CN114555631A - 检测MTBR tau同种型的方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本文公开的方法采用独特的处理步骤组合，其将血液或CSF样品转化成适合于定量MTBR tau种类以及其它tau种类的样品。本公开内容还涵盖血液或CSF中的MTBR tau种类测量3R‑和4R‑tau蛋白病的病理特征和/或临床症状的用途，以便诊断、分期和/或选择适合于给定疾病阶段的治疗，并且修改给定的治疗方案。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年8月13日提交的美国临时申请号62/886,165、于2020年2月6日提交的美国临时申请号62/970,950、以及于2020年6月26日提交的美国临时申请号63/044,836的优先权，所述美国临时申请各自在此通过引用以其整体并入。
政府权利
本发明在由美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的NS095773下，由政府支持完成。政府在本发明中拥有一定权利。
序列表的引用
本申请含有序列表，其已经由EFS-Web以ASCII格式提交，并且在此通过引用以其整体并入。ASCII副本创建于年月日，命名为“665135_ST25.txt”且大小为14 KB字节。
技术领域
本公开内容涵盖将血液或CSF样品转化成适合于通过质谱法、免疫测定法或本领域已知的其它测定法定量MTBR tau种类的方法。本公开内容还涵盖血液或CSF中的MTBRtau种类测量3R-和4R-tau蛋白病的病理特征和/或临床症状的用途，以便诊断、分期和/或选择适合于给定疾病阶段的治疗。
背景技术
tau蛋白作为不溶性聚集物在脑中的累积是阿尔茨海默氏病和称为tau蛋白病的其它神经退行性疾病的标志之一。Tau病理状况似乎跨越脑区域传播，并且通过特定病理性tau种类以朊病毒样方式在细胞间传播而扩散，尽管这些种类(即单体、低聚物和原纤维种类)的性质和扩散过程还不确定(Frost等人，2009；Goedert等人，2010，2017；Sanders等人，2014；Wu等人，2016；Mirbaha等人，2018；Lasagna-Reeves等人，2012)。Tau具有全长蛋白质的六种不同的同种型。另外，Tau具有一百多个潜在的翻译后修饰位点，包括磷酸化，加上多重截短位点(Meredith等人，2013；Sato等人，2018；Barthélemy等人，2019；Cicognola等人，2019；Blennow等人，2020)。因此，鉴定涉及tau扩散的特定病理性tau种类是一个挑战。几项质谱法(MS)研究提示了，tau的微管结合区(MTBR)在阿尔茨海默氏病的脑中的聚集物中富集(Taniguchi-Watanabe等人，2016；Roberts等人，2020)。此外，一系列低温电子显微镜检查(Cryo-EM)研究证实了，tau聚集物的核心结构由MTBR结构域的亚区段组成，并且特定的构象取决于tau蛋白病(Fitzpatrick等人，2017；Falcon等人，2018，2019；Zhang等人，2020)。这些发现强烈提示了，MTBR tau对于tau聚集是关键的。然而，这些研究使用死后的脑组织。关于生物样品例如CSF和血液中的相应细胞外的含MTBR tau种类的病理生理学知之甚少，所述tau种类可以充当活人中的脑tau聚集物的替代生物标记物。
