JP2023542122A - 神経細胞由来のエクソソームを用いる診断アッセイ - Google Patents

神経細胞由来のエクソソームを用いる診断アッセイ Download PDF

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Abstract

本発明は、神経変性疾患のための低侵襲バイオマーカーベースの診断、並びに細胞外小胞（ＥＶ）の特定集団を分離する及び分析するための組成物及び方法に関する。特に、本発明の実施形態は、神経細胞由来のＥＶを分離する、特定する又は捕捉するための、生体試料を分析するための、並びに神経学的状態及び神経変性状態を診断する、評価する、かつ神経学的状態及び神経変性状態の発症を予測するための方法及びシステムに関する。【選択図】なし

Description

発明の分野
本発明は、神経変性疾患のための低侵襲でバイオマーカーベースの診断法、並びに特異的エクソソームを単離しそれらの内容物を分析するための組成物及び方法に関する。
発明の背景
神経変性疾患のための承認された治療は非常に少なく、これらの疾患に対する疾患修飾療法の開発は、医療分野において最も困難なタスクの１つと考えられている。このタスクに伴う課題のいくつかは、利用可能な診断ツールボックスの不足によるものである。例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）及びパーキンソン病（ＰＤ）におけるミスフォールドタンパク質の病理学的（ｐｈｙｔｏｌｏｇｉｃａｌ）蓄積は、臨床症状の開始及び診断の何年も前から始まる（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ９１（９）：３９５－４０２，２０１８）。したがって、後の症候性段階で診断された場合、神経細胞はすでに完全に悪化しているか、又はひどく損傷しており、ほとんどの治療を無効にする。別の欠点は、死後の分析が、ＡＤ患者の２０％～３０％が誤診され、他の種類の認知症に苦しんでいることを実証する、という事実から明らかである。
このような神経疾患の現在の診断は、臨床検査、脳イメージング及び脳脊髄液（ＣＳＦ）バイオマーカーに依存している。脳イメージングとＣＳＦバイオマーカーの進歩は臨床試験に組み込まれたが、これらは高価で侵襲的であり、かつ／又は放射線への曝露を必要とし、そのため、集団スクリーニング又は長期的モニタリングには適していない。安価で低侵襲の血液ベースの診断検査は、これらのニーズに対応できる。加えて、集団スクリーニングは、ＡＤ及び他の神経疾患を初期にかつ／又はより正確に特定することを助け得る。血液検査の開発はまた、疾患の進行及び治療への応答の定期的及び長期的モニタリングを可能にし得る。さらに、多くの場合、診断プロセスは長くて面倒である。例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の診断は、平均して約１４ヶ月かかる。診断が確定するまでのプロセスは複雑であり、複数の医師による評価を伴い、医師と患者の両方について不確実性を伴う。
細胞外小胞（ＥＶ）は、全ての細胞によって放出されかつ全ての生体液に見出される膜状の粒子である。それらは、エンドソーム／多胞体に由来するエクソソーム（直径３０ｎｍ～１５０ｎｍ）、及び原形質膜の出芽によって生成される微小胞（１５０ｎｍ～１０００ｎｍ）を含む。ＥＶは、それらの元の細胞のタンパク質とＲＮＡを含有し、それらが、様々な診断目的に潜在的に関連し得る多数のバイオマーカーを含有し得ることが示されている（Ｋｅｅｒｔｈｉｋｕｍａｒら，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４２８（４）：６８８－６９２，２０１６）。加えて、ＥＶは多くの表面タンパク質を含み得、そのうちのいくつかは特定の起源の細胞に特有である。診断にＥＶを使用する際の課題の１つは、現在臨床使用されているほとんどの細胞マーカーが、タンパク質マーカーのレベルをそれらの環境中の対照細胞のレベルと比較する、組織学又は蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）アッセイを用いて発見されていることである。特定の起源（例えば、細胞型又は組織）に由来するＥＶに選択的な、あるマーカーを発見するには、このマーカーが、それらが由来するこれらのＥＶ及び／若しくは細胞型に固有であるか、又は他の細胞型に由来するＥＶでよりも高いレベルでこれらのＥＶで見出される必要がある。
以前の研究は、神経細胞由来のエクソソームを選択するためのＬ１細胞接着分子（Ｌ１ＣＡＭ）特異的抗体の使用を示唆した。しかし、Ｌ１ＣＡＭは神経細胞で高発現される一方で、それは、リンパ節、腎臓及び一部の活性化リンパ球でも発現され、そのため、潜在的な診断アッセイにおける単離標的としてのその使用が損なわれる。本発明者及び共働者の最近の公報は、老化のボルチモア長期的研究における細胞外小胞バイオマーカーとＡＤの関連に関する（Ｋａｐｏｇｉａｎｎｉｓら，ＪＡＭＡ Ｎｅｕｒｏｌ．，７６（１１）：１３４０－１３５１，２０１９）。この研究は、Ｌ１ＣＡＭベースのエクソソーム単離が、ＥＶ単離の小規模な実験室アッセイを用いる、数年にわたる異なる時点での様々なバイオマーカーの長期的測定において、ステージ１のＡＤを特定できる（１３１人の発症前ＡＤ患者において）ことを示している。他の研究は、ＰＤ、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）及びＨＩＶ関連認知症などの他の神経障害のマーカーを開発するために、神経細胞由来のエクソソームの濃縮を伴う手法を含む、様々な手法を検討した（Ｏｓｉｅｒら Ｍｏｌ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．２０１８；５５（１２）：９２８０－９２９３）。
そのため、例えば、Ｌ１ＣＡＭ特異的抗体を利用する選択を伴うこれまでに報告された方法は、神経細胞エクソソームと様々な非神経細胞エクソソームの両方を単離し、そのため、所望のエクソソーム集団をほんのわずかしか濃縮せず、精度が不十分である。
米国特許第９，９５８，４６０号は、ＡＤ及び他の神経変性疾患のためのバイオマーカー及び診断方法と予後診断の方法に関する。これはまた、バイオマーカーを検出するための組成物、並びにＡＤ及び他の神経変性疾患を治療するために有用な組成物及び方法を提供する。特に、この公報は、生体試料から取得された小胞における特定のバイオマーカーの検出を開示する。ＷＯ２０１７１９３１１５は、ＡＤ及び他の神経変性疾患の鑑別診断のためのシナプスタンパク質バイオマーカーに関する。特に、この公報は、（ｉ）対象から小胞を含む生体試料を取得する工程、（ｉｉ）生体試料中の１以上のバイオマーカーのレベルを測定する工程、及び（ｉｉｉ）生体試料中の１以上のバイオマーカーのレベルを対照生体試料中の１以上のバイオマーカーの対照レベルと比較する工程、を含む対象からの試料を分析する方法を開示し、少なくとも１以上のバイオマーカーが、シナプトフィジン、シナプトポジン、シナプトタグミン、ニューログラニン、及びヒト成長関連タンパク質４３（ＧＡＰ４３）からなる群から選択される。生体試料からの小胞の単離及び／又は分析を伴う他の公報は、例えば、米国特許公開第２０１９０２１９５７８号、同第２０１８０３４０９４５号、同第２０１９０３６１０３７号、同第２０１８００８０９４５号、同第２０１９０１３７５１７号及びＷＯ２０１６１７２５９８を含む。
本出願の優先日以降に公開された、本発明者及び共働者の最近の公報は、ＡＤのマウスモデルにおける脳の病態を反映する血液中の神経細胞及びアストロサイトの細胞外小胞バイオマーカーに関する（Ｄｅｌｇａｄｏ－Ｐｅｒａｚａら，２０２１，Ｃｅｌｌｓ １０，９９３）。神経変性障害のための改善された診断アッセイに対する医学的ニーズは未だ満たされていない。ＡＤ及び認知症などの様々な神経障害の早期かつ正確な検出を可能にする低侵襲バイオマーカーベースの診断プラットフォーム、並びにそのような障害の鑑別診断、予後予測及びモニタリングの手段の開発は、非常に有利である。加えて、神経細胞由来エクソソームの特異的単離及びそれらのペイロードの分析を提供する方法及び手段は、実験的及び臨床的状況の両方においてかなりの利益をもたらすであろう。
本発明は、神経変性疾患のための低侵襲バイオマーカーベースの診断、並びに細胞外小胞（ＥＶ）の特定集団を単離し及び分析するための組成物及び方法に関する。特に、本発明の実施形態は、神経細胞由来のＥＶを単離する、特定する又は捕捉するための、生体試料を分析するための、並びに神経学的状態及び神経変性状態を診断する、評価する、かつ発症を予測するための方法及びシステムに関する。
本発明は、部分的には、神経細胞由来の細胞外小胞（ＮＤＥ）を単離する及び分析するための改良されたアッセイ及び方法の驚くべき特定に基づく。本発明のアッセイ及び方法は有利には、シナプスタンパク質に向けられる物質を結合した親和性分子の相乗的組み合せの使用を用い、それによりＮＤＥの表面上の複数のシナプスタンパク質を標的とする。本発明のさらに有利なアッセイ及び方法は、合成の又は組換え生成された対照粒子を含む改良されたプロトコルに基づく。本発明はさらに、様々な神経疾患の高精度診断アッセイの予期せぬ発見に部分的に基づき、末梢血試料を分析することにより疾患又は病態の早期検出及び特徴付けを可能にする。特に、本明細書に開示されるのは、４つのタンパク質マーカーの組み合わせに基づく軽度認知障害（ＭＣＩ）のための高精度診断分類器、及び前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）病態生理学の鑑別診断のためのアッセイである。加えて、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ；３つのバイオマーカーの組み合わせに基づく）のための及びアルツハイマー病（ＡＤ;４つのタンパク質マーカーのレベルの組み合わせ）のための非常に正確な診断分類器もまた、本発明のシステム及び方法を用いて開発された。
一態様において、
ａ．ＥＶの表面上の標的分子に結合できる物質結合親和性分子を含む単離システムを提供することであって、標的分子の少なくとも１つが、シナプスタンパク質である、提供すること、
ｂ．１以上の標的分子を提示する所定量の粒子を含有する対照試料を提供すること、
ｃ．ｉ．それらの対応する標的分子への上記親和性分子の特異的結合を可能にする条件下で、上記システムと対照試料を接触させること、
ｉｉ．上記親和性分子により結合される粒子の量を定量すること、かつ
ｉｉｉ．結合された粒子の量が所定の閾値を超えることを決定すること
によりシステムの精度を決定すること、
ｄ．ＥＶ含有生体液試料を提供すること、
ｅ．それらの対応する標的分子への上記親和性分子の特異的結合を可能にする条件下で、上記生体液試料と上記システムを接触させること、並びに
ｆ．上記親和性分子に結合したＥＶを単離すること
を含む、神経細胞由来のＥＶを単離するための方法が提供される。
一実施形態では、上記シナプスタンパク質は、ニューロリギン－３（ＮＬＧＮ３）、成長関連タンパク質４３（ＧＡＰ４３）、シナプトタグミン－１（ＳＹＴ１）、及びグルタミン酸受容体１（ＧｌｕＲ１、ＧＲＩＡ１）からなる群から選択される。別の実施形態では、上記標的分子は、ＮＬＧＮ３及びＧＡＰ４３を含む。別の実施形態では、上記標的分子は、ＮＬＧＮ３及びＧＡＰ４３である。さらに別の実施形態では、上記標的分子は、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１ＣＡＭ）及び／又はＲａｂ３ａをさらに含む。別の実施形態では、上記標的分子は、ＮＬＧＮ３、ＧＡＰ４３及びＬ１ＣＡＭである。
別の実施形態では、対照試料の粒子は、マーカーによって標識される。別の実施形態では、上記粒子は、ビーズ（微粒子又はナノ粒子のビーズを含むが、これらに限定されない）である。特定の実施形態では、上記粒子は、蛍光標識されたビーズであり、対照試料は、上記生体液試料と上記親和性分子を接触させる前に上記生体液試料と組み合わされる。さらに別の実施形態では、粒子は、操作された細胞から取得される対照ＥＶである。別の実施形態では、対照試料は、１以上の標的分子を外因的に発現するように操作された陽性対照ＥＶを含む対照ＥＶを含み、任意で上記標的分子を発現しない陰性対照ＥＶをさらに含む。特定の実施形態では、上記対照試料は、ａ）第１の蛍光マーカーを含有する非神経細胞から取得された、陰性対照ＥＶ、及びｂ）上記１以上の標的分子を発現するように操作された同等の非神経細胞から取得され、かつ第２の別個の蛍光マーカーを含有する、陽性対照ＥＶを含む。別の実施形態では、所定の閾値は、対照試料中で提供される所定量の粒子（すなわち、陽性対照ＥＶ又はビーズなどの標的提示粒子）の少なくとも４４％の回収率に相当する。
別の実施形態では、単離されたＥＶは、少なくとも２０倍の非神経細胞特異的マーカーレベルに対する神経細胞特異的マーカーレベルの比率によって特徴付けられる。別の実施形態では、物質（それに親和性分子が結合される）は、複数の磁気ビーズである。別の実施形態では、親和性分子は、抗体であるか、又はその抗原結合部分を含む。別の実施形態では、生体液試料は、血液、血漿、及び血清からなる群から選択される。別の実施形態では、上記対象は、ヒトである。
別の実施形態では、本方法は、単離されたＥＶ中の１以上のバイオマーカーのレベルを決定することをさらに含む。別の実施形態では、１以上のバイオマーカーは、タンパク質バイオマーカー、核酸バイオマーカー、脂質バイオマーカー、代謝産物バイオマーカー、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。別の実施形態では、１以上のバイオマーカーは、微小管結合タンパク質タウ（タウ）、リン酸化タウ（ｐ－タウ）、アミロイド－ベータ４２（Ａβ４２）、及びＮＬＧＮ、ＴＤＰ４３、クラスタリン（ＣＬＵ）、ＳＹＰ、ＢＩＭ、ＮＥＦＬ、ＥＮＯ２、ＮＲＧＮ、及びＧＰＲ２６遺伝子産物、並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される。様々な他の実施形態では、１以上のバイオマーカーは、タウ、ｐ－タウ、Ａβ４２、及びＮＬＧＮ、ＴＤＰ４３、ＣＬＵ、ＳＹＰ、ＢＩＭ、ＮＥＦＬ、ＥＮＯ２、ＮＲＧＮ、カテプシンＤ、ＬＣ３、ＳＹＴ及びＧＰＲ２６遺伝子産物、並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される。さらに他の実施形態では、１以上のバイオマーカーは、ＬＣ３、カテプシンＤ、ＮＲＦ２、Ａβ４２、ｐ－タウ、ＰＳＤ９５、ｐｒｏＢＤＮＦ、ＣＯＸ２、ＥＩＦ２Ｃ２及びＮＦ－κＢからなる群から選択される。各可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。
別の実施形態では、試料は、ＭＣＩを有すると、又はＡＤを発症する素因があると疑われる対象から取得される。別の実施形態では、バイオマーカーは、タウ（本明細書では「総タウ」とも呼ばれる）、ｐ－タウ、Ａβ４２、及びニューロリギンである。別の実施形態では、試料は、ＭＣＩを有する、かつ／又はＡＤを発症する素因があると疑われる対象から取得され、バイオマーカーは、タウ、ｐ－タウ、Ａβ４２、及びニューロリギンである。別の実施形態では、本方法は、単離されたＥＶ中のバイオマーカーのレベルを、対照生体液試料に対応するそれらのそれぞれのレベルと比較して、それにより試料の診断シグネチャを対照診断シグネチャと比較することをさらに含み、対照診断シグネチャと比較される試料の診断シグネチャにおける有意差は、上記対象がＭＣＩに罹患していることを示す。別の実施形態では、本方法は、単離されたＥＶ中のバイオマーカーのレベルを、対照生体液試料に対応するそれらのそれぞれのレベルと比較して、それにより試料の診断シグネチャを対照診断シグネチャと比較することをさらに含み、対照診断シグネチャと比較される試料の診断シグネチャにおける有意差は、上記対象がＡＤを発症する（例えば、生体液試料を取得してから３～５年以内に症候性ＡＤを発症する）素因があることを示す。
別の実施形態では、試料は、ＦＴＤを有すると診断された、又は有する疑いのある対象から取得され、バイオマーカーは、ＴＤＰ４３及びｐ－タウである。別の実施形態では、上記方法は、単離されたＥＶ中の決定されたＴＤＰ４３及びｐ－タウのレベルに基づき上記対象におけるＦＴＤ病態を特徴付けることをさらに含む。
別の実施形態では、上記バイオマーカーは、Ａβ４２、ｐ－タウ、ＰＳＤ９５及びｐｒｏＢＤＮＦであり、試料は、ＡＤを有すると疑われる対象から取得される。別の実施形態では、上記方法は、単離されたＥＶ中のバイオマーカーのレベルを、対照生体液試料に対応するそれらのそれぞれのレベルと比較して、それにより試料の診断シグネチャを対照診断シグネチャと比較することをさらに含み、対照診断シグネチャと比較される試料の診断シグネチャにおける有意差は、上記対象がＡＤに罹患していることを示す。
別の実施形態では、上記バイオマーカーは、ＬＣ３、ＴＤＰ４３、及びＮＲＦ２であり、試料は、ＡＬＳを有すると疑われる対象から取得される。別の実施形態では、本方法は、単離されたＥＶ中のバイオマーカーのレベルを、対照生体液試料に対応するそれらのそれぞれのレベルと比較して、それにより試料の診断シグネチャを対照診断シグネチャと比較することをさらに含み、対照診断シグネチャと比較される試料の診断シグネチャにおける有意差は、上記対象がＡＬＳに罹患していることを示す。
別の態様では、
ａ．ＥＶ含有生体液試料を提供すること、
ｂ．それらの対応する標的分子への親和性分子の特異的結合を可能にする条件下で、ＥＶの表面上の標的分子に結合できる親和性分子と試料を接触させることであって、上記標的分子が、ＮＬＧＮ３及びＧＡΒ４３を含む、接触させること、並びに
ｃ．親和性分子に結合されたＥＶを特定する又は捕捉すること
を含む、神経細胞由来のＥＶを特定する又は捕捉する方法が提供される。
別の実施形態では、上記標的分子は、ＮＬＧＮ３及びＧＡΒ４３である。別の実施形態では、上記標的分子は、Ｌ１ＣＡＭをさらに含む。別の実施形態では、上記標的分子は、ＮＬＧＮ３、ＧＡΒ４３及びＬ１ＣＡＭである。別の実施形態では、上記親和性分子は、物質結合型である。別の実施形態では、物質は、複数の磁気ビーズである。
別の実施形態では、本方法は、
ｉ．標的分子の少なくとも１つを提示する粒子の所定量を含有する対照試料を提供すること、
ｉｉ．それらの対応する標的分子への親和性分子の特異的結合を可能にする条件下で、対照試料と親和性分子を接触させること、
ｉｉｉ．上記親和性分子により結合された粒子の量を定量すること、及び
ｉｖ．結合された粒子の量が所定の閾値を超えることを決定すること
をさらに含む。
別の実施形態では、上記粒子は、蛍光標識されたビーズであり、対照試料は、上記生体液試料と上記親和性分子を接触させる前に、上記生体液試料と組み合わされる。別の実施形態では、上記対照試料は、１以上の標的分子を外因的に発現するように操作された陽性対照ＥＶを含み、任意に、上記標的分子を発現しない陰性対照ＥＶをさらに含む。別の実施形態では、上記対照試料は、第１の蛍光マーカーを含有する非神経細胞から取得された陰性対照ＥＶ、及び１以上の標的分子を発現するように操作された同等の非神経細胞から取得され、かつ第２の別個の蛍光マーカーを含有する陽性対照ＥＶを含む。別の実施形態では、所定の閾値は、対照試料中で提供される粒子（１以上の上記標的分子を提示する）の所定量の少なくとも４４％の回収率に相当する。
別の実施形態では、単離されたＥＶは、少なくとも２０倍の非神経細胞特異的マーカーレベルに対する神経細胞特異的マーカーレベルの比率によって特徴付けられる。別の実施形態では、物質は、複数の磁気ビーズである。別の実施形態では、親和性分子は、抗体であるか、又はその抗原結合部分を含む。別の実施形態では、生体液試料は、血液、血漿及び血清からなる群から選択される。別の実施形態では、上記対象は、ヒトである。
別の実施形態では、本方法は、親和性分子に結合したＥＶ中の１以上のバイオマーカーのレベルを決定することをさらに含む。別の実施形態では、１以上のバイオマーカーは、タンパク質バイオマーカー、核酸バイオマーカー、脂質バイオマーカー、代謝産物バイオマーカー、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。別の実施形態では、１以上のバイオマーカーは、タウ、リン酸化タウ（ｐ－タウ）、Ａβ４２、及びＮＬＧＮ、ＴＤＰ４３、クラスタリン、ＳＹＰ、ＢＩＭ、ＮＥＦＬ、ＥＮＯ２、ＮＲＧＮ、及びＧＰＲ２６遺伝子産物、並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される。
別の実施形態では、試料は、ＭＣＩを有すると、又はＡＤを発症する素因があると疑われる対象から取得される。別の実施形態では、バイオマーカーは、総タウ（タウ）、ｐ－タウ、Ａβ４２、及びニューロリギンである。別の実施形態では、試料は、ＭＣＩを有する、又はＡＤを発症する素因があると疑われる対象から取得され、バイオマーカーは、タウ、ｐ－タウ、Ａβ４２、及びニューロリギンである。別の実施形態では、本方法は、単離されたＥＶ中のバイオマーカーのレベルを、対照生体液試料に対応するそれらのそれぞれのレベルと比較して、それにより試料の診断シグネチャを対照診断シグネチャと比較することをさらに含み、対照診断シグネチャと比較される試料の診断シグネチャにおける有意差は、上記対象がＭＣＩに罹患していることを示す。別の実施形態では、本方法は、単離されたＥＶ中のバイオマーカーのレベルを、対照生体液試料に対応するそれらのそれぞれのレベルと比較して、それにより試料の診断シグネチャを対照診断シグネチャと比較することをさらに含み、対照診断シグネチャと比較される試料の診断シグネチャにおける有意差は、上記対象がＡＤを発症する素因があることを示す。
別の実施形態では、試料は、ＦＴＤを有すると診断された、又はＦＴＤを有する疑いのある対象から取得され、バイオマーカーは、ＴＤＰ４３及びｐ－タウである。別の実施形態では、上記方法は、単離されたＥＶ中の決定されたＴＤＰ４３及びｐ－タウのレベルに基づき上記対象におけるＦＴＤ病態を特徴付けることをさらに含む。
さらに他の実施形態では、１以上のバイオマーカーは、ＬＣ３、カテプシンＤ、ＮＲＦ４２、Ａβ４２、ｐ－タウ、ＰＳＤ９５、ｐｒｏＢＤＮＦ、ＣＯＸ２、ＥＩＦ２Ｃ２及びＮＦ－κＢからなる群から選択される。別の実施形態では、上記バイオマーカーは、Ａβ４２、ｐ－タウ、ＰＳＤ９５及びｐｒｏＢＤＮＦであり、試料は、ＡＤを有すると疑われる対象から取得される。別の実施形態では、上記方法は、単離されたＥＶ中のバイオマーカーのレベルを、対照生体液試料に対応するそれらのそれぞれのレベルと比較して、それにより試料の診断シグネチャを対照診断シグネチャと比較することをさらに含み、対照診断シグネチャと比較される試料の診断シグネチャにおける有意差は、上記対象がＡＤに罹患していることを示す。
別の実施形態では、上記バイオマーカーは、ＬＣ３、ＴＤＰ４３、及びＮＲＦ２であり、試料は、ＡＬＳを有すると疑われる対象から取得される。別の実施形態では、本方法は、単離されたＥＶ中のバイオマーカーのレベルを、対照生体液試料に対応するそれらのそれぞれのレベルと比較して、それにより試料の診断シグネチャを対照診断シグネチャと比較することをさらに含み、対照診断シグネチャと比較される試料の診断シグネチャにおける有意差は、上記対象がＡＬＳに罹患していることを示す。
別の態様では、試料の神経細胞由来のＥＶ中のバイオマーカーのレベルを決定することを含む、生体液試料を分析するための方法が提供され、
ａ．試料は、ＭＣＩを有すると、又はＡＤを発症する素因があると疑われる対象から取得され、バイオマーカーは、タウ、ｐ－タウ、Ａβ４２、及びニューロリギンである；又は
ｂ．試料は、ＦＴＤと診断されるか、又はＦＴＤを有する疑いのある対象から取得され、バイオマーカーは、ＴＤＰ４３及びｐ－タウである。
別の態様では、試料の神経細胞由来のＥＶ中のバイオマーカーのレベルを決定することを含む、生体液試料を分析するための方法が提供され、
ａ．試料は、ＭＣＩを有すると、又はＡＤを発症する素因があると疑われる対象から取得され、バイオマーカーは、総タウ（タウ）、ｐ－タウ、Ａβ４２、及びニューロリギン（ＮＬＧＮ）である；又は
ｂ．試料は、ＦＴＤと診断されるか、又はＦＴＤを有する疑いのある対象から取得され、バイオマーカーは、ＴＤＰ４３及びｐ－タウであるか；又は
ｃ．試料は、ＡＤを有する疑いのある対象から取得され、バイオマーカーは、Ａβ４２、ｐ－タウ、ＰＳＤ９５及びｐｒｏＢＤＮＦである；又は
ｄ．試料は、ＡＬＳを有する疑いのある対象から取得され、バイオマーカーは、ＬＣ３、ＴＤＰ４３、及びＮＲＦ２である。
別の実施形態では、本方法は、ＥＶ中のバイオマーカーのレベルを、対照生体液試料に対応するそれらのそれぞれのレベルと比較することをさらに含む。別の実施形態では、本方法は、神経細胞由来のＥＶ中のバイオマーカーのレベルを決定する前に、それらの対応する標的分子への親和性分子の特異的結合を可能にする条件下で、少なくとも１つの標的分子がシナプスタンパク質である、上記ＥＶの表面上の標的分子に結合できる物質結合親和性分子と上記試料を接触させること、および上記親和性分子に結合したＥＶを単離することにより、上記ＥＶを試料から単離する工程をさらに含む。別の実施形態では、上記親和性分子は、ＮＬＧＮ３及びＧＡＰ４３に向けられ、物質は、複数の磁気ビーズである。
別の実施形態では、本方法はさらに、
ｉ．１以上の標的分子を提示する粒子の所定量を含有する対照試料を提供すること、
ｉｉ．それらの対応する標的分子への特異的結合を可能にする同じ条件下で、対照試料と親和性分子を接触させること、
ｉｉｉ．上記親和性分子により結合された粒子の量を定量すること、及び
ｉｖ．結合された粒子の量が所定の閾値を超えることを決定すること
を含む。
別の実施形態では、上記粒子は、蛍光標識されたビーズであり、対照試料は、上記生体液試料と上記親和性分子を接触させる前に上記生体液試料と組み合わされる。別の実施形態では、上記対照試料は、１以上の上記標的分子を外因的に発現するように操作された陽性対照ＥＶを含み、任意に、上記標的分子を発現しない陰性対照ＥＶをさらに含む。別の実施形態では、上記対照試料は、第１の蛍光マーカーを含有する非神経細胞から取得された陰性対照ＥＶ、及び１以上の上記標的分子を発現するように操作された同等の非神経細胞から取得され、かつ第２の別個の蛍光マーカーを含有する陽性対照ＥＶを含む。別の実施形態では、所定の閾値は、対照試料中で提供される粒子の所定量の少なくとも４４％の回収率に相当する。
別の実施形態では、単離されたＥＶは、少なくとも２０倍の非神経細胞特異的マーカーレベルに対する神経細胞特異的マーカーレベルの比率によって特徴付けられる。別の実施形態では、上記標的分子は、ＮＬＧＮ３及びＧＡΒ４３を含む。別の実施形態では、上記標的分子は、ＮＬＧＮ３及びＧＡΒ４３である。別の実施形態では、上記標的分子は、Ｌ１ＣＡＭ及び／又はＲａｂ３ａをさらに含む。別の実施形態では、上記標的分子は、ＮＬＧＮ３、ＧＡＰ４３及びＬ１ＣＡＭである。別の実施形態では、物質は、複数の磁気ビーズである。別の実施形態では、親和性分子は、抗体であるか、又はその抗原結合部分を含む。別の実施形態では、生体液試料は、血液、血漿及び血清からなる群から選択される。別の実施形態では、上記対象は、ヒトである。
別の態様では、本方法は、それを必要とする対象におけるＭＣＩを診断するために使用され、
ａ．対象からＥＶ含有生体液試料を取得すること、
ｂ．ＥＶの表面上の標的分子に結合できる物質結合親和性分子を含む単離システムを提供することであって、標的分子の少なくとも１つが、ＮＬＧＮ３及びＧＡＰ４３からなる群から選択されるシナプスタンパク質である、提供すること、
ｃ．それらの対応する標的分子への上記親和性分子の特異的結合を可能にする条件下で、生体液試料と上記システムを接触させること、
ｄ．上記親和性分子に結合したＥＶを単離すること、
ｅ．単離されたＥＶ中のタウ、ｐ－タウ、Ａβ４２、及びニューロリギンのレベルを決定すること、並びに
ｆ．単離されたＥＶにおいて決定されたタウ、ｐ－タウ、Ａβ４２、及びニューロリギンのレベルを、対照生体液試料に対応するそれらのそれぞれのレベルと比較して、それにより試料の診断シグネチャを対照診断シグネチャと比較することであって、対照診断シグネチャと比較される試料の診断シグネチャの有意差が、上記対象がＭＣＩに罹患していることを示す、比較すること
を含む。
別の実施形態では、本方法はさらに、
ｉ．１以上の標的分子を提示する粒子の所定量を含有する対照試料を提供すること、
ｉｉ．それらの対応する標的分子への特異的結合を可能にする条件下で、対照試料とシステムを接触させること、
ｉｉｉ．上記親和性分子により結合された粒子の量を定量すること、及び
ｉｖ．結合された粒子の量が所定の閾値を超えることを決定すること
を含む。
