JP7102406B2

JP7102406B2 - エキソソームの亜集団の定量および神経変性障害の診断

Info

Publication number: JP7102406B2
Application number: JP2019526214A
Authority: JP
Inventors: マサト・ミツハシ
Original assignee: Nanosomix Inc
Current assignee: Nanosomix Inc
Priority date: 2016-11-16
Filing date: 2017-11-16
Publication date: 2022-07-19
Anticipated expiration: 2037-11-16
Also published as: JP2022160422A; JP2020500309A; WO2018094120A1; US11852635B2; IL266652A; EP3542159A1; US20190361037A1; EP3542159A4; CA3044048A1

Description

関連出願
本出願は、その全体が出典明示により本明細書に組み込まれる、２０１６年１１月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／４２２，８８９号の優先権を主張する。

技術分野
本発明は、エキソソームの亜集団を定量するための方法および神経変性障害（例えばアルツハイマー病）のための診断および予後判定方法に関する。本発明はまた、エキソソームの亜集団を定量するための組成物並びにアルツハイマー病および他の神経変性障害を治療することにおいて有用な組成物および方法を提供する。

エキソソームは、例えば血漿などの生体試料に存在し、かつ病状（例えばアルツハイマー病）を診断するために使用されてもよい様々なバイオマーカーを保有する。血漿などの生体試料におけるエキソソームの正常なレベルは確立されていない。したがって、生体試料におけるエキソソームを定量する方法が当技術分野で必要とされている。さらに、５４０万人以上のアメリカ人および世界では３５００万人が、認知症の最も一般的な形態であるアルツハイマー病を有する。現在、アルツハイマー病を診断する唯一の確実な方法は、患者の死亡後の脳組織の直接検査によるものである。医師は、アルツハイマー病を有する疑いのある患者における疾患を診断するために、脳イメージング、行動評価、精神医学的検査および他の手段を使用するが、いずれも高い正確性を示さず、かつ多くはコストがかかるか、実用的ではない。

従って、エキソソームを定量するための方法およびアルツハイマー病および他の神経変性障害を診断するためのバイオマーカーおよび方法が当技術分野で必要とされている。さらに、エキソソームを定量するための組成物、ならびにアルツハイマー病および他の神経変性障害を治療するために有用な組成物および方法が、当技術分野で必要とされている。本発明は、アルツハイマー病および他の神経変性障害を診断するための、正確で、非侵襲的な方法を提供することによって、この必要性を満たす。本発明は、さらに、生体試料におけるエキソソームを定量するための新規な方法、アッセイ、キット、および組成物を提供する。

本発明は、以下の工程：（ｉ）エキソソームを含む生体試料を得ること、および（ｉｉ）試料を抗体と接触させること、およびバイオマーカーおよび抗体間の結合を検出することによりバイオマーカーが試料に存在するかどうかを検出すること、ここでバイオマーカーは、シナプトソーム関連タンパク質２５（ＳＮＡＰ２５）、興奮性アミノ酸トランスポーター１（ＥＡＡＴ１）、オリゴデンドロサイト－ミエリン糖タンパク質（ＯＭＧＰ）、ドーパミン受容体１（ＤＲ１）、セロトニン受容体２Ａ（ＳＲ２Ａ）、セロトニン受容体２Ｃ（ＳＲ２Ｃ）、ガンマ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）Ｂ１受容体、グルタミン酸受容体－１（ＧｌｕＲ－１）、オピオイド受容体（ＫＯＲ）、睡眠ペプチドオレキシン受容体（ＯＲ）、およびドーパミントランスポーター（ＤＡＴ）からなる群から選択される、を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、抗体は、抗ＳＮＡＰ２５抗体、抗ＥＡＡＴ１抗体、抗ＯＭＧＰ抗体、抗ＤＲ１抗体、抗ＳＲ２Ａ抗体、抗ＳＲ２Ｃ抗体、抗ＧＡＢＡＢ１抗体、抗ＧｌｕＲ－１抗体、抗ＫＯＲ抗体、抗ＯＲ抗体、および抗ＤＡＴ抗体からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、ＣＤ８１、ＣＤ６３、およびＣＤ９からなる群から選択されるエキソソームバイオマーカーである。他の実施形態ではバイオマーカーは、ＳＮＡＰ２５、ＥＡＡＴ１、ＯＭＧＰ、ＤＲ１、ＳＲ２Ａ、ＳＲ２Ｃ、ＧＡＢＡＢ１、ＧｌｕＲ－１、ＫＯＲ、ＯＲ、およびＤＡＴからなる群から選択される神経バイオマーカーである。他の実施形態では、バイオマーカーは、ドーパミン、セロトニン、ＧＡＢＡ、グルタミン酸、オピオイド、オレキシン、アドレナリン、ノルアドレナリン、アセチルコリン、およびドーパミントランスポーターについての受容体からなる群から選択される。他の実施形態では、該方法は、生体試料における１以上のバイオマーカーのレベルを定量することをさらに含む。さらに他の実施形態では、１以上のバイオマーカーのレベルが生体試料におけるエキソソームの量を決定する。他の実施形態では、エキソソームは、ニューロン由来のエキソソーム、アストロサイト由来のエキソソーム、オリゴデンドロサイト由来のエキソソーム、およびミクログリア由来のエキソソームからなる群から選択される。他の実施形態では、エキソソームは、シナプス前ドーパミン作動性ニューロン由来のエキソソーム、シナプス後ドーパミン作動性ニューロン由来のエキソソーム、セロトニン作動性ニューロン由来のエキソソーム、ＧＡＢＡ作動性ニューロン由来のエキソソーム、グルタミン酸作動性ニューロン由来のエキソソーム、およびオピオイドニューロン由来のエキソソームからなる群から選択される。さらなる他の実施形態では、対象は神経変性障害を有すると診断され、または疑われている。他の実施形態では、神経変性障害は、以下からなる群から選択される：アルツハイマー病（ＡＤ）、血管疾患性認知症、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、レビー小体型認知症、神経原線維変化優位型老年期認知症、ピック病（ＰｉＤ）、嗜銀顆粒病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、他の運動ニューロン疾患、グアムパーキンソン認知症複合、ＦＴＤＰ－１７、リティコ－ボディグ病、多発性硬化症、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、およびパーキンソン病。いくつかの実施形態では、生体試料は、全血、血清、血漿、尿、間質液、腹水、子宮頸部スワブ、涙、唾液、頬スワブ、皮膚、脳組織、および脳脊髄液からなる群から選択される。

本発明は、以下：（ｉ）エキソソームを含む生体試料を得ること、（ｉｉ）試料を１以上の抗体と接触させること、および１以上のエキソソームバイオマーカーおよび１以上の抗体間の結合を検出することにより、１以上のエキソソームバイオマーカーが試料に存在するかどうかを検出すること、ここで、１以上のエキソソームバイオマーカーは、ＣＤ８１、ＣＤ６３、およびＣＤ９からなる群から選択される、および（ｉｉｉ）試料を１以上の抗体と接触させること、および１以上の神経バイオマーカーおよび１以上の抗体間の結合を検出することにより、１以上の神経バイオマーカーが試料に存在するかどうかを検出すること、ここで１以上の神経バイオマーカーは、ＳＮＡＰ２５、ＥＡＡＴ１、ＯＭＧＰ、ＤＲ１、ＳＲ２Ａ、ＳＲ２Ｃ、ＧＡＢＡＢ１、ＧｌｕＲ－１、ＫＯＲ、ＯＲ、およびＤＡＴからなる群から選択される、を含む方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、以下：（ｉ）エキソソームを含む生体試料を得ること、および（ｉｉ）試料における少なくとも１つのエキソソームバイオマーカーおよび少なくとも１つの神経バイオマーカーの量を決定すること。いくつかの実施形態では、エキソソームバイオマーカーは、ＣＤ８１、ＣＤ６３、およびＣＤ９からなる群から選択される。他の実施形態では、神経バイオマーカーは、ＳＮＡＰ２５、ＥＡＡＴ１、ＯＭＧＰ、ＤＲ１、ＳＲ２Ａ、ＳＲ２Ｃ、ＧＡＢＡＢ１、ＧｌｕＲ－１、ＫＯＲ、ＯＲ、およびＤＡＴからなる群から選択される、を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、エキソソームバイオマーカーはＣＤ８１であり、かつ神経バイオマーカーはＳＮＡＰ２５である。いくつかの実施形態では、エキソソームバイオマーカーはＣＤ８１であり、かつ神経バイオマーカーはＥＡＡＴ１である。いくつかの実施形態では、エキソソームバイオマーカーはＣＤ８１であり、かつ神経バイオマーカーはＯＭＧＰである。いくつかの実施形態では、エキソソームバイオマーカーはＣＤ８１であり、かつ神経バイオマーカーはＤＲ１である。いくつかの実施形態では、エキソソームバイオマーカーはＣＤ８１であり、かつ神経バイオマーカーはＳＲ２Ａである。いくつかの実施形態では、エキソソームバイオマーカーはＣＤ８１であり、かつ神経バイオマーカーはＳＲ２Ｃである。いくつかの実施形態では、エキソソームバイオマーカーはＣＤ８１であり、かつ神経バイオマーカーはＧＡＢＡＢ１である。いくつかの実施形態では、エキソソームバイオマーカーはＣＤ８１であり、かつ神経バイオマーカーはＧｌｕＲ－１である。いくつかの実施形態では、エキソソームバイオマーカーはＣＤ８１であり、かつ神経バイオマーカーはＫＯＲである。いくつかの実施形態では、エキソソームバイオマーカーはＣＤ８１であり、かつ神経バイオマーカーはＯＲである。いくつかの実施形態では、エキソソームバイオマーカーはＣＤ８１であり、かつ神経バイオマーカーはＤＡＴである。

他の実施形態では、本発明は、生体試料において二重陽性であるエキソソームのレベルを検出することを含む、生体試料における脳由来のエキソソームのレベルを決定するための方法を提供し、ここで、エキソソームが、少なくとも１つのエキソソームバイオマーカーについて陽性であり、かつ少なくとも１つの神経バイオマーカーについて陽性であり、それにより脳由来のエキソソームのレベルを決定する。いくつかの実施形態では、エキソソームマーカーは、ＣＤ８１、ＣＤ６３、およびＣＤ９からなる群から選択される。他の実施形態では、神経バイオマーカーは、ドーパミン、セロトニン、ＧＡＢＡ、グルタミン酸、オピオイド、オレキシン、アドレナリン、ノルアドレナリン、アセチルコリン、およびドーパミントランスポーターについての受容体からなる群から選択される。他の実施形態では、神経バイオマーカーは、ＳＮＡＰ２５、ＥＡＡＴ１、ＯＭＧＰ、ＤＲ１、ＳＲ２Ａ、ＳＲ２Ｃ、ＧＡＢＡＢ１、ＧｌｕＲ－１、ＫＯＲ、ＯＲ、およびＤＡＴからなる群から選択される。本発明はまた、生体試料において二重陽性であるエキソソームのレベルを検出すること、ここで、エキソソームが、少なくとも１つのエキソソームバイオマーカーについて陽性であり、かつ少なくとも１つの神経バイオマーカーについて陽性であり、それにより脳由来のエキソソームのレベルを決定すること、を含む生体試料における脳由来のエキソソームを単離する方法を提供する。いくつかの実施形態では、エキソソームマーカーは、ＣＤ８１、ＣＤ６３、およびＣＤ９からなる群から選択される。他の実施形態では、神経バイオマーカーは、ＳＮＡＰ２５、ＥＡＡＴ１、ＯＭＧＰ、ＤＲ１、ＳＲ２Ａ、ＳＲ２Ｃ、ＧＡＢＡＢ１、ＧｌｕＲ－１、ＫＯＲ、ＯＲ、およびＤＡＴからなる群から選択される。