CSF照常规在临床就诊期间经由腰椎穿刺从研究参与者中获得。先前的CSF tau生物标记物研究提示了，MTBR tau在CSF中缺失，并且集中于N末端和中部结构域区域(Meredith等人，2013；Sato等人，2018)。由N末端至中部结构域组成的种类似乎在中部结构域和MTBR结构域之间的截短后，从神经元主动分泌到细胞外空间内(Sato等人，2018)。报道了MTBR tau种类的检测(Barthélemy等人，2016b，a)，但没有就与疾病的关系进行表征。最近，在CSF中鉴定了含有在重复区域4 (R4)内的残基368处的切割的tau种类(tau368)(Blennow等人，2020)。然而，鉴于通过抗体并未捕获到的区域、截短和构象结构的变化，目前还不清楚tau368是否反映了MTBR tau种类的总体池。
高分辨率质谱法技术的进步已产生了新的方法来测量生物样品中的蛋白质丰度。尽管在仪器使用和数据分析软件方面的进展，样品制备仍是巨大的挑战。样品制备方法的选择影响观察到的代谢物概况和数据质量，并且可以最终影响报道结果。这对于生物样品中低丰度的蛋白质和肽尤其如此。属于这一范畴的肽包括全长蛋白质的许多蛋白酶解片段，其在各种疾病过程中差异地产生。
相应地，本领域仍然需要改善的样品处理方法，以便定量生物流体中的低丰度MTBR tau种类。
发明内容
在本公开内容的各个方面，提供了处理先前获得的生物样品，以便通过质谱法测量tau的相对浓度或绝对浓度的方法。
本公开内容的一个方面涵盖用于测量生物样品中的tau的方法，该方法包括(a)提供选自血液样品或CSF样品的生物样品；(b)通过蛋白质沉淀从生物样品中去除蛋白质，并分离沉淀的蛋白质以获得上清液；(c)通过固相提取从上清液中纯化tau；(d)用蛋白酶切割纯化的tau，然后任选地通过固相提取使所得的切割产物脱盐，以获得包含tau的蛋白酶解肽的样品；并且(e)对包含tau的蛋白酶解肽的样品执行液相层析 - 质谱法，以检测且测量tau的至少一种蛋白酶解肽的浓度。
本公开内容的另一个方面涵盖用于测量生物样品中的tau的方法，该方法包括(a)通过亲和力耗尽降低生物样品中的N末端tau、中部结构域tau或N末端tau和中部结构域tau，其中所述生物样品是血液样品或CSF样品；(b)通过蛋白质沉淀从生物样品中去除另外的蛋白质，并分离沉淀的蛋白质以获得上清液；(c)通过固相提取从上清液中纯化tau；(d)用蛋白酶切割纯化的tau，然后任选地通过固相提取使所得的切割产物脱盐，以获得包含tau的蛋白酶解肽的样品；并且(e)对包含tau肽的样品执行液相层析 - 质谱法，以检测且测量tau的至少一种蛋白酶解肽的浓度。
本公开内容的另一个方面涵盖用于测量生物样品中的tau的方法，该方法包括(a)通过亲和力耗尽降低生物样品中的N末端tau、中部结构域tau或N末端tau和中部结构域tau，其中所述生物样品是血液样品或CSF样品；(b)使MTBR tau亲和纯化；(c)用蛋白酶切割纯化的MTBR tau，然后任选地通过固相提取使所得的切割产物脱盐，以获得包含MTBR tau的蛋白酶解肽的样品；并且(d)对包含MTBR tau的蛋白酶解肽的样品执行液相层析 - 质谱法，以检测且测量MTBR tau的至少一种蛋白酶解肽的浓度。
本公开内容的另一个方面涵盖用于测量生物样品中的tau的方法，该方法包括(a)通过亲和力耗尽降低生物样品中的N末端tau、中部结构域tau或N末端tau和中部结构域tau，其中所述生物样品是血液样品或CSF样品；其中亲和力耗尽包括使生物样品与表位结合剂接触，所述表位结合剂与tau-441的氨基酸1至221内(包含端点在内)，优选氨基酸50至221内(包含端点在内)，或更优选氨基酸104至221内(包含端点在内)的表位(或对于其它全长同种型的类似限定区域内)特异性结合；(b)使MTBR tau亲和纯化，其中亲和纯化包括使步骤(a)的产物与表位结合剂接触，所述表位结合剂与对于由步骤(a)的表位结合剂识别的表位为C末端的表位特异性结合；(c)用蛋白酶切割纯化的MTBR tau，然后任选地通过固相提取使所得的切割产物脱盐，以获得包含MTBR tau的蛋白酶解肽的样品；并且(d)对包含MTBR tau的蛋白酶解肽的样品执行液相层析 - 质谱法，以检测且测量MTBR tau的至少一种蛋白酶解肽的浓度。