別の実施形態では、上記粒子は、蛍光標識されたビーズであり、対照試料は、上記生体液試料と上記システムを接触させる前に生体液試料と組み合わされる。別の実施形態では、上記対照ＥＶは、１以上の上記標的分子を外因的に発現するように操作された陽性対照ＥＶを含み、任意に、上記標的分子を発現しない陰性対照ＥＶをさらに含む。別の実施形態では、上記対照試料は、第１の蛍光マーカーを含有する非神経細胞から取得された陰性対照ＥＶ、及び１以上の上記標的分子を発現するように操作された同等の非神経細胞から取得され、かつ第２の別個の蛍光マーカーを含有する陽性対照ＥＶを含む。別の実施形態では、所定の閾値は、対照試料中で提供される粒子の所定量の少なくとも４４％の回収率に相当する。
別の実施形態では、単離されたＥＶは、少なくとも２０倍の非神経細胞特異的マーカーレベルに対する神経細胞特異的マーカーレベルの比率によって特徴付けられる。別の実施形態では、上記標的分子は、ＮＬＧＮ３及びＧＡＰ４３を含む。別の実施形態では、上記標的分子は、ＮＬＧＮ３及びＧＡＰ４３である。別の実施形態では、上記標的分子は、Ｌ１ＣＡＭ及び／又はＲａｂ３ａをさらに含む。別の実施形態では、上記標的分子は、ＮＬＧＮ３、ＧＡＰ４３及びＬ１ＣＡＭである。別の実施形態では、物質は、複数の磁気ビーズである。別の実施形態では、親和性分子は、抗体であるか、又はその抗原結合部分を含む。別の実施形態では、生体液試料は、血液、血漿及び血清からなる群から選択される。別の実施形態では、上記対象は、ヒトである。
他の実施形態では、本方法は、スクリーニング目的のため、例えば、対象がＡＤを発症するリスクが高いかどうかを評価するために使用され得る。そのため、別の態様では、
ａ．対象からＥＶ含有生体液試料を取得すること、
ｂ．ＥＶの表面上の標的分子に結合できる物質結合親和性分子を含む単離システムを提供することであって、標的分子の少なくとも１つが、ＮＬＧＮ３及びＧＡＰ４３からなる群から選択されるシナプスタンパク質である、提供すること、
ｃ．それらの対応する標的分子への上記親和性分子の特異的結合を可能にする条件下で、生体液試料と上記システムを接触させること、
ｄ．上記親和性分子に結合したＥＶを単離すること、
ｅ．単離されたＥＶ中のタウ、ｐ－タウ、Ａβ４２、及びニューロリギンのレベルを決定すること、並びに
ｆ．単離されたＥＶにおいて決定されたタウ、ｐ－タウ、Ａβ４２、及びニューロリギンのレベルを、対照生体液試料に対応するそれらのそれぞれのレベルと比較して、それにより試料の診断シグネチャを対照診断シグネチャと比較することであって、対照診断シグネチャと比較される生体液試料の診断シグネチャの有意差が、上記対象がＡＤを発症する素因があることを示す、比較すること
を含む、対象がＡＤを発症する素因がある可能性を決定する方法が提供される。
別の態様では、本方法は、それを必要とする対象におけるＦＴＤ病態を特徴付けるために使用され、
ａ．対象からＥＶ含有生体液試料を取得すること、
ｂ．ＥＶの表面上の標的分子に結合できる物質結合親和性分子を含む単離システムを提供することであって、標的分子の少なくとも１つがＮ、ＬＧＮ３及びＧＡＰ４３からなる群から選択されるシナプスタンパク質である、提供すること、
ｃ．それらの対応する標的分子への上記親和性分子の特異的結合を可能にする条件下で、生体液試料と上記システムを接触させること、
ｄ．上記親和性分子に結合したＥＶを単離すること、
ｅ．単離されたＥＶ中のＴＤＰ４３及びｐ－タウのレベルを決定すること、
ｆ．単離されたＥＶにおいて決定されたＴＤＰ４３及びｐ－タウのレベルをそれらのそれぞれの対照レベルと比較すること、並びに
ｇ．単離されたＥＶにおいて決定されたＴＤＰ４３及びｐ－タウのレベルに基づき、上記対象におけるＦＴＤ病態を特徴付けること
を含む。
別の実施形態では、ＦＴＤ患者のプールに対応する対照レベルと比較して、単離されたＥＶにおけるＴＤＰ４３の増加されたレベル及びｐ－タウの低下されたレベルは、上記ＦＴＤ病態がＴＤＰ４３タンパク質症と関連付けられることを示し、かつ
ＦＴＤ患者のプールに対応する対照レベルと比較して、単離されたＥＶにおけるＴＤＰ４３の低下されたレベル及びｐ－タウの増加されたレベルは、上記ＦＴＤ病態がタウタンパク質症と関連付けられることを示す。
別の実施形態では、本方法はさらに、
ｉ．１以上の標的分子を提示する所定量の粒子を含有する対照試料を提供すること、
ｉｉ．それらの対応する標的分子への特異的結合を可能にする条件下で、対照試料とシステムを接触させること、
ｉｉｉ．上記親和性分子により結合された粒子の量を定量すること、及び
ｉｖ．結合された粒子の量が所定の閾値を超えることを決定すること
を含む。
別の実施形態では、上記粒子は、蛍光標識されたビーズであり、対照試料は、上記生体液試料と上記システムを接触させる前に、上記生体液試料と組み合わされる。別の実施形態では、上記対照試料は、１以上の上記標的分子を外因的に発現するように操作された陽性対照ＥＶを含み、任意に、上記標的分子を発現しない陰性対照ＥＶをさらに含む。別の実施形態では、上記対照ＥＶは、第１の蛍光マーカーを含有する非神経細胞から取得された陰性対照ＥＶ、及び１以上の上記標的分子を発現するように操作された同等の非神経細胞から取得され、かつ第２の別個の蛍光マーカーを含有する陽性対照ＥＶを含む。別の実施形態では、所定の閾値は、対照試料中で提供される粒子の所定量の少なくとも４４％の回収率に相当する。
別の実施形態では、単離されたＥＶは、少なくとも２０倍の非神経細胞特異的マーカーレベルに対する神経細胞特異的マーカーレベルの比率によって特徴付けられる。別の実施形態では、上記標的分子は、ＮＬＧＮ３及びＧＡΒ４３を含む。別の実施形態では、上記標的分子は、ＮＬＧＮ３及びＧＡΒ４３である。別の実施形態では、上記標的分子は、Ｌ１ＣＡＭ及び／又はＲａｂ３ａをさらに含む。別の実施形態では、上記標的分子は、ＮＬＧＮ３、ＧＡＰ４３及びＬ１ＣＡＭである。別の実施形態では、物質は、複数の磁気ビーズである。別の実施形態では、親和性分子は、抗体であるか、又はその抗原結合部分を含む。別の実施形態では、生体液試料は、血液、血漿及び血清からなる群から選択される。別の実施形態では、上記対象は、ヒトである。
別の態様では、本方法は、それを必要とする対象におけるＡＬＳを診断するために使用され、かつ
ａ．対象からＥＶ含有生体液試料を取得すること、
ｂ．ＥＶの表面上の標的分子に結合できる物質結合親和性分子を含む単離システムを提供することであって、標的分子の少なくとも１つが、ＮＬＧＮ３及びＧＡＰ４３からなる群から選択されるシナプスタンパク質である、提供すること、
ｃ．それらの対応する標的分子への上記親和性分子の特異的結合を可能にする条件下で、生体液試料と上記システムを接触させること、
ｄ．上記親和性分子に結合したＥＶを単離すること、
ｅ．単離されたＥＶ中のＬＣ３、ＴＤＰ４３、及びＮＲＦ２のレベルを決定すること、並びに
ｆ．単離されたＥＶにおいて決定されるＬＣ３、ＴＤＰ４３、及びＮＲＦ２のレベルを、対照生体液試料に対応するそれらのそれぞれのレベルと比較して、それにより試料の診断シグネチャを対照診断シグネチャと比較することであって、対照診断シグネチャと比較した生体液試料の診断シグネチャにおける有意差が、上記対象がＡＬＳに罹患していることを示す、比較すること
を含む。
別の態様では、ａ．対象からＥＶ含有生体液試料を取得すること、
ｂ．ＥＶの表面上の標的分子に結合できる物質結合親和性分子を含む単離システムを提供することであって、標的分子の少なくとも１つが、ＮＬＧＮ３及びＧＡＰ４３を含むシナプスタンパク質である、提供すること、
ｃ．それらの対応する標的分子への上記親和性分子の特異的結合を可能にする条件下で、生体液試料と上記システムを接触させること、
ｄ．上記親和性分子に結合したＥＶを単離すること、
ｅ．単離されたＥＶ中の少なくとも１つのシナプスタンパク質、少なくとも１つのタウ遺伝子産物及び少なくとも１つのアミロイド遺伝子産物を含む少なくとも４つのバイオマーカーのレベルを決定すること、並びに
ｆ．単離されたＥＶにおいて決定されたバイオマーカーのレベルを、対照生体液試料に対応するそれらのそれぞれのレベルと比較して、それにより試料の診断シグネチャを対照診断シグネチャと比較することであって、対照診断シグネチャと比較される生体液試料の診断シグネチャの有意差が、上記対象がＡＤに罹患しているか、又は発症する素因があることを示す、比較すること
を含む、それを必要とする対象におけるＡＤ又はその素因を診断する方法が提供される。
別の実施形態では、少なくとも１つのシナプスタンパク質は、ＰＳＤ９５又はＮＬＧＮ１であり、少なくとも１つのタウ遺伝子産物は、タウ又はｐ１８１－タウであり、少なくとも１つのアミロイドマーカーは、Ａβ４２である。別の実施形態では、上記バイオマーカーは、Ａβ４２、ｐ－タウ、ＰＳＤ９５及びｐｒｏＢＤＮＦであり、対照診断シグネチャと比較される生体液試料の診断シグネチャにおける有意差は、上記対象がＡＤに罹患していることを示す。
別の実施形態では、本方法はさらに、
ｉ．１以上の標的分子を提示する粒子の所定量を含有する対照試料を提供すること、
ｉｉ．それらの対応する標的分子への特異的結合を可能にする条件下で、対照試料とシステムを接触させること、
ｉｉｉ．上記親和性分子により結合された粒子の量を定量すること、及び
ｉｖ．結合された粒子の量が所定の閾値を超えることを決定すること
を含む。
別の実施形態では、上記粒子は、蛍光標識されたビーズであり、対照試料は、上記生体液試料と上記システムを接触させる前に生体液試料と組み合わされる。別の実施形態では、上記対照試料は、１以上の上記標的分子を外因的に発現するように操作された陽性対照ＥＶを含み、任意に、上記標的分子を発現しない陰性対照ＥＶをさらに含む。別の実施形態では、上記対照ＥＶは、第１の蛍光マーカーを含有する非神経細胞から取得された陰性対照ＥＶ、及び１以上の上記標的分子を発現するように操作された同等の非神経細胞から取得され、かつ第２の別個の蛍光マーカーを含有する陽性対照ＥＶを含む。別の実施形態では、所定の閾値は、対照試料中で提供される粒子の所定量の少なくとも４４％の回収率に相当する。
別の実施形態では、単離されたＥＶは、少なくとも２０倍の非神経細胞特異的マーカーレベルに対する神経細胞特異的マーカーレベルの比率によって特徴付けられる。別の実施形態では、上記標的分子は、ＮＬＧＮ３及びＧＡＰ４３を含む。別の実施形態では、上記標的分子は、ＮＬＧＮ３及びＧＡＰ４３である。別の実施形態では、上記標的分子は、Ｌ１ＣＡＭ及び／又はＲａｂ３ａをさらに含む。別の実施形態では、上記標的分子は、ＮＬＧＮ３、ＧＡＰ４３及びＬ１ＣＡＭである。別の実施形態では、物質は、複数の磁気ビーズである。別の実施形態では、親和性分子は、抗体であるか、又はその抗原結合部分を含む。別の実施形態では、生体液試料は、血液、血漿及び血清からなる群から選択される。別の実施形態では、上記対象は、ヒトである。別の態様では、神経細胞由来のＥＶを単離するためのシステムであって、生体液試料から神経細胞由来のＥＶを特定又は捕捉するための手段を含み、ＥＶの表面上の標的分子に結合できる物質結合親和性分子を含み、（ｉ）システムの精度を決定する手段、及び／又は（ｉｉ）捕捉されたＥＶ中の少なくとも１つのバイオマーカーのレベルを決定する手段をさらに含む、システムが提供され、
標的分子の少なくとも１つが、シナプスタンパク質（特に、ＮＬＧＮ３及びＧＡＰ４３からなる群から選択されるシナプスタンパク質）であり、
上記システムの精度を決定するための手段が、少なくとも１つのシナプスタンパク質を提示しかつマーカーによって標識される粒子を含み、かつ
少なくとも１つのバイオマーカーが、タウ、リン酸化タウ（ｐ－タウ）、Ａβ４２、ＮＬＧＮ、ＴＤＰ４３、クラスタリン、ＳＹＰ、ＢＩＭ、ＮＥＦＬ、ＥＮＯ２、ＮＲＧＮ、及びＧＰＲ２６遺伝子産物、並びにそれらの組み合わせからなる群から選択されるか、又はＬＣ３、カテプシンＤ、ＮＲＦ２、Ａβ４２、ｐ－タウ、ＰＳＤ９５、ｐｒｏＢＤＮＦ、ＣＯＸ２、ＥＩＦ２Ｃ２及びＮＦ－κＢ並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される。
別の実施形態では、標的分子は、ＮＬＧＮ３及びＧＡＰ４３を含む。別の実施形態では、上記標的分子は、ＮＬＧＮ３及びＧＡＰ４３である。別の実施形態では、上記標的分子は、ＮＬＧＮ３、ＧＡＰ４３及びＬ１ＣＡＭである。別の実施形態では、捕捉されたＥＶ中の少なくとも１つのバイオマーカーのレベルを決定するための手段は、２つ、３つ、４つ、又は５つの上記バイオマーカーに対する抗体を含む。別の実施形態では、捕捉されたＥＶ中の少なくとも１つのバイオマーカーのレベルを決定するための手段は、タウ、ｐ－タウ、Ａβ４２、及びニューロリギン－１に対する抗体を含む。別の実施形態では、捕捉されたＥＶ中の少なくとも１つのバイオマーカーのレベルを決定するための上記手段は、ｐ－タウ及びＴＤＰ４３に対する抗体を含む。別の実施形態では、捕捉されたＥＶ中の少なくとも１つのバイオマーカーのレベルを決定するための上記手段は、Ａβ４２、ｐ－タウ、ＰＳＤ９５及びｐｒｏＢＤＮＦに対する抗体を含む。別の実施形態では、捕捉されたＥＶ中の少なくとも１つのバイオマーカーのレベルを決定するための上記手段は、ＬＣ３、ＴＤＰ４３、及びＮＲＦ２に対する抗体を含む。
別の態様では、ＥＶの表面上のそれぞれＮＬＧＮ３及びＧＡＰ４３に結合できるＮＬＧＮ３－特異的親和性分子及びＧＡＰ４３特異的親和性分子、並びに親和性分子に結合したＥＶを特定又は捕捉するための手段を含む、神経細胞由来のＥＶを特定する又は捕捉するためのキットが提供される。
別の態様では、本発明は、試料の神経細胞由来のＥＶ中のバイオマーカーのレベルを決定する手段を含み、バイオマーカーが、タウ、ｐ－タウ、Ａβ４２、及びニューロリギン－１である、ＭＣＩを有する、又はＡＤを発症する素因があると疑われる対象の生体液試料を分析するためのキットを提供する。
別の態様では、試料の神経細胞由来のＥＶ中のバイオマーカーのレベルを決定するための手段を含み、
対象は、ＭＣＩを有すると、またはＡＤを発症する素因があると疑われており、かつバイオマーカーは、タウ、ｐ－タウ、Ａβ４２、及びニューロリギン－１であり；
対象は、ＡＤを有すると疑われ、かつバイオマーカーは、Ａβ４２、ｐ－タウ、ＰＳＤ９５及びｐｒｏＢＤＮＦであり、
又は対象は、ＡＬＳを有すると疑われ、かつバイオマーカーは、ＬＣ３、ＴＤＰ４３、及びＮＲＦ２である、
神経障害を有すると疑われる対象の生体液試料を分析するためのキットが提供される。
本発明の他の目的、特徴及び利点は、以下の説明及び図面から明らかになるであろう。
図１Ａ～１Ｂは、磁気ビーズシステムを用いる様々な膜タンパク質に対する抗体を用いるＮＤＥ単離を示す。Ｌｕｍｉｎｅｘキットを用いて測定された総タウ（図１Ａ）及びｐ１８１－タウ（図１Ｂ）を、神経タンパク質マーカーとして用いた。 図２は、磁気ビーズシステムを用いる様々な膜タンパク質に対する抗体を用いるＮＤＥ単離、及びｑＰＣＲによる神経ｍＲＮＡマーカーの定量を示す。より濃い色合い（より低いＣｔ値）は、より高いｍＲＮＡレベルを表す。 図３は、血漿試料中にスパイクされたヒト人工多能性幹細胞（ＩＰＳ）由来の神経細胞から単離されたエクソソームの特異的回収率を示す。 図４Ａ～４Ｂは、スパイクイン検証対照用の操作されたＥＶシステムの利用を示す。図４Ａ－システムの概略図。図４Ｂ、左パネル－ＩｇＧ対照；図４Ｂ、右パネル－抗ＮＬＧＮ３抗体を用いるＮＤＥ単離。 図５Ａ～５Ｆは、内部スパイクイン対照用のビーズベースシステムの利用を示す。図５Ａ－標識ビーズの概略図；図５Ｂ－標識されたビーズの回収率（％）；図５Ｃ－標識されたビーズでスパイクインした試料から単離された内因性ＮＤＥ中のタウタンパク質レベル（ｐｇ／ｍｌ）。図５Ｄ－標識ビーズでスパイクインした試料から単離された内因性ＮＤＥ中のＮＲＧＮ ｍＲＮＡレベル（Ｃｔ）。図５Ｅ－量子ドットの回収率曲線（「ＱＤインプット」－添加されたＱＤ；「ＱＤ回収率」－回収されたＱＤ；ＭＦＩ－平均蛍光強度）；図５Ｆ－量子ドットでスパイクインした試料（ＱＤ）とスパイクインしていない試料（ＱＤなし）から単離された内因性ＮＤＥ中のタウタンパク質レベル（ｐｇ／ｍｌ）。 図６は、選択性の高いＮＤＥ単離を提供する複数の単離標的に対する抗体の相乗的な組み合わせの使用を示す。結果を、血小板マーカーＰＦ４のｍＲＮＡレベル（ノイズ）に対する神経細胞マーカーＮＲＧＮのｍＲＮＡレベル（シグナル）の倍数変化として示す。 図７Ａ～７Ｂは、ウェスタンブロット（ＷＢ）及び蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析を用いる単離特異性を示す。図７Ａ－様々な神経細胞マーカー及び非神経細胞マーカーのレベルを測定するための２つのドナー（ＮＤＥ１及びＮＤＥ２）からのマーカーの組み合せにより単離されたＥＶの可溶化液、全血漿（Ｐｌ）及びＨＥＫ２９３細胞可溶化液（細胞）でのＷＢ。神経細胞タンパク質Ｌ１ＣＡＭ及びＧＲＩＡ２、一般的なエクソソームマーカーＡＬＩＸ、ＦＬＯＴ１、ＣＤ６３、ＣＤ９及びＣＤ８１、並びに対照タンパク質アルブミン及びカルネキシンのレベルを、決定した。図７Ｂ－マーカーの組み合わせ（ＮＤＥ）により又は非特異的抗体（ＩｇＧ対照）を用いて単離された無傷のＥＶに対するＦＡＣＳにより検査されたエクソソーム（ＣＤ９）及び神経細胞（Ｌ１ＣＡＭ）マーカー。 図８Ａ～Ｃは、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の高精度診断分類器の開発を示す。図８Ａ－ＡＬＳ患者及び対照におけるＬＣ３、カテプシンＤ及びＴＤＰ４３のレベル（ｎ＝３５）。図８Ｂ－ＡＬＳ患者及び対照におけるＣＯＸ－２、ＥＩＦ２Ｃ２及びＮＲＦ２（ＮＦＥ２Ｌ２）のレベル（ｎ＝１５）。図８Ｃ－ＡＬＳ患者対対照のＬＣ３、ＴＤＰ４３及びＮＦＥ２Ｌ２レベルの組み合わせに基づく受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線。 図９Ａ～９Ｃは、アルツハイマー病（ＡＤ）のいくつかの動物モデルにおける、抗体の組み合わせ（ＮＥＶ）及び脳組織（皮質）を用いて単離されたＥＶ中の神経タンパク質のレベル間の相関を示す。図９Ａ－総タウレベル（ｔタウ）；図９Ｂ－リン酸化タウレベル（ｐ１８１－タウ）；図９Ｃ－アミロイドベータ４２レベル（Ａβ４２）。円は、野生型マウス（ＷＴ）を表し、四角形は、２ｘＴｇ－ＡＤマウスを表し、十字は、３ｘＴｇ－ＡＤマウスを表し、かつ星は、５ｘＦＡＤマウスを表す。 図１０Ａ～Ｂは、軽度認知障害（ＭＣＩ）の高精度診断分類器の開発を示す。図１０Ａ－個々の患者（右）又は健常対照者（左）における総タウ（tタウ）、リン酸化タウ（ｐタウ－１８１）、アミロイドベータ４２（Ａβ４２）、アミロイドベータ４０（Ａβ４０１）及びＮＬＧＮ１（ＮＬＧＮ）のレベル。図１０Ｂ－ＭＣＩ患者を特定できる、タウ、ｐ－タウ、ＮＬＧＮ及びＡβ４２の相対レベルを組み合わせる診断スコア。 図１１Ａ～Ｈは、初期のＡＤ及び健常対照からの血漿中の神経細胞由来エクソソームのタンパク質レベルを示す。レベルを、Ａβ４２（図１１Ａ）、タウ（図１１Ｂ）、ｐ－１８１－タウ（図１１Ｃ）、ＰＳＤ９５（図１１Ｄ）、ｐｒｏＢＤＮＦ（図１１Ｅ）、及びＮｆκＢ（図１１Ｆ）について測定した。図１１Ｇ－ＡＤ対対照におけるＡβ４２、ｐ－１８１－タウ、ＰＳＤ９５及びｐｒｏＢＤＮＦの相対レベルを組み合わせる診断スコア。図１１Ｈ－受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線の特定されたスコアを表す。 図１２は、複数のＮＤＥマーカーを用いる前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）病態生理の鑑別診断を示す。
発明の詳細な説明
本発明は、神経変性疾患のための低侵襲バイオマーカーベースの診断、並びに細胞外小胞（ＥＶ）の特定集団を単離する及び分析するための組成物及び方法に関する。特に、本発明の実施形態は、神経細胞由来のＥＶを単離する、特定する又は捕捉するための、生体試料を分析するための、並びに神経学的状態及び神経変性状態を診断する、評価する及び発症を予測するための方法並びにシステムに関する。
本発明は、一部には、血漿及び血清などの生体試料から神経由来細胞外小胞（ＮＤＥ）を単離するために非常に有用である、特にシナプスタンパク質を含む分子標的の驚くべき特定に基づく。ニューロリギン－３（ＮＬＧＮ３）及び成長関連タンパク質４３（ＧＡＰ４３）が、選択的にＮＤＥを捕捉するための表面標的として、既知の標的であるＬ１細胞接着分子（Ｌ１ＣＡＭ）を含む他の神経細胞タンパク質よりも有意に有効であることが、本明細書で初めて開示される。驚くべきことに、ＮＬＧＮ３及びＧＡＰ４３に対する物質結合抗体の組み合わせは、単独で、又は物質結合抗Ｌ１ＣＡＭ抗体とさらに組み合わされて、特異的単離能力を高めるように、かつ単離されたＥＶで測定される特異的マーカーと非特異的マーカーの比率を改善するように相乗的に作用することが発見された。この特有の組み合わせは、元の組織中のそれらのレベルを反映する、捕捉されたＥＶから単離された脳タンパク質の非常に顕著でつり合った濃縮を提供した。興味深いことに、ＮＬＧＮ３とＧＡＰ４３を組み合わせて標的とすることは、ＮＬＧＮ３、ＧＡＰ４３とＬ１ＣＡＭを組み合わせて標的とするよりもさらに選択的であり、単離されたＥＶ可溶化液中で測定される特異的（神経細胞ｍＲＮＡ）マーカーレベルと非特異的（血小板ｍＲＮＡ）マーカーレベルの比率をさらに向上させた。
本発明はさらに、部分的には、改良された分析アッセイの開発に基づき、臨床的診断に適する信頼性の高い一貫した測定を提供する。驚くべきことに、操作された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）又は操作された（ｍａｎｉｐｕｌａｔｅｄ）ＥＶに基づく検証スパイクイン対照の使用は、広範囲の試料希釈液下での特定のＥＶ回収率の評価を可能にし、臨床使用のための特定された分子標的の適用性をさらに確立した。加えて、ビーズ（微粒子）ベースのシステムが、開発され、内部スパイクイン対照として特に有用であると決定され、アッセイの収率に大きな影響を与えることなく、各試験試料の回収率の直接評価を可能にした。
本発明はまた、部分的には、神経疾患の高精度診断アッセイの予期せぬ発見に基づき、末梢血試料を分析することによって疾患又は病状の早期発見及び特徴付けを可能にする。本発明者によって開発された、改良されたＮＤＥ単離の方法及びシステムを用いて、多数の診断マーカー及びシグネチャが、特定され、異なる神経変性状態を有するヒト対象の感受性、病態及び予後を評価することにおいて予想外に有効であると見出された。特に、４つのタンパク質マーカーの組み合わせに基づく軽度認知障害（早期ＡＤと関連付けられるＭＣＩを含む、ＭＣＩ）の高精度診断分類器と、２つのタンパク質バイオマーカーの組み合わせに基づく前頭側頭型認知症の病態生理の鑑別診断用アッセイが、予想外に開発された。加えて、３つのバイオマーカーのみの組み合わせに基づく筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）のための極めて正確な診断分類器、及び４つのタンパク質マーカーのレベルを組み合わせる、ＡＤの診断分類器もまた、本発明のシステム及び方法を用いて開発された。
そのため、特定の理論又は作用機序に縛られることなく、本明細書に開示される改良された方法及びアッセイを用いて、血液循環中へと血液脳関門（ＢＢＢ）を通過するＮＤＥの単離及び評価は、脳組織生検を行う必要なしに、簡単な血液検査を利用して高い忠実度で中枢神経系（ＣＮＳ）神経細胞をプローブすることを可能にする。さらに、本明細書に開示されるような技術的改良は、商業的、臨床グレード及びハイスループットスクリーニング適用に適する堅牢で正確なアッセイ及びシステムを含む、大規模適用に有利に適合する。
本発明の態様及び実施形態により、神経由来エクソソーム又はＥＶ（ＮＤＥ）が生体試料から単離され、捕捉され又は選択されるアッセイ及び方法が、提供される。本発明の実施形態により、ＥＶ含有生体試料（本明細書に開示される血漿又は様々な他の生体液試料を含む）が、ＮＤＥの表面上のシナプスタンパク質標的に特異的に結合できる、かつ試料から上記ＮＤＥの濃縮又は精製を提供できる、１以上の親和性分子と接触される。本発明の実施形態では、試料は、それらの対応する標的（本明細書では標的分子又は単離マーカーとも呼ばれる）への上記親和性分子の特異的結合を可能にする条件下で、親和性分子と接触される。親和性分子に結合したＮＤＥを次いで、本明細書に開示されるように、試料から取得又は選択し、例えば、単離し、さらなる分析のために使用できる。例えば、様々な診断マーカーを、単離されたＮＤＥの表面及び／又は内部で検出し、それらのレベルを測定し、それらのそれぞれの対照レベルと比較できる。
Ａ．単離システム及び関連アッセイ
いくつかの態様及び実施形態では、本発明は、ＥＶ用の、特にＮＤＥ用の単離システムに関する。本発明の実施形態による単離システムは、ＥＶの表面上の標的分子に結合できる物質結合親和性分子を含む。有利には、本明細書に開示されるように、標的分子は、少なくとも１つのシナプスタンパク質を含む。他の実施形態では、ＥＶの表面上の標的分子に結合できる物質結合親和性分子は、ＥＶ、特にＮＤＥを特定する又は捕捉するためのアッセイ及び方法において使用され得る。
シナプスタンパク質と単離標的
本明細書で使用される用語「シナプスタンパク質」は、非シナプス膜領域と比較して、シナプス空間で顕著に濃縮されることが知られている膜タンパク質を指す。シナプスタンパク質は、神経伝達物質の放出と受容の調節、シナプス構造の保持、及び／又は神経細胞の初期の発達に関与し得る。
いくつかの実施形態では、シナプスタンパク質は、ＮＤＥの単離又は捕捉のための優れた標的であると本明細書で開示される。他の実施形態では、いくつかのシナプスタンパク質はまた、以下でさらに詳細に説明されるように、例えば診断シグネチャを形成するために他のバイオマーカーと組み合わせて、診断マーカーとして使用され得る。
様々な実施形態では、ＮＤＥ単離マーカーとして有用なシナプスタンパク質は、単独で又は組み合わせてのいずれかで、例えば、ニューロリギン（ＮＬＧＮ）ファミリーメンバー及び／又はその対応物のリガンドを含む。本明細書で初めて開示されるように、ＮＬＧＮ３は、血液由来試料などの非神経細胞生体液から選択的にＮＤＥを捕捉するための特に有用な標的である。追加の実施形態では、ＮＬＧＮ１を含むが、これに限定されない他のＮＬＧＮファミリータンパク質、又はニューレキシン（ＮＲＸＮ）を含むが、これに限定されないＮＬＧＮ対応物（リガンド）の使用が、企図される。さらなる実施形態では、ＧＡＰ４３、シナプトタグミン－１（ＳＹＴ１）、及びＧＲＩＡ１（グルタミン酸受容体１、ＧｌｕＲ１）を含むが、これらに限定されない、追加のシナプスタンパク質標的が、使用され得る。そのため、追加の実施形態により、本発明は、複数の標的（例えば、本明細書に開示される複数のシナプスタンパク質標的、又はＲａｂ３ａなどの追加の標的分子）の使用を採用する。例示的な実施形態により、ＥＶの表面上の２つ、３つ又は４つの標的分子に結合できる物質結合親和性分子が使用され得、各可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。したがって、別の例示的な実施形態では、本発明は、追加のシナプス又は非シナプス標的と組み合わせた少なくとも１つのＮＬＧＮ標的、例えば成長関連タンパク質４３(ＧＡＰ４３)と組み合わせた、及び任意にさらに、ＮＤＥ単離のための標的分子として、Ｌ１ＣＡＭと組み合わせたＮＬＧＮ３の使用に関する。
そのため、本発明の方法の別の実施形態では、試料を、それらの対応する標的への親和性分子の特異的結合を可能にする条件下で、ＥＶの表面上で、シナプスタンパク質標的ＮＬＧＮ３及びＧＡＰ４３に及び追加の標的Ｌ１ＣＡＭに結合できる親和性分子（の組み合わせ）と接触させる。本発明の方法の別の特定の実施形態では、上記親和性分子は、ＮＬＧＮ３及びＧＡＰ４３からなる標的分子に結合できる（例えば、以下で説明及び実証されるように、ＮＬＧＮ３及びＧＡＰ４３に対する抗体）。
本発明の実施形態による特定の好ましいシナプスタンパク質標的の詳細を、以下の表１に提供する。いくつかの実施形態では、これらのバイオマーカーの１以上は、本明細書に開示されるようなアッセイ及び方法に従って、ヒト対象のＮＤＥを捕捉する又は単離するために使用され得る。
表１－例示的なシナプスタンパク質
Figure 2023542122000001
物質結合親和性分子
様々な実施形態では、親和性分子は、抗体、受容体、リガンド、小分子、及びアプタマーを含むが、これらに限定されない、目的の標的を特異的に認識するために使用される結合剤を含む。いくつかの実施形態では、親和性分子は、抗体であるか、又はその抗原結合部分を含む。
本明細書で使用する抗原に向けられる（又は特異的な）抗体は、抗原を特異的に結合できる抗体である。本明細書で使用する用語「特異的に結合する」又は「特異的に認識する」は、抗原への抗体の結合が非関連分子の存在により競合的に阻害されないことを意味する。