本発明はまた、（ｉ）エキソソームを含む生体試料を得ること、（ｉｉ）試料を処理して試料をエキソソームについて単離するまたは濃縮すること、および（ｉｉｉ）生体試料における１以上のバイオマーカーのレベルを検出することを含む方法であって、ここで１以上のバイオマーカーの少なくとも１つは、ＳＮＡＰ２５、ＥＡＡＴ１、ＯＭＧＰ、ＤＲ１、ＳＲ２Ａ、ＳＲ２Ｃ、ＧＡＢＡＢ１、ＧｌｕＲ－１、ＫＯＲ、ＯＲ、およびＤＡＴからなる群から選択される方法を提供する。いくつかの実施形態では、生体試料からエキソソームを濃縮することまたは単離することは、以下を含む：生体試料に存在するエキソソームが薬剤に結合してエキソソーム－薬剤複合体を形成する条件下で生体試料を薬剤と接触させること；およびエキソソーム－薬剤複合体からエキソソームを単離して、エキソソームを含有する試料を得ること、ここで、試料に存在するエキソソームの純度が、生体試料に存在するエキソソームの純度より大きい。他の実施形態では、薬剤は、抗ＣＤ８１抗体、抗ＣＤ６３抗体、抗ＣＤ９抗体または抗ＣＤ１７１抗体である。他の実施形態では、薬剤は、抗ＳＮＡＰ２５抗体、抗ＥＡＡＴ１抗体、抗ＯＭＧＰ抗体、抗ＤＲ１抗体、抗ＳＲ２Ａ抗体、抗ＳＲ２Ｃ抗体、抗ＧＡＢＡＢ１抗体、抗ＧｌｕＲ－１抗体、抗ＫＯＲ抗体、抗ＯＲ抗体、および抗ＤＡＴ抗体である。いくつかの実施形態では、薬剤は固体支持体上に固定化される。他の実施形態では、エキソソームは、ニューロン由来のエキソソーム、アストロサイト由来のエキソソーム、オリゴデンドロサイト由来のエキソソーム、およびミクログリア由来のエキソソームからなる群から選択される。さらに他の実施形態では、対象は神経変性障害を有すると診断され、または疑われている。いくつかの実施形態では、神経変性障害は、以下からなる群から選択される：アルツハイマー病（ＡＤ）、血管疾患性認知症、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、レビー小体型認知症、神経原線維変化優位型老年期認知症、ピック病（ＰｉＤ）、嗜銀顆粒病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、他の運動ニューロン疾患、グアムパーキンソン認知症複合、ＦＴＤＰ－１７、リティコ－ボディグ病、多発性硬化症、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、およびパーキンソン病。他の実施形態では、生体試料は、全血、血清、血漿、尿、間質液、腹水、子宮頸部スワブ、涙、唾液、頬スワブ、皮膚、脳組織、および脳脊髄液からなる群から選択される。

本発明は、生体試料におけるエキソソームを定量するバイオマーカーのセットを提供し、ここでバイオマーカーは、ＳＮＡＰ２５、ＥＡＡＴ１、ＯＭＧＰ、ＤＲ１、ＳＲ２Ａ、ＳＲ２Ｃ、ＧＡＢＡＢ１、ＧｌｕＲ－１、ＫＯＲ、ＯＲ、およびＤＡＴからなる群から選択される。他の実施形態では、本発明は、生体試料におけるエキソソームを定量するバイオマーカーのセットを提供し、ここでバイオマーカーは、ドーパミン受容体、セロトニン受容体、ＧＡＢＡ受容体、グルタミン酸受容体、オピオイド受容体、オレキシン受容体、アドレナリン受容体、ノルアドレナリン受容体、アセチルコリン受容体、およびドーパミントランスポーターからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、セットにおけるバイオマーカーのレベルはアッセイされ；かつバイオマーカーレベルが生体試料におけるエキソソームの量を決定する。他の実施形態では、エキソソームは、ニューロン由来のエキソソーム、アストロサイト由来のエキソソーム、オリゴデンドロサイト由来のエキソソーム、およびミクログリア由来のエキソソームからなる群から選択される。さらに他の実施形態では、生体試料は、全血、血清、血漿、尿、間質液、腹水、子宮頸部スワブ、涙、唾液、頬スワブ、皮膚、脳組織、および脳脊髄液からなる群から選択される。

他の実施形態では、本発明は、対象における神経変性障害を診断する、もしくは予後判定する、神経変性障害のリスクがある対象を同定する、または治療レジメンを処方する、または神経変性障害を有する対象における治療による利益を予想するためのキットであって、該キットがエキソソームに特異的に結合する１以上の薬剤、バイオマーカーに特異的に結合する１以上の薬剤、生体試料を収集し、かつ／または保持するための１以上の容器、およびその使用のための指示書を含み、ここでバイオマーカーは、ＳＮＡＰ２５、ＥＡＡＴ１、ＯＭＧＰ、ＤＲ１、ＳＲ２Ａ、ＳＲ２Ｃ、ＧＡＢＡＢ１、ＧｌｕＲ－１、ＫＯＲ、ＯＲ、およびＤＡＴからなる群から選択される、キットを提供する。いくつかの実施形態では、薬剤は、抗ＳＮＡＰ２５抗体、抗ＥＡＡＴ１抗体、抗ＯＭＧＰ抗体、抗ＤＲ１抗体、抗ＳＲ２Ａ抗体、抗ＳＲ２Ｃ抗体、抗ＧＡＢＡＢ１抗体、抗ＧｌｕＲ－１抗体、抗ＫＯＲ抗体、抗ＯＲ抗体、および抗ＤＡＴ抗体からなる群から選択される。他の実施形態では、エキソソームは、ニューロン由来のエキソソーム、アストロサイト由来のエキソソーム、オリゴデンドロサイト由来のエキソソーム、およびミクログリア由来のエキソソームからなる群から選択される。さらなる他の実施形態では、神経変性障害は、以下からなる群から選択される：アルツハイマー病（ＡＤ）、血管疾患性認知症、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、レビー小体型認知症、神経原線維変化優位型老年期認知症、ピック病（ＰｉＤ）、嗜銀顆粒病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、他の運動ニューロン疾患、グアムパーキンソン認知症複合、ＦＴＤＰ－１７、リティコ－ボディグ病、多発性硬化症、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、およびパーキンソン病。

他の実施形態では、本発明は、対象における神経変性障害を診断する、もしくは予後判定する、神経変性障害のリスクがある対象を同定する、または治療レジメンを処方する、または神経変性障害を有する対象における治療による利益を予想する方法であって：対象からの生体試料における１以上のバイオマーカーのレベルをアッセイすること；およびバイオマーカーのレベルに基づいて、対象における神経変性障害を診断すること、もしくは予後判定すること、神経変性障害のリスクがある対象を同定すること、または治療レジメンを処方すること、または神経変性障害を有する対象における治療による利益を予想すること、ここで１以上のバイオマーカーの少なくとも１つは、ＳＮＡＰ２５、ＥＡＡＴ１、ＯＭＧＰ、ＤＲ１、ＳＲ２Ａ、ＳＲ２Ｃ、ＧＡＢＡＢ１、ＧｌｕＲ－１、ＫＯＲ、ＯＲ、およびＤＡＴからなる群から選択される、を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、生体試料における１以上のバイオマーカーのレベルは、コントロール試料における１以上のバイオマーカーのレベルと比較され、ここで生体試料の１以上のバイオマーカーのレベルはコントロール試料と比較して上昇している。いくつかの実施形態では、生体試料における１以上のバイオマーカーのレベルは、コントロール試料における１以上のバイオマーカーのレベルと比較され、ここで、生体試料の１以上のバイオマーカーのレベルは、コントロール試料と比較して減少している。他の実施形態では、神経変性障害は、以下からなる群から選択される：アルツハイマー病（ＡＤ）、血管疾患性認知症、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、レビー小体型認知症、神経原線維変化優位型老年期認知症、ピック病（ＰｉＤ）、嗜銀顆粒病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、他の運動ニューロン疾患、グアムパーキンソン認知症複合、ＦＴＤＰ－１７、リティコ－ボディグ病、多発性硬化症、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、およびパーキンソン病。他の実施形態では、生体試料は、全血、血清、血漿、尿、間質液、腹水、子宮頸部スワブ、涙、唾液、頬スワブ、皮膚、脳組織、および脳脊髄液からなる群から選択される。他の実施形態では、該方法は、生体試料からエキソソームを単離することをさらに含む。或る実施形態では、単離されたエキソソームは、ニューロン由来のエキソソーム、アストロサイト由来のエキソソーム、オリゴデンドロサイト由来のエキソソーム、およびミクログリア由来のエキソソームからなる群から選択される。他の実施形態では、エキソソームは、シナプス前ドーパミン作動性ニューロン由来のエキソソーム、シナプス後ドーパミン作動性ニューロン由来のエキソソーム、セロトニン作動性ニューロン由来のエキソソーム、ＧＡＢＡ作動性ニューロン由来のエキソソーム、グルタミン酸作動性ニューロン由来のエキソソーム、およびオピオイドニューロン由来のエキソソームからなる群から選択される。他の実施形態では、１以上のバイオマーカーのレベルは１以上のバイオマーカーのタンパク質、ｍＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡレベルである。いくつかの態様では、本発明の方法は、神経変性障害の前臨床から症状発現までの移行を予想することをさらに含む。他の態様では、本発明の方法は、神経変性障害のアウトカムまたは悪化を予想することをさらに含む。さらなる他の態様では、本発明の方法は、アルツハイマー病を予防することを含む。いくつかの態様では、本発明の方法は、軽度の認知機能障害からアルツハイマー病認知症への転換を予想することをさらに含む。他の実施形態では、該方法は、生体試料における１以上のバイオマーカーのレベルを測定することをさらに含み、ここで１以上のバイオマーカーの少なくとも１つは、ＳＮＡＰ２５、ＥＡＡＴ１、ＯＭＧＰ、ＤＲ１、ＳＲ２Ａ、ＳＲ２Ｃ、ＧＡＢＡＢ１、ＧｌｕＲ－１、ＫＯＲ、ＯＲ、およびＤＡＴからなる群から選択される。

本発明はまた、対象における神経変性障害を診断する、もしくは予後判定する、神経変性障害のリスクがある対象を同定する、または治療レジメンを処方する、または神経変性障害を有する対象における治療による利益を予想する方法であって、対象から得られる生体試料からエキソソームを単離すること；およびエキソソームにおける１以上のバイオマーカーのレベルを決定することを含み；ここで、コントロール試料における１以上のバイオマーカーのレベルと比較した試料における１以上のバイオマーカーの上昇したレベルは神経変性障害を示し、ここで１以上のバイオマーカーの少なくとも１つは、ＳＮＡＰ２５、ＥＡＡＴ１、ＯＭＧＰ、ＤＲ１、ＳＲ２Ａ、ＳＲ２Ｃ、ＧＡＢＡＢ１、ＧｌｕＲ－１、ＫＯＲ、ＯＲ、およびＤＡＴからなる群から選択される、方法を提供する。いくつかの実施形態では、生体試料における１以上のバイオマーカーのレベルは、コントロール試料と比較して減少している。いくつかの実施形態では、神経変性障害は、以下からなる群から選択される：アルツハイマー病（ＡＤ）、血管疾患性認知症、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、レビー小体型認知症、神経原線維変化優位型老年期認知症、ピック病（ＰｉＤ）、嗜銀顆粒病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、他の運動ニューロン疾患、グアムパーキンソン認知症複合、ＦＴＤＰ－１７、リティコ－ボディグ病、多発性硬化症、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、およびパーキンソン病。他の実施形態では、生体試料は、全血、血清、血漿、尿、間質液、腹水、子宮頸部スワブ、涙、唾液、頬スワブ、皮膚、脳組織、および脳脊髄液からなる群から選択される。さらに他の実施形態では、単離されたエキソソームは、ニューロン由来のエキソソーム、アストロサイト由来のエキソソーム、オリゴデンドロサイト由来のエキソソーム、およびミクログリア由来のエキソソームからなる群から選択される。他の実施形態では、生体試料からエキソソームを単離することは、以下を含む：生体試料に存在するエキソソームが薬剤に結合してエキソソーム－薬剤複合体を形成する条件下で生体試料を薬剤と接触させること；およびエキソソーム－薬剤複合体からエキソソームを単離して、エキソソームを含有する試料を得ること、ここで、試料に存在するエキソソームの純度が、生体試料に存在するエキソソームの純度より大きい。他の実施形態では、生体試料からエキソソームを単離することは、以下を含む：生体試料からエキソソームを単離してエキソソーム試料を得ること；エキソソーム試料に存在するエキソソームが薬剤に結合してエキソソーム－薬剤複合体を形成する条件下でエキソソーム試料を薬剤と接触させること；およびエキソソーム－薬剤複合体からエキソソームを単離して、エキソソームを含有する試料を得ること、ここで、試料に存在するエキソソームの純度が、生体試料に存在するエキソソームの純度より大きい。特定の態様では、薬剤は、抗体、レクチン、リガンド、可溶性受容体、結合タンパク質、またはオリゴヌクレオチドである。他の態様では、抗体はポリクローナルまたはモノクローナル抗体である。さらなる他の態様では、抗体は、モノクローナルＮＣＡＭ抗体である。他の態様では、抗体は、モノクローナル抗ヒトＮＣＡＭ抗体である。さらなる他の態様では、抗体は、モノクローナルＣＤ１７１抗体である。他の態様では、抗体は、モノクローナル抗ヒトＣＤ１７１抗体である。他の態様では、抗体は、モノクローナルＣＤ９抗体である。他の態様では、抗体は、モノクローナルＣＤ６３抗体である。他の態様では、抗体は、モノクローナルＣＤ８１抗体である。他の態様では、抗体はニューロン特異的エノラーゼ抗体である。他の態様では、抗体は、モノクローナルニューロン特異的エノラーゼ抗体である。他の態様では、抗体は、モノクローナルＳＮＡＰ２５抗体である。他の態様では、抗体は、モノクローナルＥＡＡＴ１抗体である。他の態様では、抗体は、モノクローナルＯＭＧＰ抗体である。他の態様では、抗体は、モノクローナルＤＲ１抗体である。他の態様では、抗体は、モノクローナルＳＲ２Ａ抗体である。他の態様では、抗体は、モノクローナルＳＲ２Ｃ抗体である。他の態様では、抗体は、モノクローナルＧＡＢＡＢ１抗体である。他の態様では、抗体は、モノクローナルＧｌｕＲ－１抗体である。他の態様では、抗体は、モノクローナルＫＯＲ抗体である。他の態様では、抗体は、モノクローナルＯＲ抗体である。他の態様では、抗体は、モノクローナルＤＡＴ抗体である。他の態様では、抗体は、モノクローナルＤＡＴ抗体である。他の態様では、抗体は、モノクローナルドーパミン受容体抗体である。他の態様では、抗体は、モノクローナルセロトニン受容体抗体である。他の態様では、抗体は、モノクローナルＧＡＢＡ受容体抗体である。他の態様では、抗体は、モノクローナルグルタミン酸受容体抗体である。他の態様では、抗体は、モノクローナルオピオイド受容体抗体である。他の態様では、抗体は、モノクローナルオレキシン受容体抗体である。他の態様では、抗体は、モノクローナルアドレナリン受容体抗体である。他の態様では、抗体は、モノクローナルノルアドレナリン受容体抗体である。他の態様では、抗体は、モノクローナルアセチルコリン受容体抗体である。他の態様では、抗体は、モノクローナルドーパミントランスポーター抗体である。他の実施形態では、１以上のバイオマーカーのレベルは１以上のバイオマーカーのタンパク質、ｍＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡレベルである。