在一些实施方案中，步骤(b)的表位结合剂与tau-441的氨基酸221至441内(包含端点在内) (或对于其它全长同种型的类似限定区域内)的表位特异性结合。在一些实施方案中，步骤(b)的表位结合剂与tau-441的氨基酸235至441内(包含端点在内)(或对于其它全长同种型的类似限定区域内)的表位特异性结合。在一些实施方案中，步骤(b)的表位结合剂与tau-441的氨基酸235至368内(包含端点在内) (或对于其它全长同种型的类似限定区域内)的表位特异性结合。在一些实施方案中，步骤(b)的表位结合剂与tau-441的氨基酸244至368内(包含端点在内) (或对于其它全长同种型的类似限定区域内)的表位特异性结合。在一些实施方案中，步骤(b)的表位结合剂与tau-441的氨基酸244至299内(包含端点在内) (或对于其它全长同种型的类似限定区域内)的表位特异性结合。
在本文公开的方法中使用之前，生物样品可以通过去除细胞碎片、添加组分(例如蛋白酶抑制剂、同位素标记的内部标准、去污剂、离液剂等)和/或耗尽分析物(例如Aβ肽、N末端tau、中部结构域tau等)进行修饰。
本文公开的方法特别适合于测量MTBR tau。在上述具体实施方案中，本公开内容的方法可以用于测量tau的一种或多于一种胰蛋白酶肽的浓度，所述胰蛋白酶肽包括但不限于IGST (SEQ ID NO: 2)、VQII (SEQ ID NO: 4)、LQTA (SEQ ID NO: 3)、LDLS (SEQ IDNO: 5)、HVPG (SEQ ID NO: 6)、IGSL (SEQ ID NO: 7)和VQIV (SEQ ID NO: 9)。在一些实例中，可能期望测量tau的两种或更多种胰蛋白酶肽的浓度，然后计算两个值的比率。如本文公开的，HVPG (SEQ ID NO: 6)与IGSL (SEQ ID NO: 7)、LQTA (SEQ ID NO: 3)与IGSL(SEQ ID NO: 7)、IGST (SEQ ID NO: 2)与IGSL (SEQ ID NO: 7)、VQII (SEQ ID NO: 4)与IGSL (SEQ ID NO: 7)、LDLS (SEQ ID NO: 5)与IGSL (SEQ ID NO: 7)、IGST (SEQ ID NO:2)与HVPG (SEQ ID NO: 6)、VQII (SEQ ID NO: 4)与HVPG (SEQ ID NO: 6)、LDLS (SEQ IDNO: 5)与HVPG (SEQ ID NO: 6)和VQIV (SEQ ID NO: 7)与LDLS (SEQ ID NO: 5)的比率，可以提供有临床意义的信息以诊断tau蛋白病并指导治疗决定。在更进一步的实例中，可能期望确定一种或多种另外蛋白质的存在/不存在，和/或测量生物样品中的一种或多种另外蛋白质的浓度。
本公开内容的另一个方面提供了用于测量受试者中的tau蛋白病有关病理状况的方法，该方法包括在从受试者中获得的生物样品例如血液样品或CSF样品中，定量一个或多个中部结构域不依赖性MTBR tau种类，其中所述定量的中部结构域不依赖性MTRB-tau种类的量或其比率是受试者的脑中的tau蛋白病有关病理状况的表示。tau蛋白病可以是3R-tau蛋白病、混合性3R/4R-tau蛋白病或4R-tau蛋白病。疾病有关病理状况可以是tau沉积、tau翻译后修饰、脑和/或脑动脉中的淀粉样斑块、或本领域已知的其它病理特征。受试者可能具有或可能没有tau蛋白病的临床症状。