無傷の抗体は、例えば、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を含む。軽鎖と重鎖の両方の全体又は基本的に全体の可変領域を含む（抗原結合部分を形成する）例示的な機能性抗体断片は、例えば、（ｉ）２つの鎖として軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域からなる遺伝子操作された断片として定義される、Ｆｖ；（ｉｉ）適切なポリペプチドリンカーによって連結される、軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域を含む遺伝子操作された単鎖分子である、単鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）；（ｉｉｉ）無傷の軽鎖及び可変ドメインとそのＣＨ１ドメインからなる、重鎖のＦｄ断片をもたらすために抗体全体を酵素パパインで処理することによって得られる、抗体分子の１価の抗原結合部分を含有する抗体分子の断片である、Ｆａｂ；（ｉｖ）抗体全体を酵素ペプシンで処理し、次いで還元によって得られる（抗体分子あたり２つのＦａｂ’断片が得られる）、抗体分子の１価の抗原結合部分を含有する抗体分子の断片である、Ｆａｂ’；並びに（ｖ）抗体全体を酵素ペプシンで処理することによって得られる、抗体分子の１価の抗原結合部分を含有する抗体分子の断片である、Ｆ（ａｂ’）２（すなわち、２つのジスルフィド結合により一緒に保持されるＦａｂ’断片の二量体）、を含む。さらに、キメラ抗体；組換え抗体及び操作された抗体、一本鎖抗体（例えば一本鎖Ｆｖ）及びその断片（抗原結合部分を含む）が、本発明の範囲内に含まれる。
本明細書で使用する用語「抗原」は、抗体により結合され得る分子又は分子の一部である。抗原は典型的には、動物がその抗原のエピトープに結合できる抗体を生成するように誘導できる。抗原は、１以上のエピトープを有し得る。上記の特異的反応は、抗原が、他の抗原によって誘発され得る多数の他の抗体とは反応せず、その対応する抗体と高度に選択的に反応することを示すことを意図する。
モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を作製する方法は、当技術分野において周知である。抗体は、抗体分子のインビボ生成の誘導、免疫グロブリンライブラリーのスクリーニング、又は培養物中の連続細胞株によるモノクローナル抗体分子の作製を採用し得るいくつかの既知の方法のいずれかを介して作製され得る。これらは、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、及びエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）－ハイブリドーマ技術を含むが、これらに限定されない。抗体をインビボで生成する従来の方法に加えて、抗体は、ファージディスプレイ技術を用いて、当技術分野において周知の方法により、インビトロで作製できる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｌｉｇａｎら（編），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９２－２０００），１７章,１７．１節）。
ＮＬＧＮ３に対する抗体の非限定的な例は、例えば、ＬＳＢｉｏ ＬＣ－Ｃ８１９１０３、ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ １１１６０－Ｒ２４２、ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ １０１－１１１１６、Ｎｏｖｕｓ ＭＢＰ２－８９８２４、Ａｂｎｏｖａ Ｈ０００５４４１３－ＭＯ２、Ｒｏｃｋｌａｎｄ ２００－３０６－Ｗ８３、Ｂｉｏｒｂｙｔ ｏｒｂ４１６４０８、Ｂｏｓｔｅｒ Ａ０４６２７－１、及びＧ－Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＩＴＡ９４３３を含む。ＧＡＰ４３に対する抗体の非限定的な例は、例えば、Ｂｉｏｒｂｙｔ ｏｒｂ６２１８１２、ＬｓＢｉｏ ＬＳ－Ｂ２１５７、ＨｕＡＢＩｏ ＥＴ１６１０－９４、Ａｂｎｏｖａ ＭＡＢ２００７０、Ｈ００００２５９６－Ｍ０１、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＭＡ５－３２２５６、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ３３－５０００、ＡＢＣＡＭ ａｂ７５８１０、ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ ＭＢＳ１７９７５６、ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ ＭＢＳ２４３０２８、及びＯｒｉＧｅｎｅ ＲＡ２５０８６－１００を含む。
別の実施形態では、親和性分子は、本明細書に開示される標的分子に特異的なアプタマー、例えば核酸アプタマー又はペプチドアプタマーである。用語「アプタマー」は、安定な三次構造を有し、かつ高い親和性と特異性で標的分子に結合できる特別な種類の一本鎖核酸、二本鎖核酸、又はペプチドを指す。特定の実施形態では、アプタマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はそれらの組み合わせであり得るが、これらに限定されない。加えて、アプタマーは、修飾されない、すなわち天然のアプタマー又は修飾されたアプタマーであり得る。具体的には、修飾アプタマーは、少なくとも１つの化学修飾を含み得、少なくとも１つの化学修飾は、リボース位置、デオキシリボース位置、リン酸位置、及び塩基位置から独立して選択される１以上の位置で化学的である。加えて、化学修飾は、２'位の糖修飾、２'－フルオロ（２'－Ｆ）、２'－Ｏ－メチル、８位のプリン修飾、環外アミンのシトシンエキソ修飾、５－ブロモウラシルの置換、５－ブロモデオキシウリジンの置換、５'－ブロモデオキシシチジンの置換（５－ブロモデオキシシチジン）置換、骨格修飾、メチル化、３'－キャップ（３'ｃａｐ）及び／又は５'－キャップ（５'ｃａｐ）であり得る。加えて、疎水性官能基は、ベンジル基、ナフチル基、ピロールベンジル基、及びトリプトファンからなる群から選択される少なくとも１つであり得る。ペプチドアプタマーは、特異的標的分子を結合するように選択された又は操作された人工タンパク質である。これらのタンパク質は、タンパク質足場により提示される可変配列の１以上のペプチドループからなる。アプタマーは、例えばＳＥＬＥＸ（指数関数的濃縮によるリガンドの体系的進化）を介して、又は当技術分野で知られているペプチドアプタマーのライブラリー（例えば、酵母ツーハイブリッドシステム）を用いてインビトロで調製できる。
別の実施形態では、親和性分子は、シナプスタンパク質と相互作用するリガンドである。本明細書で使用する場合、リガンドは、標的タンパク質（例えば受容体）と特異的に相互作用するタンパク質又はペプチドとして定義される。標的分子としてシナプスタンパク質を対象とする親和性分子（例えば、ＮＬＧＮリガンド）との関連で、リガンドは、シナプスの反対側の部分（例えば、シナプス後標的の場合はシナプス前、逆もまた同様）に位置する膜タンパク質として定義され、シナプス構造の一部として上記標的と相互作用する。例えば、ＮＬＧＮ３は、ＮＲＸＮ１、ＮＲＸＮ２及びＮＲＸＮ３と、並びにＰＩＣ３Ｒ１及びＰＩＣ３Ｒ２と相互作用する。ＮＬＧＮ３との相互作用を媒介するこれらのタンパク質又はその断片は、合成され、ビーズに固定され、ＮＬＧＮ３を標的とする親和性分子として使用できる。このようなタンパク質又はペプチドの合成は、当技術分野において知られているいくつかの方法により、例えば、大腸菌、他の細菌、ＨＥＫ２９３細胞又は他の細胞型における発現により行うことができる。短鎖ペプチドもまた、液相合成（ＳＰＳ）、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）、又は他の一般的な合成方法を用いて合成できる。別の例として、ＧＡＰ４３は、ＣＡＬＭ１、ＣＡＬＭ２、ＮＣＡＭ、カルモジュリン、ＰＲＫＣＢ及びＥＬＡＶＬ４と相互作用する。これらは、完全なタンパク質として、又は部分ペプチドとして使用できる。リガンドタンパク質は、それらの天然形態で、又は当技術分野で公知の方法を用いる改良の後で使用できる。例えば、相互作用の改善は、人為的進化、ランダム又は直接成熟、非天然アミノ酸への置換、及び結合剤の変更及び選択、改善することが知られている他の方法により達成できる。
別の実施形態では、上記親和性分子は、物質に結合して、物質結合親和性分子を形成する。例えば、親和性分子（例えば抗体）は、様々な物質、典型的には結合したＥＶの捕捉又は単離を可能にする固体又は半固体物質の外表面に結合し得る。適切な物質の例としては、ビーズ（特に磁気ビーズ又は粒子を含む）、ナノ粒子、カラム、プレート、マイクロ流体構造、リポソーム、又はそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用する場合、用語「物質に結合した」は、親和性分子が、ＥＶの単離、捕捉又は特定が容易になるように、共有結合又は本発明の方法で使用される条件下で安定な他の形態の化学結合により物質に付着されることを意味する。いくつかの実施形態では、親和性分子は、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用などによって物質に付着され得る。例えば、親和性分子は、ビオチン分子に結合した抗体、又はビオチン含有リンカー（切断可能なリンカーを含む）であり得、物質は、ストレプトアビジン又はアビジン分子などのビオチン対応物に結合される又はコートされ得る。特定の実施形態では、上記物質は、ストレプトアビジンコンジュゲート磁性微粒子である。他の実施形態では、親和性分子は、物質に共有結合されるか（直接又はリンカーを介して、一級アミン、スルフヒドリル、カルボン酸、及びアルデヒドを含むがこれらに限定されない適切な化学基を使用して）、又はタンパク質間相互作用により物質に付着される。各可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。
本明細書で使用する用語「磁気ビーズ」は、磁場勾配によって引き付けられるか、若しくは反発されるか、又は非ゼロ磁化率を有するナノスケール又はマイクロスケールの粒子を指す。磁気ビーズは、常磁性又は超常磁性であり得る。いくつかの実施形態では、磁気ビーズは、超常磁性である。磁気ビーズは、本明細書において磁性粒子とも呼ばれる。
磁気ビーズのサイズは、１ｎｍ～１ｍｍの範囲であり得る。例えば、磁気ビーズのサイズは、約２５０ｎｍ～約２５０μｍである。いくつかの実施形態では、磁気ビーズのサイズは、０．１μｍ～１００μｍ、０．１μｍ～５０μｍ、０．１μｍ～１０μｍ、１μｍ～１０μｍ、２μｍ～７μｍ、又は１μｍ～３μｍである。いくつかの実施形態では、磁気ビーズは、磁性ナノ粒子又は磁性微粒子である。磁性ナノ粒子は、磁場又は磁場勾配を用いて操作できるナノ粒子の一種である。そのような粒子は一般に、鉄、ニッケル及びコバルトなどの磁性元素並びにそれらの化合物からなる。磁性ナノ粒子は周知であり、それらの調製方法は、当技術分野において記載されている。例えば、米国特許第６，８７８，４４５；同第５，５４３，１５８号；及び同第５，５７８，３２５号を参照されたい。
磁気ビーズは、親和性分子に結合できる官能基の有無にかかわらず、例えば、Ｄｙｎａｌ Ｉｎｃ．（Ｌａｋｅ Ｓｕｃｃｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．）；ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．）；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）；Ｃｏｒｔｅｘ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，Ｃａｌｉｆ．）；及びＢａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｆｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｄ．）から市販されている。
特定の実施形態では、単離システムは、本明細書に開示される単離標的に対する抗体を含み、これらは、超常磁性微粒子に化学的に連結される。例えば、限定されないが、単離プロセス中に親和性分子の担体として使用される物質は、鉄（例えば、酸化鉄）及び任意に１以上のポリマーで構成される２～１０μｍの超常磁性微粒子（ビーズ）を含有し得る。これらの粒子の表面は、抗体又は他の親和性分子のコンジュゲーションを可能にする官能基又は要素（ストレプトアビジン又はビオチンを含むが、これらに限定されない）でコートされてよい。システムは、チューブラックでの使用のために都合よく適合された磁石をさらに含有してよい。
他の実施形態では、物質は、カラム、特にアフィニティーカラムを含み得る。カラムは、アガロース、セルロース、デキストラン、ポリアクリルアミド、ラテックス及び制御された細孔ガラスを含むがこれらに限定されない、異なるアフィニティーマトリックスを含有できる。他の実施形態では、カラムは、様々な密度（２～１０％）の糖、アガロース及びアクリルアミドベースのポリマー樹脂を含むがこれらに限定されない、ゲル支持体を含有できる。アフィニティーカラムは、様々なサイズのものであり得、重力又は異なる種類のポンプで動作する。親和性分子は、共有結合化学的相互作用（例えば、一級アミン、スルフヒドリル、カルボン酸、又はアルデヒド残基を介して）又は非共有結合相互作用を用いてカラムに固定化できる。
追加の実施形態では、物質は、プレート又はチューブであり得る。プレートは、３８４、９６、２４、１２及び６ウェルプレートを含むがこれらに限定されない、異なるサイズのものであり得る。親和性分子は、共有結合化学的相互作用（例えば、一級アミン、スルフヒドリル、カルボン酸、又はアルデヒド残基を介して）又は電荷若しくは疎水性相互作用などの非共有結合相互作用を用いてカラムに固定化できる。プレート又はチューブの使用は、単独で、又はプレートを振盪若しくは回転させる、かつ液体を循環させる他の器具と一緒に行われてよい。
さらに他の実施形態では、物質は、マイクロ流体装置であり得る。装置は、親和性分子がマイクロ流体装置に直接結合していることを意味する、スタンドアロンか、又は本明細書に記載のビーズ若しくは他の物質と組み合わせて動作できる。マイクロ流体物質は、シリコン、ガラス、ポリマー（例えばポリ塩化ビニル）、複合材料、又は紙から製造できる。装置の構造は、当業者に知られているマイクロ流体の流れの基本的な基準に従って設計できる。エクソソーム単離に使用され、かつ本発明の実施形態と組み合わされ得るマイクロ流体技術の例は、Ｌｌｉｅｓｃｕら（Ｍｉｃｒｏｍａｃｈｉｎｅｓ（Ｂａｓｅｌ）．２０１９ Ｊｕｎ；１０（６）：３９２）によって概説されている。
結合と単離の工程及び条件
本発明の実施形態により、試料は、それらの対応する標的への親和性分子の特異的結合を可能にする条件下で親和性分子と接触される。いくつかの実施形態では、条件は、特異的な抗原抗体複合体の形成を可能にする。例えば、接触は、生理学的条件下で、又は本明細書以下に記載及び例示されるような、イムノアッセイを実施するのに適するとして当技術分野で公知の他の条件（例えば、特定の範囲の温度、ｐＨ、イオン強度など）下で行われ得る。別の例示的な実施形態では、インキュベーションは、０℃を超え６０℃未満の温度の範囲、例えば４～４０℃で、回転又は振盪しながら行われ得る。非限定的な例により、条件は、１～２４時間、４～５０℃の温度範囲で、低速回転（毎分１０～１００回転（ｒｐｍ））又は振盪（３００～７００ｒｐｍ）を伴うインキュベーションを含み得る。インキュベーションは有利には、プロテアーゼ阻害剤及び任意にまたホスファターゼ阻害剤の存在下で行われ得る。
いくつかの実施形態では、洗浄及び／又はブロッキング工程が、無関係分子の非特異的結合を排除又は最小化するために、さらに実行され得る。例示的な実施形態により、洗浄を、使用されるシステムに応じて、適切な範囲のｐＨ（例えば、６～８）、塩濃度（例えば、０．１～１Ｍ）及び界面活性剤含有量（例えば、０．１～１％）を有する緩衝液を用いて、行ってよい（例えば、物質へ親和性分子結合させた後で、本明細書に記載の緩衝液で親和性分子をブロッキングした後で、及び／又は物質結合親和性分子と試料をインキュベートした後で）。他の例示的な実施形態では、親和性分子のブロッキング（試料とのインキュベーション前に）は、使用されるシステムに応じて、ＢＳＡ（例えば、１～１０％）、ミルク（例えば、１～１０％）、エタノールアミン（例えば、１０～１００ｍＭ）、ビオチン（例えば、１～５０μＭ）又はそれらの組み合わせを含む緩衝液を用いて都合よく行われ得る。
本明細書で使用する場合、ＥＶの「単離」は、実質的に純粋な又は濃縮されたＥＶ集団を取得するための、それらの環境（例えば、生体液試料）からのそれらの物理的分離を指す。
ＥＶの特定及び捕捉は、物質又はそれらの環境からの物理的な分離を必ずしも伴うことなく、特定のＥＶ集団の性質及び／又は量に関する情報を得ることができる様々な方法を含む。そのような方法はさらに、ＥＶ単離の工程を伴う、又は物質からの直接的定量化又は特定を容易にし得る。特定の方法は、単離のために使用される同じ親和性分子を利用できる。例示的な実施形態により、例えば、界面活性剤含有量の上昇及び／又はｐＨの低下を伴う条件下での、例えば、物質結合親和性分子からの上記ＥＶの溶出を伴う、ＥＶ単離の後続の工程が、含まれる。他の例示的な実施形態では、そのような単離工程は含まれず、ＥＶは、無傷でかつ物質結合親和性分子に結合したままである。ＥＶの特定は次いで、例えばＥＶマーカーに対する第２の親和性分子（例えば、ＣＤ９、ＣＤ６３若しくはＣＤ８１などの１以上の一般的なＥＶマーカーに対する抗体）又はＥＶ膜と直接相互作用する呈色剤を用いて、結合したＥＶの量を評価することによって行われ得る。
ＥＶ集団
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に開示される方法によって得られる、単離されたＥＶ集団に関する。別の実施形態では、ＥＶ集団は、ＮＤＥを含むか、又は基本的にそれからなる。本明細書で使用する用語「細胞外小胞」（ＥＶ）は、様々な生合成経路の二重膜小胞（サイズが２０ｎｍ～１μｍ）を指し、生細胞から放出される小胞から及び死滅しつつある細胞から放出される両方の小胞を含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法によって単離されるＥＶ集団は典型的には、エクソソームを含む。そのため、本発明の方法の文脈において、及び別段の指示がない限り、用語「エクソソーム」及び「ＥＶ」は、互換的に使用され得る。
本明細書で使用する用語「ＮＤＥ」は、様々な生体液（例えば、血液、血漿及び血清）から単離され得る１以上の神経細胞集団に由来する（それらにより分泌される）ＥＶ集団を指す。いくつかの実施形態では、本発明の診断方法に関連して言及されるＮＤＥはさらに、インビトロで細胞培養物から（例えば、分化した神経細胞から）分泌されるＥＶと区別されるとして定義される。特定の実施形態では、ＮＤＥは、血液又は血液由来試料から単離される。
Ｂ．処理と分析
試料
様々な実施形態では、ＥＶ含有試料は、本明細書では生体液試料又は生体試料とも呼ばれ、特に血液由来試料（例えば、血漿又は血清）を含む、対象の体液又は別の液体試料である。いくつかの実施形態では、ＣＳＦ試料及び唾液試料を含むがこれらに限定されない、他の生体液試料が、使用され得る。特定の実施形態では、生体液試料は、ＣＳＦ試料以外である。様々な他の実施形態では、培養神経細胞の馴化培地を含むがこれに限定されない、追加の生体試料が、使用され得る。様々な実施形態では、本明細書以下に詳述されるような疾患若しくは障害に罹患している、又は疾患若しくは障害を有すると又はその素因があると疑われる対象から取得される。
いくつかの実施形態では、ＮＤＥの単離又は特定は、生体液試料から直接行われる（例えば、非操作又は希釈血漿試料を用いて）。さらに他の実施形態では、操作の１以上の追加の工程が、ＥＶで試料を濃縮するために、行われ得る。例えば、限定されないが、総ＥＶ（非組織特異的ＥＶ）についての濃縮は、アフィニティー選択の前又は後のいずれかに、遠心分離、濾過、電荷分離、化学的沈殿及びそれらの組み合わせによって行われ得る。例えば、本明細書に例示されるように、培養神経細胞から取得される試料は、大きい容量（１０～４００ｍｌ）及び低いＥＶ存在量であり、そのため、本発明に従い特定の単離又は捕捉の工程に上記試料を供する前に、サイズ排除クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー及び／又は限外濾過によって処理され得る。
バイオマーカーと診断マーカー
追加の実施形態により、試料は、ＥＶペイロード、例えば、単離されたＮＤＥのタンパク質、ＲＮＡ、脂質及び／又は代謝産物（例えば、無傷のＮＤＥの表面で発現されるか、又はＮＤＥ可溶化液中に存在する）の検出及び／又は定量によりさらに分析される。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、様々な疾患及び状態と関連付けられ得、それにより診断マーカー又は予後マーカーとして役立つ、１以上のＥＶバイオマーカーのレベルを測定することを含む。本発明の実施形態により、上記ＥＶ中の１以上のバイオマーカーのレベルが、測定され、対照生体試料（のＥＶ）に対応するそれらのそれぞれのレベルと比較される。いくつかの実施形態では、本方法は、複数のバイオマーカーのレベルを測定すること、および得られた診断シグネチャを決定することを含み、これは、対照シグネチャ（対照試料のＥＶに相当する）と比較され得る。
本明細書で使用する用語「バイオマーカー」は、プロセス、事象、又は状態の特徴的な生物学的な又は生物学的に誘導される指標を指す。本明細書で使用されるバイオマーカーは、限定されないが、それらの多型、変異、変異体、修飾、サブユニット、断片、タンパク質－リガンド複合体、及び分解産物と共に、タンパク質、核酸、及び代謝産物を含む、遺伝子産物、並びに他の分析物（例えば、脂質及び糖）又は生物学的状態と関連付けられる試料由来の基準を包含する。一実施形態では、バイオマーカーは、ＥＶが由来する細胞又は組織の起源を示す（例えば、本明細書に例示されるような神経細胞特異的マーカー及び血小板特異的マーカー）。
用語「診断マーカー」は、対象における特定の疾患、疾患状態、病態又は診断可能な状態と関連付けられるバイオマーカーを指す。特に、本発明の実施形態による診断マーカーは、対照個体と比較して疾患又は状態を有する個体におけるそれらの差次的発現（又は翻訳後に変更されるレベル）が、疾患若しくは状態の診断、予後診断及び／又はモニタリングを容易にする、遺伝子産物を含む。
様々な実施形態では、バイオマーカーは、以下でさらに詳細に論じ例示するように、微小管結合タンパク質タウ（タウ、総タンパク質及び／又はリン酸化画分）、アミロイドベータ４２（Ａβ４２）、ニューロリギン（ＮＬＧＮ、特にＮＬＧＮ１を含む）、ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ４３）、ニューログラニン（ＮＲＧＮ）、ＳＹＰ、カテプシンＤ、ＬＣ３、ＳＹＴ、ＢＩＭ、ＮＥＦＬ、ＥＮＯ２、ＧＰＲ２６などの神経タンパク質及びそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。別の実施形態では、１以上のバイオマーカーは、タウ、ｐ－タウ、Ａβ４２、及びＮＬＧＮ、ＴＤＰ４３、ＣＬＵ、ＳＹＰ、ＢＩＭ、ＮＥＦＬ、ＥＮＯ２、ＮＲＧＮ、及びＧＰＲ２６遺伝子産物、並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される。各可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。特定の実施形態では、リン酸化タウは、Ｔｈｒ－１８１－リン酸化タウ（ｐ１８１－タウ）を含む。
一実施形態では、バイオマーカーは、ＬＣ３、カテプシンＤ、ＮＲＦ２、Ａβ４２、ｐ－タウ、ＰＳＤ９５、ｐｒｏＢＤＮＦ、ＣＯＸ２、ＥＩＦ２Ｃ２及びＮＦ－κＢからなる群から選択される。他の実施形態では、バイオマーカーは、総タウ、ｐ－タウ、Ａβ４２、ＰＳＤ９５、ｐｒｏＢＤＮＦ及びＮＦ－κＢからなる群から選択され得る。他の実施形態では、バイオマーカーは、総タウ、ｐ－タウ、Ａβ４２、ＰＳＤ９５、ｐｒｏＢＤＮＦ及びＮＦ－κＢを含み得る。別の実施形態では、上記バイオマーカーは、Ａβ４２、ｐ－タウ、ＰＳＤ９５及びｐｒｏＢＤＮＦである。別の実施形態では、バイオマーカーは、ＬＣ３、ＴＤＰ４３、ＮＲＦ２（ＮＦＥ２Ｌ２）、カテプシンＤ、ＣＯＸ２及びＥＩＦ２Ｃ２からなる群から選択される。さらに他の実施形態では、バイオマーカーは、ＬＣ３、ＴＤＰ４３、及びＮＲＦ２からなる群から選択され得る。他の実施形態では、バイオマーカーは、ＬＣ３、ＴＤＰ４３、及びＮＲＦ２を含み得る。
本発明の実施形態による特定の好ましいバイオマーカーの詳細を、以下の表２で提供する。いくつかの実施形態では、これらのバイオマーカー（遺伝子産物、転写産物又はタンパク質レベルのいずれかで）の１以上が、本明細書に開示される様々な神経学的状態の診断における使用のために、本明細書に開示されるように単離された又は捕捉されたヒト対象のＮＤＥにおいて検出される又は定量化され得る。本発明の実施形態に従ってアッセイされ得るバイオマーカーのさらなる非限定的な例が、表５（脂質バイオマーカー）で、並びに実施例の節全体にわたって提示され及び例示される。
表２－例示的なバイオマーカー
Figure 2023542122000002
Ｉ型膜タンパク質であるニューロリギン（ＮＬＧＮ）は、神経細胞間のシナプスの形成と維持を媒介する、シナプス後膜上の細胞接着タンパク質である。ニューロリギンは、シナプス前に位置する細胞接着タンパク質であるβ－ニューレキシン（ＮＲＸＮ）のリガンドとして機能する。ニューロリギンとβ－ニューレキシンは特異的に結合し、２つの神経細胞間の接続とシナプスの生成をもたらす。ニューロリギンはまた、シナプス機能を特定することにより神経ネットワークの特性に影響を与え、かつ主要なシナプス成分を動員及び安定化することによりシグナル伝達を媒介する。ニューロリギンは、細胞が成熟するにつれて、他のシナプス後タンパク質と相互作用して、シナプス後密度で神経伝達物質受容体及びチャネルを局在化させる。本発明の方法及びアッセイにおいて診断バイオマーカーとして使用される場合、用語「ニューロリギン」又は「ＮＬＧＮ」は特に、ＮＬＧＮ１を含むか、又はＮＬＧＮ１と免疫学的に交差反応するＮＬＧＮ遺伝子産物を意味する。ＲＮＡバイオマーカーは、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、ｄｄＰＣＲ、ＲＮＡ－ｓｅｑ、チップアレイなどを含むがこれらに限定されない、様々なＲＮＡ分析方法を用いて検出又は定量化され、タンパク質バイオマーカーは、様々なイムノアッセイ又は他のタンパク質分析方法、例えばＥＬＩＳＡ、タンパク質アレイ、質量分析、フローサイトメトリーなどを用いて検出される又は定量化され得る。このようなアッセイは、以下でより詳細に論じる。検出され及び定量されたバイオマーカーの非限定的な例は、以下の実施例の節で提供される。
バイオマーカーの検出と定量化
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、単離された又は結合されたＥＶ中のバイオマーカーのレベルを決定することを伴う。決定されたレベルは、バイオマーカーが試料中に存在するかどうかを評価するため（検出）、かつ／又はその絶対量若しくは相対量を評価するため（定量化）に使用され得る。それらのｍＲＮＡ及び／又はタンパク質レベルでの遺伝子産物を含むがこれらに限定されない、バイオマーカーのレベルを決定するための様々な方法が、当技術分野において公知である。
いくつかの実施形態により、ｍＲＮＡバイオマーカーを検出及び／又は定量するための適切な方法は、限定されないが、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ、例えば定量的又は半定量的）、リアルタイムＰＣＲなどを含む増幅反応；Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ａｇｉｌｅｎｔ、及びＩｌｌｕｍｉｎａマイクロアレイプラットフォームなどの遺伝子発現マイクロアレイ；ナノストリング（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ）テクノロジー、特異的アダプター及び／又はプローブを使用する次世代シーケンシング（ＮＧＳ）などのシーケンシングなど、又はそれらの組み合わせなどの方法を含み得る。