本発明は、対象における神経変性障害を診断する、もしくは予後判定する、神経変性障害のリスクがある対象を同定する、または治療レジメンを処方する、または神経変性障害を有する対象における治療による利益を予想する方法であって：
対象から生体試料を得ること；エキソソームに特異的な抗体を試料に適用すること、ここでエキソソームの存在は抗体－エキソソーム複合体を作製する；抗体－エキソソーム複合体を単離すること；抗体－エキソソーム複合体における１以上のバイオマーカーのレベルをアッセイすること；および１以上のバイオマーカーのレベルに基づいて対象における神経変性障害を診断する、もしくは予後判定する、神経変性障害のリスクがある対象を同定する、または治療レジメンを処方する、または神経変性障害を有する対象における治療による利益を予想すること、を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、抗体－エキソソーム複合体は固相上に作製される。さらなる他の実施形態では、該方法は、抗体－エキソソーム複合体からエキソソームを放出させることをさらに含む。或る実施形態では、固相は非磁性ビーズ、磁性ビーズ、アガロース、またはセファロースである。他の実施形態では、エキソソームは抗体－エキソソーム複合体を３．５－１．５間の低ｐＨにさらすことにより放出される。さらなる他の実施形態では、放出されたエキソソームは、高ｐＨ溶液を加えることにより中和される。他の実施形態では、放出されたエキソソームは、放出されたエキソソームを溶解液とインキュベートすることにより溶解される。さらに他の実施形態では、溶解液はプロテアーゼおよびホスファターゼについての阻害剤を含有する。他の実施形態では、１以上のバイオマーカーのレベルは、エキソソームの数またはエキソソームバイオマーカーの値により正規化される。或る実施形態では、抗体はポリクローナルまたはモノクローナル抗体である。他の実施形態では、抗体は、モノクローナルＮＣＡＭ抗体である。他の実施形態では、抗体は、モノクローナル抗ヒトＮＣＡＭ抗体である。さらなる他の態様では、抗体は、モノクローナルＣＤ１７１抗体である。他の態様では、抗体は、モノクローナル抗ヒトＣＤ１７１抗体である。他の態様では、抗体は、モノクローナルＣＤ９抗体である。他の態様では、抗体は、モノクローナルＣＤ６３抗体である。他の態様では、抗体は、モノクローナルＣＤ８１抗体である。他の態様では、抗体はニューロン特異的エノラーゼ抗体である。他の態様では、抗体は、モノクローナルＳＮＡＰ２５抗体である。他の態様では、抗体は、モノクローナルＥＡＡＴ１抗体である。他の態様では、抗体は、モノクローナルＯＭＧＰ抗体である。他の態様では、抗体は、モノクローナルニューロン特異的エノラーゼ抗体である。いくつかの実施形態では、エキソソームは、ニューロン由来のエキソソーム、アストロサイト由来のエキソソーム、オリゴデンドロサイト由来のエキソソーム、およびミクログリア由来のエキソソームからなる群から選択される。さらなる他の実施形態では、生体試料は、全血、血清、血漿、尿、間質液、腹水、子宮頸部スワブ、涙、唾液、頬スワブ、皮膚、脳組織、および脳脊髄液からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、神経変性障害は、以下からなる群から選択される：アルツハイマー病（ＡＤ）、血管疾患性認知症、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、レビー小体型認知症、神経原線維変化優位型老年期認知症、ピック病（ＰｉＤ）、嗜銀顆粒病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、他の運動ニューロン疾患、グアムパーキンソン認知症複合、ＦＴＤＰ－１７、リティコ－ボディグ病、多発性硬化症、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、およびパーキンソン病。他の実施形態では、１以上のバイオマーカーのレベルは１以上のバイオマーカーのタンパク質、ｍＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡレベルである。

本発明は、１以上のバイオマーカーを含む対象の神経変性障害の状態を評価するためのバイオマーカーのセットを提供し、ここでセットにおけるバイオマーカーのレベルはアッセイされ；かつバイオマーカーレベルは少なくとも４０％特異度で対象の神経変性障害の状態を決定する、ここで少なくとも１以上のバイオマーカーのセットは、ＳＮＡＰ２５、ＥＡＡＴ１、ＯＭＧＰ、ＤＲ１、ＳＲ２Ａ、ＳＲ２Ｃ、ＧＡＢＡＢ１、ＧｌｕＲ－１、ＫＯＲ、ＯＲ、およびＤＡＴからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、バイオマーカーレベルは、少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％特異度で対象の神経変性障害の状態を決定する。いくつかの実施形態では、生体試料は、全血、血清、血漿、尿、間質液、腹水、子宮頸部スワブ、涙、唾液、頬スワブ、皮膚、脳脊髄液からなる群から選択される。他の実施形態では、神経変性障害は、以下からなる群から選択される：アルツハイマー病（ＡＤ）、血管疾患性認知症、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、レビー小体型認知症、神経原線維変化優位型老年期認知症、ピック病（ＰｉＤ）、嗜銀顆粒病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、他の運動ニューロン疾患、グアムパーキンソン認知症複合、ＦＴＤＰ－１７、リティコ－ボディグ病、多発性硬化症、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、およびパーキンソン病。さらなる他の実施形態では、該方法は、試料からのエキソソームにおけるバイオマーカーのレベルをアッセイすることをさらに含む。他の実施形態では、本発明のバイオマーカーのセットは、ＳＮＡＰ２５、ＥＡＡＴ１、ＯＭＧＰ、ＤＲ１、ＳＲ２Ａ、ＳＲ２Ｃ、ＧＡＢＡＢ１、ＧｌｕＲ－１、ＫＯＲ、ＯＲ、およびＤＡＴからなる群から選択される１以上のバイオマーカーをさらに含む。

本発明はまた、対象における神経変性障害を診断する、もしくは予後判定する、神経変性障害のリスクがある対象を同定する、または治療レジメンを処方する、または神経変性障害を有する対象における治療による利益を予想するためのキットであって、該キットがエキソソームに特異的に結合する１以上の薬剤、バイオマーカーｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを検出するための１以上のプローブまたはプライマー、生体試料を収集し、かつ／または保持するための１以上の容器、およびその使用のための指示書を含み、ここで、神経変性障害は変化したバイオマーカーレベルと関連し、かつここでバイオマーカーは、ＳＮＡＰ２５、ＥＡＡＴ１、ＯＭＧＰ、ＤＲ１、ＳＲ２Ａ、ＳＲ２Ｃ、ＧＡＢＡＢ１、ＧｌｕＲ－１、ＫＯＲ、ＯＲ、およびＤＡＴからなる群から選択される、キットを提供する。いくつかの実施形態では、薬剤はポリクローナルまたはモノクローナル抗体である。他の実施形態では、エキソソームは、ニューロン由来のエキソソーム、アストロサイト由来のエキソソーム、オリゴデンドロサイト由来のエキソソーム、およびミクログリア由来のエキソソームからなる群から選択される。さらなる他の実施形態では、神経変性障害は、以下からなる群から選択される：アルツハイマー病（ＡＤ）、血管疾患性認知症、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、レビー小体型認知症、神経原線維変化優位型老年期認知症、ピック病（ＰｉＤ）、嗜銀顆粒病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、他の運動ニューロン疾患、グアムパーキンソン認知症複合、ＦＴＤＰ－１７、リティコ－ボディグ病、多発性硬化症、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、およびパーキンソン病。さらに他の実施形態では、生体試料は、全血、血清、血漿、尿、間質液、腹水、子宮頸部スワブ、涙、唾液、頬スワブ、皮膚、脳脊髄液からなる群から選択される。他の実施形態では、キットは、試料におけるバイオマーカーレベルを分析するためのコンピューターモデルまたはアルゴリズムをさらに含む。いくつかの実施形態では、本発明のキットは、ＳＮＡＰ２５、ＥＡＡＴ１、ＯＭＧＰ、ＤＲ１、ＳＲ２Ａ、ＳＲ２Ｃ、ＧＡＢＡＢ１、ＧｌｕＲ－１、ＫＯＲ、ＯＲ、およびＤＡＴからなる群から選択される１以上のバイオマーカーに特異的に結合する１以上の薬剤をさらに含む。

他の実施形態では、本発明は、神経変性障害について、診断すること、予後判定すること、決定すること、治療レジメンを予想すること、または治療による利益を予想することの方法を提供し、ここで複数のバイオマーカーについて対象からの試料におけるバイオマーカーレベルをアッセイすること、ここで、複数のバイオマーカーは、ＳＮＡＰ２５、ＥＡＡＴ１、ＯＭＧＰ、ＤＲ１、ＳＲ２Ａ、ＳＲ２Ｃ、ＧＡＢＡＢ１、ＧｌｕＲ－１、ＫＯＲ、ＯＲ、およびＤＡＴから選択される１以上のバイオマーカーを含む；および複数のバイオマーカーのレベルに基づいて神経変性障害の進行を診断する、予後判定する、決定すること、治療レジメンを予想することまたは神経変性障害を有する対象における治療による利益を予想すること、を含む方法を提供する。一態様では、神経変性障害は、以下からなる群から選択される：アルツハイマー病（ＡＤ）、血管疾患性認知症、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、レビー小体型認知症、神経原線維変化優位型老年期認知症、ピック病（ＰｉＤ）、嗜銀顆粒病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、他の運動ニューロン疾患、グアムパーキンソン認知症複合、ＦＴＤＰ－１７、リティコ－ボディグ病、多発性硬化症、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、およびパーキンソン病。他の実施形態では、該方法は、生体試料における１以上のバイオマーカーのレベルをアッセイすることをさらに含む、ここで１以上のバイオマーカーの少なくとも１つは、ＳＮＡＰ２５、ＥＡＡＴ１、ＯＭＧＰ、ＤＲ１、ＳＲ２Ａ、ＳＲ２Ｃ、ＧＡＢＡＢ１、ＧｌｕＲ－１、ＫＯＲ、ＯＲ、およびＤＡＴからなる群から選択される。