本公开内容的另一个方面提供了用于诊断受试者中的tau蛋白病的方法，该方法包括在从受试者中获得的生物样品例如血液样品或CSF样品中，定量一个或多个中部结构域不依赖性MTBR tau种类，并且当所述定量的中部结构域不依赖性MTBR tau种类相差约1.5σ或更多时，诊断tau蛋白病，其中σ是由对照群体中测量的正态分布定义的标准差，所述对照群体没有tau蛋白病的临床体征或症状，并且如通过PET成像和/或CSF中的Aβ42/40测量所测量的呈淀粉样蛋白阴性。tau蛋白病可以是3R-tau蛋白病、混合性3R/4R-tau蛋白病或4R-tau蛋白病。受试者可能具有或可能没有疾病的临床症状。
本公开内容的另一个方面提供了用于测量受试者中的疾病稳定性的方法，该方法包括在从受试者中获得的第一生物样品中，然后在从同一受试者中获得的第二生物样品中，定量一个或多个中部结构域不依赖性MTBR tau种类，其中所述第二生物样品在第一生物样品后(例如在几天、几周、几个月或几年后)获得，并且计算样品之间定量的MTBR tau种类的差异，其中所述第二样品中定量的MTBR tau种类的统计学显著增加指示疾病进展，所述第二样品中定量的MTBR tau种类的统计学显著降低指示疾病改善，而没有变化指示稳定疾病。受试者可能具有或可能没有疾病的临床症状。
本公开内容的另一个方面提供了用于治疗患有tau蛋白病的受试者的方法，该方法包括在从受试者中获得的生物样品例如血液样品或CSF样品中，定量一个或多个中部结构域不依赖性MTBR tau种类；并且向受试者提供治疗以改善疾病有关病理状况的测量和/或临床症状，其中所述受试者具有相差约1.5σ或更多的定量的MTBR tau种类，其中σ是由对照群体中测量的正态分布定义的标准差，所述对照群体没有tau蛋白病的临床体征或症状，并且如通过PET成像和/或CSF中的Aβ42/40测量所测量的呈淀粉样蛋白阴性。tau蛋白病可以是3R-tau蛋白病、混合性3R/4R-tau蛋白病或4R-tau蛋白病。疾病有关病理状况的测量可以是如通过MTBR tau种类的量和/或PET成像测量的tau沉积，如通过质谱法或其它合适的方法测量的tau翻译后修饰，如通过PET成像测量的脑或脑动脉中的淀粉样斑块，如通过CSF中的Aβ42/40测量的淀粉样斑块，或本领域已知的其它病理特征。临床症状可以是如通过临床验证的仪器(例如MMSE、CDR-SB等)测量的痴呆，或本领域已知的关于3R-、3R/4R-和4R-tau蛋白病的其它临床症状。
本发明的这些和其它方面以及迭代在下文更全面地描述。
附图说明
申请文件含有至少一张彩色照片。本专利申请公开的带彩色照片的副本将在要求和支付必要费用后由专利局提供。
图1是最长的人tau同种型(2N4R)的示意图。N末端(N term)、中部结构域(middomain)、MTBR和C末端(C term)对于该同种型得到鉴定，并且对于其它tau同种型(例如2N3R、1NR4、1N3R、0N4R和0N3R)，将以可预测的方式变化。
图2A是说明了本公开内容的几种方法的示意图。在蓝框(右)内详述的方法是一种方法。红框(左)和蓝框(右)的组合是另一种方法。
图2B是说明了本公开内容的几种方法的示意图。在蓝框(右)内详述的方法是一种方法。红框(左)和蓝框(右)的组合是另一种方法。
图3A是关于定量来自CSF的单一测试样品的tau肽的能力，比较了三种样品处理方法的作用的图。CSF的测试样品并非来自单一个体，并且与CSF相关的疾病状态也不可用。Tau-441肽在x轴上进行鉴定，并且14N/15N比率在y轴上。显示了由抗体HJ8.5和Tau1 (各自描绘为“Y”)识别的表位的相对定位。在通过IP方法处理的样品中(绿色三角形)，可以检测到来自MTBR区域的tau的胰蛋白酶肽，但具有比从N末端到中部结构域的tau的胰蛋白酶肽低得多的信号，并且在来自慢性神经退行性疾病包括AD和健康志愿者的人CSF中无法定量。相比之下，这些肽在通过CX方法(蓝色圆圈)或IP后-CX方法(红色正方形)处理的样品中容易地检测到。