例えば、リアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）は、標的ＤＮＡ分子の増幅及び同時定量を可能にする。ＲＴ－ｑＰＣＲを用いて遺伝子発現レベルを分析するために、試料の全ｍＲＮＡ（例えば、本明細書に開示される単離されたＮＤＥ集団）を、最初に単離し、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡへと逆転写できる。例えば、ｍＲＮＡレベルは、製造元の指示に従って、例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７９００ＨＴ装置でのＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて決定できる。転写産物レベルは、十分に確立されたデルタサイクル閾値（ΔＣｔ）法に従って半定量的に試料間で比較されてよく、又は存在量が、標準曲線と比較することにより計算され得る。
デジタルＰＣＲは、核酸の検出と定量の新しい手法であり、絶対定量と希少対立遺伝子検出のための従来のリアルタイム定量ＰＣＲの代替方法を提供する。デジタルＰＣＲは、ＤＮＡ又はｃＤＮＡの試料を多くの個別の並行ＰＣＲ反応に分けることにより機能する。これらの反応のいくつかは、標的分子を含み（陽性）、一方で他方は、含まない（陰性）。単一分子が、１００万倍以上に増幅され得る。増幅中に、色素標識プローブを用いるＴａｑＭａｎケミストリーを用いて、配列特異的標的を検出する。標的配列が存在しない場合、シグナルは蓄積しない。ＰＣＲ分析に続いて、陰性反応の割合を用いて、標準物質又は内因性対照を必要とせずに、試料中の標的分子数の絶対数を生成する。ナノ流体チップの使用は、何千ものＰＣＲ反応を並行して実行するための便利で簡単なメカニズムを提供する。各ウェルに試料、マスターミックス、及びＴａｑＭａｎアッセイ試薬の混合物をロードし、個別に分析して、エンドポイントシグナルの存在（陽性）又は不在（陰性）を検出する。標的配列の２以上の分子を受け取った可能性のあるウェルを説明するために、補正率を、ポアソンモデルを用いて適用する。ドロップレットデジタル（Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｄｉｇｉｔａｌ）ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）は、存在量が非常に少ない転写物に使用されている。
ＲＮＡ－ＳＥＱは、特定の瞬間における生体試料中のＲＮＡの検出と定量化のために次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を使用する。ＲＮＡライブラリーを、調製し、転写し、断片化し、配列決定し、再構成し、目的の配列又は複数の配列を定量する。ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇテクノロジーは、多くの異なる種類の標的核酸分子に直接ハイブリダイズできる独自の色分けされた分子バーコードを用い、ｑＰＣＲに匹敵する感度で、最大８００遺伝子の発現レベルを同時に分析する費用対効果の高い方法を提供する。
例えば、遺伝子発現のマイクロアレイ解析のために、全ＲＮＡを最初に、例えば、Ｔｒｉｚｏｌ又はＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離されたＥＶ集団から取得する。単離した全ＲＮＡを次に、逆転写酵素及びｐｏｌｙＴプライマーを用いて二本鎖ｃＤＮＡへと逆転写し、例えば、Ｃｙ３－ｄＣＴＰ又はＣｙ５－ｄＣＴＰを用いて標識する。適切なＣｙ３標識された試料及びＣｙ５標識された試料を次に、プールし、適切な遺伝子及び対照の特徴を表すプローブで構成されるカスタムスポットオリゴヌクレオチドマイクロアレイにハイブリダイズさせる。試料を、共通の参照ＲＮＡに対し、色素交換戦略を用いて、二重でハイブリダイズしてよい。ハイブリダイゼーションに続いて、アレイを、洗浄し、例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｇ２５６５Ｂスキャナーでスキャンする。上記の工程の適切な代替物は、当技術分野において周知であり、当業者には明らかであろう。得られたマイクロアレイの生データを次いで、適切な方法を用いて分析して、必要に応じて、目的の遺伝子の相対発現を決定できる。
特定の実施形態では、本発明の方法は、本発明の１以上のバイオマーカー（例えば、遺伝子産物又は脂質バイオマーカー）に特異的な抗体（又は他の親和性分子）を用いる、イムノアッセイによって行われる。様々な実施形態では、イムノアッセイは、ディップスティック、ＥＬＩＳＡ（様々なマルチプレックスＥＬＩＳＡ技術を含む）、抗体アレイ、抗体チップ、ラテラルフロー試験、及びマルチプレックスビーズイムノアッセイからなる群から選択される。
本発明の原理に従って、任意の適切なイムノアッセイを用いることができる。このような技術は、通常の熟練した当業者に周知であり、多くの標準的な免疫学マニュアル及びテキストに記載されている。特定の実施形態では、遺伝子産物のレベルを決定することは、抗体アレイ又は抗体チップを含むがこれらに限定されない、抗体アレイベースの方法を用いて行われる。いくつかの実施形態では、アレイを、試料に含まれる遺伝子産物と固定化された抗体の間の特異的結合を可能にするように、対象の任意に希釈された試料（例えば、ＮＤＥ又はＮＤＥ可溶化液）とインキュベートし、アレイから未結合成分を洗い流し、洗浄したアレイを、所望のアイソタイプの検出可能な標識コンジュゲート抗体とインキュベートし、アレイから未結合の標識を洗い流し、各遺伝子産物に結合した標識のレベルを測定する。
特定の実施形態では、バイオマーカー（遺伝子産物）の検出は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）検査キットなどの他のイムノアッセイを用いて行われ得る。そのようなアッセイでは、例えば、試料は典型的には、バイオマーカーに特異的に結合できる固定化された第１の特異的結合剤（例えば抗体）の存在下でインキュベートされる。上記第１の特異的結合剤へのバイオマーカーの結合は、バイオマーカー（異なるエピトープで）又は第１の特異的結合剤に特異的に結合できる標識された第２の特異的結合剤を用いるなどの、様々な公知の方法のいずれか１つを用いて測定され得る。例示的な特異的結合剤は、例えばモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、及び組換え抗体断片、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）などの抗体断片を含む。いくつかの実施形態では、放射性同位元素、酵素、発色団又はフルオロフォアなどの、様々な従来のタグ又は標識が、使用され得る。典型的な放射性同位元素は、ヨウ素１２５又は硫黄３５である。この目的のための典型的な酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、西洋ワサビガラクトシダーゼ及びアルカリホスファターゼを含む。都合よく、化学発光、電気化学発光（ＥＣＬ）又は蛍光を伴う他の検出方法が、結合した検出抗体の量を評価するために容易に使用され得る。
ラテラルフロー試験は、上記のようなＥＬＩＳＡアッセイと同じ原理で動作する。基本的に、これらの試験は、視覚的な陽性又は陰性の結果を示す反応性分子を有するパッドの表面に沿って試料を流す。パッドは、多孔質紙片、微細構造ポリマー、又は焼結ポリマーなどの、一連のキャピラリーベッドに基づく。これらのパッドの各々は、流体を自発的に輸送する能力を有する。試料パッドは、スポンジとして機能し、過剰な試料流体を保持する。浸漬されると、流体が、コンジュゲートと呼ばれる凍結乾燥された生物活性粒子が塩－糖マトリックスに貯蔵されている第２のコンジュゲートパッドに流れる。コンジュゲートパッドは、粒子の表面に固定化された標的分子（例えば、本明細書に開示される遺伝子産物）とその化学的パートナー（例えば、抗体）の間の最適化された化学反応に必要とされる全ての試薬を含有する。これは、標的粒子を、それらがパッドを通過し試験ライン及び対照ラインに進むときに、マークする。試験ラインは、シグナル、多くの場合は色、を示す。対照ラインは、試料が流れたか、及びコンジュゲートパッド中の生体分子が活性であるかどうかを示す、アフィニティーリガンドを含有する。それらの反応ゾーンを通過した後に、流体は、単に廃棄物容器として機能する、最終的な多孔質材料である芯に入る。
さらなる例示的アッセイは、例えば、米国特許第４,６３２,９０１号、同第４,３１３,７３４号及び同第４,７８６,５８９号、同第５,６５６,４４８号及びＥＰ ０１２５１１８において実証されるように、ディップスティックテクノロジーに基づき得る。あるいは、他のイムノアッセイを用いてもよい。そのような技術は、通常の熟練した当業者に周知であり、多くの標準的な免疫学マニュアル及びテキストに記載されている。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、自動の又は半自動の分析に適しており、複数の試料の臨床的、中又は高スループットスクリーニングを可能にし得る。例えば、Ｂｉｏｔｅｓｔ’ｓ Ｑｕｉｃｋｓｔｅｐ（登録商標）ＥＬＩＳＡプロセッサ、Ｍａｘｍａｔ自動マイクロウェルＥＬＩＳＡアナライザー（Ｍａｘｍａｔ Ｓ．Ａ．，Ｆｒａｎｃｅ）、又はＤＳＸ（商標）Ｆｏｕｒ－Ｐｌａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｄｙｎｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などの自動ＥＬＩＳＡシステムが都合よく使用され、マルチプレックスＥＬＩＳＡ法を含むがこれらに限定されない、様々な方法において採用され得る。他の適切なアッセイは、例えば、フローサイトメトリーアッセイ（シングルプレックス及びマルチプレックスビーズベースのＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）アッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）など）、又は当技術分野で利用可能な他のマルチプレックスビーズイムノアッセイを含む。
別の実施形態では、上記遺伝子産物のレベルの決定は、質量分析により、又はマイクロスペクトロメーターを用いて行われる。例えば、上記遺伝子産物のタンパク質分解ペプチドに対し重標識合成内部標準物質を用いる。天然ペプチド及び標準物質は、質量分析計を用いて測定でき、内部標準からのシグナルは、試料中の元のタンパク質を表す天然ペプチドを参照する。非限定的な例では、ＳＣＩＯ近赤外ミニ分光計などの適切な機器が、使用され得る。
Ｃ．品質管理と精度の決定
いくつかの実施形態では、本発明の方法及びアッセイは、バリデーション又はスパイクイン対照の使用を採用し、システムの較正及び品質管理を可能にし、改善された精度及び定量的測定を提供する。様々な実施形態では、本発明の方法及びシステムは、操作、標識及び／又は実験的に誘発された外因性ＥＶ対照の有利な使用を含み、これらは、試験されるシステムパラメータ及び使用されるマーカーに従い使用のために生成され及び選択され得る。他の実施形態では、本発明は、試料に補充されかつ内部対照として機能し得る、標的特異的標識粒子の使用を採用する。そのため、本発明は、その有利な実施形態において、品質の保証及び管理における、並びに実験パラメータ及び試料処理の問題に起因するアッセイ変動性を制限する能力における顕著な改善をもたらす。
そのため、本発明の態様及び実施形態により、単離され、捕捉され又は検出されることを意図されるＥＶの表面に提示される１以上の標的分子を提示する粒子の所定量を含有する対照試料が、提供される。様々な実施形態では、粒子は、小胞（例えばＥＶ）又は非小胞粒子（例えば、合成マイクロビーズ又はナノビーズ）であり得る。標的を提示する粒子において、標的分子は、対応する親和性分子（例えば抗体）によるそれらの特異的結合を可能にするように、その外表面に提示される。
対照ＥＶ
いくつかの実施形態では、対照は、所定量で使用され、標的を発現するＥＶを単離するシステムの能力の評価を可能にする、陽性対照ＥＶ（例えば、単離マーカーとして選択されたシナプスタンパク質標的でトランスフェクトされるか、又はそうでなければ、シナプスタンパク質標的を発現するように誘導される）を含む。追加的又は代替的に、対照は、陰性対照ＥＶを含み、非関連小胞又は粒子の混入の程度の評価を可能にし得る。例えば、対照試料は、所定量（及び比率）の陽性対照ＥＶ及び陰性対照ＥＶを補充され（スパイクイン）、陰性対照ＥＶに対する陽性対照ＥＶの比回収率が、決定され得る。
いくつかの実施形態では、陽性対照ＥＶは、本明細書に開示されるようなシナプスタンパク質標的又は標的分子の組み合わせなどの、標的分子を外因的に発現するように操作された細胞から取得され、陰性対照ＥＶは、標的を天然では発現しない（又はより低い基礎レベルで発現する）同等の細胞から取得される。そのため、対照ＥＶは、それらの対応する標的への上記親和性分子の特異的結合を可能にする同じ条件下で親和性分子と接触され、適切に単離され得る。好都合には、陽性対照ＥＶ及び陰性対照ＥＶは、ＥＶの特定又は単離を容易にする、例えば蛍光分子又は他の適切な標識若しくは色素（本明細書ではマーカーとも称される）で、標識される。例えば、限定されないが、陰性対照ＥＶは、非神経細胞（第１の標識、例えば、ＰＫＨ２６などの膜染色蛍光色素を含有し得る）から取得され、陽性対照ＥＶは、ＮＬＧＮ３を過剰発現するように操作された同じ（若しくは同等の）非神経細胞、又は本発明の別の標的若しくは標的の組み合せから取得され、かつ有利には、第２の標識を含有する（例えば、ＧＦＰなどの第２の標識をさらにコードし得るＮＬＧＮ３をコードする核酸構築物でのトランスフェクションにより）。第１の標識及び第２の標識は、非重複フルオロフォアなどの、簡便にかつ有利に別個の（同等でない）標識であり、蛍光プレートリーダー又はフローサイトメトリーなどの適切な方法により、上記親和性分子により結合されたＥＶの評価又は分離を容易に促進することを理解されたい。
他の実施形態では、陽性対照ＥＶは、単離マーカーとして選択された１以上の標的分子（本明細書に開示されるシナプスタンパク質標的など）を発現するように実験的に誘導された細胞（例えば、多能性幹細胞）から取得される。例えば、限定されないが、陽性対照ＥＶは、ＮＤＥ特異的マーカー（例えば、単離標的としてのＮＬＧＮ３及びバイオマーカー若しくは診断マーカーとしてのタウ又はｐ－タウ）を発現するように、例えば適切な成長因子、ホルモン及び／又は培地サプリメントを用いてエクスビボで分化された人工多能性幹細胞（ＩＰＳ）から取得され得る。例えば、限定されないが、インスリン、Ｔ３、レチノイン酸、ＦＧＦ２及びそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない成長因子及びホルモン、又は例えばＢ２７を補充したＤＭＥＭ若しくはＦ１２などの市販の培地が、使用され得る。別の例示的な実施形態では、陽性対照ＥＶは、（関心のある神経学的状態を有しエクスビボで分化された対象の細胞から取得される）疾患由来ＩＰＳから取得され、陰性対照ＥＶは、健常対象のＩＰＳ（同様にエクスビボで分化された）から取得される。
非ＥＶ粒子の対照
他の実施形態では、本発明の方法は、ＥＶを捕捉するために使用される同じタンパク質標的（又は標的の少なくとも１つ）を提示する標識された粒子（例えば、フルオロフォアに結合した又はフルオロフォアを含有する）の所定量を試料（又は上記試料の別々のアリコート）に補充することを、さらに含む。例えば、限定されないが、試料又はアリコートは、マーカー（例えば、ＧＡＰ４３ポリペプチド）に結合した微粒子又は他のビーズを含有する対照試料と組み合わされ得る。これらの実施形態により、本方法は、捕捉された標識粒子の量を定量することにより（例えば、蛍光発光を測定することにより）ビーズ又は粒子の回収率を決定することを含む。捕捉された粒子のレベルの定量は、捕捉されない粒子の定量により、及び適切に捕捉された粒子の量を計算することによっても行われ得ることを理解されたい。
本発明の方法及びアッセイに関連して本明細書で使用される用語「標識されたビーズ」は、本明細書に開示される標的分子に直接的又は間接的に（例えば、ストレプトアビジン－ビオチン相互作用を介して）結合される、かつ定量可能な標識（例えば、フルオロフォア若しくは色素）を含むか、又はそうでなければフォトルミネッセンス又は蛍光特性を示す、典型的にはマイクロメートル又はナノメートルスケールの合成粒子に関する。標識されたビーズは典型的には、非磁性であり、それらの物理的及び化学的特性においてＥＶ単離システムでアフィニティー分子を結合するための物質として使用され得るビーズとは異なる。磁気ビーズが親和性分子の基質として使用される場合、品質管理として使用される標識されたビーズは非磁性であることを理解されたい。
適切な微粒子ビーズは、例えば、メラミン樹脂ミクロスフェア又はポリスチレンコアビーズを含まれる。定量可能な標識は、例えば、強力なフルオロフォア又は別の種類の検出シグナルであり得、少量のビーズの検出を可能にし、ＮＤＥの単離を妨げない。ビーズは典型的には、非特異的相互作用を低減するために、基質ビーズ（親和性分子を結合するために使用される）と同様の様式でブロックされる。
他の実施形態では、ビーズは、量子ドットを含むがこれに限定されない、ナノ粒子である。量子ドット（ＱＤ）は、数ナノメートル（ｎｍ）の大きさの半導体粒子であり、量子力学により、より大きな粒子とは異なる光学的及び電子的特性を有する。量子ドットがＵＶ光により照らされると、量子ドット中の電子は、より高いエネルギーの状態に励起され得る。励起された電子は、光の放出（フォトルミネッセンス）によりそのエネルギーを放出する価電子帯に戻ることができる。それらの光電子特性は、サイズと形状の両方の関数として変化する。例えば、直径５～６ｎｍのより大きなＱＤは一般に、オレンジ又は赤などの色を有する、より長い波長を放出するが、より小さいＱＤ（２～３ｎｍ）は一般に、より短い波長を放出し、青及び緑のような色を発する。特定の色は、ＱＤの正確な組成によって異なる。ドットは、硫化鉛、セレン化鉛及びセレン化カドミウムを含むがこれらに限定されない材料から（コロイド法において）、又はシリコン若しくはゲルマニウムから（プラズマ合成）、例えばコロイド合成、自己組織化及び電気ゲーティングによって合成され得る。例えば、限定されないが、Ｑｄｏｔストレプトアビジンコンジュゲートナノ粒子又は類似の生成物が、使用され得る。これらのＱＤのサイズは１５～２０ｎｍであり、様々な色で発光を提供し得る（例えば、５２５、５６５、５８５、６０５、６５５、又は７０５ｎｍの発光最大値）。
特許請求の範囲を含み、本明細書で使用する用語「フルオロフォア」は、特定の波長のエネルギーを吸収し、かつ結果として異なる特定の波長でエネルギーを放出できる官能基を有する分子（すなわち、蛍光分子）を意味する。例示的なフルオロフォアは、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、フタロシアニン、ポルフィリン、ピレン、シアニン、スクアライン、及びホウ素－ジピロメテンを含むが、これらに限定されない。
合成法及び組換え法
本発明の方法及びアッセイにおいて使用されるポリペプチド及びペプチド（例えば、粒子上に提示される単離標的、又はシナプスタンパク質のポリペプチドリガンドとして）は、当技術分野で公知の任意の組換え又は合成方法を用いて単離される又は合成され得る。
合成方法は、限定されないが、固相の（例えば、Ｂｏｃ又はｆ－Ｍｏｃ化学）及び液相の合成法を含む。例えば、ペプチドは、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３ Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９－２１５６）の固相ペプチド合成法により合成できる。あるいは、ペプチドは、当技術分野で周知の標準的な溶液法（例えば、Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，１９８４ Ｔｈｅ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照）を用いて、又はペプチド合成について当技術分野で公知の任意の他の方法により合成できる。単離標的として使用されると意図されるペプチドは、標識ビーズなどの、本明細書に開示される対照粒子に化学的にコンジュゲートされ得る。
代替実施形態では、ポリペプチド及びペプチドは、組換え技術によって生成され得る。タンパク質及びペプチドを設計する、発現する及び精製するための組換え方法は、当技術分野において公知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００１を参照されたい）。本発明による核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＤＮＡ若しくはＲＮＡのいずれかの誘導体を含み得る。ポリペプチド又はペプチドをコードする単離された核酸配列は、その天然源から、全体の（すなわち、完全な）遺伝子又はその一部として取得できる。核酸分子はまた、組換えＤＮＡ技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、クローニング）又は化学合成を用いて生成できる。核酸配列は、天然の対立遺伝子変異体を含むがこれに限定されない、天然の核酸配列及びそのホモログと、改変が本発明に従って機能性ポリペプチド又はペプチドをコードする核酸分子の能力に実質的に干渉しないようにその中のヌクレオチドが挿入され、欠失され、置換され、及び／又は反転された改変核酸配列とを含む。ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド配列は、タンパク質の遺伝暗号から推定できるが、コードの縮重、並びにいわゆる「ゆらぎ（Ｗｏｂｂｌｅ）ルール」によって与えられるようなコドンの３番目の位置における古典的な塩基対形成の例外の許容を考慮に入れなければならない。例えば、１以上の標的分子を外因的に発現するように操作された陽性対照ＥＶは、組換え技術に従って培養中の適切な細胞の表面に標的分子を発現させること、及び得られた標的発現ＥＶを収集することにより生成され得る。
アッセイパラメータ
例示的な実施形態により、少なくとも４０％、典型的には少なくとも４４％、４５％、４８％、５０％、５４％又は５５％の回収率（例えば、本明細書に開示されるような陽性対照標的特異的ＥＶ又は粒子）は、本方法又はシステムが特異的ＮＤＥ単離に適していることを示す。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、少なくとも４０％、典型的には少なくとも４４％、４５％、４８％、５０％、５４％又は５５％の標的特異的対照粒子の回収率によって特徴付けられる。特定の実施形態では、対照試料中の上記粒子（提供される、１以上の上記標的分子を提示する）の所定量の少なくとも４４％の回収率に相当する所定の閾値が、適用される。
対照ＥＶ又は粒子に関して本明細書で使用する用語「回収率」は、評価される方法又はシステムを用いて、物質結合親和性分子と所定量のＥＶ又は粒子を含む試料を接触させた後に測定される、結合粒子の相対量を指す。回収率の決定のために、接触は、それらの対応する標的分子（本方法又はシステムにおいて使用されることが意図される）への上記親和性分子の特異的結合を可能にする条件下で行われる。
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、非特異的（Ｉｇ対照）抗体を用いて単離されたＥＶのそれぞれの回収率と比較して少なくとも８倍又は１０、１５、２０又は５０倍高い感度（陽性対照ＥＶの回収により評価される）により特徴付けられる。追加的に又は代替的に、本発明の方法は、高い特異性（例えば、非特異的抗体を用いて単離されたＥＶのそれぞれの回収率と比較して少なくとも４００倍又は５００、６００又は８００倍低い陰性対照ＥＶの回収率により評価される）により特徴付けられる。他の実施形態では、本発明の方法は、単離されたＥＶにおいて、少なくとも１０倍、典型的には少なくとも２０、３０、４０、６０、８０、１００又は１２０倍、及び最大で約５００倍の非神経細胞特異的マーカー（例えば、血小板特異的マーカー）のレベルに対する神経細胞特異的マーカーのレベルの比率により特徴付けられる。
本明細書に開示される及び例示されるように、本発明のアッセイ及び方法は、これまでに報告されたＮＤＥ単離及び特性評価の方法と比較して著しく改善された精度を示す。特に、本発明のアッセイ及び方法は、ＥＶ単離のための唯一の親和性分子として抗Ｌ１ＣＡＭ抗体を用いる既知の方法と比較して増強された特異性を提供する。特に、これらのこれまでに知られている方法の使用と比較して少なくとも５、８、１０、１２、１５、２０、２３、２５、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、４６、４７又は５０倍の改善された特異性が、以前の方法と比較して本発明の方法に関連して実証された。例えば、本明細書の実施例７は、約４７倍の血小板特異的マーカーに対する神経細胞特異的マーカーの比率の改善を実証する。別の実施形態では、本発明の方法及びアッセイは、新しい疾患関連市場の特定及びハイスループット集団スクリーニングを含むがこれらに限定されない、様々な臨床及び研究適用のための堅牢なプラットフォームを提供する。別の実施形態では、本発明の方法は、単離されたＮＤＥにおける神経細胞特異的マーカー（例えば、タンパク質又はＲＮＡ）のレベルとそれぞれの脳組織におけるそれらのレベルの間の少なくとも０．５のピアソン相関係数を提供するか又はそれにより特徴付けられる。
Ｄ．適用と診断アッセイ
様々な実施形態では、本発明の原理は、様々な神経学的疾患及び状態のための改善された診断の及び分析のアッセイを提供する。いくつかの実施形態では、本発明の方法及びアッセイは、神経学的状態に罹患している、有すると疑われる、又はそれを発症するリスクがあると考えられる対象から取得された生体試料を分析するのに有用である。様々な実施形態では、本方法及びアッセイは、神経学的な及び神経変性の状態並びに病状を診断する、それらの発症リスクを評価する、それらの進行を監視する、予知する、又は鑑別診断を提供するために使用される。単離されたＥＶから測定されるバイオマーカー、及び有利には単離標的及び対応する親和性分子もまた、本明細書に開示されるように、適切に選択され得る。
徴候
いくつかの実施形態では、本発明のアッセイ、方法及びシステムに関連して使用される試料は、神経変性疾患に罹患している、又は神経変性疾患を有すると若しくは素因があると疑われる対象から取得される。本明細書で使用する「神経変性疾患」は、変性が神経系の灰白質若しくは白質のいずれか、又はその両方において起こる疾患を指す。例えば、限定されないが、試料は、軽度認知障害（ＭＣＩ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、又は他の原因による認知症（前頭側頭型認知症を含むが、これらに限定されない）に罹患している、又はそれらを有すると若しくはそれらの素因があると疑われる対象から取得でき、各可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。
他の実施形態では、試料は、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、レビー小体型認知症、もつれ優勢老人性認知症、ピック病（ＰｉＤ）、好銀性穀物病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症及び外傷性脳損傷（ＴＢＩ）を含むがこれらに限定されない、神経学的（神経変性を含む）状態に罹患している、又はそれらを有すると若しくはそれらの素因があると疑われる対象から取得でき、各可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。