別の実施形態では、本発明は、対象における神経変性障害を診断する、および治療する方法であって：（ａ）対象から試料を得ること、ここで試料は、エキソソームを含む；（ｂ）バイオマーカーを含有する試料を処理して試料をエキソソームについて単離するまたは濃縮すること；および（ｃ）エキソソームにおける１以上のバイオマーカーのレベルを検出すること、（ｄ）コントロール試料におけるレベと比較して試料における１以上のバイオマーカーのレベルに基づいて神経変性障害を有する対象を診断すること；および（ｅ）診断された対象に有効量の治療薬剤を投与すること、を含む方法を提供する。一態様では、神経変性障害は、以下からなる群から選択される：アルツハイマー病（ＡＤ）、血管疾患性認知症、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、レビー小体型認知症、神経原線維変化優位型老年期認知症、ピック病（ＰｉＤ）、嗜銀顆粒病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、他の運動ニューロン疾患、グアムパーキンソン認知症複合、ＦＴＤＰ－１７、リティコ－ボディグ病、多発性硬化症、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、およびパーキンソン病。他の実施形態では、該方法は、生体試料における１以上のバイオマーカーのレベルをアッセイすることをさらに含む、ここで１以上のバイオマーカーの少なくとも１つは、ＳＮＡＰ２５、ＥＡＡＴ１、ＯＭＧＰ、ＤＲ１、ＳＲ２Ａ、ＳＲ２Ｃ、ＧＡＢＡＢ１、ＧｌｕＲ－１、ＫＯＲ、ＯＲ、およびＤＡＴからなる群から選択される。他の実施形態では、エキソソームはニューロン由来のエキソソーム、アストロサイト由来のエキソソーム、オリゴデンドロサイト由来のエキソソーム、またはミクログリア由来のエキソソームである。

いくつかの実施形態では、本発明は、脳由来のエキソソームのレベルを定量する方法であって、生体試料において二重陽性であるエキソソームを検出すること、ここでエキソソームは、ＣＤ８１、ＣＤ６３、およびＣＤ９からなる群から選択される１以上のエキソソームバイオマーカーについて陽性であり、かつ、ここでエキソソームは、ニューロン、アストロサイト、またはオリゴデンドロサイトと特異的な１以上の神経バイオマーカーについて陽性であり、それにより試料における脳由来のエキソソームのレベルを定量すること、を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、１以上の神経バイオマーカーは、ドーパミン、セロトニン、ＧＡＢＡ、グルタミン酸、オピオイド、オレキシン、アドレナリン、ノルアドレナリン、アセチルコリン、およびドーパミントランスポーターについての受容体からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、１以上の神経バイオマーカーは、ＳＮＡＰ２５、ＥＡＡＴ１、ＯＭＧＰ、ＤＲ１、ＳＲ２Ａ、ＳＲ２Ｃ、ＧＡＢＡＢ１、ＧｌｕＲ－１、ＫＯＲ、ＯＲ、またはＤＡＴから選択される。他の実施形態では、該方法は、付着された少なくとも１つのキャプチャー試薬を含む固体支持体上のエキソソームを捕捉することをさらに含み、ここでキャプチャー試薬はＣＤ８１、ＣＤ６３、およびＣＤ９からなる群からの少なくとも１つのバイオマーカーと結合する。

本発明のこれらの、および他の実施形態は、容易に、本明細書の開示に照らして当業者に想起され、全てのそのような実施形態が具体的に企図されている。

本発明の各々の限定は、本発明の様々な実施形態を包含し得る。従って、任意の１つの要素または要素の組み合わせを伴う本発明の各々の限定は、本発明の各態様に含まれ得ると考えられる。本発明は、その適用にあたり、以下詳述される構造の詳細および構成要素の配置に限られない。本発明は他の実施形態が可能であり、様々な方法で実施または具体化することができる。また、本明細書で使用される表現および用語は説明の目的のためであり、限定とみなされるべきではない。本明細書における「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「伴う（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、およびそれらの活用形の使用は、その後に列挙される項目およびその同等物ならびに追加項目を包含することを意味する。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに指示しない限り、複数の言及を含むことに注意しなければならない。

図１Ａ－１Ｅは、スパイクされたエキソソームとの血漿希釈試験を示すデータを示す。図２Ａ－２Ｅは、本発明の例示的なＥＬＩＳＡのアッセイ内およびアッセイ外変動を示すデータを示す。図３Ａ－３Ｅは、コントロール対象および神経変性障害を有する対象におけるエキソソームの血漿レベルを示すデータを示す。図４Ａ－４Ｈは、全エキソソームの血漿レベルおよび脳由来のエキソソームの亜集団間の相互関係を示すデータを示す。図５は、ＳＫ－Ｎ－ＳＨ細胞培養上清から調製されたエキソソームのフローサイトメトリープロフィールを示すデータを示す。図６Ａおよび６Ｂは、抗ＣＤ８１および抗ＣＤ６３抗体のスクリーニングを示すデータを示す。図７は、低い、中間の、高い量のエキソソームの血漿希釈試験を示すデータを示す。図８Ａおよび８Ｂは、ＳＮＡＰ２５－およびＣＤ１７１ベースのニューロン由来のエキソソーム間の違いを示すデータを示す。図９は、本発明の神経バイオマーカーが血漿からエキソソームを検出および単離するために使用され得ることを示すデータを示す。

本発明は、本明細書中に記載された、変化し得るような特定の方法論、プロトコール、細胞株、アッセイ、および薬剤に限られないということが理解されるべきである。また、本明細書で使用される用語は、本発明の特定の実施形態を説明することを意図し、添付の特許請求の範囲に記載の本発明の範囲を限定することを意図するものではないことが理解されるべきである。

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに指示しない限り、複数への言及を含むことに注意しなければならない。従って、例えば「断片」への言及は、そのような断片の複数を含み、「抗体」への言及は、１つ以上の抗体および当業者に知られたその同等物などへの言及である。

特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと、類似もしくは同等の任意の方法および材料を、本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法、装置、および材料が以下に記載されている。本明細書に引用される全ての刊行物は、本発明に関連して使用されてもよい、刊行物で報告された方法論、薬剤、およびツールを説明および開示する目的で、その全体が出典明示により本明細書に組み込まれる。本明細書において、本発明が、先行発明により上述の開示に先行する権利がないと認めるものとして解釈されるべきものはない。

特に指示しない限り、本発明の実施は、当技術分野の技術の範囲内で、化学、生化学、分子生物学、細胞生物学、遺伝学、免疫学および薬理学の従来の方法を採用するだろう。このような技術は、文献に十分に説明されている。例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．Ｒ．，ｅｄ．（１９９０）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈｅｄ．，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．；Ｃｏｌｏｗｉｃｋ，Ｓ．ｅｔａｌ．，ｅｄｓ．，ＭｅｔｈｏｄｓＩｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．；ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．Ｉ－ＩＶ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒａｎｄＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６，ＢｌａｃｋｗｅｌｌＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ｅｔａｌ．，ｅｄｓ．（１９８９）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，２ｎｄｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｏｌｓ．Ｉ－ＩＩＩ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔａｌ．，ｅｄｓ．（１９９９）ＳｈｏｒｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ；Ｒｅａｍｅｔａｌ．，ｅｄｓ．（１９９８）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：ＡｎＩｎｔｅｎｓｉｖｅＬａｂｏｒａｔｏｒｙＣｏｕｒｓｅ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ）；ＰＣＲ（ＩｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎｔｏＢｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓＳｅｒｉｅｓ）、２ｎｄｅｄ．（Ｎｅｗｔｏｎ＆Ｇｒａｈａｍｅｄｓ．，１９９７，ＳｐｒｉｎｇｅｒＶｅｒｌａｇ）を参照のこと。

本発明は、部分的には、エキソソームのバイオマーカーをアッセイして、例えばアルツハイマー病（ＡＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）、および前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）を含む神経変性障害を有する、または発症する可能性のある対象を同定できるという発見に関する。

本発明は、部分的には、神経変性疾患（例えばアルツハイマー病）を有する対象の血液循環中に存在するニューロン由来のエキソソーム中の特定のバイオマーカーの予想外の増加の発見に基づく。本発明は、これらのバイオマーカーのエキソソームのレベルをアッセイして、神経変性疾患を有する対象における神経変性障害を診断し得ることを実証する。本発明は、さらに、対象からのニューロン由来のエキソソーム中の特定のバイオマーカーの測定を用いて、神経変性疾患のその後の発症を予測し得る（例えば、神経変性障害を発症するリスクのある対象を同定し得る）ということを示す。

また、本発明は、本明細書中に記載の方法における使用のための組成物を提供する。かかる組成物は、低分子化合物、抗体もしくはそれらの機能的に活性な断片を含む、ペプチドおよびタンパク質；ならびに低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、およびアンチセンス配列を含む、ポリヌクレオチドを含んでもよい。（Ｚｅｎｇ（２００３）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ１００：９７７９－９７８４；ａｎｄＫｕｒｒｅｃｋ（２００３）ＥｕｒＪＢｉｏｃｈｅｍ２７０：１６２８－１６４４を参照のこと。）

本発明は、さらに、対象における神経変性障害を診断もしくは予後判定する、神経変性障害のリスクのある対象を同定する、または、治療レジメンを処方もしくは神経変性障害を有する対象における治療の利益を予測するためのキットを提供する。これらの実施形態では、キットは、エキソソームに特異的に結合する１つ以上の抗体、バイオマーカーに特異的に結合する１つ以上の抗体、生体試料を収集および／または保持するための１つ以上の容器、およびキットの使用のための指示書を含む。

セクションの見出しは、構成上の目的のためのみに本明細書中で使用され、本明細書に記載の主題を限定するものとして決して解釈されるべきではない。

生体試料
本発明は、アルツハイマー病および他の神経変性障害のための、バイオマーカーならびに診断方法および予後判定方法を提供する。本発明はまた、生体試料におけるエキソソームレベルを定量するためのバイオマーカーを提供する。バイオマーカーおよびエキソソームレベルは対象から得られた生体試料において決定される。いくつかの実施形態では、本発明の生体試料は、血液から得ることができる。いくつかの実施形態では、約１－１０ｍｌの血液が対象から採血される。他の実施形態では、約１０－５０ｍｌの血液が対象から採血される。血液は、腕、脚、または中心静脈カテーテルを介してアクセス可能な血液を含む、身体の任意の適切な領域から採血できる。いくつかの実施形態では、血液は、処置または活動の後に収集される。例えば、血液は、健康診断の後に収集できる。また、収集のタイミングは、試料中に存在するエキソソームの数および／または組成を増加するように調整することができる。例えば、血液は、血管拡張を誘導する運動または処置の後に収集できる。

血液は、その後の技術のために、試料を保存または準備するための収集の後に、様々な成分と組み合わせることができる。例えば、いくつかの実施形態では、血液は、収集後に、抗凝固剤、細胞固定剤、プロテアーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤、タンパク質、ＤＮＡ、もしくはＲＮＡ保存剤で処理される。いくつかの実施形態では、血液は、ＥＤＴＡまたはヘパリンなどの抗凝固剤を含有する真空採取チューブを用いて静脈穿刺によって収集される。また、血液は、ヘパリンコーティングされた注射器および皮下注射針を用いて収集できる。血液はまた、細胞培養のために有用であろう成分と組み合わせることができる。例えば、いくつかの実施形態では、血液は、細胞培養培地または補充した細胞培養培地（例えば、サイトカイン）と組み合わせられる。

生体試料はまた、全血、血清、血漿、尿、間質液、腹水、子宮頸部スワブ、涙、唾液、頬スワブ、皮膚、脳脊髄液、または、例えば脳組織を含む他の組織を含む、当技術分野で知られた他の供給源から得ることができる。

エキソソームの濃縮または単離
試料は、ポジティブセレクション、ネガティブセレクション、またはポジティブセレクションおよびネガティブセレクションの組み合わせを通して、エキソソームについて濃縮され得る。いくつかの実施形態では、エキソソームは直接捕捉される。他の実施形態では、血液細胞が捕捉され、エキソソームは残りの生体試料から収集される。いくつかの実施形態では、生体試料中で濃縮されたエキソソームは、ニューロン由来のエキソソーム、アストロサイト由来のエキソソーム、オリゴデンドロサイト由来のエキソソーム、およびミクログリア由来のエキソソームである。