图3B是描绘了样品处理可以如何影响通过下游方法检测到的tau蛋白群体的图示。在IP方法中(以绿色虚线为界)，使具有由抗体(分别以HJ8.5和Tau1为例)识别的N末端和中部结构域表位的tau种类免疫沉淀。在IP后-CX方法中(以红色虚线为界)，在免疫沉淀和沉淀后存在的tau种类没有由免疫沉淀中使用的抗体识别的表位(由“MTBR-C”图示为例)，或者表位是无法接近的(以非线性构象的tau的图示为例)。无需先前免疫沉淀而发生的CX方法(以蓝色虚线为界)产生具有起因于IP方法和IP后-CX方法的tau种类的样品。
图4是在LOAD100和LOAD60 CSF样品中测量的pT217% (x轴)相对于Aβ42/40浓度(y轴)的图。水平虚线划分了由CSF Aβ42/40浓度定义的淀粉样蛋白状态(CSF Aβ42/40 >0.1389 = 淀粉样蛋白阳性，并且CSF Aβ42/40 < 0.1389 = 淀粉样蛋白阴性)。如所示的，p217%与由该截断定义的淀粉样蛋白状态极其良好地相关联。
图5以图形方式描绘了CSF样品中通过质谱法定量的tau的两种胰蛋白酶肽TPPS和HVPG的量，所述CSF样品通过实施例1中描述的IP方法(IP_TPPS，左图)、或者通过实施例1和2中描述的IP后-CX方法(IP后_HVPG，右图)进行处理。CSF样品通过CDR分数和淀粉样蛋白状态进行鉴定。两个图之间的图形描绘了tau-441中的胰蛋白酶肽的相对定位。NS - 不显著。
图6A以图形方式描绘了在通过实施例1和2中描述的IP后-CX方法处理的CSF样品中，tau的胰蛋白酶肽HVPG相对于Aβ42/40的量。CSF样品通过淀粉样蛋白状态进行鉴定 -淀粉样蛋白阳性(红色)或淀粉样蛋白阴性(蓝色)。数据显示了在通过实施例1和2中描述的IP后-CX方法处理的CSF样品中的HVPG测量概括了脑中的淀粉样蛋白状态，如通过与按照Aβ42/40的淀粉样蛋白状态的紧密关联性证明的。
图6B以图形方式描绘了在通过实施例1和2中描述的IP后-CX方法处理的CSF样品中，tau的胰蛋白酶肽HVPG相对于pT217%的量。CSF样品通过淀粉样蛋白状态进行鉴定 - 淀粉样蛋白阳性(红色)或淀粉样蛋白阴性(蓝色)。数据显示了在通过实施例1和2中描述的IP后-CX方法处理的CSF样品中的HVPG测量概括了脑中的淀粉样蛋白状态，如通过与按照pT217%的淀粉样蛋白状态的紧密关联性证明的。
图7A、图7B和图7C以图形方式描绘了在通过实施例1和2中描述的IP后-CX方法处理的CSF样品中，tau的三种胰蛋白酶肽LQTA (图7A)、HVPG (图7B)和IGSL (图7C)的量。CSF样品按CDR分数和淀粉样蛋白状态分组。数据显示了即使在无症状阶段，与淀粉样蛋白阴性受试者相比，LQTA在淀粉样蛋白阳性受试者中增加；尤其是在无症状阶段，与淀粉样蛋白阴性受试者相比，HVPG在淀粉样蛋白阳性受试者中增加；并且与淀粉样蛋白阴性受试者相比，IGSL在淀粉样蛋白阳性受试者中增加，且在有症状阶段后降低。
图8A、图8B和图8C分别以图形方式描绘了在通过实施例1和2中描述的IP后-CX方法处理的CSF样品中，tau的三种胰蛋白酶肽LQTA (图8A)、HVPG (图8B)和IGSL (图8C)的量。来自个别患者的纵向样品用通过符号指示的淀粉样蛋白状态显示(CDR0=黑色圆圈，CDR0.5=蓝色三角形，CDR1=红色正方形，CDR2=紫色倒三角形)。配对t检验用于来自个别参与者的第1次就诊和第2次就诊结果。淀粉样蛋白阳性组在每个患者的方向上显示了显著变化。同样值得注意的是对于参与者A (由粗体红线表示)观察到的变化，所述参与者A的tau-PET信号很高(>2 SUVR)，并且CDR分数从CDR1变为CDR2。对于该患者，由于tau病理状况的进展，LQTA增加(图8A)，HVPG降低(图8B)，且IGSL降低(图8C)。