アルツハイマー病（ＡＤ）は、大脳皮質及び皮質下灰白質におけるβ－アミロイド沈着及び神経原線維変化により特徴付けられる、神経認知障害である。ＡＤは、認知症の最も一般的な原因であり、高齢者の認知症の６０～８０％を占めている。ＡＤを有する人の割合は年齢とともに増加し、男性と比較して女性において２倍見られる。アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、並びにプレセニリン－１及びプレセニリン－２（それぞれＰＳＥＮ１及びＰＳＥＮ２）の遺伝子における変異は、常染色体優性型のＡＤを引き起こし、典型的には初老期発症を伴う（家族性ＡＤ）。他の遺伝的決定要因は、β－アミロイド沈着に影響を与えるアポリポタンパク質（ａｐｏ）Ｅ（イプシロン）対立遺伝子、及び神経炎症に影響を与えるＴＲＥＭ２変異を含む。血管危険因子（例えば、喫煙又は他の化学物質誘導物質）は、ＡＤのリスクを高め得る。ＡＤの最も一般的な最初の症状は、短期記憶の喪失である。他の認知障害は、推論の障害、複雑なタスクの処理の困難、及び判断力の低下、言語障害、及び視空間機能障害を含む、複数の機能を伴う傾向がある。ＡＤの追加の症状は、徘徊、動揺、叫び声、及び迫害観念などの、行動障害である。ＡＤの治療は、安全及びサポート対策を含み、コリンエステラーゼ阻害剤及びメマンチンも含み得る。
いくつかの実施形態では、本発明のアッセイ、方法及びシステムに関連して使用される試料は、ＡＤを有すると、又はＡＤを発症する素因があると疑われる対象から取得される。
いくつかの実施形態では、対象は、ＡＤを有すると疑われる。典型的には、対象は、例えば、本明細書上記で特定されるようなＡＤの１以上の症状又は疾患の徴候の存在に基づき、ＡＤを有すると疑われる。特定の実施形態では、対象は、短期記憶の喪失、推論の障害、複雑なタスクの処理の困難、判断力の低下、言語障害、及び／又は視空間機能障害を示す。特に、対象は、少なくとも認知症の存在に基づきＡＤを有すると疑われ得る。例えば、本明細書に例示されるように、Ａβ４２、ｐ－タウ、ＰＳＤ９５及びｐｒｏＢＤＮＦ遺伝子産物のレベルの変化に基づく診断シグネチャが、認知症の徴候を示すＡＤ患者において特定された。そのため、本発明の方法の例示的な実施形態により、試料は、認知症の徴候を示し、かつＡＤを有すると疑われる対象から取得され、本方法は、Ａβ４２、ｐ－タウ、ＰＳＤ９５及びｐｒｏＢＤＮＦのレベルを決定することを含む。
追加的に又は代替的に、対象は、ＡＤと関連付けられる１以上の危険因子の存在に基づき、ＡＤを有すると、又はＡＤを発症する素因があると疑われ得る。本明細書で使用する場合、神経変性疾患などの疾患の「素因」は、例えば、本明細書に記載及び例示されるような、遺伝的、家族性又は化学的に誘発される素因を指し得る。疾患にかかりやすいと疑われる対象は、症状又は疾患徴候がない場合であっても、上記の危険因子の１以上に基づき、その疑いのある者として特定され得る。
いくつかの実施形態では、対象は、ＡＤを発症するリスクと相関することが知られている遺伝子変異を有する。いくつかの実施形態では、対象は、ＡｐｏＥのε４又はε３対立遺伝子を保有している。他の実施形態では、対象は、アミロイド前駆体タンパク質遺伝子（ＡＰＰ）、プレセニリン１遺伝子（ＰＳＥＮ１）及びプレセニリン２遺伝子（ＰＳＥＮ２）からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子に変異を有する。
本発明の方法を用いて疾患の素因があると決定された（又は素因があると診断された）対象は、診断から数年（例えば、１～３年）以内に疾患症状を発症する可能性が高いと確認され及び考慮される。そのような対象は典型的には、無症候性又は最小限の症候性（又は場合によっては、疾患に特異的又は特有ではない症状を示す）であるが、疾患発症の根底にある活発な病理学的プロセスにより特徴付けられる。特定の理論又は作用機序に縛られることなく、そのような病理学的プロセスは、今や並外れた精度で早期に特定され得る。対象における素因のこの決定又は診断は、治療する医師が対象のための治療又は管理計画を決定することを支援するために使用され得る。例えば、いくつかの実施形態では、神経変性疾患の予防的処置の早期発症は、例えば、本発明の方法及びアッセイに従って疾患を発症する素因があると決定される前症候性対象において示され得る。
他の実施形態では、疾患の素因があると疑われる対象の特定は、疾患の発症の危険因子、要因又は予測因子であると考えられる別の疾患又は状態の存在に基づき行われ得る。例えば、場合によっては、ＭＣＩ患者は、以下でさらに詳細に説明されるように、最終的にＡＤを発症し得る。
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、本発明の方法及びアッセイに従い（例えば本明細書に例示されるＡＤの診断シグネチャを用いて）ＡＤと診断された対象に治療を提供する又は割り当てる工程を含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ＡＤを治療する工程を含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、コリンエステラーゼ阻害剤、メマンチン、及びアデュカヌマブからなる群から選択される療法を、本発明の方法に従いＡＤと診断された対象に投与する工程を含む。いくつかの実施形態によれば、コリンエステラーゼ阻害剤は、ドネペジル、リバスチグミン、ガランタミン及びタクリンからなる群から選択される。各可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。
軽度認知障害（ＭＣＩ）は、個人の年齢と教育レベルについて予想されるよりも大きい認知機能低下として定義される神経学的症候群であるが、それは日常生活の活動を特に妨げない。ＭＣＩは、１９８０年代に臨床実体として認識され、ＭＣＩを診断するための臨床基準は、１９９９年にＲｏｎａｌｄ Ｃ．Ｐｅｔｅｒｓｅｎ博士により説明され、（１）記憶の愁訴、（２）日常生活の正常な活動、（３）正常な他の認知機能、（４）年齢の割に異常な記憶、及び（５）認知症なし、を含んだ。これらの基準は、その後のコンセンサス会議に基づき改良を伴い広く採用され、ＭＣＩ症例の大部分を診断するために臨床医により使用されている。認知的愁訴の評価は、神経心理学的及び認知的評価の一連の試験の使用を必要とする。
そのため、この状態は、加齢性記憶障害（その障害は、老化の特徴である）及び認知症（その障害は、日常機能が損なわれることにより特徴付けられる）などの他の状態と区別可能である。ＡＤ及び他の神経変性状態（例えば、ＦＴＤ、レビー小体型認知症）、慢性外傷性脳症、外傷性脳損傷、脳卒中、脳腫瘍、硬膜下血腫、正常圧水頭症、うつ病、並びに代謝性、内分泌性、感染性及び毒性状態などの、認知機能に影響を与える他の神経学的又は精神的障害は、ＭＣＩを正確に診断するために、ＭＣＩの人を診断する前に除外される必要がある。最近の研究は、ＭＣＩを有する多くの個人がＡＤを発症するより高いリスクを有することを示した。しかし、ＭＣＩからＡＤへの変換率は、小さく（典型的には約１０～１５％）、その結果ＭＣＩの診断は、その人が最終的にＡＤを発症することを意味しない。
ＭＣＩ患者の治療は通常、運動、認知トレーニング及び食事指導などの非薬理学的介入を含む。加えて、安息香酸ナトリウム、セロトニン作動薬又は可溶性アミロイド前駆体タンパク質分泌を刺激する他の薬剤、及び低用量のある種のコリンエステラーゼ阻害剤を含むがこれらに限定されない、いくつかの薬理学的薬剤が、ＭＣＩの管理のために示唆されている。
いくつかの実施形態では、本発明のアッセイ、方法及びシステムに関連して使用される試料は、ＭＣＩを有すると疑われる対象から取得される。ＭＣＩを有すると疑われる対象は典型的には、記憶喪失を示し、それは最初に自己申告の愁訴として認識されるか、又は例えば標準化された認知試験を用いて医師により評価され得る。
認知症は、慢性的で、広範囲の、通常は不可逆的な認知機能の低下により特徴付けられる症候群である。認知症は、どの年齢でも発生する可能性があるが、主に高齢者に影響を及ぼす。認知症は、記憶が典型的には障害され（主にせん妄における注意力ではなく）、障害が慢性的で、典型的には永久的であるという点でせん妄などの他の状態と区別され、障害が日常生活を妨げるほど重度であるという点でＭＣＩなどの状態と区別され得る。この症候群は、ＡＤ、ＦＴＤ、血管性認知症、レビー小体型認知症、辺縁系優勢加齢性ＴＤＰ－４３脳症（ＬＡＴＥ）及びもつれ優勢老人性認知症を含むがこれらに限定されない特定の神経変性疾患を患う患者に現れることがある。
認知症は、症状に基づき早期、中期又は後期の認知症に分けることができる。認知の変化は、標準化された認知試験（例えば、ミニメンタルステート検査（ＭＭＳＥ）、及びモントリオール認知評価（ＭｏＣＡ）スケール）により都合よく評価され得る。人格の変化及び行動障害は、早期に又は遅く発症する可能性がある。運動及び他の局所神経障害は、認知症のタイプに応じて異なる段階で起こる。それらは、血管性認知症の初期及びＡＤと関連付けられる認知症の後期に発生する。発作の発生率は、全ての段階でいくらか増加する。
前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）は、前頭葉及び側頭葉に影響を与える散発性及び遺伝性の障害を指す。これらの状態は、異なるタンパク質（主に、タウ及び４３ｋＤａのトランスアクティブ応答ＤＮＡ結合タンパク質（ＴＤＰ４３）を含むタンパク質症）の脳内蓄積と関連付けられる。ＦＴＤ症例の約半分は、遺伝的に継承される。多くの既知の変異は、染色体１７ｑ２１－２２に影響を与え、微小管結合タウタンパク質の異常をもたらす。しかし、今日まで、タンパク質症は、非常にエラーが発生しやすい症状の種類に基づいてのみ示唆でき、正確な診断は、死後にのみ行うことができる。
一般に、ＦＴＤは、性格、行動、及び通常は言語機能（文法と流暢さ）に影響を与える。抽象的な思考と注意（維持とシフト）が損なわれる。応答はまとまりがない。見当識は保持されるが、情報の取得が損なわれる可能性がある。運動能力は一般的に維持される。患者は一連の作業が困難になる可能性があるが、視覚空間及び構成作業はそれほど影響されない。一部の患者は、全身性筋萎縮、脱力感、線維束性収縮、球症状（例えば、嚥下障害、発声障害、咀嚼困難）、並びに誤嚥性肺炎及び早期死亡のリスクの増加を伴う運動神経細胞疾患を発症する。意味性認知症は、一次進行性失語症の一種である。脳の左側が非常に影響されると、単語を理解する能力が徐々に失わる。発話は流暢であるが、意味がない。物体の特定の名前の代わりに、一般用語又は関連用語が使用され得る。右側が非常に影響される場合、患者は、進行性失名詞症（物体の名前を挙げることができない）及び顔貌失認（なじみのある顔を認識できない）を有する。彼らは、地形関係を思い出すことができない。
脳のどの部分が影響を受けるかに応じて、ＦＴＤの異なる種類がある。行動（前頭）異常型（ｖａｒｉａｎｔ）ＦＴＤでは、眼窩基底前頭葉（ｏｒｂｉｔｏｂａｓａｌ ｆｒｏｎｔａｌ ｌｏｂｅ）が影響を受けるため、社会的行動と人格が変化する。一次進行性失語症では、非対称（左側で悪化）の前外側側頭葉萎縮のために言語機能が低下する。海馬と記憶は比較的免れる。ピック病は、重度の萎縮、神経細胞の喪失、神経膠症、及び封入体（ピック体）を含む異常な神経細胞（ピック細胞）の存在を含む、ＦＴＤの病理学的変化を説明するために使用される用語である。
ＦＴＤの診断は、認知症に似ているが、いくつかの他の認知症と区別するための追加の臨床評価を含む。ＣＴ及びＭＲＩは、脳萎縮の位置と程度を決定するために、及び他の可能性のある原因（例えば、脳腫瘍、膿瘍、脳卒中）を除外するために行われ得る。ＦＴＤは、側頭葉と前頭葉に重度の萎縮性、時には紙のように薄い脳回により特徴付けられる。しかし、ＭＲＩ又はＣＴは、ＦＴＤの後期までこれらの変化を示さない場合がある。
いくつかの実施形態では、本発明のアッセイ、方法及びシステムに関連して使用される試料は、ＦＴＤを有すると疑われる（例えば、本明細書に開示されるような症状又は徴候により）対象から取得される。他の実施形態では、本発明のアッセイ、方法及びシステムに関連して使用される試料は、ＦＴＤと診断された（例えば、本明細書に開示されるように）対象から取得される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、ＦＴＤの病態（例えば、本明細書に開示されるようなタンパク質症）を区別でき、個別化医薬若しくは治療法の開発又は選択を可能にする。
別の特定の実施形態では、病態は、ＡＬＳである。ＡＬＳは、最も一般的な運動神経細胞疾患である。ＡＬＳは、皮質脊髄路、前角細胞、及び／又は延髄運動核の着実に、絶え間なく進行する変性を特徴とする。症状の重症度は様々であり、筋力の低下及び萎縮、線維束性収縮、情緒不安定、及び呼吸筋力低下を含み得る。他の症状は、嗄声、嚥下障害、及び不明瞭な発話を含む。嚥下が難しいため、唾液分泌が増加するように見え、患者は、液体で窒息する傾向がある。障害の後期に、仮性眼球の影響が生じ、不適切で、無意識の、制御不能な過度の笑いや泣きが起こる。感覚システム、意識、認知、随意眼球運動、性機能、並びに尿道括約筋及び肛門括約筋は通常、免れる。死は通常、呼吸筋の機能不全により引き起こされる。患者の５０％が発症から３年以内に死亡し、３０年を超える生存はまれである。
ＡＬＳの診断は通常、脳の電気診断検査とＭＲＩ、及び脳神経が関与していない場合は頸椎の電気診断検査とＭＲＩを伴う。追加の診断が、純粋な筋力低下を引き起こす他の障害、例えば、神経筋伝達の障害、様々なミオパチー（非炎症性及び薬物誘発性を含む）、脊髄性筋萎縮症（主に子供）、多発性筋炎、及び皮膚筋炎を除外するために必要とされる。このプロセスは、長くて面倒であり、これまで知られている方法に従って確定診断を行うには平均して約１４ヶ月かかる。加えて、多くの患者は、最初に誤診され、そのため、正しい診断を得るために必要とされる期間中に不必要な整形外科的処置を受ける。
ＡＬＳの治療は、主に支持療法と、リルゾール（２～３ヶ月の生存率の改善をもたらす可能性がある）及びエダラボン（機能の低下をある程度遅らせる可能性がある）などの薬を含む。症状を軽減するのに役立ち得る追加の薬物は、バクロフェン（痙縮に対して）、キニーネ又はフェニトイン（筋痙攣に対して）、抗コリン薬（唾液生成を減らすため）、及び仮性眼球影響を防ぐためのアミトリプチリン、フルボキサミン、又はデキストロメトルファンとキニジンの組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、本発明のアッセイ、方法及びシステムに関連して使用される試料は、ＡＬＳを有すると疑われる対象から取得される。いくつかの実施形態では、対象は、例えば本明細書の上で特定されるようなＡＬＳの１以上の症状又は疾患徴候の存在に基づきＡＬＳを有すると疑われる。特定の実施形態では、対象は、筋力の低下及び萎縮、線維束性収縮、情緒不安定、呼吸筋力低下、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるＡＬＳ症状を呈する。
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、本明細書に開示される方法に従ってＡＬＳと診断された対象に治療を提供する又は割り当てることを含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ＡＬＳを治療する工程を含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、バクロフェン、キニーネ又はフェニトイン、抗コリン作動薬、アミトリプチリン、フルボキサミン、デキストロメトルファンとキニジンの組み合わせ、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される療法を、ＡＬＳと診断された（例えば、本明細書に例示するようなＡＬＳの診断シグネチャを用いて）対象に施す工程を含む。
方法
一態様では、
ａ．ＥＶ含有生体液試料を提供すること、
ｂ．それらの対応する標的分子への親和性分子の特異的結合を可能にする条件下で、ＥＶの表面上の標的分子に結合できる親和性分子と試料を接触させることであって、上記標的分子が、ＮＬＧＮ３及びＧＡΒ４３を含む、接触させること、並びに
ｃ．親和性分子に結合したＥＶを特定する又は捕捉すること
を含む、神経細胞由来のＥＶを特定する又は捕捉する方法が提供される。
別の実施形態では、上記標的分子は、ＮＬＧＮ３及びＧＡＰ４３である。別の実施形態では、上記標的分子は、Ｌ１ＣＡＭをさらに含む。さらに別の実施形態では、上記標的分子は、ＮＬＧＮ３、ＧＡＰ４３及びＬ１ＣＡＭである。一実施形態では、上記親和性分子は、物質結合型である。特定の実施形態では、物質は、複数の磁気ビーズである。
別の実施形態では、本方法はさらに、
ｉ．標的分子（又は上記標的分子の少なくとも１つ）を提示する粒子の所定量を含有する対照試料を提供すること、
ｉｉ．それらの対応する標的分子への特異的結合を可能にする条件下で、対照試料と親和性分子を接触させること、
ｉｉｉ．上記親和性分子により結合された粒子の量を定量すること、及び
ｉｖ．上記量が所定の閾値を超えることを決定すること
を含む。
別の実施形態では、粒子は、例えば蛍光で、標識される。別の実施形態では、上記粒子は、ビーズ（例えば、微粒子）である。特定の実施形態では、上記ビーズは、色素、例えば、フルオロフォアにより標識される。別の実施形態では、粒子は、上記生体液試料と上記親和性分子を接触させる前に生体液試料に添加される（生体液試料と組み合わされる）、蛍光標識ビーズである。別の実施形態では、粒子は、操作された細胞から取得される対照ＥＶである。別の実施形態では、対照ＥＶは、標的分子を外因的に発現するように操作された陽性対照ＥＶを含む。別の実施形態では、対照ＥＶは、標的分子を発現しない陰性対照ＥＶを含む。特定の実施形態では、対照ＥＶは、第１の蛍光標識を含有する非神経細胞から取得される陰性対照ＥＶ、及び標的分子を発現するように操作された同じ（又は同等の）非神経細胞から取得され、かつ第２の別個の蛍光標識を含有する陽性対照ＥＶを含む。
別の実施形態では、本方法は、親和性分子に結合したＥＶ中の１以上のバイオマーカーのレベルを決定することをさらに含む。様々な実施形態では、バイオマーカーは、タンパク質、核酸、脂質及び／又は代謝産物バイオマーカーからなる群から選択される。例示的な実施形態により、バイオマーカーは、タウ（総タンパク質又はリン酸化画分）、アミロイドβ４２（Ａβ４２）、ＮＬＧＮ３、ＴＤＰ４３、クラスタリン、ＳＹＰ、ＢＩＭ、ＮＥＦＬ、ＥＮＯ２、ＮＲＧＮ、及びＧＰＲ２６遺伝子産物、並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される。様々な他の実施形態では、バイオマーカーは、タウ、ｐ－タウ、Ａβ４２、及びＮＬＧＮ、ＴＤＰ４３、ＣＬＵ、ＳＹＰ、ＢＩＭ、ＮＥＦＬ、ＥＮＯ２、ＮＲＧＮ、カテプシンＤ、ＬＣ３、ＳＹＴ及びＧＰＲ２６遺伝子産物、並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される。別の実施形態では、１以上のバイオマーカーは、ＬＣ３、カテプシンＤ、ＮＲＦ２、Ａβ４２、ｐ－タウ、ＰＳＤ９５、ｐｒｏＢＤＮＦ、ＣＯＸ２、ＥＩＦ２Ｃ２及びＮＦ－κＢからなる群から選択される。別の実施形態では、上記バイオマーカーは、Ａβ４２、ｐ－タウ、ＰＳＤ９５及びｐｒｏＢＤＮＦである。別の実施形態では、上記バイオマーカーは、ＬＣ３、ＴＤＰ４３、及びＮＲＦ２である。各可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。
別の実施形態では、試料は、ＭＣＩ（ＡＤと関連付けられるＭＣＩを含む）、又はＡＤを発症する素因を有すると疑われる対象から取得され、バイオマーカーは、総タウ、ｐ－タウ（特に、ｐ１８１－タウを含む）、Ａβ４２、及びニューロリギン（ＮＬＧＮ、特にＮＬＧＮ１を含む）である。別の実施形態では、本方法は、結合したＥＶ中のバイオマーカーのレベルを、対照生体液試料に対応するそれらのそれぞれのレベルと比較して、それにより試料の診断シグネチャを対照診断シグネチャと比較することをさらに含み、対照診断シグネチャと比較される試料の診断シグネチャにおける有意差は、上記対象がＭＣＩに罹患していることを示す。
本発明の方法の様々な実施形態では、対照生体液試料は、少なくとも１人の健常個体からの試料、健常個体のセットからの対照試料のパネル、及び健常個体から得られたデータの保存セットからなる群から選択される。各可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。ある他の実施形態（疾患又は病状を区別するために本方法が使用される場合などの）では、対照試料は、少なくとも１人の診断された個体（例えば、既知のＦＴＤ病態を有すると）からの試料、同様に診断された個体のセットからの対照試料のパネル、及び同様に診断された個体から得られたデータの保存セットからなる群から選択され得る。各可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。
別の実施形態では、試料は、ＦＴＤと診断されるか、又はＦＴＤを有すると疑われる対象から取得され、バイオマーカーは、ＴＤＰ４３及びｐ－タウである。別の実施形態では、本方法は、結合したＥＶ中の１以上のバイオマーカーのレベルを、対照生体液試料に対応するそれらのそれぞれのレベルと比較すること、及び単離されたＥＶにおいて決定されたＴＤＰ４３及びｐ－タウのレベルに基づき上記対象におけるＦＴＤ病態を特徴付けることをさらに含む。
別の実施形態では、試料は、ＡＤを有すると疑われる対象から取得され、上記バイオマーカーは、Ａβ４２、ｐ－タウ、ＰＳＤ９５及びｐｒｏＢＤＮＦである。特定の実施形態では、対象は、少なくとも認知症の存在に基づきＡＤを有すると疑われる。別の実施形態では、試料は、認知症を呈し、かつＡＤを有すると疑われる対象から取得され、上記バイオマーカーは、Ａβ４２、ｐ－タウ、ＰＳＤ９５及びｐｒｏＢＤＮＦである。別の実施形態では、本方法は、単離したＥＶ中のバイオマーカーのレベルを、対照生体液試料に対応するそれらのそれぞれのレベルと比較して、それにより試料の診断シグネチャを対照診断シグネチャと比較することをさらに含み、対照診断シグネチャと比較される試料の診断シグネチャにおける有意差は、上記対象がＡＤに罹患していることを示す。
別の実施形態では、試料は、ＡＬＳを有すると疑われる対象から取得され、上記バイオマーカーは、ＬＣ３、ＴＤＰ４３、及びＮＲＦ２である。別の実施形態では、本方法は、単離したＥＶ中のバイオマーカーのレベルを、対照生体液試料に対応するそれらのそれぞれのレベルと比較して、それにより試料の診断シグネチャを対照診断シグネチャと比較することをさらに含み、対照診断シグネチャと比較される試料の診断シグネチャにおける有意差は、上記対象がＡＬＳに罹患していることを示す。
別の態様では、
ａ．ＥＶの表面上の１以上の標的分子に結合できる物質結合親和性分子を含む単離システムを提供することであって、少なくとも１つの標的分子が、シナプスタンパク質である、提供すること、
ｂ．１以上の標的分子（又は上記標的分子の少なくとも１つ）を提示する粒子の所定量を含有する対照試料を提供すること、
ｃ．ｉ．それらの対応する標的分子への上記親和性分子の特異的結合を可能にする条件下で、上記システムと対照試料を接触させること、
ｉｉ．上記親和性分子により結合された粒子の量を定量すること、かつ
ｉｉｉ．上記量が所定の閾値を超えることを決定すること
によりシステムの精度を決定すること、
ｄ．ＥＶ含有生体液試料を提供すること、
ｅ．それらの対応する標的分子への上記親和性分子の特異的結合を可能にする条件下で、上記生体液試料と上記システムを接触させること、並びに
ｆ．上記親和性分子に結合したＥＶを単離すること
を含む、神経細胞由来のＥＶを単離するための方法が提供される。
別の実施形態では、上記シナプスタンパク質は、ＮＬＧＮ３、ＧＡＰ４３、ＳＹＴ１、及びＧＲＩＡ１からなる群から選択される。別の実施形態では、上記標的分子は、ＮＬＧＮ３及びＧＡＰ４３を含む。別の実施形態では、上記標的分子は、ＮＬＧＮ３及びＧＡＰ４３である。別の実施形態では、上記標的分子は、Ｌ１ＣＡＭ及び／又はＲａｂ３ａをさらに含む。さらに別の実施形態では、上記標的分子は、ＮＬＧＮ３、ＧＡＰ４３及びＬ１ＣＡＭである。一実施形態では、上記親和性分子は、物質結合型である。特定の実施形態では、物質は、複数の複数の磁気ビーズ（典型的には、超常磁性微粒子）である。例えば、限定されないが、本発明は、ＢｉｏＭａｇ、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、ＭｙＯｎｅ又はＭａｇセファロースを含むがこれらに限定されない、様々な市販の磁気ビーズ単離システムの使用を採用する。これらのシステムは典型的には、鉄（例えば、酸化鉄）及び任意の様々なポリマーで構成される１～３μｍの超常磁性微粒子（ビーズ）を利用する。これらの粒子の表面は、抗体又は他の親和性分子のコンジュゲーションを可能にする官能基又は要素（例えば、ストレプトアビジンなど）でコートされてよい。システムは、チューブラックでの使用のために都合よく適合された磁石をさらに利用する。
別の実施形態では、対照試料の粒子は、マーカー、例えば、フルオロフォアにより標識される。別の実施形態では、上記粒子は、ビーズである。特定の実施形態では、上記ビーズは、色素、例えば、フルオロフォアにより標識される。別の実施形態では、粒子は、蛍光標識されたビーズであり、対照試料は、上記生体液試料と上記親和性分子を接触させる前に、上記生体液試料に添加される。別の実施形態では、粒子は、操作された細胞から取得される対照ＥＶである。別の実施形態では、対照ＥＶは、標的分子を外因的に発現するように操作された陽性対照ＥＶを含む。別の実施形態では、対照ＥＶは、標的分子を発現しない陰性対照ＥＶを含む。特定の実施形態では、対照ＥＶは、第１の蛍光マーカーを含有する非神経細胞から取得される陰性対照ＥＶ、及び標的分子を発現するように操作された同等の非神経細胞から取得され、かつ第２の別個の蛍光マーカーを含有する陽性対照ＥＶを含む。様々な実施形態では、工程ｃは、工程ｄの前に、工程ｄと同時に、又は工程ｄの後に実行される。例えば、内部のスパイクイン対照の場合、対照試料の粒子を、ＥＶ含有試料と組み合わせ、工程ｃを、工程ｄと同時に実行する。別の例では、対照試料を、ＥＶ含有試料とは別に（前に、後で又は同時に）システムと接触させる。そのため、工程ｃは、工程ｂ後の任意の時点で実行され得ると理解され、各可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。
別の実施形態では、所定の閾値は、対照試料中で提供される粒子の所定量の少なくとも４４％、４５％、４８％、５０％、５４％又は５５％の回収率に相当する。特定の実施形態では、所定の閾値は、対照試料中で提供される１以上の上記標的分子を提示する粒子の所定量の少なくとも４４％の回収率に相当する。別の実施形態では、単離されたＥＶは、少なくとも２０、３０、４０、６０、８０、１００又は１２０倍の非神経細胞特異的マーカー（例えば、血小板特異的マーカー）に対する神経細胞特異的マーカーの比率により特徴付けられる。
別の実施形態では、本方法は、親和性分子に結合したＥＶ中（例えば、ＥＶ可溶化液中又は上記ＥＶの表面上）における１以上のバイオマーカーのレベルを決定することをさらに含む。様々な実施形態では、バイオマーカーは、タンパク質、核酸、脂質及び／又は代謝産物バイオマーカーからなる群から選択される。例示的な実施形態により、バイオマーカーは、タウ、リン酸化タウ（ｐ－タウ）、Ａβ４２、ＮＬＧＮ３、ＴＤＰ４３、クラスタリン、ＳＹＰ、ＢＩＭ、ＮＥＦＬ、ＥＮＯ２、ＮＲＧＮ、及びＧＰＲ２６、ＮＲＸＮ、ＢＡＤ、及びリン酸化ＢＡＤ（ｐ－ＢＡＤ）遺伝子産物、並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される。様々な他の実施形態では、バイオマーカーは、タウ、ｐ－タウ、Ａβ４２、及びＮＬＧＮ、ＴＤＰ４３、ＣＬＵ、ＳＹＰ、ＢＩＭ、ＮＥＦＬ、ＥＮＯ２、ＮＲＧＮ、カテプシンＤ、ＬＣ３、ＮＲＦ２、ＳＹＴ及びＧＰＲ２６遺伝子産物、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される１以上のバイオマーカーからなる群から選択される。各可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。
別の実施形態では、試料は、ＭＣＩを有すると、又はＡＤを発症する素因があると疑われる対象から取得され、バイオマーカーは、全タウ、ｐ－タウ、Ａβ４２、及びＮＬＧＮ遺伝子産物（例えば、タンパク質）である。別の実施形態では、本方法は、結合したＥＶ中のバイオマーカーのレベルを、対照生体液試料に対応するそれらのそれぞれのレベルと比較して、それにより試料の診断シグネチャを対照診断シグネチャと比較することをさらに含み、対照診断シグネチャと比較される試料の診断シグネチャにおける有意差は、上記対象がＭＣＩに罹患していることを示す。
別の実施形態では、試料は、ＦＴＤと診断されるか、又はＦＴＤを有すると疑われる対象から取得され、バイオマーカーは、ＴＤＰ４３及びｐ－タウ遺伝子産物である。別の実施形態では、本方法は、結合したＥＶ中の１以上のバイオマーカーのレベルを、対照生体液試料に対応するそれらのそれぞれのレベルと比較すること、及び単離されたＥＶにおいて決定されたＴＤＰ４３及びｐ－タウのレベルに基づき上記対象におけるＦＴＤ病態を特徴付けることをさらに含む。