試料はまた、エキソソームの生化学的特性の差異に基づいて、エキソソームについて濃縮され得る。例えば、試料は、抗原、核酸、代謝、遺伝子発現、またはエピジェネティックな差異に基づいて、エキソソームについて濃縮され得る。抗原の差異に基づくいくつかの実施形態では、磁場勾配における抗体結合磁性もしくは常磁性ビーズまたはフローサイトメトリーと蛍光標識された抗体が使用される。核酸の差異に基づくいくつかの実施形態では、フローサイトメトリーが使用される。代謝の差異に基づくいくつかの実施形態では、フローサイトメトリーにより測定される色素の取り込み／排出または他のソーティング技術が使用される。遺伝子発現に基づく実施形態のいくつかでは、サイトカインとの細胞培養が使用される。試料はまた、当技術分野で知られた他の生化学的特性に基づいて、エキソソームについて濃縮され得る。例えば、試料は、ｐＨおよび運動性に基づいて、エキソソームについて濃縮され得る。さらに、いくつかの実施形態では、１より多くの方法がエキソソームについての濃縮のために使用される。他の実施形態では、試料は、抗体、リガンド、または可溶性受容体を使用してエキソソームについて濃縮される。

他の実施形態では、表面マーカーが、試料中のエキソソームを正に濃縮するために使用される。他の実施形態では、ＮＣＡＭ、ＣＤ１７１、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ニューロン特異的エノラーゼ、多様なニューロンもしくはアストロサイト接着タンパク質、ミクログリアＣＤ１８／１１、またはＣＤ３Ｔ細胞膜の細胞表面マーカーが、エキソソームについての濃縮に使用される。他の実施形態では、ＳＮＡＰ２５、ＥＡＡＴ１、ＯＭＧＰ、ＤＲ１、ＳＲ２Ａ、ＳＲ２Ｃ、ＧＡＢＡＢ１、ＧｌｕＲ－１、ＫＯＲ、ＯＲ、またはＤＡＴがエキソソームの濃縮について使用される。いくつかの実施形態では、エキソソーム集団上で見られない細胞表面マーカーが、細胞集団を枯渇させることにより、エキソソームを負に濃縮するために使用される。また、フローサイトメトリーソーティングが、蛍光標識にコンジュゲートした細胞表面マーカーまたは細胞内もしくは細胞外マーカーを用いて、エキソソームについてさらに濃縮するために使用されてもよい。細胞内および細胞外のマーカーは、核染色、またはエキソソーム中に優先的に発現する細胞内もしくは細胞外タンパク質に対する抗体を含んでもよい。細胞表面マーカーは、エキソソーム上に優先的に発現される細胞表面抗原に対する抗体を含んでいてもよい（例えばＮＣＡＭ）。いくつかの実施形態では、細胞表面マーカーは、例えばＮＣＡＭまたはＣＤ１７１、ＳＮＡＰ２５、ＥＡＡＴ１、ＯＭＧＰ、ＤＲ１、ＳＲ２Ａ、ＳＲ２Ｃ、ＧＡＢＡＢ１、ＧｌｕＲ－１、ＫＯＲ、ＯＲ、またはＤＡＴを含む、ニューロン由来のエキソソーム表面マーカーである。いくつかの実施形態では、モノクローナルＮＣＡＭ、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ニューロン特異的エノラーゼ、ＣＤ１７１、ＳＮＡＰ２５、ＥＡＡＴ１、ＯＭＧＰ、ＤＲ１、ＳＲ２Ａ、ＳＲ２Ｃ、ＧＡＢＡＢ１、ＧｌｕＲ－１、ＫＯＲ、ＯＲ、またはＤＡＴ抗体が、試料からエキソソームを濃縮または単離するために使用される。ある特定の態様において、ＮＣＡＭ、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ニューロン特異的エノラーゼ、ＣＤ１７１、ＳＮＡＰ２５、ＥＡＡＴ１、ＯＭＧＰ、ＤＲ１、ＳＲ２Ａ、ＳＲ２Ｃ、ＧＡＢＡＢ１、ＧｌｕＲ－１、ＫＯＲ、ＯＲ、またはＤＡＴ抗体は、ビオチン化されている。この実施形態では、ビオチン化されたＮＣＡＭまたはＣＤ１７１抗体は、ストレプトアビジン－アガロース樹脂またはビーズを用いて、その後に単離され得る抗体－エキソソーム複合体を形成し得る。他の実施形態では、ＮＣＡＭ、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ニューロン特異的エノラーゼ、ＣＤ１７１、ＳＮＡＰ２５、ＥＡＡＴ１、ＯＭＧＰ、ＤＲ１、ＳＲ２Ａ、ＳＲ２Ｃ、ＧＡＢＡＢ１、ＧｌｕＲ－１、ＫＯＲ、ＯＲ、またはＤＡＴ抗体は、モノクローナル抗ヒトＮＣＡＭ、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ニューロン特異的エノラーゼ、ＣＤ１７１、ＳＮＡＰ２５、ＥＡＡＴ１、ＯＭＧＰ、ＤＲ１、ＳＲ２Ａ、ＳＲ２Ｃ、ＧＡＢＡＢ１、ＧｌｕＲ－１、ＫＯＲ、ＯＲ、またはＤＡＴ抗体である。いくつかの実施形態では、生体試料から濃縮されたエキソソームは、その後、エキソソームの特定のタイプ（例えばエキソソームの亜集団）について濃縮される。例えば、生体試料は、エキソソームについて濃縮され、次いで、濃縮されたエキソソームは、その後、ニューロン由来のエキソソームについて濃縮される。いくつかの実施形態では、生体試料は、エキソソームの個々の神経細胞供給源について濃縮される。ある特定の態様では、エキソソームの神経細胞供給源は、ミクログリア、ニューロン、またはアストロサイトである。

他の実施形態では、表面マーカーはエキソソームの特定のタイプ（例えばニューロン由来のエキソソーム）について濃縮するために使用される。いくつかの実施形態では、ＳＮＡＰ２５、ＥＡＡＴ１、ＯＭＧＰ、ＤＲ１、ＳＲ２Ａ、ＳＲ２Ｃ、ＧＡＢＡＢ１、ＧｌｕＲ－１、ＫＯＲ、ＯＲ、および／またはＤＡＴ細胞表面マーカーは、エキソソームの特定のタイプについて濃縮するために使用される。いくつかの実施形態では、目的のエキソソーム上に見いだされない細胞表面マーカーは、望ましくない細胞集団を枯渇させることによりエキソソームを負に濃縮するために使用される。フローサイトメトリー選別はまた、細胞表面マーカーまたは蛍光標識に結合した細胞内もしくは細胞外マーカーを使用してエキソソームの特定のタイプをさらに濃縮するために使用され得る。細胞内もしくは細胞外マーカーは、核染色または目的のエキソソーム内または上で優先的に発現した細胞内または細胞外タンパク質に対する抗体を含んでもよい。細胞表面マーカーは、エキソソーム上で優先的に発現する細胞表面抗原（例えばＳＮＡＰ２５、ＥＡＡＴ１、ＯＭＧＰ、ＤＲ１、ＳＲ２Ａ、ＳＲ２Ｃ、ＧＡＢＡＢ１、ＧｌｕＲ－１、ＫＯＲ、ＯＲ、およびＤＡＴ）に対する抗体を含んでもよい。いくつかの実施形態では、細胞表面マーカーは例えば、ＳＮＡＰ２５を含むニューロン由来のエキソソーム表面マーカーである。いくつかの実施形態では、細胞表面マーカーは例えば、ＥＡＡＴ１を含むアストロサイト由来のエキソソーム表面マーカーである。いくつかの実施形態では、細胞表面マーカーは例えば、ＯＭＧＰを含むオリゴデンドロサイト由来のエキソソーム表面マーカーである。いくつかの実施形態では、細胞表面マーカーは、ドーパミン、セロトニン、ＧＡＢＡ、グルタミン酸、オピオイド、オレキシン、アドレナリン、ノルアドレナリン、アセチルコリン、および／またはドーパミントランスポーターについての受容体である。いくつかの実施形態では、モノクローナルＳＮＡＰ２５、ＥＡＡＴ１、ＯＭＧＰ、ＤＲ１、ＳＲ２Ａ、ＳＲ２Ｃ、ＧＡＢＡＢ１、ＧｌｕＲ－１、ＫＯＲ、ＯＲ、またはＤＡＴ抗体は、試料からエキソソームを濃縮するまたは単離するために使用される。特定の態様では、ＳＮＡＰ２５、ＥＡＡＴ１、ＯＭＧＰ、ＤＲ１、ＳＲ２Ａ、ＳＲ２Ｃ、ＧＡＢＡＢ１、ＧｌｕＲ－１、ＫＯＲ、ＯＲ、またはＤＡＴ抗体はビオチン化される。この施形態では、ビオチン化ＳＮＡＰ２５、ＥＡＡＴ１、ＯＭＧＰ、ＤＲ１、ＳＲ２Ａ、ＳＲ２Ｃ、ＧＡＢＡＢ１、ＧｌｕＲ－１、ＫＯＲ、ＯＲ、またはＤＡＴ抗体は、ストレプトアビジン－アガロースレジンまたはビーズを使用してその後単離され得る抗体－エキソソーム複合体を形成できる。他の実施形態では、ＳＮＡＰ２５、ＥＡＡＴ１、ＯＭＧＰ、ＤＲ１、ＳＲ２Ａ、ＳＲ２Ｃ、ＧＡＢＡＢ１、ＧｌｕＲ－１、ＫＯＲ、ＯＲ、またはＤＡＴ抗体は、モノクローナル抗ヒトＳＮＡＰ２５、ＥＡＡＴ１、ＯＭＧＰ、ＤＲ１、ＳＲ２Ａ、ＳＲ２Ｃ、ＧＡＢＡＢ１、ＧｌｕＲ－１、ＫＯＲ、ＯＲ、またはＤＡＴ抗体である。

他の実施形態では、エキソソームは生体試料から単離または濃縮され、生体試料中に存在するエキソソームが薬剤に結合してエキソソーム－薬剤複合体を形成する条件下で、生体試料を薬剤と接触させること、およびエキソソーム－薬剤複合体からエキソソームを単離してエキソソームを含有する試料を得ることを含み、ここで、試料中に存在するエキソソームの純度は生体試料中に存在するエキソソームの純度より高い。特定の実施形態では、薬剤は抗体またはレクチンである。エキソソーム－レクチン複合体を形成するのに有用なレクチンは、米国特許出願公開第２０１２／００７７２６３号に記載されている。いくつかの実施形態では、エキソソームは、エキソソーム、微粒子、微エキソソーム、ナノソーム、細胞外エキソソーム、またはエクトソームである。いくつかの実施形態では、エキソソームは、ニューロン由来のエキソソーム、アストロサイト由来のエキソソーム、オリゴデンドロサイト由来のエキソソーム、またはミクログリア由来のエキソソームである。いくつかの実施形態では、複数の単離または濃縮段階が実施される。本実施形態の特定の態様において、第一の単離段階は血液試料からエキソソームを単離するために実施され、第二の単離段階は他のエキソソームからニューロン由来のエキソソームを単離するために実施される。他の実施形態では、エキソソーム－薬剤複合体のエキソソーム部分は、溶解薬剤を用いて溶解され、溶解されたエキソソームのタンパク質レベルが分析される。いくつかの実施形態では、抗体－エキソソーム複合体が固相上に作成される。さらに他の実施形態では、当該方法は、抗体－エキソソーム複合体からエキソソームを放出することをさらに含む。特定の実施形態では、固相は非磁性ビーズ、磁性ビーズ、アガロースまたはセファロースである。他の実施形態では、抗体－エキソソーム複合体を低ｐＨ３．５－１．５にさらすことによって、エキソソームが放出される。さらに他の実施形態では、放出されたエキソソームは、高ｐＨ溶液を加えることによって中和される。他の実施形態では、放出されたエキソソームは、放出されたエキソソームを溶解溶液とインキュベートすることによって溶解される。さらに他の実施形態では、溶解溶液は、プロテアーゼおよびホスファターゼに対する阻害剤を含有する。特定の実施形態では、薬剤は抗体またはレクチンである。エキソソーム－レクチン複合体を形成するのに有用なレクチンは、米国特許出願公開第２０１２／００７７２６３号に記載されている。いくつかの実施形態では、エキソソームは、エキソソーム、微粒子、微エキソソーム、ナノソーム、細胞外エキソソーム、またはエクトソームである。いくつかの実施形態では、エキソソームは、ニューロン由来のエキソソーム、アストロサイト由来のエキソソーム、オリゴデンドロサイト由来のエキソソーム、またはミクログリア由来のエキソソームである。いくつかの実施形態では、複数の単離または濃縮段階が実施される。本実施形態の特定の態様において、第一の単離段階は血液試料からエキソソームを単離するために実施され、第二の単離段階は他のエキソソームからニューロン由来のエキソソームを単離するために実施される。他の実施形態では、エキソソーム－薬剤複合体のエキソソーム部分は、溶解薬剤を用いて溶解され、溶解されたエキソソームのタンパク質レベルが分析される。いくつかの実施形態では、抗体－エキソソーム複合体が固相上に作成される。さらに他の実施形態では、当該方法は、抗体－エキソソーム複合体からエキソソームを放出することをさらに含む。特定の実施形態では、固相は非磁性ビーズ、磁性ビーズ、アガロースまたはセファロースである。他の実施形態では、抗体－エキソソーム複合体を低ｐＨ３．５－１．５にさらすことによって、エキソソームが放出される。さらに他の実施形態では、放出されたエキソソームは、高ｐＨ溶液を加えることによって中和される。他の実施形態では、放出されたエキソソームは、放出されたエキソソームを溶解溶液とインキュベートすることによって溶解される。さらに他の実施形態では、溶解溶液は、プロテアーゼおよびホスファターゼに対する阻害剤を含有する。