图9A、图9B和图9C以图形方式描绘了在通过实施例1和2中描述的IP后-CX方法处理的CSF样品中，tau的三种胰蛋白酶肽的量相对于样品由其获得的受试者的CDR-SB分数。tau的三种胰蛋白酶肽分别是LQTA、HVPG和IGSL。淀粉样蛋白阳性受试者为蓝色圆圈；淀粉样蛋白阴性受试者为红色正方形。如通过所附统计分析显示的，仅LQTA与CDR-SB显著相关联。
图10A、图10B和图10C以图形方式描绘了在通过实施例1和2中描述的IP后-CX方法处理的CSF样品中，tau的三种胰蛋白酶肽的量相对于样品由其获得的受试者的简易精神状态检查表(MMSE)分数。tau的三种胰蛋白酶肽分别是LQTA、HVPG和IGSL。淀粉样蛋白阳性受试者为蓝色圆圈；淀粉样蛋白阴性受试者为红色正方形。如通过所附统计分析显示的，仅LQTA与MMSE显著相关联。
图11A、图11B和图11C以图形方式描绘了在通过实施例1和2中描述的IP后-CX方法处理的CSF样品中，tau的三种胰蛋白酶肽的量相对于样品由其获得的受试者的Tau-PET分数。tau的三种胰蛋白酶肽分别是LQTA、HVPG和IGSL。淀粉样蛋白阳性受试者为蓝色圆圈；淀粉样蛋白阴性受试者为红色正方形。如通过所附统计分析显示的，仅LQTA与Tau-PET显著相关联。MTBR tau的其它胰蛋白酶肽并非如此。
图12A和图12B以图形方式描绘了在通过实施例1和2中描述的IP后-CX方法处理的CSF样品中，tau的胰蛋白酶肽LQTA的量相对于CDR-SB (图12A)和MMSE (图12B)。数据显示了LQTA显示与认知功能的显著关联性，如通过认知损害的两种不同测量评估的。
图13A以图形方式描绘了通过IP方法(x轴)和IP后-CX方法(y轴)处理的样品中，tau的胰蛋白酶肽LQTA的量。淀粉样蛋白阳性受试者用红色符号标识；淀粉样蛋白阴性受试者用蓝色符号标识。如通过所附统计分析显示的，仅“MTBR有关的LQTA” (在通过IP后-CX方法处理的样品中测量的)显示了在淀粉样蛋白阳性组中比在淀粉样蛋白阴性组中更多的增加。
图13B和图13C以图形方式描绘了如实施例1和2中所述，分别通过IP后-CX方法或IP方法处理的CSF样品中，tau的胰蛋白酶肽LQTA的量。CSF样品按CDR分数和淀粉样蛋白状态分组。数据显示了，仅对于“MTBR有关的LQTA”观察到LQTA特异性特性(即，在有症状阶段后的线性增加)。数据表示为个别结果(图)和平均值(条)。统计检验中的显著性：****p <0.001，***p < 0.001，**p < 0.01，*p < 0.05。NS = 不显著。统计学差异用单因素ANOVA进行评价，伴随使用Benjamini-Hochberg错误发现率(FDR)方法的多重比较校正，其中FDR设定为5%。
图14是显示了接受者操作曲线(ROC)的图，其比较了在IP方法(蓝色(底部)线)或IP后-CX方法(红色(顶部)线)之后，通过质谱法测量的tau的胰蛋白酶肽LQTA用于确定淀粉样蛋白状态的灵敏度和特异性。曲线显示了IP后-LQTA (MTBR有关的LQTA)显然比IP-LQTA更好地区分淀粉样蛋白状态。
图15A和图15B显示了IGSL/HVPG的比率加强了区分力。图15A以图形方式描绘了通过实施例1和实施例2中描述的IP后-CX方法处理的CSF样品中，表示为比率(IGSL/LQTA)的tau的胰蛋白酶肽IGSL和LQTA的量。CSF样品按CDR分数和淀粉样蛋白状态分组。图15B以图形方式显示了IGSL/LQTA比率与pT205%之间的关系。pT205%如先前所述(Barthélemy，N.R.，Li，Y.，Joseph-Mathurin，N.等人Nat Med 26，398–407 (2020))进行测量。IGSL/LQTA显示了与pT205非常紧密的关联性，所述pT205在接近于AD发作时进行调节。