別の実施形態では、試料はＡＤを有すると疑われる対象から取得され、上記バイオマーカーは、Ａβ４２、ｐ－タウ、ＰＳＤ９５及びｐｒｏＢＤＮＦである。別の実施形態では、本方法は、単離されたＥＶ中のバイオマーカーのレベルを、対照生体液試料に対応するそれらのそれぞれのレベルと比較して、それにより試料の診断シグネチャを対照診断シグネチャと比較することをさらに含み、対照診断シグネチャと比較される試料の診断シグネチャにおける有意差は、上記対象がＡＤに罹患していることを示す。
別の実施形態では、試料は、ＡＬＳを有すると疑われる対象から取得され、上記バイオマーカーは、ＬＣ３、ＴＤＰ４３、及びＮＲＦ２である。別の実施形態では、本方法は、単離されたＥＶ中のバイオマーカーのレベルを、対照生体液試料に対応するそれらのそれぞれのレベルと比較して、それにより試料の診断シグネチャを対照診断シグネチャと比較することをさらに含み、対照診断シグネチャと比較される試料の診断シグネチャにおける有意差は、上記対象がＡＬＳに罹患していることを示す。
別の態様では、試料の神経細胞由来のＥＶ中の１以上のバイオマーカーのレベルを決定することを含む、生体液試料を分析するための方法を提供し、
ａ．試料は、ＭＣＩを有すると、又はＡＤを発症する素因があると疑われる対象から取得され、バイオマーカーは、全タウ、ｐ－タウ、Ａβ４２、及びＮＬＧＮ遺伝子産物である；
ｂ．試料は、ＦＴＤと診断されるか、又はＦＴＤを有すると疑われるる対象から取得され、バイオマーカーは、ＴＤＰ４３及びｐ－タウ遺伝子産物である；
ｃ．試料は、ＡＤを有すると疑われる対象から取得され、バイオマーカーは、Ａβ４２、ｐ－タウ、ＰＳＤ９５及びｐｒｏＢＤＮＦである；又は
ｄ．試料は、ＡＬＳを有すると疑われる対象から取得され、バイオマーカーは、ＬＣ３、ＴＤＰ４３、及びＮＲＦ２である。
様々な実施形態では、生体液試料を分析することは、ＥＶペイロード（例えば、本明細書に開示される、遺伝子発現レベル若しくはバイオマーカーレベル）の検出及び／又は定量化を含む。
一実施形態では、本方法は、単離されたＥＶ中のバイオマーカーのレベルを、対照生体試料に対応するそれらのそれぞれのレベルと比較することをさらに含む。別の実施形態では、本方法はさらに、それらの対応する標的分子への上記親和性分子の特異的結合を可能にする条件下で、少なくとも１つの標的分子が本明細書に開示されるシナプスタンパク質である、上記ＥＶの表面上の１以上の標的分子に結合できる表面結合親和性分子と上記試料を接触させること、及び親和性分子に結合したＥＶを単離することにより、上記ＥＶを試料から単離する工程を、神経細胞由来のＥＶ中のバイオマーカーのレベルを決定する前に、含む。特定の実施形態では、上記親和性分子は、ＮＬＧＮ３及びＧＡＰ４３に向けられ、物質は、複数の磁気ビーズである。別の実施形態では、本方法はさらに、
ｉ．標的分子（又は上記標的分子の少なくとも１つ）を提示する粒子の所定量を含有する対照試料を提供すること、
ｉｉ．それらの対応する標的分子への特異的結合を可能にする条件下で、対照試料と親和性分子を接触させること、
ｉｉｉ．上記親和性分子により結合された粒子の量を定量すること、及び
ｉｖ．上記量が所定の閾値を超えることを決定すること
を含む。
様々な実施形態では、本方法は、神経学的状態及び神経変性状態、例えば、本明細書に開示される疾患若しくは状態の発症を診断する、評価する又は予測するために使用される。
別の実施形態では、本方法は、それを必要とする対象におけるＭＣＩを診断するために使用される。別の実施形態では、ａ．対象からＥＶ含有生体液試料を取得すること、
ｂ．ＥＶの表面上の１以上の標的に結合できる表面結合親和性分子を含む単離システムを提供することであって、少なくとも１つの標的が、ＮＬＧＮ３及びＧＡＰ４３からなる群から選択されるシナプスタンパク質である、提供すること、
ｃ．それらの対応する標的への上記親和性分子の特異的結合を可能にする条件下で、生体液試料と上記システムを接触させること、
ｄ．親和性分子に結合したＥＶを単離すること、
ｅ．単離されたＥＶ中の総タウ、ｐ－タウ、Ａβ４２、及びＮＬＧＮのレベルを決定すること、並びに
ｆ．単離されたＥＶ中のバイオマーカーのレベルを、対照生体液試料に対応するそれらのそれぞれのレベルと比較して、それにより試料の診断シグネチャを対照診断シグネチャと比較することであって、対照診断シグネチャと比較される試料の診断シグネチャにおける有意差は、上記対象がＭＣＩに罹患していることを示す、比較すること
を含む、それを必要とする対象においてＭＣＩを診断するための方法が提供される。
別の実施形態では、本方法は、それを必要とする対象におけるＡＤを診断するために使用される。別の実施形態では、ａ．対象からＥＶ含有生体液試料を取得すること、
ｂ．ＥＶの表面上の１以上の標的に結合できる表面結合親和性分子を含む分離システムを提供することであって、少なくとも１つの標的が、ＮＬＧＮ３及びＧＡＰ４３からなる群から選択されるシナプスタンパク質である、提供すること、
ｃ．それらの対応する標的への上記親和性分子の特異的結合を可能にする条件下で、生体液試料と上記システムを接触させること、
ｄ．親和性分子に結合したＥＶを単離すること、
ｅ．単離されたＥＶ中のＡβ４２、ｐ－タウ、ＰＳＤ９５及びｐｒｏＢＤＮＦのレベルを決定すること、並びに
ｆ．単離されたＥＶ中のバイオマーカーのレベルを、対照生体液試料に対応するそれらのそれぞれのレベルと比較して、それにより試料の診断シグネチャを対照診断シグネチャと比較することであって、対照診断シグネチャと比較される試料の診断シグネチャにおける有意差は、上記対象がＡＤに罹患していることを示す、比較すること
を含む、それを必要とする対象におけるＡＤを診断するための方法が提供される。
別の実施形態では、本方法は、それを必要とする対象におけるＡＤ又はその素因を診断するために使用され、
ａ．対象からＥＶ含有生体液試料を取得すること、
ｂ．ＥＶの表面上のＮＬＧＮ３及びＧＡＰ４３を含む標的分子に結合できる物質結合親和性分子を含む単離システムを提供すること、
ｃ．それらの対応する標的分子への上記親和性分子の特異的結合を可能にする条件下で、生体液試料と上記システムを接触させること、
ｄ．上記親和性分子に結合したＥＶを単離すること、
ｅ．単離されたＥＶ中の少なくとも１つのシナプスタンパク質、少なくとも１つのタウ遺伝子産物及び少なくとも１つのアミロイド遺伝子産物を含む少なくとも４つのバイオマーカーのレベルを決定すること、並びに
ｆ．単離されたＥＶにおいて決定されたバイオマーカーのレベルを、対照生体液試料に対応するそれらのそれぞれのレベルと比較して、それにより試料の診断シグネチャを対照診断シグネチャと比較することであって、対照診断シグネチャと比較される生体液試料の診断シグネチャにおける有意差は、上記対象がＡＤに罹患しているか、又はＡＤを発症する素因があることを示す、比較すること
を含む。
様々な実施形態では、シナプスタンパク質バイオマーカーは、ＰＳＤ９５及びＮＬＧＮ１から選択され、タウ遺伝子産物は、総タウ及びｐ－タウ（特にｐ１８１－タウ）から選択され、アミロイド遺伝子産物は、Ａβ４２である。別の実施形態では、さらなるバイオマーカーはｐｒｏＢＤＮＦである。別の実施形態では、上記バイオマーカーは、Ａβ４２、ｐ－タウ、ＰＳＤ９５及びｐｒｏＢＤＮＦであり、対照診断シグネチャと比較される生体液試料の診断シグネチャにおける有意差は、上記対象がＡＤに罹患していることを示す。
さらに別の実施形態では、本方法は、それを必要とする対象におけるＦＴＤ病態を特徴付けるために使用される。別の実施形態では、
ａ．対象からＥＶ含有生体液試料を取得すること、
ｂ．ＥＶの表面上の１以上の標的に結合できる表面結合親和性分子を含む単離システムを提供することであって、少なくとも１つの標的が、ＮＬＧＮ３及びＧＡＰ４３からなる群から選択されるシナプスタンパク質である、提供すること、
ｃ．それらの対応する標的への上記親和性分子の特異的結合を可能にする条件下で、生体液試料と上記システムを接触させること、
ｄ．親和性分子に結合したＥＶを単離すること、
ａ．単離されたＥＶ中のＴＤＰ４３及びｐ－タウのレベルを決定すること、並びに
ｂ．単離されたＥＶ中の１以上のバイオマーカーのレベルを、対照生体液試料に対応するそれらのそれぞれのレベルと比較すること、並びに
単離されたＥＶにおいて決定されたＴＤＰ４３及びｐ－タウのレベルに基づき上記対象におけるＦＴＤ病態を特徴付けること
を含む、それを必要とする対象におけるＦＴＤ病態を特徴付けるための方法が提供される。
別の実施形態では、ＦＴＤ病態を特徴付けることは、試料がＴＤＰ４３の増加されたレベル及びｐ－タウの低下されたレベルにより特徴付けられるかどうかを決定すること、並びに／又は試料がＴＤＰ４３の低下されたレベル及びｐ－タウの増加されたレベルにより特徴付けられるかどうかを決定することを含む。別の実施形態では、対照生体液試料は、ＦＴＤ患者からの試料のプールに対応する。
別の実施形態では、ＦＴＤ患者のプールに対応する対照レベルと比較して、単離されたＥＶ中のＴＤＰ４３の増加されたレベル及びｐ－タウの低下されたレベルは、上記ＦＴＤ病態がＴＤＰ４３タンパク質症と関連付けられることを示す。別の実施形態では、ＦＴＤ患者のプールに対応する対照レベルと比較して、単離されたＥＶ中のＴＤＰ４３の低下されたレベル及びｐ－タウの増加されたレベルは、上記ＦＴＤ病態がタウタンパク質症と関連付けられることを示す。さらに別の実施形態では、ＦＴＤ患者のプールに対応する対照レベルと比較して、単離されたＥＶ中のＴＤＰ４３の増加されたレベル及びｐ－タウの低下されたレベルは、上記ＦＴＤ病態がＴＤＰ４３タンパク質症と関連付けられることを示し、ＦＴＤ患者のプールに対応する対照レベルと比較して、単離されたＥＶ中のＴＤＰ４３の低下されたレベル及びｐ－タウの増加されたレベルは、上記ＦＴＤ病態がタウタンパク質症と関連付けられることを示す。
本明細書で使用する場合、本明細書に開示されるバイオマーカー（例えば、ＴＤＰ４３又はｐ－タウ）の増加されたまたは低下されたレベルは、有意な差（それぞれ、上昇又は減少）を指す。「有意な差」は、本発明の方法に関連して使用される場合、統計的に有意な差及び／又は当技術分野で認められる許容基準に従って当業者（例えば、治療する医師）により評価される有意な差を指す。
さらなる実施形態では、本方法は、それを必要とする対象におけるＡＬＳを診断するために使用される。別の実施形態では、ａ．対象からＥＶ含有生体液試料を取得すること、
ｂ．ＥＶの表面上の１以上の標的に結合できる表面結合親和性分子を含む単離システムを提供することであって、少なくとも１つの標的が、ＮＬＧＮ３及びＧＡＰ４３からなる群から選択されるシナプスタンパク質である、提供すること、
ｃ．それらの対応する標的への上記親和性分子の特異的結合を可能にする条件下で、生体液試料と上記システムを接触させること、
ｄ．親和性分子に結合したＥＶを単離すること、
ｅ．単離されたＥＶ中のＬＣ３、ＴＤＰ４３、及びＮＲＦ２のレベルを決定すること、並びに
ｆ．単離されたＥＶ中のバイオマーカーのレベルを、対照生体液試料に対応するそれらのそれぞれのレベルと比較して、それにより試料の診断シグネチャを対照診断シグネチャと比較することであって、対照診断シグネチャと比較される試料の診断シグネチャにおける有意差は、上記対象がＡＬＳに罹患していることを示す、比較すること
を含む、それを必要とする対象におけるＡＬＳを診断するための方法が提供される。
本発明の方法の実施形態により、親和性分子は、抗体又はその抗原結合部分である。本発明の方法のさらなる実施形態では、生体液又は生体試料は、血液、血漿及び血清からなる群から選択される。他の実施形態では、対象は、ヒトである。特定の実施形態では、試料は、疾患を発症する素因があると疑われる、又は考慮されるヒト対象から取得される。さらに別の実施形態では、試料は、疾患についての日常的な又は予定されたスクリーニングの一部として試験されているヒト対象から取得される。例えば、限定されないが、５０、５５、６０、６５歳の又はそれを超える年齢の対象をスクリーニングして、例えば、単離されたＥＶ中の総タウ、ｐ－タウ、Ａβ４２、及びＮＬＧＮのレベルを決定することを伴う、本明細書に開示されるような方法により、例えば試験の５年以内にＡＤを発症する対象らの可能性を特定できる。他の実施形態では、試料は、例えば、前臨床試験において有用なマウス、ラット又は他の哺乳動物から取得され得る。各可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。
データ解析
本発明の実施形態により、診断シグネチャの実質的な差異又は類似性は、シグネチャのバイオマーカー（例えば、遺伝子産物）の総体のレベルを考慮して決定される。いくつかの実施形態では、対照と比較して実質的に異なる診断シグネチャは、それらのそれぞれの対照レベルと比較して本明細書に開示される遺伝子産物のセットの顕著に増加されたレベルを含む。他の実施形態では、対照と比較して実質的に異なる診断シグネチャは、それらのそれぞれの対照レベルと比較して本明細書に開示される遺伝子産物のセットの顕著に低下されたレベルを含む。さらに他の実施形態では、対照と比較して実質的に異なる診断シグネチャは、それらのそれぞれの対照レベルと比較して本明細書に開示される１以上のマーカーの顕著に増加されたレベルと、本明細書に開示される１以上の追加のマーカーの顕著に低下されたレベルの両方を含む。各可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。
有利には、本発明の方法は、本明細書に開示されるような試料又は対象の診断シグネチャと対照診断シグネチャとを区別するために、学習及びパターン認識アナライザー、クラスタリングアルゴリズムなどの使用を採用できる。例えば、本方法は、生体液試料から単離したＥＶ中の本明細書に開示されるバイオマーカーのレベルを決定すること、並びにそのようなアルゴリズム及び／又はアナライザーを用いて得られた診断シグネチャを対照診断シグネチャと比較することを含み得る。
特定の実施形態では、１以上のアルゴリズム又はコンピュータプログラムは、試料中で定量化された各遺伝子産物の量を所定のカットオフに対して（又はいくつかの所定のカットオフに対して）比較するために使用され得る。あるいは、ヒトにより必要な工程を手動で実行するための１以上の説明書が、提供され得る。
いくつかの実施形態では、受信者動作特性（ＲＯＣ）分析及びＡＵＣプラス確率的測定基準（例えば、対数損失）が、本発明の方法と関連して使用されてよい。仮説に基づくシグネチャ開発では、疾患におけるバイオマーカーの役割に関する事前知識が考慮され得る。他の実施形態では、線形混合効果アルゴリズムが、選択されたバイオマーカー（複数可）における差異をモデル化するために使用され得る。他の実施形態では、機械学習（ＭＬ）が、進行の潜在的な指標としてバイオマーカーを評価するために用いられ、時間的に不均一な効果、並びに疾患進行に伴い一般的に見られるまばらで様々な長さの患者の特性を利用する。混合効果機械学習及び長期記憶と短期記憶（ＬＳＴＭ）神経ネットワークが、バイオマーカー軌道の変化を予測するため、及び患者を分類するために用いられてよい。多変量解析法（例えば、ロジスティック回帰、Ｋ最近傍法、サポートベクターマシン、及び機械学習）も使用できる。決定木ベースの方法（すなわち、ランダムフォレスト、勾配ブースティング）及びサポートベクターマシンを含む小さな及び中程度の規模のデータセットでより良いパフォーマンスを示す、非線形アルゴリズムのクラスも使用され得る。
診断シグネチャを決定及び比較するためのアルゴリズムは、さらに、勾配ブーストツリー、ランダムフォレスト、正則化回帰、多重線形回帰（ＭＬＲ）、主成分回帰（ＰＣＲ）、部分最小二乗（ＰＬＳ）、線形判別分析（ＬＤＡ）を含む判別関数分析（ＤＦＡ）、最近傍、人工神経ネットワーク、多層パーセプトロン（ＭＬＰ）、一般化回帰ニューラルネットワーク（ＧＲＮＮ）、及びそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない、教師あり分類アルゴリズム、又はＫ平均法、スペクトルクラスタリング、階層クラスタリング、ガウス混合モデル、及びそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない、教師なしクラスタリングアルゴリズムを含む。
アルゴリズムの多くは、神経ネットワークベースのアルゴリズムである。神経ネットワークは、インプット層、処理層及び出力層を有する。神経ネットワークにおける情報は、処理層全体に分散される。処理層は、ノードへの相互接続により神経細胞をシミュレートするノードで構成される。データのコレクションの基礎となるパターンを明らかにする統計分析と同様に、神経ネットワークは、所定の基準に基づきデータのコレクション中で一貫したパターンを位置づける。
他の実施形態では、主成分分析が用いられる。主成分分析（ＰＣＡ）は、多数の相関変数を少数の非相関変数に変換する数学的手法を伴う。より少ない数の無相関変数は、主成分として知られる。最初の主成分又は固有ベクトルは、可能な限り多くのデータにおける変動性を説明し、後続の各成分は、可能な限り多くの残りの変動性を説明する。ＰＣＡの主な目的は、データセットの次元を減らすこと、及び新しい基礎となる変数を特定することである。
別の実施形態では、アルゴリズムは、分類器である。分類器の１つのタイプは、トレーニングセットからのデータを用いてアルゴリズムを「訓練すること」により作製され、その性能は、試験セットデータで評価される。分類器の例は、判別分析、決定木分析、受信者動作曲線又はスプリット分析及びスコア分析である。
いくつかの実施形態では、アルゴリズム又は分析装置は、単離されたＥＶにおいて決定される本発明のバイオマーカー（例えば、ＭＣＩを診断する方法における総タウ、ｐ－タウ、Ａβ４２、及びニューロリギン；ＡＬＳを診断する方法におけるＬＣ３、ＴＤＰ４３、及びＮＲＦ２；又はＡＤを診断する方法におけるＡβ４２、ｐ－タウ、ＰＳＤ９５及びｐｒｏＢＤＮＦ）の組み合わせのレベルを、対照生体液試料に対応するそれらのそれぞれのレベルと比較して、それにより試料の診断シグネチャを対照診断シグネチャと比較する。
製造品
別の態様では、
ＥＶの表面上の１以上の標的分子に結合できる表面結合親和性分子を含む生体液試料から神経細胞由来のＥＶを特定する又は捕捉するための手段を含み、（ｉ）システムの精度を決定するための手段、及び／又は（ｉｉ）捕捉されたＥＶ中の少なくとも１つのバイオマーカーのレベルを決定するための手段をさらに含む、神経細胞由来のＥＶを分離するためのシステムが提供され、
少なくとも１つの標的分子が、シナプスタンパク質であり、
システムの精度を決定するための手段が、少なくとも１つのシナプスタンパク質を提示しかつマーカーにより標識される粒子を含み、かつ
少なくとも１つのバイオマーカーが、タウ、ｐ－タウ、Ａβ４２、ＮＬＧＮ、ＴＤＰ４３、クラスタリン、ＳＹＰ、ＢＩＭ、ＮＥＦＬ、ＥＮＯ２、ＮＲＧＮ、及びＧＰＲ２６遺伝子産物、並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される。
様々な他の実施形態では、バイオマーカーは、タウ、ｐ－タウ、Ａβ４２、及びＮＬＧＮ、ＴＤＰ４３、ＣＬＵ、ＳＹＰ、ＢＩＭ、ＮＥＦＬ、ＥＮＯ２、ＮＲＧＮ、カテプシンＤ、ＬＣ３、ＳＹＴ及びＧＰＲ２６遺伝子産物、並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される１以上のバイオマーカーからなる群から選択される。さらに他の実施形態では、少なくとも１つのバイオマーカーは、ＬＣ３、カテプシンＤ、ＮＲＦ２、Ａβ４２、ｐ－タウ、ＰＳＤ９５、ｐｒｏＢＤＮＦ、ＣＯＸ２、ＥＩＦ２Ｃ２及びＮＦ－κＢ並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される。各可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。
別の態様では、ＥＶの表面上でそれぞれ、ＮＬＧＮ３及びＧＡＰ４３に結合できる、ＮＬＧＮ３特異的親和性分子及びＧＡＰ４３特異的親和性分子、及び親和性分子に結合したＥＶを特定する又は捕捉するための手段を含む、神経細胞由来のＥＶを特定する又は捕捉するためのキットが提供される。
さらに別の態様では、試料の神経細胞由来のＥＶ中のバイオマーカーのレベルを決定するための手段を含み、バイオマーカーが、総タウ、ｐ－タウ、Ａβ４２、及びＮＬＧＮ３である、ＭＣＩを有すると、又はＡＤを発症する素因があると疑われる対象の生体液試料を分析するためのキットが提供される。
別の態様では、試料の神経細胞由来のＥＶ中のバイオマーカーのレベルを決定するための手段を含む、神経障害を有すると疑われる対象の生体液試料を分析するためのキットが提供され、
対象は、ＭＣＩを有すると、又はＡＤを発症する素因を有すると疑われ、試料の神経細胞由来のＥＶ中のバイオマーカーのレベルを決定するための手段を含み、バイオマーカーは、総タウ、ｐ－タウ、Ａβ４２、及びニューロリギン－１である；
対象は、ＡＤを有すると疑われ、バイオマーカーは、Ａβ４２、ｐ－タウ、ＰＳＤ９５及びｐｒｏＢＤＮＦである、又は
対象は、ＡＬＳを有すると疑われ、バイオマーカーは、ＬＣ３、ＴＤＰ４３、及びＮＲＦ２である。
いくつかの実施形態では、システムの精度を決定するための手段は、特に、本明細書の節Ｃで詳述されるように、対照ＥＶ粒子又は非ＥＶ粒子を含む。例えば、システム又はキットは、節Ｃで詳細に説明されるように、１以上の標的分子を提示する標識された粒子及び／又はそれらの合成のための手段を含有し得る。
他の実施形態では、捕捉されたＥＶ中の少なくとも１つのバイオマーカーのレベルを決定するための手段は、本明細書の節Ｂで詳述されるようなバイオマーカーの検出及び定量の方法のいずれか１つと共に使用するのに適する、例えば抗体、検出プローブなどを含む。この手段は、それぞれのバイオマーカー（例えば、ＡＬＳの場合はＬＣ３、ＴＤＰ４３、及びＮＲＦ２に特異的な抗体）の特異的な特定及び／又は定量化を提供すると意図されることを理解されたい。
他の実施形態では、親和性分子に結合したＥＶを特定する又は捕捉するための手段は、本明細書の節Ａに開示されるような特異的標的分子に対する物質結合親和性分子を含む。
以下の実施例は、本発明のいくつかの実施形態をより完全に説明するために提示される。しかし、それらは決して本発明の広い範囲を制限するものと解釈されるべきではない。
実施例
実施例全体を通して、かつ本明細書に開示されるように、別段の指示がない限り、用語「エクソソーム」及び「ＥＶ」は互換的に使用される。
実施例１．神経細胞由来エクソソーム（ＮＤＥ）の捕捉を可能にする神経細胞選択標的のスクリーニング
バイオインフォマティクス解析により示唆された２０の候補膜タンパク質を、ＮＤＥ単離の表面標的として機能するそれらの能力についてスクリーニングした。この目的のために、これらの膜タンパク質に対する３０の異なる抗体を、以下のように無傷のエクソソームのＥＬＩＳＡにより試験した。抗体を、一晩のインキュベートによりＥＬＩＳＡプレートに付着させ、ＢＳＡ及びエタノールアミンでブロックした。血漿試料を添加し（３～２４３倍の曲線段階希釈）、プレートを２時間インキュベートした。一般的なエクソソームマーカーＣＤ６３及びＣＤ８１に対するビオチン化抗体を、結合したＥＶの検出のためにストレプトアビジン－ＨＲＰと組み合わせて使用した。各プレート結合抗体が特異的にＮＤＥを捕捉する能力を、表３に示す３つのパラメータ、すなわち、１）ピアソン相関により評価される希釈によるシグナル直線性（「直線性」）、２）ブランク（血漿なし）バックグラウンドを上回る検出シグナルを用いて最高希釈により評価されるシグナル対バックグラウンド比（「最小希釈」）及び３）上位３つの希釈液のシグナルの平均とブランクの比率（「ブランクからの割合」）、により評価した。結果を表３に示す。
表３に見られるように、４つのシナプスタンパク質と２つの非シナプスタンパク質を含むいくつかのタンパク質マーカーは、０．９を超える直線性、及び１０倍を超えるシグナル対バックグラウンド比として定義される高品質の測定値を生成した。特に、ニューロリギン－３（ＮＬＧＮ３）及び成長関連タンパク質４３（ＧＡＰ４３）は、無傷のエクソソームのＥＬＩＳＡにより、ＥＶを捕捉するための表面標的として、既知の標的Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１ＣＡＭ）よりも有意により効果的であると見出された。これらの及び他の高性能候補を、以下で説明するように、選択的にＮＤＥを分離するそれらの能力のさらなる試験及び分析のために選択した。
表３－ＮＤＥ単離のために試験した抗体
Figure 2023542122000003
実施例２．異なる選択標的によるＮＤＥの単離と細胞内神経タンパク質マーカーの測定
６つのシナプスタンパク質マーカー（ＮＬＧＮ３、ＧＡＰ４３、ＳＹＴ、ＧＲＩＮ２Ｂ、ＧＲＩＡ１及びＧＲＩＡ２）並びに５つの他の神経細胞タンパク質マーカー（Ｌ１ＣＡＭ、ＮＣＡＭ、ＮＲＣＡＭ、ＰＴＰＲＺ及びＣＮＴＮ２）を、磁気ビーズシステムを用いる血漿試料からのＮＤＥ単離とのそれらの適合性、並びに細胞内神経タンパク質マーカーのタウ及びｐ－１８１リン酸化タウ（ｐ－タウ）の測定とのそれらの適合性について試験した。この目的のために、様々な試験マーカーに対するビオチン化抗体を、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用によりストレプトアビジンコンジュゲート磁気ビーズ（ＢｉｏＭａｇ（登録商標）ストレプトアビジン－ＱＩＡＧＥＮ）に付着させ、血漿試料に１０μｇ／ｍｌの濃度で添加し、一晩インキュベートした。インキュベーション後、ビーズをマグネットラックに置き、ＥＶを、洗浄し、溶出し、界面活性剤含有緩衝液（Ｍ－ＰＥＲタンパク質抽出試薬）を用いて溶解し、タウ及びｐ－タウのレベルを、製造元の指示に従ってＬｕｍｉｎｅｘマルチプレックスキットを用いて測定した。磁気ビーズに結合した非特異的ＩｇＧ対照抗体を、陰性対照として用いた。結果を図１に示し、その中で、各抗体について３つの独立した健康な血漿プールの平均及び標準偏差を提示する。
結果は、タウとｐ－タウの両方が、希釈していない血漿中のそれらのレベル（それは、アッセイの定量下限を下回った）とは対照的に、単離されたＮＤＥ中で検出可能であったこと、及び単離標的として非シナプスタンパク質を用いて単離されたＥＶでよりも、シナプスタンパク質を用いて単離されたＥＶにおいて平均して高かったことを示している。図１に見られるように、ＮＬＧＮ３又はＧＡＰ４３のいずれかを用いて単離されたエクソソームにおけるタウとｐ－タウの両方のレベルは、非特異的抗体対照を用いて単離されたエクソソーム中よりも約５倍高かったのに対し、Ｌ１ＣＡＭを用いて単離されたエクソソーム中のそれらのレベルは対照よりも３倍しか高くなかった。そのため、ＮＬＧＮ３及びＧＡＰ４３は、単離されたＥＶの可溶化液中の神経タンパク質の濃縮により明らかにされるように、特異的にＮＤＥを単離するそれらの能力においてＬ１ＣＡＭよりも予想外に優れていると見出された。
実施例３．異なる選択標的によるＮＤＥの単離と細胞内神経ｍＲＮＡマーカーの測定
様々なシナプスタンパク質（ＮＬＧＮ３、ＧＡＰ４３、ＳＹＴ又はＧＲＩＡ１）及びＬ１ＣＡＭに対する抗体の、健常個体の血漿試料からＮＤＥを捕捉する能力を、比較した。抗体を、磁気ビーズに付着させ、血漿試料とインキュベートし、次いでエクソソームを、基本的に実施例２に記載されるように、溶出した。捕捉されたＥＶを、Ｔｒｉｚｏｌ緩衝液で溶解し、ＲＮＡを、可溶化液から単離し、対応するｃＤＮＡを、ＲＴ－ＰＣＲ（ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ １１７５４０５０）により作製した。プレ増幅（ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ ４４８８５９３）（１４ｃｔ）及びｑＰＣＲを、いくつかの神経細胞特異的ｍＲＮＡマーカー（ＮＥＦＬ、ＥＮＯ２、ＮＲＧＮ、ＧＰＲ８８）（ＴａｑＭａｎアッセイ：それぞれＨｓ００１９６２４５＿ｍ１、Ｈｓ００１５７３６０＿ｍ１、Ｈｓ００１８３４６９＿ｍ１及びＨｓ０３０２７８３２＿ｓ１）に対し
行った。結果を図２に示し、その中で、値を、２つの独立した健康な血漿プールのｑＰＣＲサイクル閾値（Ｃｔ）平均として示す（そのため、より小さい数値は、ｌｏｇ２スケールでより高いレベルを示す）。「選択マーカー」は、それに対し抗体が作られる単離標的を示す；「ＩｇＧ」は、非特異的抗体対照を示す；「測定されたｍＲＮＡ」は、示されたｍＲＮＡマーカーのレベル（Ｃｔ）を表す。暗い色合いは、Ｃｔが低いことを表し、ｍＲＮＡレベルが高いことを示す。
