은 인간에게서 채취한 혈액으로부터 항응고제를 사용하여 분리한 혈장을 시료로 이용한다는 것에 특징이 있다.

(ⅲ) 본 발명을 이용하면 신속ㅇ정확하게 시누클레인병증의 진단 및 예후 분석을 할 수 있다.

도 1은 각 군으로부터 채취한 혈장 내에 존재하는 전체 α-syn의 양을 나타낸다.
도 2는 각 군으로부터 채취한 혈장 내에 존재하는 α-syn 올리고머의 양을 나타낸다.
도 3은 각 군으로부터 채취한 혈장 내에 존재하는 전체 α-syn의 양에 대한α-syn 올리고머의 양의 비를 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험방법

환자로부터 혈장 채취

파킨슨병 환자(PD) 9명, 초기 파킨슨병 환자(Early Parkinson's disease, PDE) 3명, 파킨슨병 치매 환자(Parkinson's disease with dementia, PDD) 5명, 알츠하이머 질환 환자(Alzheimer's disease, AD) 20명, 전두측두엽성 치매 환자(frontotemporal dementia, FTD) 10명, 및 정상인(normal control, NC)의 혈액으로부터 혈액 10 ㎖를 채취하였다. 채취된 혈액은 헤파린을 포함하는 용기에 담고 혈액과 항응고제가 충분히 섞이도록 천천히 혼합하였다. 채취된 혈액은 850 xg에서 30분간 원심분리 후 혈구와 섞이지 않게 혈장을 분리하였다.

전체 α-시누클레인 측정

전체 α-시누클레인의 양을 측정하기 위하여 50 mM 카보네이트-바이카보네이트 버퍼에 1 μg/㎖로 희석된 항-α-syn 항체(인간 α-syn의 115-122 아미노산 서열을 인식하는 단일클론 항체, LB509, abcam)를 96 웰 플레이트에 100 ㎕씩 각 웰에 처리하여 코팅하였다. 하룻밤 동안 4℃에서 반응시킨 후 300 ㎕의 트윈 20 함유-PBS(Phosphate buffered saline with tween-20, PBST)로 5번 세척하였다. Block ace(BA) 원액을 증류수에 4배 희석한 뒤 각 웰에 300 ㎕씩 처리한 후 37℃에서 2시간 반응하였다. 처리 후 위와 동일한 방법으로 세척하였다. 환자의 혈장 샘플을 PBST에 10배 희석하고, 표준 재조합 α-syn은 160 ng/㎖에서 0.25 ng/㎖ 까지 2배로 계열 희석하여 준비하였다. 표준 재조합 α-syn과 환자 샘플을 100 ㎕씩 첨가한 후 2시간 동안 37℃에서 반응하고 300 ㎕의 PBST로 5번 세척하였다. 항-α-syn 다클론 항체인 FL140(인간 α-syn의 전장 서열을 에피토프로 하여 제조된 다클론 항체, santa cruz biotechnology)을 PBST에 1 μg/㎖로 희석한 뒤 100 ㎕씩 처리 후 37℃에서 2시간 반응하였다. 세척 후 Goat anti rabbit conjugated HRP 항체를 BA가 10% 첨가된 PBST에 5000배 희석하여 각 웰에 100 ㎕씩 첨가한 후 37℃에서 30분간 반응하였다. 세척 후 강화된 화학발광제(enhanced chemiluminescence, ECL)를 100 ㎕씩 첨가한 후 곧바로 루미날 신호(luminal signal)를 측정하였다.

α-시누클레인 올리고머의 측정

α-syn 올리고머를 측정하기 위하여 200 mM carbonate-bicarbonate 버퍼에 1 μg/㎖로 희석된 항-α-syn 항체(인간 α-syn의 121-125 아미노산 서열을 인식하는 단일클론 항체, 211, santa cruz biotechnology)를 96 웰 플레이트에 100 ㎕씩 각 웰에 처리하여 코팅하였다. 하룻밤 동안 4℃에서 반응시킨 후 300 ㎕의 PBST로 5번 세척하였다. Block ace(BA) 원액을 증류수에 2배 희석한 뒤 각 웰에 300 ㎕씩 처리한 후 37℃에서 2시간 반응하였다. 처리 후 위와 동일한 방법으로 세척하였다. 환자의 혈장 샘플을 PBST에 10배 희석하여 준비하였다. 표준 재조합 α-syn과 환자 샘플을 100 ㎕씩 첨가한 후 2시간 동안 37℃에서 반응하고, 300 ㎕의 PBST로 5번 세척하였다. 비오틴화 211 항체를 PBST에 1 μg/㎖로 희석한 뒤 100 ㎕씩 처리 후 37℃에서 2시간 반응하였다. 세척 후에 streptavidin poly HRP를 BA가 10% 첨가된 PBST에 5000배 희석하여 각 웰에 100 ㎕씩 첨가한 후 37℃에서 30분간 반응하였다. 세척 후 ECL을 100 ㎕씩 첨가한 후 곧바로 루미날 신호를 측정하였다.