神経変性障害
本発明は、対象における神経変性障害を診断する、もしくは予後判定する、神経変性障害のリスクがある対象を同定する、または治療レジメンを処方する、または神経変性障害を有する対象における治療による利益を予想する方法を提供する。

いくつかの実施形態では、神経変性障害は、以下からなる群から選択される：アルツハイマー病（ＡＤ）、血管疾患性認知症、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、レビー小体型認知症、神経原線維変化優位型老年期認知症、ピック病（ＰｉＤ）、嗜銀顆粒病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、他の運動ニューロン疾患、グアムパーキンソン認知症複合、ＦＴＤＰ－１７、リティコ－ボディグ病、多発性硬化症、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、およびパーキンソン病。

いくつかの実施形態では、本発明は、医師が対象における１つ以上の神経変性障害を診断または予後判定することを可能にする。他の実施形態では、本発明は、医師が診断可能性としての１つ以上の神経変性疾患を除外または排除することを可能にする。さらに他の実施形態では、本発明は、医師が神経変性障害を発症するリスクのある対象を同定することを可能にする。他の実施形態では、本発明は、医師が、対象が後に神経変性障害を発症するかどうかを予測することを可能にする。さらなる実施形態では、本発明は、医師が、治療レジメンを処方もしくは神経変性障害を有する対象における治療の利益を予測することを可能にする。

バイオマーカー
バイオマーカーレベルは神経変性障害（例えばアルツハイマー病）を有するまたは有するリスクがある対象から得られる生体試料においてアッセイされる。いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、ドーパミン、セロトニン、ＧＡＢＡ、グルタミン酸、オピオイド、オレキシン、アドレナリン、ノルアドレナリン、アセチルコリン、および／またはドーパミントランスポーターについての受容体である。いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、ＳＮＡＰ２５、ＥＡＡＴ１、ＯＭＧＰ、ＤＲ１、ＳＲ２Ａ、ＳＲ２Ｃ、ＧＡＢＡＢ１、ＧｌｕＲ－１、ＫＯＲ、ＯＲ、および／またはＤＡＴである。他の既知の神経変性障害バイオマーカーは本発明のバイオマーカーと組み合わせて使用されてもよい。かかるバイオマーカーの例は、出典明示により組み込まれる米国特許出願公報第２０１５／０１１９２７８号内容に提供される。

いくつかの実施形態では、本発明のバイオマーカーレベルは、バイオマーカーの量または遺伝子発現を決定することにより測定される。特定の実施形態では、表１に示される１つ以上の遺伝子の発現レベルを決定することにより、遺伝子発現の変化が測定される。特定の態様では、バイオマーカーの遺伝子発現は、ＰＣＲ、マイクロアレイまたはシーケンシングを使用して決定される。いくつかの実施形態では、バイオマーカーの発現レベルは、バイオマーカーのｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡのレベルを測定することによって決定される。

当業者は、本発明のマーカーの検出および分析のために利用可能ないくつかの方法および装置を有する。患者試験試料中のポリペプチドまたはタンパク質に関して、多くの場合イムノアッセイ装置および方法が利用される。これらの装置および方法は、目的の分析物の存在または量に関するシグナルを生成するために、様々なサンドイッチ（ｓａｎｄｗｉｃｈ）、競合、または非競合アッセイ形式で標識分子を利用することができる。さらに、バイオセンサーおよび光学的イムノアッセイなどの特定の方法および装置が、標識分子を必要とすることなく、分析物の存在および量を決定するために使用されてもよい。

他の方法（例えば、マーカーＲＮＡレベルの測定）は、当業者に良く知られているが、好ましくは、マーカーはイムノアッセイを使用して分析される。マーカーの存在または量は、一般的に、各マーカーに特異的な抗体を使用して、かつ特異的な結合を検出して、決定される。任意の適切なイムノアッセイ、例えば、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、競合結合アッセイ、プレーナーウェイブガイド技術などが利用されてもよい。マーカーに対する特異的な抗体の免疫学的結合は、直接的にまたは間接的に決定され得る。直接標識は、抗体に結合した蛍光もしくは発光タグ、金属、色素または放射性核種などを含む。間接標識は、アルカリホスファターゼ、西洋わさびペルオキシダーゼなどの当技術分野でよく知られた種々の酵素を含む。

マーカーに特異的な固定化抗体の使用も、本発明によって企図される。抗体は、磁気もしくはクロマトグラフィーマトリックス粒子、アッセイ場所（マイクロタイターウェルなど）の表面、固体基板材料片（プラスチック、ナイロン、紙など）等などの、種々の固体支持体上に固定化され得る。アッセイストリップは固体支持体上のアレイに抗体または複数の抗体をコーティングすることによって調製できる。このストリップを、試験試料中に浸漬し、次いで、洗浄および検出段階を経て迅速に処理して、着色されたスポットなどの測定可能なシグナルを生成できる。

複数のマーカーの分析は１つの試験試料と別々にまたは同時に行ってもよい。複数の試料の効率的な処理のために、いくつかのマーカーは１つの試験に組み合わされてもよい。さらに、当業者は、同じ個体からの複数の試料（例えば、連続した時点）を試験する価値を認識するだろう。そのような連続した試料を試験することは、経時的なマーカーレベルの変化の同定を可能にするだろう。マーカーレベルの増加または減少だけでなく、マーカーレベルの変化の非存在は、事象の開始からのおおよその時間を同定すること、救助可能な組織（ｓａｌｖａｇｅａｂｌｅｔｉｓｓｕｅ）の存在および量、薬物療法の妥当性、様々な治療法の有効性、事象の重症度の同定、疾患の重症度の同定、ならびに将来の事象のリスクを含む患者の治療結果（アウトカム）の同定に限定されるものではないが、これらを含む、疾患状態についての有用な情報を提供するだろう。

本発明で参照されるマーカーの組み合わせからなるアッセイを構築し、鑑別診断に関する関連情報を提供してもよい。そのようなパネルは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０もしくはそれ以上、または個別のマーカーを使用して構築されてもよい。単一のマーカー、またはより大きなマーカーのパネルを含むマーカーのサブセットの分析を本発明内に記載された方法において実施し、種々の臨床状況における臨床的感度または特異度を最適化することができる。

マーカーの分析は、同様に種々の物理的形式において実施され得る。例えば、マイクロタイタープレートの使用または自動化を用いて、多数の試験試料の処理を容易にすることができる。あるいは、単一試料形式を開発し、例えば、外来輸送（ａｍｂｕｌａｔｏｒｙｔｒａｎｓｐｏｒｔ）または緊急治療室の状況において、時機を逸せずに迅速な処置および診断を容易にすることができる。特に、有用な物理形式は、複数の異なる検体の検出のための、複数の不連続な、アドレス可能な位置を有する表面を含む。かかる形式はプロテインマイクロアレイもしくは「プロテインチップ」およびキャピラリー装置を含む。

本発明のバイオマーカーは、神経変性障害（例えばアルツハイマー病）早期検出およびモニタリングにおいて、重要な役割を果たす。かかる障害のマーカーは典型的に、測定することができる身体試料中に見られる物質である。測定された量は、基礎障害もしくは疾患の病態生理、神経変性障害の存在もしくは非存在、または将来の神経変性障害の可能性に相関し得る。患者の状態の治療を患者が受ける際に、測定された量はまた、治療の反応性に相関するだろう。いくつかの実施形態では、本発明の１以上のバイオマーカーのレベルの増加は第一の神経変性障害を示し、かつ同じ１以上のバイオマーカーのレベルの減少は第二の神経変性障害を示す。したがって、本発明の方法は神経変性障害の鑑別診断に有用である。

いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、免疫組織化学、免疫細胞化学、免疫蛍光、免疫沈降、ウェスタンブロッティング、およびＥＬＩＳＡからなる群から選択される方法で測定される。

臨床アッセイ性能
本発明の方法は、対象における神経変性障害を診断もしくは予後判定する、神経変性障害のリスクのある対象を同定する、および／または、治療レジメンを処方もしくは神経変性障害を有する対象における治療の利益を予測するために、臨床アッセイにおいて用いられてもよい。臨床アッセイ性能は、アッセイの感度、特異度、ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）、精度、陽性適中率（ＰＰＶ）、および陰性適中率（ＮＰＶ）を決定することによって評価できる。本明細書中に開示されているものは、対象における神経変性障害を診断もしくは予後判定する、神経変性障害のリスクのある対象を同定する、または、治療レジメンを処方もしくは神経変性障害を有する対象における治療の利益を予測するためのアッセイである。

アッセイの臨床性能は感度に基づいてもよい。本発明のアッセイの感度は、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％であってもよい。アッセイの臨床性能は特異度に基づいてもよい。本発明のアッセイの特異度は、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％であってもよい。アッセイの臨床性能はＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）に基づいてもよい。本発明のアッセイのＡＵＣは、少なくとも約０．５、０．５５、０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９または０．９５であってもよい。アッセイの臨床性能は精度に基づいてもよい。本発明のアッセイの精度は、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％であってもよい。

組成物
本発明の方法において有用な組成物は、神経変性障害に関連するバイオマーカーを特に認識する組成物であり、当該バイオマーカーは、ＳＮＡＰ２５、ＥＡＡＴ１、ＯＭＧＰ、ＤＲ１、ＳＲ２Ａ、ＳＲ２Ｃ、ＧＡＢＡＢ１、ＧｌｕＲ－１、ＫＯＲ、ＯＲ、およびＤＡＴである。さらに他の実施形態では、組成物は、ペプチド、核酸、抗体および低分子からなる群から選択される。

或る実施形態では、本発明は、神経変性障害に関連するバイオマーカーを特異的に検出する組成物に関する。本明細書の他の場所で詳述されるように、本発明は、ＳＮＡＰ２５、ＥＡＡＴ１、ＯＭＧＰ、ＤＲ１、ＳＲ２Ａ、ＳＲ２Ｃ、ＧＡＢＡＢ１、ＧｌｕＲ－１、ＫＯＲ、ＯＲ、およびＤＡＴが神経変性障害の診断において使用され得るエキソソームの亜集団に特異的なバイオマーカーであるという発見に基づく。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、ＳＮＡＰ２５、ＥＡＡＴ１、ＯＭＧＰ、ＤＲ１、ＳＲ２Ａ、ＳＲ２Ｃ、ＧＡＢＡＢ１、ＧｌｕＲ－１、ＫＯＲ、ＯＲ、およびＤＡＴに特異的に結合し、かつ検出する。他の実施形態では、本発明の組成物は、ドーパミン、セロトニン、ＧＡＢＡ、グルタミン酸、オピオイド、オレキシン、アドレナリン、ノルアドレナリン、アセチルコリン、および／またはドーパミントランスポーターについての受容体に特異的に結合し、かつ検出する。

いくつかの実施形態では、組成物は抗体を含み、前記抗体は本発明のバイオマーカーまたはエキソソームと特異的に結合する。本明細書中で使用され、さらに以下に説明される「抗体」なる用語は、バイオマーカーまたはエキソソーム（例えばエキソソーム）と特異的に反応する、それらの断片を含むことを意図している。抗体は従来の技術を用いて断片化することができ、全長抗体（ｗｈｏｌｅａｎｔｉｂｏｄｙ）に関して上記に記載したものと同じ方法で、断片は有用性についてスクリーニングできる。例えば、Ｆ（ａｂ）_２断片は、ペプシンで抗体を処理することによって生成され得る。得られたＦ（ａｂ）_２断片をジスルフィド架橋を還元するように処理して、Ｆａｂ断片を産生することができる。抗原結合部位はまた、組換えＤＮＡ技術により、または無傷の（ｉｎｔａｃｔ）抗体の酵素的もしくは化学的切断により、産生されてもよい。抗原結合部位は、とりわけ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、ｄＡｂ、および相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、二重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ダイアボディ、および、ポリペプチドに特異的抗原結合を付与するために十分な、少なくとも免疫グロブリンの部分を含有するポリペプチドを含む。特定の実施形態では、抗体は、抗体に結合し、かつ検出され得る、標識をさらに含む（例えば、標識は放射性同位体、蛍光物質、酵素または酵素の補酵素とすることができる）。