図２に見られるように、特定のｍＲＮＡマーカーのレベルは、異なる表面標的に対する抗体を用いて単離されたＥＶにおいて増加した。特に、ＮＬＧＮ３とＧＡＰ４３は、ＮＤＥの濃縮を提供する最も選択的な標的であるように見えた。試験した全ての神経細胞ｍＲＮＡのレベルは、対照の非特異的ＥＶにおいてよりも、ＮＬＧＮ３又はＧＡＰ４３のいずれかを用いて単離されたＥＶにおいて、著しくかつ一貫して高かった。驚くべきことに、様々な神経細胞ｍＲＮＡのレベルは、Ｌ１ＣＡＭ特異的抗体を用いて単離されたエクソソーム中よりもＮＬＧＮ３又はＧＡＰ４３特異的抗体を用いて単離されたエクソソームにおいて約８倍高く、非特異的抗体対照（ＩｇＧ）を用いて単離されたエクソソームよりも少なくとも６４倍高かった。
実施例４．血漿試料中にスパイクされた、ヒト人工多能性幹細胞（ＩＰＳ）由来の神経細胞から単離されたエクソソームの特異的回収
健康なヒトドナーのＩＰＳ（ＢｒａｉｎＸｅｌｌから購入）を、製造元の指示に従って、エクスビボで皮質神経細胞に分化させた。分化させた皮質神経細胞からの馴化培地を、馴化培地の７０％を収集し、４週の間、週に２回、２０００ｇで１５分間遠心分離して細胞破片を除去し、凍結前に上清を新しいチューブに移すことを含んだプロトコルにより収集した。馴化培地の融解に続いて、収集した全ての培地を、２００ｍｌ試料と組み合わせ、エクソソームを、陰イオン交換クロマトグラフィー（Ｑカラム）、続いて１００ＫＤカットオフフィルターでの限外濾過、サイズ排除クロマトグラフィーにより単離し、最後に１００ＫＤカットオフフィルターでの第２の限外濾過でエクソソームを濃縮した。
得られた単離された対照ＥＶの所定量（別々のアッセイで決定される、２０００ｐｇのタウに相当）を、３００μｌの血漿試料に添加した。所定量のＥＶを補充（スパイク）した血漿試料を次いで、図３に記載される選択した表面標的に対する抗体にコンジュゲートされた磁気ビーズを用いて、基本的に実施例２に記載されるように、単離プロトコルに供した。非特異的抗体（ＩｇＧ）にコンジュゲートされた磁気ビーズは、対照として機能した。
タウのレベルを、Ｌｕｍｉｎｅｘにより決定し、ＥＶ回収率を、以下の式に従って（％で）計算した：（回収したタウ－内因性タウ）／スパイクしたタウ（すなわち、単離されたＥＶ中のタウの量からスパイクイン前の天然試料中のそのレベル（それはスパイクイン後よりも少なくとも１０倍低い）を減算し、単離前のスパイクされたＥＶに存在する２０００ｐｇの所定量で割る）。結果を図３に示し、各ヒストグラムは、３つの独立した健康な血漿プールの平均を表す。
図３に見られるように、異なる試験抗体の回収率は、非特異的抗体対照の約１０％と比較して、ＧＲＩＡ１についての約３５％～ＮＬＧＮ３及びＧＡＰ４３についての５０％超の範囲であった。スパイクインしたＥＶの約４０％を、Ｌ１ＣＡＭ特異的抗体で回収した。ＮＬＧＮ３又はＧＡＰ４３に対する抗体によるＮＤＥ回収率の５倍増加は、血漿環境でＮＤＥを特異的かつ効率的に捕捉するそれらの能力を実証する。さらに、この結果は、システムにより捕捉されたスパイクインＥＶの割合を定量することによりアッセイの精度を評価するシステムの能力を実証する。
実施例５．操作されたＥＶを用いてスパイクイン検証対照を提供するシステム
非神経細胞ＨＥＫ２９３細胞を、ＮＬＧＮ３及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする組換えコンストラクト（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ カタログ番号ＨＧ１１１６０－ＡＣＧから購入した）でトランスフェクトし、コンストラクトを含む安定な遺伝子操作細胞株を、作製した。緑色蛍光マーカー及び神経細胞特異的抗原ＮＬＧＮ３を含有するＧＦＰ＋ ＥＶを、サイズ排除クロマトグラフィーによりこれらの細胞の馴化培地から単離した（「特異的な」、緑色蛍光で標識されたＥＶ）。非トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞の馴化培地から取得された、非特異的なＥＶを、製造元の指示に従って赤色蛍光マーカーＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で標識した（「非特異的な」、赤色蛍光で標識されたＥＶ）。図４Ａは、システムの概略図を提供し、その中で「ＮＳＡ」は、特異的なＥＶを捕捉する又は特定するために使用される神経細胞特異的標的（この場合、ＮＬＧＮ３）を示す。
特異的な及び非特異的な標識されたＥＶを、図４Ｂで詳述するように、異なる比率で血漿試料中にスパイクした。ＥＶを、基本的に実施例２に記載のとおり、抗ＮＬＧＮ３抗体又はアイソタイプ対照抗体（ＩｇＧ）に結合された磁気ビーズを用いて試料から捕捉した。特異的な及び非特異的なＥＶの回収率を、蛍光プレートリーダーで測定し、実施例４に記載したように計算した。結果を図４Ｂに示す（左パネル－ＩｇＧ対照；右パネル－抗ＮＬＧＮ３抗体を用いるＮＤＥ単離；＊は、特異的回収率と非特異的回収率の間の統計的有意性を示す）。
図４Ｂに見られるように、システムは、特異的ＥＶ回収率の一貫した信頼性の高い測定を提供し、抗ＮＬＧＮ３抗体と対照抗体の性能を明確に区別した。驚くべきことに、４４～５０％の回収率が、非特異的ＥＶを特異的ＥＶより１０００倍過剰でスパイクインした場合でも、ＮＬＧＮ３単離ＥＶにおいて一貫して明らかであった。直接蛍光測定を用いて反応精度を評価する能力は、システム検証のための改善された手段を提供する。
実施例６．内部スパイクイン対照用のビーズベースのシステム
赤色蛍光ストレプトアビジンコンジュゲートビーズ（Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ）を、ストレプトアビジン－ビオチン相互作用により組換えビオチン化ＧＡＰ４３タンパク質でコートした。ビーズを、異なる量（蛍光単位）で血漿試料中にスパイクし、堅牢なシグナルを生成する最小量を決定し、さらなる使用のために選択した。抗原を提示する標識されたビーズを、ＧＡＰ４３に特異的な抗体又は非特異的なＩｇＧ対照抗体（「選択抗体」）を用いて、基本的に実施例２に記載したように磁気ビーズシステムで捕捉した。標識されたビーズの概略図を図５Ａに提供する。回収率を、蛍光リーダーにより評価し、その結果を図５Ｂに示す。
図５Ｂに見られるように、抗ＧＡＰ４３抗体を用いて捕捉されたビーズの回収率は、約５４％であった（アイソタイプ対照ＩｇＧ抗体を用いるよりも５倍高かった）。有意に、測定された回収率は、異なる測定間で非常に一貫していることがわかった（変動係数（ＣＶ）＜１３％）。
次に、標的特異的に標識されたビーズが内部スパイクイン対照（それはＥＶ含有試料に添加され得る）として機能する能力、及び試料から単離されたＥＶ中の様々なマーカーの下流の測定値に対するそれらの潜在的な干渉を、評価した。代表的な神経細胞特異的タンパク質マーカー（タウ）及び代表的な神経細胞特異的ｍＲＮＡマーカー（ＮＲＧＮ）を、分析のために選択した。この目的のために、標識された対照ビーズを補充した（「スパイクイン」）、または未処理のままの（「スパイクインなし」）血漿試料を、ＧＡＰ４３特異的抗体又はＩｇＧ対照抗体に結合された磁気ビーズとインキュベートした。ＥＶを、基本的に実施例２に記載したように単離し、ＥＶ中のマーカーのレベルを、実施例２（タンパク質マーカータウについて）又は実施例３（ｍＲＮＡマーカーＮＲＧＮについて）に記載したように評価した。結果をそれぞれ図５Ｃ（タウ）及び図５Ｄ（ＮＲＧＮ）に示す。
図５Ｃ～５Ｄに見られるように、小さな、有意でない差が、スパイクインされない試料と比較して、スパイクインされたビーズを含有する試料から捕捉されたＥＶ中で測定されたマーカーのレベルにおいて観察された。
次に、実験を、追加の種類の標識粒子、すなわち量子ドット（ＱＤ）ナノ粒子を用いて繰り返した。この目的のために、ＱＤ（ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ Ｑ１０１４１ＭＰ）をストレプトアビジン－ビオチン相互作用により組換えビオチン化ＧＡＰ４３タンパク質でコートし、標識された、標的特異的ＱＤを、血漿試料中にスパイクした。次いで、スパイクされた試料を、ＧＡＰ４３抗体（ＮＤＥ）又は非特異的対照抗体（ＩｇＧ）を用いるＥＶ単離に供した。図５Ｅは、量子ドット粒子（ＱＤ）の回収曲線をプロットし、単離後に測定された平均蛍光強度（ＭＦＩ）の割合（「ＱＤ回収率」）を、スパイクインＱＤ（「ＱＤインプット」）の初期量の関数として示す。
図５Ｆは、ＱＤスパイクインが、スパイクインされた試料から単離されたＮＤＥ中のタウの測定レベルに干渉しないことを実証する。
そのため、結果は、内部スパイクイン対照としての使用のためのシステムの適合性を実証し、アッセイの収率に顕著な影響を与えることなく各試験試料の回収率を評価することを提供する。結果は、微粒子とナノ粒子の両方が内部対照としての使用に適することを実証する。
実施例７．複数の単離標的に対する抗体の相乗的な組み合わせは選択性の高いＮＤＥ単離を提供する
Ｌ１ＣＡＭ、ＮＬＧＮ３及びＧＡＰ４３（「選択マーカー」）に対する抗体を、血漿試料からＮＤＥを単離するそれらの能力について、単独で又は様々な組み合わせで試験した。この目的のために、抗体を、磁気ビーズにコンジュゲートし、基本的に実施例２に記載したようにＥＶを捕捉するために使用した。各試料可溶化液中の神経細胞ｍＲＮＡマーカーＮＲＧＮ（シグナル）及び血小板ｍＲＮＡマーカーＰＦ４（ノイズ）のレベルを、基本的に実施例３に記載したように、測定した。各抗体又は組み合わせを用いて単離されたＥＶにおけるシグナル対ノイズ（ＮＲＧＮ／ＰＦ４）比を、総血漿ＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ ＲＮＡｅａｓｙキットで単離された）の比率と比較した。結果を図６に示す。
図６に見られるように、ＮＬＧＮ３とＧＡＰ４３の両方は、選択的ＮＤＥ単離標的としてＬ１ＣＡＭよりも約１０倍有効であった。さらに、抗Ｌ１ＣＡＭ抗体と組み合わせて使用されたＮＬＧＮ３又はＧＡＰ４３に対する抗体は、相加的又は相乗的にこの能力を増加させ、シグナル対ノイズゲインを４０．７７倍（Ｌ１ＣＡＭ＋ＧＡＰ４３、Ｌ１ＣＡＭ単独の２．６６倍及びＧＡＰ４３単独の３２．０３倍と比較して）又は３３．７３倍（Ｌ１ＣＡＭ＋ＮＬＧＮ３、Ｌ１ＣＡＭ単独の２．６６倍及びＮＬＧＮ３単独の２３．０８倍と比較して）に向上させた。３つの抗体を組み合わせることは、相乗的に選択的捕捉能力を向上させ、シグナル対ノイズゲインを６１．８８倍に向上させた。さらに驚くべきことに、相乗効果は、Ｌ１ＣＡＭに対する抗体を添加せずに、ビーズがＮＬＧＮ３及びＧＡＰ４３に対する抗体を含んだ場合に、より大きかった。シグナル対ノイズゲインは、３つの抗体全てにコンジュゲートされたビーズよりも２倍を超えて、及び各抗体単独の場合よりも４～５倍高かった。特に、Ｌ１ＣＡＭ特異的抗体（２．６６）と比較してＮＬＧＮ３特異的抗体とＧＡＰ４３特異的抗体の組み合わせのシグナル対ノイズゲイン（１２４．４１）は、約４７倍であった（図６）。
結果は、生体試料からＮＤＥを選択的に捕捉することにおける、単独で又はＬ１ＣＡＭをさらに標的とする、シナプスタンパク質に対する抗体の組み合わせの有利な使用を実証する。結果はさらに、単離標的としてのＮＬＧＮ３とＧＡＰ４３の組み合わせた使用が、単離されたＥＶにおいて、非特異的血小板マーカーと比較して、特異的神経マーカーの高度に選択的かつ相乗的な濃縮をもたらすことを実証する。
実施例８．ウェスタンブロット及びＦＡＣＳ分析を用いる単離プロセスの特異性の評価
抗体結合磁気ビーズにより単離された粒子がＮＤＥであることをさらに検証するために、２つのドナー（「ＮＤＥ１」及び「ＮＤＥ２」）の血漿試料を、Ｌ１ＣＡＭ、ＮＬＧＮ３及びＧＡＰ４３特異的抗体の組み合わせを用いて、基本的に実施例７に記載したような単離プロトコルに供した。単離プロトコルに供されなかった全血漿（Ｐｌ）及びＨＥＫ２９３細胞可溶化液（細胞）を、対照として使用した。神経細胞タンパク質Ｌ１ＣＡＭ及びＧＲＩＡ２、並びに一般的なエクソソームマーカーＡＬＩＸ、ＦＬＯＴ１、ＣＤ６３、ＣＤ９及びＣＤ８１のレベルを、標準的な手順を用いるウエスタンブロッティング（ＷＢ）を用いて捕捉されたＥＶ又は対照試料の可溶化液中で決定した。一般的な非エクソソーム血漿タンパク質であるアルブミン（「ＡＬＢ」）と、エクソソームで放出されない細胞タンパク質であるカルネキシンのレベルを、陰性対照として使用した。結果を図７Ａに示す。
加えて、ＥＶを、基本的に実施例７に記載したように、ＮＬＧＮ３、ＧＡＰ４３及びＬ１ＣＡＭ特異的抗体でコートした磁気ビーズを用いて、又は非選択的ＩｇＧ対照を用いて血漿試料から捕捉し、溶出液を用いる代わりに、及び溶出されたＥＶを溶解する代わりに、フルオロフォアにコンジュゲートされた、Ｌ１ＣＡＭ又はＣＤ９に対する第２の抗体（Ｒ－フィコエリスリン）を用いて、結合したＥＶと相互作用させ検出した。蛍光を、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）により測定し、その結果を図７Ｂに示す。
結果は、ＷＢとＦＡＣＳの両方を用いるＮＤＥの特異的単離を実証する。捕捉されたＥＶ可溶化液中で検出されたアルブミンとカルネキシンの非常に低いレベルは、無関係なマーカーの最小限の混入を有する単離プロセスの顕著な純度を示している。
これを、追加の自動化ウェスタンブロットアッセイ（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ社製ＷＥＳ（商標）機器）によりさらに確認し、実施例７に記載したように単離しされ
たＮＤＥの純度及び特異性を、エクソソームマーカーＣＤ９及びＦＬＯＴ１に対する抗体、並びに神経細胞マーカーＮｅｕｒＮ及びＧｌｕＲ２に対する抗体を用いて調べた。追加のマーカーもまた、単離されたＮＤＥの高い純度と特異性を実証した。
実施例９．質量分析による神経タンパク質の特異的濃縮の実証と、プロテオミクス解析及びリピドミクス解析との適合性の実証
ＮＬＧＮ３、ＧＡＰ４３及びＬ１ＣＡＭに対する抗体を、磁気ビーズのバッチに付着させ、基本的に実施例７に記載したように、健康なヒト個体の血漿試料のプールからＮＤＥを捕捉するために使用した。ビーズとのインキュベーションに続いて、捕捉されたＥＶを溶出し、溶解し、液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ－ＭＳ）及びプロテオーム分析に供した。
平均して６２０個の、すなわち、典型的には未処理の血漿試料のプロテオミクス解析で特定される範囲内の数の、特有のタンパク質を、特定した。遺伝子オントロジーバイオインフォマティクス解析（注釈、視覚化及び統合された発見バイオインフォマティクスリソースのためのデータベース（ｔｈｅ ｄａｔａｂａｓｅ ｆｏｒ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ， ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）－ＤＡＶＩＤを用いる）を行った。結果を表４に示し、各グループについて（総エクソソーム及びＮＤＥについて）１０個の最も重要な組織「ゴーターム（ｇｏ－ｔｅｒｍ）」特定子（「ＰＶ」は遺伝子オントロジー解析のＰ値を表し、「２．００Ｅ－１３８」は２×１０－１３８を表す）を示す。
表４－プロテオミクス解析
Figure 2023542122000004
表４に見られるように、分析は、ＥｘｏＱｕｉｃｋキットにより単離された総ＥＶを上回る、特異的抗体を用いて単離されたＥＶ中の脳関連タンパク質（「ＮＤＥ」）の顕著な濃縮を明らかにした。ＮＤＥで排他的に又は優先的に特定された濃縮タンパク質のリストは、いくつかの神経細胞特異的タンパク質を含んだ。
単離されたＮＤＥ、総ＥＶ、及び非選択的ＩｇＧ対照を用いて得られたＥＶの脂質組成を、脂質分析に特異的な質量分析法を用いてさらに分析した。結果を表５に示し、その中で、各脂質マーカーについて、各試料において特定された脂質の総量の百分位数を示す。
表５に見られるように、特定された脂質はエクソソームの特徴を有し、単離されたＮＤＥ中に見られる脂質の割合は、総エクソソーム又は対照試料（非選択的ＩｇＧを用いて得られた）で見られるものと顕著に異なっていた。
表５－リピドミクス解析
Figure 2023542122000005
そのため、この結果は、偏りのないプロテオミクス手法を用いて、ＮＬＧＮ３、ＧＡＰ４３、とＬ１ＣＡＭ抗体の組み合わせを用いて単離されたＥＶが、ＮＤＥについて顕著に濃縮されることを実証する。この結果は、このアッセイとプロテオミクス解析及びリピドミック解析の適合性をさらに実証する。
実施例１０．ＮＤＥの神経タンパク質のレベルはいくつかのアルツハイマー病（ＡＤ）マウスモデルの皮質及び海馬のレベルと正に相関する
ＮＤＥを、基本的に実施例７に記載したように、ＮＬＧＮ３、ＧＡＰ４３及びＬ１ＣＡＭに対する抗体を用いてマウスの血漿試料から単離した。調べたマウスは、野生型マウス、又はＡＤの様々なモデルに相当するマウス系統のいずれかであった。以下のマウスのコホートを調べた：ｎ＝４ ２ｘＴｇ－ＡＤ（全て雌；齢：平均＝８．３、ＳＤ＝０．１２ヶ月；正方形）、ｎ＝１５ ３ｘＴｇ－ＡＤ（雄９匹、雌６匹；齢：平均＝９．１、ＳＤ＝０．８、６～１０．５ヶ月；十字）、ｎ＝９ ５ｘＦＡＤ（全て雌；１２ヶ月齢；星）及びｎ＝１５野生型マウス（ＷＴ；雄５匹、雌１０匹；齢：平均８．９、ＳＤ＝３．２、５～１２ヶ月；円）；合計４３匹のマウス；雌２９匹、雄１４匹；齢：平均＝９．６、ＳＤ＝２．４、５～１２ヶ月。
選択したモデルは、ＡＤの多様なマウスモデルを表し、それは、ＡＤのモデルとして広く特徴付けられ、受け入れられている。特に、モデルは、異なる病状を有する家族性ＡＤの形態を表す。２ｘＴｇ－ＡＤアミロイドーシスマウスモデルは、マウスプリオンタンパク質プロモーターの制御下で中枢神経系（ＣＮＳ）においてヒトアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）ＫＭ６７０／６７１ＮＬ（スウェーデン;ＡＰＰｓｗｅ）及びプレセニリン－１（ＰＳＥＮ１）ＤＥ９変異を発現し、病理学的ＡＰＰプロセシング及びＡβプラークの蓄積をもたらす。５ｘＦＡＤは、合計５つの変異（ＡＰＰｓｗｅ、ＡＰＰ Ｉ７１６Ｖ（フロリダ）、ＡＰＰ Ｖ７１７Ｉ（ロンドン）、ＰＳＥＮ１ Ｍ１４６Ｌ（Ａ＞Ｃ）、及びＰＳＥＮ１ Ｌ２８６Ｖ）を有するヒトＡＰＰ及びＰＳＥＮ１導入遺伝子を過剰発現することによりＡβ病態をより迅速に再現する、より新しいモデルである。３ｘＴｇ－ＡＤマウスは、ＰＳＥＮ１ Ｍ１４６Ｖ変異型ノックインマウスにおいてヒトＡＰＰｓｗｅ及びＴａｕ Ｐ３０１Ｌを過剰発現することにより、Ａβプラークとタウのもつれの両方の病態を呈する。星状細胞の補体の発現は、タウオパチー及びアミロイドーシスのマウスモデルにおいて上昇される。タウオパチーのＰ３０１ＳマウスモデルにおけるＡβが刺激するＣ１ｑタンパク質レベルの増加は、シナプス変性と関連付けられる。異なるマウスは、疾患のわずかに異なる態様及び重症度を表し、そのため、血漿ＥＶとＣＮＳ組織の間の一致の評価を可能にする。
いくつかの神経タンパク質及び対照タンパク質のレベルを、Ｌｕｍｉｎｅｘマルチプレックスアッセイを用いて、単離されたＥＶ（「ＮＥＶ」）、並びに各マウスの解剖され
た皮質及び海馬組織（「皮質」）において測定した。
結果は、各グラフに示されるピアソン相関係数により示されるように、ＮＤＥにおける総タウ（ｔタウ）、リン酸化タウ（ｐ１８１－タウ）及びアミロイドベータ４２（Ａβ４２；それぞれ図９Ａ～９Ｃ）のレベルと皮質及び海馬組織におけるそれらのレベルの間の統計的に有意な正の相関を示す。驚くべきことに、単離されたＮＤＥにおけるそれらのタンパク質のレベルは、マウスの齢及びそれらの脳の病態の重症度とも相関した。これは、ＮＬＧＮ３、ＧＡＰ４３、とＬ１ＣＡＭ特異的抗体の組み合わせを用いて単離されたエクソソームが、マウスの脳で起こる変化を反映し、かつ低侵襲血液検査により脳をプローブするための有用なツールを提供することを実証する。
同様の結果が、神経タンパク質のクラステリンとＳＹＰ、及び全ての細胞型に見られる非組織選択的タンパク質であるＢＩＭについても得られ、これはまた、単離されたＮＤＥ中のそれらのレベルと脳組織中のそれらのレベルの間の有意な相関を示した。これらの結果はさらに、本明細書に記載したように単離されたＮＤＥが、元の組織におけるそれらの相対レベルを反映するハウスキーピングタンパク質の比例的発現を提供する能力を、実証する。
実施例１１．軽度認知障害（ＭＣＩ）及びアルツハイマー病（ＡＤ）のための高精度の診断分類器の開発
早期ＡＤと関連付けられるＭＣＩを含む軽度認知障害（ＭＣＩ）患者のコホート（ミニメンタルステート検査（ＭＭＳＥ）スコア＝２７±３．２、ｎ＝２０）、及びマッチする正常対照（ｎ＝２０）を、以下のようにブラインド方式で分析した。ＮＤＥを、基本的に実施例１０に記載したように、ＮＬＧＮ３、ＧＡＰ４３及びＬ１ＣＡＭ（以下「組み合わせ標的」）に対する抗体を用いて血漿試料から単離した。様々なタンパク質のレベルを、Ｌｕｍｉｎｅｘ分析又はＥＬＩＳＡ分析を用いてＮＤＥ可溶化液中で測定した。診断候補としての異なるタンパク質の有効性を、健常対照個体の試料中のそれらのそれぞれのレベルとの比較により、バイオインフォマティクスで評価した。ＮＬＧＮ１のレベルを評価するために、ＭＢＳ９３１３１４０ ＮＬＧＮ１ ＥＬＩＳＡキット（ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ）を、使用した。このキットは、ニューロリギン（ＮＬＧＮ）ファミリーメンバー、特にヒトニューロリギン－１（ＮＬＧＮ１）を特定するのに有用である。
個々の患者において測定されたいくつかのタンパク質のレベルを、図１０Ａに示す。図１０Ａに見られるように、これらのタンパク質のいくつかは、健常個体（左）と比較してＭＣＩ患者（右）において、平均で、増加傾向（例えば、ｐタウ、Ａｂ４２）又は減少傾向（ＮＬＧＮ１）を示したが、個々のタンパク質は、十分な精度でグループ間を区別するのに十分でなく、特定の患者に信頼できる診断を提供するためにも十分でなかった。ＳＹＰ、カテプシンＤ、及びＨＳＰ７０などの他のタンパク質は、診断マーカーとして有効ではなく、グループの単離に寄与しなかった。
驚くべきことに、ＭＣＩ患者と健常対照の分離において高い精度を提供する、タンパク質シグネチャが特定された。具体的には、４つのタンパク質、すなわち、タウ、ｐ－タウ、ニューロリギン及びアミロイドベータ４２の組み合わせ相対レベルに基づく診断アルゴリズムは、８５％の感度及び９０％の特異度をもたらした。結果を図１０Ｂに示し、その中で、「診断スコア」は、アルゴリズムに従って計算されたこれらのタンパク質の組み合わせ相対レベルを反映する数値スコアである。診断カットオフ、すなわち、この試験対象グループの分析に適用可能であることが見出されたＭＣＩ決定のための閾値も、図１０Ｂに示される。
脳におけるタウ及びアミロイドβ（Ａβ）アイソフォームの凝集は、ＡＤの特徴である。そのため、それらは候補バイオマーカーと見なされる。しかし、血液試料中のバイオマーカーとしてのＡβ及びタウの信頼性を確立しようとする研究は、正確な診断に必要な条件とパラメータに関する矛盾する結果と理論の混同に至った。これまで様々な血液バイオマーカーが示唆されたが、初期の診断プロトコルで確立された又は実施されたものは未だない。ＡＤは、患者に症状が現れるまでに、病気がほとんどの治療薬が無効になるところまで進行しているため、治療不可能で不治の病であると依然として考えられている。
特定の理論又は作用機序に縛られるものではないが、本明細書に記載の方法は、組み合わせた標的を用いるＮＤＥ単離、及び本明細書に開示される４つマーカータンパク質シグネチャを用いるペイロード分析を含み、これまで示唆された血液検査と比較して、ＭＣＩの予想外に正確な診断及びＡＤの基礎疾患の早期発見を提供した。
同様の実験において、さらなるタンパク質セットを、ＡＤと健常対照の違いを評価する能力について試験した。血漿ＮＤＥを、初期のＡＤ患者（１０、２０及び３２人の患者の３つのコホート）並びに健常対照対象から（上記のＮＬＧＮ３、ＧＡＰ４３及びＬ１ＣＡＭに対する抗体を用いて）単離した。ＭＣＩコホート（ＭＭＳＥスコアが２５～３０の範囲）の患者とは対照的に、ＡＤコホートの患者は、認知症を示し、１８～２７の範囲のＭＭＳＥスコアにより特徴付けられた。
結果を、図１１Ａ～１１Ｆに示す（ｐｇ／ｍｌ（図１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ及び１１Ｅ）、又は図１１Ｄ及び１１Ｆでは相対単位（Ａ、Ｕ））。図１１Ａ～１１Ｆに見られるように、以下のタンパク質のレベルは、ＡＤと健常対照の間で異なっていた：Ａβ４２（図１１Ａ）、総タウ（タウ、図１１Ｂ）、ｐ－タウ（ｐ－１８１－タウ、図１１Ｃ）、ＰＳＤ９５（図１１Ｄ）、ＢＤＮＦ前駆体（ｐｒｏＢＤＮＦ、図１１Ｅ）及びＮｆκＢ（図１１Ｆ）。
さらに、図１１Ｇ～１１Ｈに見られるように、Ａβ４２、ｐ－１８１－タウ、ＰＳＤ９５及びｐｒｏＢＤＮＦのレベルを組み合わせる診断シグネチャは予想外にも、例外的な精度でグループ間を区別することが見出された。
図１１Ｇに示すように、「ＡＤスコア」は、アルゴリズム（レベルＡβ４２、ｐ－１８１－タウを組み合わせ、ＰＳＤ９５及びｐｒｏＢＤＮＦのレベルを所定の比率で減少させる）に従い計算されたそれらのタンパク質の組み合わせた相対レベルを反映する数値スコアである。診断カットオフ、すなわち、この試験対象グループの分析に適用可能であることが見出されたＡＤ決定のための閾値も、図１１Ｇに示す。
図１１Ｈは、ＡＤ患者対対照のＡβ４２、ｐ－１８１－タウ、ＰＳＤ９５及びｐｒｏＢＤＮＦレベルの組み合わせに基づく受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す。驚くべきことに、６２人のＡＤ患者と６５人の対照の分析は、それらが９０％の感度と７８％の特異度で分離できることを明らかにした（図１１Ｈ）。
実施例１２．前頭側頭型認知症病態生理の鑑別診断
前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）は、主にタウ及び４３ｋＤａのトランスアクティブ応答ＤＮＡ結合タンパク質（ＴＤＰ４３）を含む、異なるタンパク質の脳蓄積と関連付けられる一連の臨床症候群を包含する。根底にある病態の早期発見は、治療法の開発と決定において非常に有利である。しかし、今日まで、タンパク質症は、非常に誤りが起きやすい、症状の種類に基づいてのみ示唆でき、正確な診断は、死後にのみ行うことができる。
研究を、孤発性行動ＦＴＤの患者から採取した９つの血液試料について行った。血漿ＮＤＥを、基本的に実施例７に記載したように、組み合わせた標的により単離した。ＮＤＥ可溶化液中のｐ１８１－タウ（ｐ－タウ）及びＴＤＰ４３レベルを、それぞれＬｕｍｉｎｅｘ及びＥＬＩＳＡにより測定し、全ての患者でそれぞれの平均値に正規化した。
結果を図１２に示し、その中で、ＦＴＤ１～ＦＴＤ９は、個々の患者を表し、ｐ－タウ（三角形）とＴＤＰ４３（円）の正規化レベルは、式：正規化された値＝値（患者）／値（平均）に従い、患者のＥＶのマーカーのレベルを試験母集団の平均値で割ったものとして計算される任意の単位で示す。さらに、個々の患者から単離されたＮＤＥ中のタンパク質マーカーのレベル（ｐｇ／ｍｌで）及びｐ－タウレベルに対するＴＤＰ４３レベルのそれぞれの比率を、以下の表６に示す。
表６－ＦＴＤ患者のＥＶ中のバイオマーカーのレベル
Figure 2023542122000006
図１２及び表６で見られるように、マーカーＴＤＰ４３とｐ－タウの組み合わせは、高いＮＤＥ ＴＤＰ４３レベルと低いＮＤＥ ｐ－タウレベルにより、又はその逆により、特徴付けられる、２つの別々のＦＴＤ患者グループを明確に特定した。
したがって、本明細書に開示される方法は、本明細書に開示されるような標的による血漿ＮＤＥの単離及び診断マーカーとしてのＴＤＰ４３及びｐ－タウを用いるペイロード分析を含み、ＦＴＤ病態の早期発見及び決定を提供する。本明細書に提示した結果は、治療開発において極めて重要な役割を有する、ＦＴＤ病態用の最初の血液バイオマーカーを提供し得る。
実施例１３．筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）のための高精度診断分類器の開発
ＡＬＳの診断のためにＮＤＥタンパク質バイオマーカーを用いる可能性も、検討した。筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ、ｎ＝３５）の患者のコホート、及びマッチする正常対照（健常、ｎ＝３５）を、分析した。ＮＤＥを、基本的に実施例１１に記載したように、ＮＬＧＮ３、ＧＡＰ４３及びＬ１ＣＡＭに対する抗体を用いて血漿試料から単離した。様々なタンパク質のレベルを、Ｌｕｍｉｎｅｘ又はＥＬＩＳＡ分析（ＬＣ３及びカテプシンＤ Ｒ＆Ｄシステム、ＴＤＰ４３ ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ、ＣＯＸ２、ＥＩＦ２ｃ２及びＮＦＥ２Ｌ２、ＣＵＳＡＢＩＯ）を用いて、ＮＤＥ可溶化液中で測定した。診断候補としての異なるタンパク質の有効性を、健常対照個体の試料から取得されたＥＶ中のそれらのそれぞれのレベルと比較することにより評価した。個々の患者において測定されたいくつかのタンパク質のレベルを図８Ａ及び８Ｂに示す。