통계 분석

실험에서 얻어진 수치는 Minitab 프로그램을 사용하여 통계치를 얻어내었다. 정량치 항목(data type: quantitative value)은 Student's t-test를 사용하여 유의성(p < 0.05, p < 0.01)을 확인하였다.

실험 결과

전체 α-시누클레인

각 군으로부터 채취한 혈액 내에 존재하는 전체 α-syn의 양을 도 1에 나타내었다. 도 1에 나타난 바와 같이, 모든 시누클레인병증(synucleinopathy) 환자군의 전체α-syn의 수치는 정상군(NC)의 수치보다 낮았다. 구체적으로, 파킨슨병 환자군(PD, p=0.002), 초기 파킨슨병 환자군(PDE, p=0.002) 및 파킨슨병 치매 환자군(PDD, p=0.07)의 전체α-syn 수치는 정상군 보다 낮았으며, 통계적으로 유의성이 있었다. 또한, 알츠하이머 질환 환자군(AD, p=0.036)의 전체α-syn 수치 역시 정상군 보다 낮았으며, 통계적으로 유의성이 있었다(도 1).

α-시누클레인 올리고머

각 군으로부터 채취한 혈액 내에 존재하는 α-syn 올리고머의 양을 도 2에 나타내었다. 도 2에 나타난 바와 같이, 파킨슨병 치매 환자군(PDD)의 α-syn 올리고머 수치는 파킨슨병 환자군(PD, p=0.027) 및 전두측두엽성 치매 환자군(FTD, p=0.041) 보다 낮았으며, 통계적으로 유의성이 있었다(도 2).

α-syn 올리고머/전체 α-syn 비

각 군으로부터 채취한 혈액 내에 존재하는 전체 α-syn의 수치에 대한 α-syn 올리고머 수치의 비(올리고머/전체 α-syn 비)를 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타난 바와 같이, 파킨슨병 환자군(PD)의 올리고머/전체 α-syn 비는 파킨슨병 치매 환자군(PDD, p=0.018) 및 알츠하이머 질환 환자군(AD, p=0.018) 보다 높았으며, 통계적으로 유의성이 있었다. 그러나, PDD 환자와 AD 환자의 올리고머/전체 α-syn 비는 통계적인 유의성이 없었다(도 3).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

인간으로부터 분리된 혈액 및 항응고제를 포함하는 시료를 얻는 단계;
전체 α-시누클레인(total α-synuclein)의 양을 측정하는 단계;
올리고머형의 α-시누클레인(α-synuclein oligomers)의 양을 측정하는 단계; 및
전체 α-시누클레인의 양에 대한 올리고머형의 α-시누클레인의 양의 비(올리고머/전체 α-시누클레인 비)를 구하는 단계를 포함하는 파킨슨병 치매(Parkinson's disease with dementia)의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 있어서,
상기 측정된 전체 α-시누클레인의 양이 정상 대조구 시료의 것보다 낮을 경우;
상기 측정된 올리고머형의 α-시누클레인의 양이 파킨슨병(Parkinson's disease) 환자 시료의 것보다 낮을 경우; 또는
상기 측정된 올리고머형의 α-시누클레인의 양이 전두측두엽성 치매(frontotemporal dementia) 환자 시료의 것보다 낮을 경우;
파킨슨병 치매로 판단하는 것인, 방법.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 항응고제는 헤파린, 헤파린염, 와파린, 옥살산염, 시트레이트염디에틸렌트리아민 펜타아세트산(DTPA), 1,2-디아미노시클로헥산 테트라아세트산(DCTA) 및 에틸렌비스(옥시에틸렌니트릴로)테트라아세트산(EGTA)으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 시료는 혈액 1㎖ 당 항응고제 0.02-0.28 mg을 포함하는 것인, 방법.
다음을 포함하는 파킨슨병 치매의 진단용 키트:
(a) 항응고제;
(b) α-시누클레인의 전체 또는 일부 아미노산 서열에 결합하는 결합제, 또는 올리고머형의 α-시누클레인에 결합하는 결합제;
상기 결합제는 항체 또는 앱타머이다.
제 5 항에 있어서, 상기 키트는 면역분석(immunoassay)용 키트인, 키트.