特定の実施形態では、本発明の抗体はモノクローナル抗体であり、かつ特定の実施形態では、本発明は、本発明のバイオマーカーまたはエキソソームに特異的に結合する新規抗体を生成するための方法を利用可能にする。例えば、バイオマーカーまたはエキソソームに特異的に結合するモノクローナル抗体を生成するための方法は、検出可能な免疫応答を刺激するのに有効な、バイオマーカーもしくはエキソソーム、またはそれらのフラグメントを含む免疫原性組成物の量をマウスへ投与すること、マウスから抗体産生細胞（例えば、脾臓由来の細胞）を得て、抗体産生ハイブリドーマを得るために、骨髄腫細胞と抗体産生細胞を融合すること、および、バイオマーカーまたはエキソソームに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定するために抗体産生ハイブリドーマを試験することを含んでもよい。いったん得られると、ハイブリドーマは細胞培養で、任意に、ハイブリドーマ由来の細胞がバイオマーカーまたはエキソソームに特異的に結合するモノクローナル抗体を生成する培養条件で、増殖され得る。モノクローナル抗体は、細胞培養物から精製されてもよい。

抗体に関して使用される「と特異的に反応する」という用語は、当技術分野において一般に理解されるように、抗体が目的の抗原（例えばバイオマーカーまたはエキソソーム）と目的でない他の抗原の間で、十分に選択的であることを意味することを意図している。治療応用などの抗体を使用する特定の方法では、結合におけるより高い程度の特異性が望まれてもよい。モノクローナル抗体は、一般に、所望の抗原と、交差反応するポリペプチドとの間で効果的に識別する、より大きな傾向（ポリクローナル抗体と比較して）を有する。抗体：抗原相互作用の特異性に影響する１つの特徴は、抗原に対する抗体のアフィニティーである。所望の特異性は異なるアフィニティーの範囲に到達してもよいが、一般に、好ましい抗体は、約１０^－６、１０^－７、１０^－８、１０^－９またはそれ以下のアフィニティー（解離定数）を有するだろう。

抗体は、例えば、ニューロン由来のエキソソーム、アストロサイト由来のエキソソーム、オリゴデンドロサイト由来のエキソソーム、ＳＮＡＰ２５、ＥＡＡＴ１およびＯＭＧＰを含む本発明のエキソソームのエピトープまたはバイオマーカーに特異的に結合するよう生成され得る。いくつかの実施形態では、ニューロン由来のエキソソームはシナプス前ドーパミン作動性ニューロン由来のエキソソーム、またはシナプス後ドーパミン作動性、セロトニン作動性、ＧＡＢＡ作動性、グルタミン酸作動性、およびオピオイドニューロン由来のエキソソームである。

また、所望の抗体を同定する目的で抗体をスクリーニングするために用いられる技術は、得られる抗体の性質に影響してもよい。種々の異なる技術は、特に望ましい抗体を同定するために、抗体抗原間の相互作用を試験するために利用できる。このような技術は、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴結合アッセイ（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ結合アッセイ、ＢｉａｃｏｒｅＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）、サンドイッチアッセイ（例えば、常磁性ビーズシステム、ＩＧＥＮＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ．）、ウェスタンブロット、免疫沈降アッセイ、免疫細胞化学、および免疫組織化学を含む。

いくつかの実施形態では、本発明は、神経変性障害を治療するまたは予防するために使用される組成物に関する。本明細書の他の場所で詳述されるように、本発明は、ＳＮＡＰ２５、ＥＡＡＴ１、ＯＭＧＰ、ＤＲ１、ＳＲ２Ａ、ＳＲ２Ｃ、ＧＡＢＡＢ１、ＧｌｕＲ－１、ＫＯＲ、ＯＲ、およびＤＡＴがエキソソームの特定の亜集団についての細胞表面マーカーであるという発見に基づく。したがって、一実施形態では、本発明は、エキソソームの亜集団を検出すること、および／または定量することに有用な組成物を提供する。

治療方法
本発明は、対象からの生体試料におけるＳＮＡＰ２５、ＥＡＡＴ１、ＯＭＧＰ、ＤＲ１、ＳＲ２Ａ、ＳＲ２Ｃ、ＧＡＢＡＢ１、ＧｌｕＲ－１、ＫＯＲ、ＯＲ、および／またはＤＡＴを検出すること、および神経変性障害を治療する有効量の組成物を対象に投与することを含む、対象における神経変性障害を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、神経変性障害は、以下からなる群から選択される：アルツハイマー病（ＡＤ）、血管疾患性認知症、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、レビー小体型認知症、神経原線維変化優位型老年期認知症、ピック病（ＰｉＤ）、嗜銀顆粒病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、他の運動ニューロン疾患、グアムパーキンソン認知症複合、ＦＴＤＰ－１７、リティコ－ボディグ病、多発性硬化症、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、およびパーキンソン病。他の実施形態では、生体試料は、全血、血清、血漿、尿、間質液、腹水、子宮頸部スワブ、涙、唾液、頬スワブ、皮膚、脳組織、および脳脊髄液からなる群から選択される。

キット
本発明の別の態様は、対象における神経変性障害を検出またはモニタリングするためのキットを包含する。様々な構成要素を有する種々のキットが、本発明により企図されている。一般的に言うと、キットは対象から得られる生体試料におけるにおける１つ以上のバイオマーカーを定量するための手段を含む。別の実施形態では、キットは生体試料を収集するための手段、生体試料中の１つ以上のバイオマーカーを定量する手段、およびキットの内容物の使用のための説明書を含む。特定の実施形態では、キットは生体試料中のエキソソームを濃縮または単離するための手段を含む。さらなる態様では、エキソソームを濃縮または単離するための手段は、生体試料からエキソソームを濃縮または単離するために必要な試薬を含む。特定の態様では、キットは、バイオマーカーまたはエキソソームの特定のタイプ（例えばニューロン由来のエキソソーム）の量を定量するための手段を含む。さらなる態様では、バイオマーカーの量を定量するための手段は、バイオマーカーの量を検出するために必要な試薬を含む。

本発明のこれら、および他の実施形態は、容易に、本明細書の開示に鑑みて当業者に想起されるだろう。

本発明は、本発明の単なる例示であるよう意図された、以下の実施例を参照することによってさらに理解されるだろう。これらの実施例は、本発明を例示するためにのみ提供される。本発明は、本発明の単一の態様の例示としてのみ意図されている例示の実施形態によって範囲は限定されない。機能的に同等である任意の方法は、本発明の範囲内である。本明細書に記載したものに加えて、本発明の種々の改変は、前述の説明から当業者に明らかになるだろう。このような改変は、添付の特許請求の範囲内に入ることが意図される。

実施例１：生体試料からのエキソソームの亜集団の単離および定量
エキソソームの特定の亜集団は以下のように生体試料から単離され、定量される。ＥＬＩＳＡアッセイはホワイトＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔｅｒ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）、ＥＬＩＳＡコーテイングバッファ、およびＥＬＩＳＡ洗浄バッファ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して実施した。抗体は、抗ＣＤ８１（ＢＤＰｈａｒｍｉｇｅｎ，ＳａｎＪｏｓｅ、ＣＡ）、抗ＣＤ６３（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ，ＮｏｒｔｈＷａｌｅｓ、ＰＡ）、および抗ＳＮＡＰ２５（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＤａｌｌａｓＴＸ）を含んだ。ビオチン化抗体は、抗ＣＤ８１（ＬＳＢｉｏ，Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ、およびＭＢＬ，Ｎａｇｏｙａ，Ａｉｃｈｉ，Ｊａｐａｎ）、抗ＣＤ１７１（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）、および抗ＳＮＡＰ２５（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＷａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を含んだ。ＥＡＡＴ１およびＯＭＧＰ（Ｂｉｏｓｓ抗体，Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）に対する非コンジュゲートおよびビオチン化抗体もまた利用した。追加の材料には、正常マウスＩｇＧ（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＤａｌｌａｓＴＸ）、ＥｘｏＱｕｉｃｋ（ＳｙｓｔｅｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＰａｌｏＡｌｔｏ、ＣＡ）、ヒト血漿（ＩｎｎｏｖａｔｉｖｅＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｎｏｖｉ、ＭＩ；ＰｒｅｃｉｓｉｏｎＭｅｄ，ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ；ＢｉｏＲｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ，Ｃｈｅｓｔｅｒｔｏｗｎ、ＭＤ）、ｔｗｅｅｎ－２０（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、ＥＺ－ＬｉｎｋＳｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ビオチン、Ｚｅｂｒａスピンカラム、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、１０％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ブロッカーカゼイン、ストレプトアビジン（ＳＡ）Ｐｏｌｙ－ＨＲＰ、ＨＲＰ基質スーパーシグナル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ヒト神経芽腫細胞系（ＳＫ－Ｎ－ＳＨ、ＲＩＫＥＮＢＲＣ，Ｔｓｕｋｕｂａ，Ｉｂａｒａｋｉ，Ｊａｐａｎ）、およびＮ２サプリメント（ＷａｋｏＰｕｒｅＣｈｅｍｉｃａｌｓＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ．，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を含んだ。

ＥｘｏＱｕｉｃｋを使用して様々なヒト血漿および培養上清から全エキソソームを調製し、ＰＢＳ中に懸濁した。Ｈａｒｔｌｅｙｅｔａｌ（１０）の方法に従ってＳＫ－Ｎ－ＳＨ細胞を１ｘ１０^－５Ｍのａｌｌ－ｔｒａｎｓレチノイン酸の存在下で培養し、続いてＮ２サプリメントを伴う血清フリーＨａｍＦ－１２／Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地で７日培養した。培養上清を収集し、アリコートを－８０℃冷凍庫で保存した。ＣＤ８１およびＣＤ１７１表面マーカーの二重発現をフローサイトメトリーにより確認した（図５）。

様々な濃度の抗体を１ＸＥＬＩＳＡコーテイングバッファに懸濁し、５０μＬをホワイトＥＬＩＳＡストリップの各ウェルに分注した。次にストリップを冷蔵庫内で一晩７００ｒｐｍで一定に振盪しながらインキュベートした。各ウェルを１Ｘ洗浄バッファで１回洗浄した後、１％ＢＳＡを補充した７５μＬのブロッカーカゼインを加え、室温で１時間、７００ｒｐｍで一定に振盪しながらインキュベートした。インキュベーション後、各ウェルを１Ｘ洗浄バッファで２回洗浄し、そして使用するまで冷蔵庫に保存した。

ＥＺ－ＬｉｎｋＳｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ビオチン（Ｔｈｅｒｍｏ）のプロトコールに従って、抗体をビオチン化し、および遊離ビオチンは試料をスピンカラムにアプライすることにより除去した。

５０μＬの抗体を固定化に使用したため、ＥＬＩＳＡを最終容量４０μＬで実施した。標準および試料を４０μＬのＰＢＳに懸濁し、ＥＬＩＳＡウェルにアプライし、７００ｒｐｍで一定に振盪しながら冷蔵庫で一晩インキュベートした。各ウェルを１Ｘ洗浄バッファで二回洗浄した後、１％ｔｗｅｅｎ２０（ｔＰＢＳ）、１％ＢＳＡ、ビオチン化抗体、およびマウスＩｇＧ（４μｇ／ｍＬ）を加えた４０μＬのＰＢＳを各ウェルに加え、そして室温で１時間、７００ｒｐｍで一定に振盪しながらインキュベートした。各ウェルを１Ｘ洗浄バッファで二回洗浄した後、ブロッカーカゼイン（５％）およびＳＡポリ－ＨＲＰ（１／１６，０００希釈）を加えた４０μＬのｔＰＢＳ－ＢＳＡを各ウェルに加え、そして室温で３０分、７００ｒｐｍで一定に振盪しながらインキュベートした。各ウェルを１Ｘ洗浄バッファで３回洗浄した後、５０μＬスーパーシグナルＨＲＰ基質を各ウェルに加え、アルミホイルで覆い、そして室温で４分、７００ｒｐｍで一定に振盪しながらインキュベートした。化学発光シグナル（相対発光量（ＲＬＵ））を照度計（ＤＳＬａｃｔｉｖｅＧＬＯ（ＡＮＳＨｌａｂＷｅｂｓｔｅｒ、ＴＸ））でｓｏｆｔｗａｒｅ，ＡｎｓｈＬｉｔｅＤＲＳｖ．１２を用いて決定した。