図８Ａ及び図８Ｂに見られるように、ＬＣ３、カテプシンＤ（ＣａｔＤ）、ＴＤＰ４３及びＮＲＦ２（ＮＦＥ２Ｌ２）を含む、特定のタンパク質バイオマーカーのレベルは、ＡＬＳ患者から取得されたＥＶと健常個体から取得されたものの間で異なっていた。この差異は、ＣＯＸ２とＥＩＦ２Ｃ２についてはそれほど顕著でなく、ｐｒｏＢＤＮＦとＢＡＤを含む他のバイオマーカーは、試料間で実質的な差異を示さなかった。驚いたことに、ＡＬＳ患者と健常対照を分離する高い精度を提供する、タンパク質シグネチャが特定された。驚くべきことに、ＬＣ３、ＴＤＰ４３、及びＮＲＦ２（所定の比率のＮＲＦ２＋ＴＤＰ４３－ＬＣ３）の組み合わせた相対レベルに基づく診断アルゴリズムは、９０％の感度と１００％の特異度をもたらした（図８Ｃ）。
特定の実施形態の前述の説明は、本発明の一般的な性質を完全に明らかにするので、過度の実験なしに、一般的な概念から逸脱することなく、現在の知識を適用することにより、様々な適用のためにそのような特定の実施形態を容易に修正し、かつ／又は適合させることができ、したがって、そのような適合及び修正は、開示される実施形態の意味及び等価物の範囲内で理解されるべきであり、理解されることが意図される。本明細書で採用される語句又は用語は、説明を目的としており、限定することではないことを理解されたい。様々な開示された機能を実施するための手段、材料、及び工程は、本発明から逸脱することなく、様々な代替形態をとり得る。

Claims (77)

  1. ａ．前記ＥＶの表面上の標的分子に結合できる物質結合親和性分子を含む単離システムを提供することであって、前記標的分子の少なくとも１つが、シナプスタンパク質である、提供すること、
    ｂ．１以上の前記標的分子を提示する粒子の所定量を含有する対照試料を提供すること、
    ｃ．ｉ．それらの対応する標的分子への前記親和性分子の特異的結合を可能にする条件下で、前記システムを前記対照試料と接触させること、
    ｉｉ．前記親和性分子により結合された粒子の量を定量すること、かつ
    ｉｉｉ．前記結合された粒子の量が所定の閾値を超えていることを決定すること
    により、前記システムの精度を決定すること、
    ｄ．ＥＶ含有生体液試料を提供すること、
    ｅ．それらの対応する標的分子への前記親和性分子の特異的結合を可能にする条件下で、前記生体液試料を前記システムと接触させること、並びに
    ｆ．前記親和性分子に結合したＥＶを単離すること
    を含む、神経細胞由来の細胞外小胞（ＥＶ）を単離するための方法。
  2. 前記シナプスタンパク質が、ニューロリギン－３（ＮＬＧＮ３）、成長関連タンパク質４３（ＧＡＰ４３）、シナプトタグミン－１（ＳＹＴ１）、及びグルタミン酸受容体１（ＧｌｕＲ１、ＧＲＩＡ１）からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記標的分子が、ＮＬＧＮ３及びＧＡＰ４３を含む、請求項１に記載の方法。
  4. 前記標的分子が、ＮＬＧＮ３及びＧＡＰ４３である、請求項３に記載の方法。
  5. 前記標的分子が、ＮＬＧＮ３、ＧＡＰ４３及びＬ１細胞接着分子（Ｌ１ＣＡＭ）である、請求項３に記載の方法。
  6. 前記物質が、複数の磁気ビーズである、請求項１に記載の方法。
  7. 前記対照試料の粒子が、マーカーにより標識される、請求項１に記載の方法。
  8. 前記粒子が、ビーズである、請求項７に記載の方法。
  9. 前記粒子が、蛍光標識されたビーズであり、かつ前記対照試料が、前記生体液試料を前記親和性分子と接触させる前に前記生体液試料と組み合わされる、請求項８に記載の方法。
  10. 前記粒子が、操作された細胞から取得される対照ＥＶである、請求項１に記載の方法。
  11. 前記対照試料が、１以上の前記標的分子を外因的に発現するように操作された陽性対照ＥＶを含み、かつ任意で前記標的分子を発現しない陰性対照ＥＶをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  12. 前記対照試料が、ａ）第１の蛍光マーカーを含有する非神経細胞から取得された陰性対照ＥＶ、及びｂ）前記１以上の標的分子を発現するように操作された同等の非神経細胞から取得され、かつ第２の別個の蛍光マーカーを含有する陽性対照ＥＶを含む、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記所定の閾値が、前記対照試料中で提供される、１以上の前記標的分子を提示する粒子の所定量の少なくとも４４％の回収率に相当する、請求項１に記載の方法。
  14. 前記単離されたＥＶが、少なくとも２０倍の非神経細胞特異的マーカーレベルに対する神経細胞特異的マーカーレベルの比率により特徴付けられる、請求項１に記載の方法。
  15. 前記単離されたＥＶ中の１以上のバイオマーカーのレベルを決定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  16. 前記１以上のバイオマーカーが、タンパク質バイオマーカー、核酸バイオマーカー、脂質バイオマーカー、代謝産物バイオマーカー、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記１以上のバイオマーカーが、タウ、リン酸化タウ（ｐ－タウ）、アミロイド－ベータ４２（Ａβ４２）、ニューロリギン（ＮＬＧＮ）、ＴＤＰ４３、クラスタリン、ＳＹＰ、ＢＩＭ、ＮＥＦＬ、ＥＮＯ２、ＮＲＧＮ、及びＧＰＲ２６遺伝子産物、並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
  18. 前記バイオマーカーが、タウ、ｐ－タウ、Ａβ４２、及びニューロリギンである、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記試料が、軽度認知障害（ＭＣＩ）を有すると、又はアルツハイマー病（ＡＤ）を発症する素因を有すると疑われる対象から取得される、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記単離されたＥＶ中の前記バイオマーカーのレベルを対照生体液試料に対応するそれらのそれぞれのレベルと比較して、それにより前記試料の診断シグネチャを前記対照診断シグネチャと比較することをさらに含み、前記対照診断シグネチャと比較される前記試料の診断シグネチャにおける有意差が、前記対象がＭＣＩに罹患していることを示す、請求項１８又は１９に記載の方法。
  21. 前記試料が、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）と診断されるか、又はＦＴＤを有すると疑われる対象から取得され、かつ前記バイオマーカーが、ＴＤＰ４３及びｐ－タウである、請求項１７に記載の方法。
  22. 前記単離されたＥＶ中で決定されたＴＤＰ４３及びｐ－タウのレベルに基づき前記対象におけるＦＴＤ病態を特徴付けることをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記１以上のバイオマーカーが、ＬＣ３、カテプシンＤ、ＮＲＦ２、Ａβ４２、ｐ－タウ、ＰＳＤ９５、ｐｒｏＢＤＮＦ、ＣＯＸ２、ＥＩＦ２Ｃ２及びＮＦ－κＢからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
  24. 前記バイオマーカーが、Ａβ４２、ｐ－タウ、ＰＳＤ９５及びｐｒｏＢＤＮＦであり、かつ前記試料が、ＡＤを有すると疑われる対象から取得される、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記単離されたＥＶ中の前記バイオマーカーのレベルを対照生体液試料に対応するそれらのそれぞれのレベルと比較して、それにより前記試料の診断シグネチャを前記対照診断シグネチャと比較することをさらに含み、前記対照診断シグネチャと比較される前記試料の診断シグネチャにおける有意差が、前記対象がＡＤに罹患していることを示す、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記バイオマーカーが、ＬＣ３、ＴＤＰ４３、及びＮＲＦ２であり、かつ前記試料が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を有すると疑われる対象から取得される、請求項２３に記載の方法。
  27. 前記単離されたＥＶ中の前記バイオマーカーのレベルを対照生体液試料に対応するそれらのそれぞれのレベルと比較して、それにより前記試料の診断シグネチャを前記対照診断シグネチャと比較することをさらに含み、前記対照診断シグネチャと比較される前記試料の診断シグネチャにおける有意差が、前記対象がＡＬＳに罹患していることを示す、請求項２６に記載の方法。
  28. ａ．ＥＶ含有生体液試料を提供すること、
    ｂ．それらの対応する標的分子への前記親和性分子の特異的結合を可能にする条件下で、前記試料を前記ＥＶの表面上の標的分子に結合できる親和性分子と接触させることであって、前記標的分子が、ＮＬＧＮ３及びＧＡΒ４３を含む、接触させること、並びに
    ｃ．前記親和性分子に結合した前記ＥＶを特定すること又は捕捉すること
    を含む、神経細胞由来のＥＶを特定する又は捕捉する方法。
  29. 前記標的分子が、ＮＬＧＮ３及びＧＡΒ４３である、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記標的分子が、ＮＬＧＮ３、ＧＡΒ４３及びＬ１ＣＡＭである、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記親和性分子が、物質結合型である、請求項２８に記載の方法。
  32. 前記物質が、複数の磁気ビーズである、請求項２８に記載の方法。
  33. ｉ．前記標的分子の少なくとも１つを提示する粒子の所定量を含有する対照試料を提供すること、
    ｉｉ．それらの対応する標的分子への特異的結合を可能にする条件下で、前記対照試料を前記親和性分子と接触させること、
    ｉｉｉ．前記親和性分子により結合された粒子の量を定量すること、及び
    ｉｖ．前記結合された粒子の量が所定の閾値を超えていることを決定すること
    をさらに含む、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記粒子が、蛍光標識されたビーズであり、かつ前記対照試料が、前記生体液試料を前記親和性分子と接触させる前に前記生体液試料と組み合わされる、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記対照試料が、１以上の前記標的分子を外因的に発現するように操作された陽性対照ＥＶを含み、かつ任意に前記標的分子を発現しない陰性対照ＥＶをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
  36. 前記対照試料が、第１の蛍光マーカーを含有する非神経細胞から取得された陰性対照ＥＶ、及び前記１以上の前記標的分子を発現するように操作された同等の非神経細胞から取得され、かつ第２の別個の蛍光マーカーを含有する陽性対照ＥＶを含む、請求項３３に記載の方法。
  37. 前記所定の閾値が、前記対照試料中で提供される、１以上の前記標的分子を提示する粒子の所定量の少なくとも４４％の回収率に相当する、請求項３３に記載の方法。
  38. 前記単離されたＥＶが、少なくとも２０倍の非神経細胞特異的マーカーレベルに対する神経細胞特異的マーカーレベルの比率により特徴付けられる、請求項２８に記載の方法。
  39. 前記親和性分子に結合したＥＶ中の１以上のバイオマーカーのレベルを決定することをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
  40. 前記バイオマーカーが、タンパク質バイオマーカー、核酸バイオマーカー、脂質バイオマーカー、代謝産物バイオマーカー、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記バイオマーカーが、タウ、リン酸化タウ（ｐ－タウ）、アミロイドベータ４２（Ａβ４２）、及びＮＬＧＮ、ＴＤＰ４３、クラスタリン、ＳＹＰ、ＢＩＭ、ＮＥＦＬ、ＥＮＯ２、ＮＲＧＮ、及びＧＰＲ２６遺伝子産物、並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３９に記載の方法。
  42. 前記バイオマーカーが、タウ、ｐ－タウ、Ａβ４２、及びニューロリギンである、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記生体液試料が、ＭＣＩを有すると、又はＡＤを発症する素因があると疑われる対象から取得される、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記結合したＥＶ中のバイオマーカーのレベルを対照生体液試料に対応するそれらのそれぞれのレベルと比較して、それにより前記試料の診断シグネチャを前記対照診断シグネチャと比較することをさらに含み、前記対照診断シグネチャと比較される前記試料の診断シグネチャにおける有意差が、前記対象がＭＣＩに罹患していることを示す、請求項４２又は４３に記載の方法。
  45. 前記試料が、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）と診断されるか、又はＦＴＤを有すると疑われる対象から取得され、かつ前記バイオマーカーが、ＴＤＰ４３及びｐ－タウである、請求項４２に記載の方法。
  46. 前記単離されたＥＶ中の決定されたＴＤＰ４３及びｐ－タウのレベルに基づき前記対象における前記ＦＴＤ病態を特徴付けることをさらに含む、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記１以上のバイオマーカーが、ＬＣ３、カテプシンＤ、ＮＲＦ２、Ａβ４２、ｐ－タウ、ＰＳＤ９５、ｐｒｏＢＤＮＦ、ＣＯＸ２、ＥＩＦ２Ｃ２及びＮＦ－κＢからなる群から選択される、請求項４２に記載の方法。
  48. 前記バイオマーカーが、Ａβ４２、ｐ－タウ、ＰＳＤ９５及びｐｒｏＢＤＮＦであり、かつ前記試料が、ＡＤを有すると疑われる対象から取得される、請求項４７に記載の方法。
  49. 前記単離されたＥＶ中の前記バイオマーカーのレベルを対照生体液試料に対応するそれらのそれぞれのレベルと比較して、それにより前記試料の診断シグネチャを前記対照診断シグネチャと比較することをさらに含み、前記対照診断シグネチャと比較される前記試料の診断シグネチャにおける有意差が、前記対象がＡＤに罹患していることを示す、請求項４８に記載の方法。
  50. 前記バイオマーカーが、ＬＣ３、ＴＤＰ４３、及びＮＲＦ２であり、かつ前記試料が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を有すると疑われる対象から取得される、請求項４２に記載の方法。
  51. 前記単離されたＥＶ中の前記バイオマーカーのレベルを対照生体液試料に対応するそれらのそれぞれのレベルと比較して、それにより前記試料の診断シグネチャを前記対照診断シグネチャと比較することをさらに含み、前記対照診断シグネチャと比較される前記試料の診断シグネチャにおける有意差が、前記対象がＡＬＳに罹患していることを示す、請求項５０に記載の方法。
  52. 生体液試料を分析するための方法であって、前記試料の神経細胞由来のＥＶ中のバイオマーカーのレベルを決定することを含み、
    ａ．前記試料が、軽度認知障害（ＭＣＩ）を有すると、又はアルツハイマー病（ＡＤ）を発症する素因があると疑われる対象から取得され、かつ前記バイオマーカーが、タウ、ｐ－タウ、アミロイドベータ４２（Ａβ４２）、及びニューロリギンである；又は
    ｂ．前記試料が、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）と診断されるか、又はＦＴＤを有すると疑われる対象から取得され、かつ前記バイオマーカーが、ＴＤＰ４３及びｐ－タウである；又は
    ｃ．前記試料が、ＡＤを有すると疑われる対象から取得され、かつ前記バイオマーカーが、Ａβ４２、ｐ－タウ、ＰＳＤ９５及びｐｒｏＢＤＮＦである；又は
    ｄ．前記試料が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を有すると疑われる対象から取得され、かつ前記バイオマーカーが、ＬＣ３、ＴＤＰ４３、及びＮＲＦ２である
    方法。
  53. 前記ＥＶ中のバイオマーカーのレベルを対照生体液試料に対応するそれらのそれぞれのレベルと比較することをさらに含む、請求項５２に記載の方法。
  54. 前記親和性分子のそれらの対応する標的分子への特異的結合を可能にする条件下で、少なくとも１つの標的分子がシナプスタンパク質である、前記ＥＶの表面上の標的分子に結合できる物質結合親和性分子と前記試料を接触させること、及び前記親和性分子に結合したＥＶを単離することにより、前記試料から前記ＥＶを単離する工程を、前記神経細胞由来のＥＶ中のバイオマーカーのレベルを決定する前に、さらに含む、請求項５２又は５３に記載の方法。
  55. 前記親和性分子が、ＮＬＧＮ３及びＧＡＰ４３に向けられかつ前記物質が、複数の磁気ビーズである、請求項５４に記載の方法。
  56. それを必要とする対象における軽度認知障害（ＭＣＩ）を診断するために使用される、かつ
    ａ．前記対象からＥＶ含有生体液試料を取得すること、
    ｂ．前記ＥＶの表面上の標的分子に結合できる物質結合親和性分子を含む単離システムを提供することであって、前記標的分子の少なくとも１つが、ＮＬＧＮ３及びＧＡＰ４３からなる群から選択されるシナプスタンパク質である、提供すること、
    ｃ．それらの対応する標的分子への前記親和性分子の特異的結合を可能にする条件下で、前記生体液試料と前記システムを接触させること、
    ｄ．前記親和性分子に結合した前記ＥＶを単離すること、
    ｅ．前記単離されたＥＶ中のタウ、ｐ－タウ、Ａβ４２、及びニューロリギンのレベルを決定すること、並びに
    ｆ．前記単離されたＥＶにおいて決定されたタウ、ｐ－タウ、Ａβ４２、及びニューロリギンのレベルを対照生体液試料に対応するそれらのそれぞれのレベルと比較して、それにより前記試料の診断シグネチャを前記対照診断シグネチャと比較することであって、前記対照診断シグネチャと比較される前記生体液試料の診断シグネチャにおける有意差が、前記対象がＭＣＩに罹患していることを示す、比較すること
    を含む、請求項５２に記載の方法。
  57. それを必要とする対象における前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）病態を特徴付けるために使用される、かつ
    ａ．前記対象からＥＶ含有生体液試料を取得すること、
    ｂ．前記ＥＶの表面上の標的分子に結合できる物質結合親和性分子を含む単離システムを提供することであって、前記標的分子の少なくとも１つが、ＮＬＧＮ３及びＧＡＰ４３からなる群から選択されるシナプスタンパク質である、提供すること、
    ｃ．それらの対応する標的分子への前記親和性分子の特異的結合を可能にする条件下で、前記生体液試料と前記システムを接触させること、
    ｄ．前記親和性分子に結合した前記ＥＶを単離すること、
    ｅ．前記単離されたＥＶ中のＴＤＰ４３及びｐ－タウのレベルを決定すること、
    ｆ．前記単離されたＥＶにおいて決定されたＴＤＰ４３及びｐ－タウのレベルをそれらのそれぞれの対照レベルと比較すること、並びに
    ｇ．前記単離されたＥＶ中の決定されたＴＤＰ４３及びｐ－タウのレベルに基づき前記対象におけるＦＴＤ病態を特徴付けること
    を含む、請求項５２に記載の方法。
  58. ＦＴＤ患者のプールに対応する対照レベルと比較して前記単離されたＥＶ中のＴＤＰ４３の増加されたレベル及びｐ－タウレベルの低下されたレベルが、前記ＦＴＤ病態がＴＤＰ４３タンパク質症と関連付けられることを示し、かつ
    ＦＴＤ患者のプールに対応する対照レベルと比較して前記単離されたＥＶ中のＴＤＰ４３の低下されたレベル及びｐ－タウの増加されたレベルが、前記ＦＴＤ病態がタウタンパク質症と関連付けられることを示す、請求項５７に記載の方法。
  59. それを必要とする対象における筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を診断するために使用される、かつ
    ａ．前記対象からＥＶ含有生体液試料を取得すること、
    ｂ．前記ＥＶの表面上の標的分子に結合できる物質結合親和性分子を含む単離システムを提供することであって、前記標的分子の少なくとも１つが、ＮＬＧＮ３及びＧＡＰ４３からなる群から選択されるシナプスタンパク質である、提供すること、
    ｃ．それらの対応する標的分子への前記親和性分子の特異的結合を可能にする条件下で、前記生体液試料と前記システムを接触させること、
    ｄ．前記親和性分子に結合した前記ＥＶを単離すること、
    ｅ．前記単離されたＥＶ中のＬＣ３、ＴＤＰ４３、及びＮＲＦ２のレベルを決定すること、並びに
    ｆ．前記単離されたＥＶにおいて決定されたＬＣ３、ＴＤＰ４３、及びＮＲＦ２のレベルを対照生体液試料に対応するそれらのそれぞれのレベルと比較して、それにより前記試料の診断シグネチャを前記対照診断シグネチャと比較することであって、前記対照診断シグネチャと比較される前記生体液試料の診断シグネチャにおける有意差が、前記対象がＡＬＳに罹患していることを示す、比較すること
    を含む、請求項５２に記載の方法。
  60. ａ．前記対象からＥＶ含有生体液試料を取得すること、
    ｂ．前記ＥＶの表面上の標的分子に結合できる物質結合親和性分子を含む単離システムを提供することであって、前記標的分子の少なくとも１つが、ＮＬＧＮ３及びＧＡＰ４３を含むシナプスタンパク質である、提供すること、
    ｃ．それらの対応する標的分子への前記親和性分子の特異的結合を可能にする条件下で、前記生体液試料と前記システムを接触させること、
    ｄ．前記親和性分子に結合した前記ＥＶを単離すること、
    ｅ．前記単離されたＥＶ中の少なくとも１つのシナプスタンパク質、少なくとも１つのタウ遺伝子産物及び少なくとも１つのアミロイド遺伝子産物を含む少なくとも４つのバイオマーカーのレベルを決定すること、並びに
    ｆ．前記単離されたＥＶにおいて決定されたバイオマーカーのレベルを対照生体液試料に対応するそれらのそれぞれのレベルと比較して、それにより前記試料の診断シグネチャを前記対照診断シグネチャと比較することであって、前記対照診断シグネチャと比較される前記生体液試料の診断シグネチャにおける有意差が、前記対象がＡＤに罹患しているか、又はＡＤを発症する素因があることを示す、比較すること
    を含む、それを必要とする対象におけるＡＤ又はその素因を診断する方法。
  61. 前記少なくとも１つのシナプスタンパク質が、ＰＳＤ９５又はＮＬＧＮ１であり、前記少なくとも１つのタウ遺伝子産物が、タウ又はｐ１８１－タウであり、かつ前記少なくとも１つのアミロイドマーカーが、Ａβ４２である、請求項６０に記載の方法。
  62. 前記バイオマーカーが、Ａβ４２、ｐ－タウ、ＰＳＤ９５及びｐｒｏＢＤＮＦであり、かつ前記対照診断シグネチャと比較される前記生体液試料の診断シグネチャにおける有意差が、前記対象がＡＤに罹患していることを示す、請求項６１に記載の方法。
  63. ｉ．１以上の前記標的分子を提示する粒子の所定量を含有する対照試料を提供すること、
    ｉｉ．それらの対応する標的分子への特異的結合を可能にする同じ条件下で、前記対照試料と前記親和性分子を接触させること、
    ｉｉｉ．前記親和性分子により結合された粒子の量を定量すること、及び
    ｉｖ．前記結合された粒子の量が所定の閾値を超えていることを決定すること
    をさらに含む、請求項５２～６２のいずれか一項に記載の方法。
  64. 前記粒子が、蛍光標識ビーズであり、かつ前記対照試料が、前記生体液試料と前記親和性分子を接触させる前に前記生体液試料と組み合わされる、請求項６３に記載の方法。
  65. 前記対照試料が、１以上の前記標的分子を外因的に発現するように操作された陽性対照ＥＶを含み、かつ任意に前記標的分子を発現しない陰性対照ＥＶをさらに含む、請求項６３に記載の方法。
  66. 前記対照試料が、第１の蛍光マーカーを含む非神経細胞から取得された陰性対照ＥＶと、１以上の前記標的分子を発現するように操作された同等の非神経細胞から取得され、かつ第２の別個の蛍光マーカーを含有する陽性対照ＥＶを含む、請求項６５に記載の方法。
  67. 前記所定の閾値が、前記対照試料中で提供される、１以上の前記標的分子を提示する前記粒子の所定量の少なくとも４４％の回収率に対応する、請求項６３に記載の方法。
  68. 前記単離されたＥＶが、少なくとも２０倍の非神経細胞特異的マーカーレベルに対する神経細胞特異的マーカーレベルの比率により特徴付けられる、請求項５２～６７のいずれか一項に記載の方法。
  69. 前記標的分子が、ＮＬＧＮ３及びＧＡＰ４３である、又は前記標的分子が、ＮＬＧＮ３、ＧＡＰ４３及びＬ１ＣＡＭである、請求項５２～６８のいずれか一項に記載の方法。
  70. 前記親和性分子が、抗体であるか又はその抗原結合部分を含む、請求項１～７０のいずれか一項に記載の方法。
  71. 前記生体液試料が、血液、血漿及び血清からなる群から選択される、請求項１～７０のいずれか一項に記載の方法。
  72. 前記対象が、ヒトである、請求項１～７０のいずれか一項に記載の方法。
  73. 神経細胞由来の細胞外小胞（ＥＶ）を単離するためのシステムであって、生体液試料から神経細胞由来のＥＶを特定する又は捕捉するための手段を含み、前記ＥＶの表面上の標的分子に結合できる物質結合親和性分子を含み、かつ（ｉ）前記システムの精度を決定するための手段、及び／又は（ｉｉ）前記捕捉されたＥＶ中の少なくとも１つのバイオマーカーのレベルを決定するための手段をさらに含み、
    前記標的分子の少なくとも１つが、ＮＬＧＮ３及びＧＡＰ４３からなる群から選択されるシナプスタンパク質であり、
    前記システムの精度を決定するための前記手段が、少なくとも１つのシナプスタンパク質を提示しかつマーカーにより標識される粒子を含み、
    前記少なくとも１つのバイオマーカーが、タウ、リン酸化タウ（ｐ－タウ）、アミロイドベータ４２（Ａβ４２）、ＮＬＧＮ、ＴＤＰ４３、クラスタリン、ＳＹＰ、ＢＩＭ、ＮＥＦＬ、ＥＮＯ２、ＮＲＧＮ、及びＧＰＲ２６遺伝子産物、並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される、又はＬＣ３、カテプシンＤ、ＮＲＦ２、Ａβ４２、ｐ－タウ、ＰＳＤ９５、ｐｒｏＢＤＮＦ、ＣＯＸ２、ＥＩＦ２Ｃ２及びＮＦ－κＢ並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される
    システム。
  74. 前記標的分子が、ＮＬＧＮ３及びＧＡＰ４３を含む、請求項７３に記載のシステム。
  75. 前記標的分子が、ＮＬＧＮ３及びＧＡＰ４３である、又は前記標的分子が、ＮＬＧＮ３、ＧＡＰ４３及びＬ１ＣＡＭである、請求項７４に記載のシステム。
  76. ＥＶの表面上の、それぞれ、ＮＬＧＮ３及びＧＡＰ４３に結合できる、ＮＬＧＮ３－特異的親和性分子及びＧＡＰ４３特異的親和性分子、並びに前記親和性分子に結合したＥＶを特定する又は捕捉するための手段を含む、神経細胞由来の細胞外小胞（ＥＶ）を特定する又は捕捉するためのキット。
  77. 神経障害を有すると疑われる対象の生体液試料を分析するためのキットであって、
    前記試料の神経細胞由来のＥＶ中のバイオマーカーのレベルを決定するための手段を含み、
    前記対象が、軽度認知障害（ＭＣＩ）を有すると、またはアルツハイマー病（ＡＤ）を発症する素因があると疑われ、かつ前記バイオマーカーが、タウ、ｐ－タウ、アミロイドベータ４２（Ａβ４２）、及びニューロリギン－１である；
    前記対象が、ＡＤを有すると疑われ、かつ前記バイオマーカーが、Ａβ４２、ｐ－タウ、ＰＳＤ９５及びｐｒｏＢＤＮＦである；又は
    前記対象が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を有すると疑われ、かつ前記バイオマーカーが、ＬＣ３、ＴＤＰ４３、及びＮＲＦ２である
    キット。
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