結果
血漿試料を抗ＣＤ８１または抗ＣＤ６３抗体が以前に固定化されたＥＬＩＳＡウェルにアプライした。未結合物質を除去した後、各ウェルを様々なビオチン化抗体にさらし、続いてＳＡポリ－ＨＲＰ反応させ、化学発光シグナルを生じさせた。我々のスクリーニング試験の例として図６に示されるように、我々は最初に、抗ＣＤ８１が抗ＣＤ６３よりも良好な結果を示すことを見出した。多くのモノクローナル抗体の中で、我々は非常に強力な抗ＳＮＡＰ２５および抗ＣＤ１７１抗体を見出した。エピトープ－エピトープ変動を避けるために、我々はＥＡＡＴ１およびＯＭＧＰに対するポリクローナル抗体を使用し、かつ両抗体が抗ＣＤ８１固定化ウェル上の血漿試料に非常に反応性であることを見出した。我々はまた、抗ＳＮＡＰ２５、ＣＤ１７１、ＥＡＡＴ１、およびＯＭＧＰを固定化することにより抗体の組み合わせを切り替え、ビオチン化抗ＣＤ８１でプローブした。結果は全く同等であったが、抗ＥＡＡＴ１およびＯＭＧＰ固定化ウェルは、シグナル－ノイズ比を高めることによりわずかに優れた性能を示した。したがって、我々は、全エキソソーム（ＴＥ）（抗ＣＤ８１プローブ）の定量のための抗ＣＤ８１固定化ストリップならびにＡＤＥおよびＯＤＥの定量のための２種のＮＤＥ［抗ＳＮＡＰ２５（ｓＮＤＥ）および抗ＣＤ１７１（ｃＮＤＥ）］、および抗ＥＡＡＴ１およびＯＭＧＰ固定化ストリップ（抗ＣＤ８１プローブ）を使用した。

アッセイ特異度はエキソソームマーカーＣＤ８１および脳マーカーＳＮＡＰ２５、ＣＤ１７１、ＥＡＡＴ１、およびＯＭＧＰの組み合わせに基づく。図６に示されるように、多くの抗体および無ビオチンコントロールは、大量の血漿をアプライした後であってもシグナルを示さなかった。強いシグナルは適切な抗体の組み合わせからのみ得られたものであり、ＥＬＩＳＡシステムが２つの抗体の組み合わせに特異的であることを示している。この研究で使用された各抗体の特異度は、製品の添付文書で特徴付けられた。

従来のサンドイッチＥＬＩＳＡとは異なり、これらの物質が２つの異なる標的エピトープを発現しないため組み換えタンパク質またはペプチドは定量標準に適用できない。したがって、我々は定量標準として使用するためにシングルドナーから５０ｍＬの血漿を得、１００Ｕ／ｍＬを任意に割り当て、－８０℃冷凍庫で凍結保存した複数のアリコートを調製した。各アリコートをその後の研究に使用した。

図１に示されるように、ＴＥ、ｓＮＤＥ、ｃＮＤＥ、ＡＤＥ、およびＯＤＥについてのＥＬＩＳＡシグナルは適用した標準血漿の量に比例して直線的に増加した。２つの異なる濃度の全エキソソーム懸濁液を標準血漿にスパイクしたとき、ＲＬＵは全ての分析物と平行して上方にシフトし、これはエキソソームの回収が一貫していることを示す。

図３（Ａ－Ｅ）において使用される７２血漿試料からの二連の試料のアッセイ内変動並びに８つの異なる血漿試料の２つの別々の測定のアッセイ内変動（図２Ｆ）を示す、アッセイ精度を図２Ａ－Ｅに示す。アッセイ内およびアッセイ外変動の両方は最小であった。

血漿試料をＰＢＳで８倍に希釈し、５－２０μＬを各ＥＬＩＳＡに二連で使用した。５つのすべての分析物について必要とされる血漿容量は１４μＬ程度に小さかった。第一のコントロール群は複数の決定を伴う商業的供給源（ＩｎｎｏｖａｔｉｖｅＲｅｓｅａｒｃｈ）（ｎ＝８）から得られる健康なコントロール血漿である。セット１は、１６の年齢－性別一致コントロールおよび各８人のＭＣＩおよびＡＤを含んだ。セット２は、ＡＤおよび商業的供給源（ＰｒｅｃｉｓｉｏｎＭｅｄ）から得られる年齢－性別一致コントロール試料の各５人を含んだ。セット３は、ＡＤおよび第二の商業的供給源（ＢｉｏＲｅｃｌａｍａｔｉｏｎ）から得られる年齢－性別一致コントロールの各４人を含有した。

図３Ａ－Ｅに示されるように、５つのすべての分析物について、我々の検出限界より高いレベルの１５を超える対象を見出した。セット３において、ＡＤにおけるＴＥ、ｓＮＤＥ、ｃＮＤＥのレベルは、対のコントロールよりも低かったが、これらの値はセット１における対のコントロールよりもＡＤにおける方がわずかに高かった。２つの異なる集団のために、我々は次に検出限界を超える対象の発生率を算出した（図３、ａ－ｅ）。コントロールおよびＡＤ試料の両方は、上限を超えて１５－２５％を示しが、ＭＣＩ試料は上限の５０％をもたらした。ノンパラメトリックＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を使用して、ＯＤＥにおけるＭＣＩの発生率は、コントロールのものよりも有意に（ｐ＜０．０５）高かった。

図３における値はＸ－Ｙプロットで再分析した。図４に示されるように、ｓＮＤＥおよびｃＮＤＥのレベルは全エキソソームの値とよく相関した。これは、ＮＤＥの量が全エキソソームの計算に影響を与えるのに十分大きいことを示していてもよい。興味深いことに、ｓＮＤＥおよびｃＮＤＥの値はｒ^２＝０．９９１と非常に近く、ＮＤＥの値はＡＤＥおよびＯＤＥの値とは非常に異なり、ＮＤＥ、ＡＤＥ、ＯＤＥが異なる標的であることを示している。

図３に示されるように、ＴＥ、ｓＮＤＥ、ｃＮＤＥ、ＡＤＥ、およびＯＤＥのレベルは、２つの異なる群、我々の検出範囲内の１群および検出上限を超える他の群を実証した。図２に示されるように二連の試料間のばらつきが非常に小さかったため、高い値は技術的な問題に起因した。かかる高い値は第二の実験において再現された（図２Ｆ）。かかる対象の血漿希釈は、範囲内の値の減少（図７）を実証した。脳のエキソソームは近隣領域に病変を広め、伝播させることが知られており、かかるエキソソームの過剰生産は、将来最も重要な研究の焦点となるだろう。ＭＣＩは、コントロールよりも有意に高い値を示したため（図３Ｅ）、これは、認識機能障害またはＡＤのさらなる発症の素因に関連する可能性がある。

我々は、図４に示される分析物間の相互関係を解析した。ｓＮＤＥおよびｃＮＤＥのレベルはｒ^２＝０．９９１により示されるように密接に相関した。図８に示されるように、ＣＤ１７１は、抗ＳＮＡＰ２５－固定化されたＥＬＩＳＡストリップ上で検出されたが、ＳＮＡＰ２５は抗ＣＤ１７１－固定化されたＥＬＩＳＡストリップでは非常に低かった。我々の予備的研究において、我々はそれぞれｓＮＤＥおよびｃＮＤＥを単離し、タウタンパク質の量が、ｓＮＤＥ（データ示さず）よりもｃＮＤＥにおいてはるかに高いことを見出した。したがって、これらの２つのＮＤＥｓは同一ではない。しかしながら、これらの２種のＮＤＥｓの値は、ＡＤＥおよびＯＤＥの値とは異なり、ＮＤＥ、ＡＤＥ、およびＯＤＥは異なる標的を見ていることを示す。

これらの結果は、本発明の方法および組成物がエキソソームおよびエキソソームの特定の亜集団を単離および定量するために有用であるということを示した。これらの結果は、本発明の方法および組成物は神経変性障害を有する対象を同定するために有用であるということをさらに示した。これらの結果は本発明の方法およびバイオマーカーは神経変性障害を診断するために有用であるということをさらに示した。これらの結果は、本発明の方法が神経変性障害を有する対象を治療するために有用であろうことを示唆した。

実施例２：生体試料からのエキソソームの亜集団の単離および定量
エキソソームの特定の亜集団は以下のように生体試料から単離され、定量された。ＥＬＩＳＡアッセイはホワイトＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔｅｒ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）、ＥＬＩＳＡコーテイングバッファ、およびＥＬＩＳＡ洗浄バッファ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して実施した。様々な抗体およびコントロールマウスＩｇＧをＥＬＩＳＡプレート上に固定化した。プールしたヒト血漿をＥＬＩＳＡプレートにアプライした後、キャプチャーされたエキソソームを抗ＣＤ８１抗体（ＢＤＰｈａｒｍｉｇｅｎ，ＳａｎＪｏｓｅ、ＣＡ）とインキュベートした。

図９に示されるように、様々な神経伝達物質受容体に対する抗体は陽性であり、それはドーパミン受容体１（ＤＲ１）、セロトニン受容体２Ａ（ＳＲ２Ａ）および２Ｃ（ＳＲ２Ｃ）、ガンマ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）Ｂ１受容体、グルタミン酸受容体－１（ＧｌｕＲ－１）、オピオイド受容体（ＫＯＲ）、および睡眠ペプチドオレキシン受容体（ＯＲ）を含んだ。ドーパミントランスポーター（ＤＡＴ）はシナプス前ドーパミン作動性ニューロン上に存在する膜タンパク質であり、これはまた、抗ＣＤ８１で増加したシグナルを示した（図９参照）。

これらの結果は、本発明の方法および組成物が、エキソソームおよびシナプス前ドーパミン作動性ニューロン由来のエキソソーム、またはシナプス後ドーパミン作動性、セロトニン作動性、ＧＡＢＡ作動性、グルタミン酸作動性、およびオピオイドニューロン由来のエキソソームの特定の亜集団を単離および定量するのに有用であることを示した。これらの結果は、本発明の方法およびバイオマーカーがエキソソームおよび例えば、ニューロン由来のエキソソームを含むエキソソームの特定の亜集団を単離および定量するのに有用であることをさらに示した。

本明細書に示され記載されたものに加え、本発明の種々の改変が、前述の説明から当業者に明らかになるであろう。このような改変は、添付の特許請求の範囲内に入ることが意図される。

本明細書中で引用されるすべての参考文献は、その全体が出典明示により本明細書に組み込まれる。

Claims

生体試料において二重陽性であるエキソソームを検出することを含む方法であって、前記エキソソームがＣＤ８１、ＣＤ６３、およびＣＤ９からなる群から選択される１以上のエキソソームバイオマーカーについて陽性であり、かつ前記エキソソームがドーパミン受容体（ＤＲ１）について陽性であり、それにより、前記試料における脳由来のエキソソームのレベルを定量する、方法。
付着された少なくとも１つのキャプチャー試薬を含む固体支持体上で前記エキソソームを捕捉することをさらに含み、ここで、前記キャプチャー試薬がＣＤ８１、ＣＤ６３、ＣＤ９からなる群からの少なくとも１つのバイオマーカーに結合する、請求項１に記載の方法。
付着された少なくとも１つのキャプチャー試薬を含む固体支持体上で前記エキソソームを捕捉することをさらに含み、ここで、前記キャプチャー試薬がＤＲ１に結合する、請求項１に記載の方法。
前記生体試料が、全血、血清、血漿、尿、間質液、腹水、子宮頸部スワブ、涙、唾液、頬スワブ、皮膚、脳組織、および脳脊髄液からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
前記エキソソームが、ニューロン由来のエキソソーム、アストロサイト由来のエキソソーム、オリゴデンドロサイト由来のエキソソーム、およびミクログリア由来のエキソソームからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
前記ニューロン由来のエキソソームが、シナプス前ドーパミン作動性ニューロン由来のエキソソーム、シナプス後ドーパミン作動性、セロトニン作動性、ＧＡＢＡ作動性、グルタミン酸作動性、およびオピオイドニューロン由来のエキソソームからなる群から選択される、請求項５に記載の方法。