图15C和图15D显示了IGSL/HVPG的比率加强了区分力。图15C以图形方式描绘了通过实施例1和实施例2中描述的IP后-CX方法处理的CSF样品中，表示为比率(IGSL/HVPG)的tau的胰蛋白酶肽IGSL和HVPG的量。CSF样品按CDR分数和淀粉样蛋白状态分组。图15D以图形方式显示了IGSL/LQTA比率与pT217%之间的关系。IGSL/HVPG显示了与pT217非常紧密的关联性，所述pT217概括了淀粉样蛋白状态。
图16是显示了tau病理状况通过阿尔茨海默氏病的不同阶段进化的图示。在具有确定性阿尔茨海默氏病突变的一组参与者中，测量四种不同的可溶性tau种类和不溶性tau，我们显示了在约40年的过程中(x轴)，展开的tau有关变化(y轴)，并且基于疾病的阶段和其它可测量的生物标记物而不同。从原纤维淀粉样蛋白病理状况的发展起始，在位置217(紫色)和181 (蓝色)处的磷酸化开始增加。随着神经元功能障碍的增加(基于代谢变化)，在位置205 (绿色)处的磷酸化开始连同可溶性tau (橙色)一起增加。最后，随着神经变性的发作(基于脑萎缩和认知下降)，tau PET缠结(红色)开始发展，而217和181的磷酸化开始降低。总之，这突出显示了可溶性和聚集性tau在疾病过程中的动态和分歧模式以及与淀粉样蛋白病理状况的密切关系。
图17是理论模型的说明，其显示了MTBR tau的不同区域对切割的可接近性在阿尔茨海默氏病(AD)进展过程中可以如何变化，并且为何包含SEQ ID NO: 3 (LQTAPVPMPDLK)的氨基酸序列的MTBR tau种类是跨越所有AD阶段的tau病理状况的良好替代物。在临床前的AD阶段，脑tau聚集物是不成熟的，允许蛋白酶的更大接近。包含MTBR tau-243、MTBRtau-299和MTBR tau-354的MTBR tau种类被分泌到CSF内。然而，随着tau聚集物伴随疾病进展而成熟并形成越来越刚性的核心，蛋白酶对MTBR tau-354以及随后MTBR tau-299的接近降低，并且包含MTBR tau-354以及随后MTBR tau-299的MTBR种类在CSF中稳定。然而，MTBRtau-243保持暴露，使在所有疾病阶段的蛋白酶消化和释放到CSF内成为可能。观察到这三个种类在CSF中的不平衡，作为脑tau聚集物形成的反映。应注意：在该图示中，没有描绘MTBR tau种类之间的大小差异。
图18A是来自tau的胰蛋白酶肽(灰色条)的示意图，所述肽在实施例3中进行定量，并且在图18B和图18C中进一步讨论。
图18B和图18C是显示了与对照脑提取物相比，包含MTBR tau-243、299和354的脑MTBR tau种类在聚集的阿尔茨海默氏病的脑不溶性提取物中富集的图，确认了MTBR tau在阿尔茨海默氏病的脑中特异性沉积。该图显示了来自(图18B)对照和阿尔茨海默氏病的脑(在发现队列中n=2，具有6 - 8个脑区域样品/组)，以及(图18C)来自对照(淀粉样蛋白阴性，n=8)、极轻度至中度阿尔茨海默氏病(AD) (淀粉样蛋白阳性，CDR=0.5 – 2，n=5)、以及重度AD脑(淀粉样蛋白阳性，CDR=3，n=7) (验证队列中的总n=20)的tau肽的富集概况。tau肽的相对丰度相对于中部结构域(残基181-190)肽进行定量用于内部标准化。与对照相比，含有微管结合区(MTBR)结构域的上游区域(残基243-254，MTBR tau-243)和重复区域2(R2)至R3和R4 (分别为残基299-317，MTBR tau-299和354-369，MTBR tau-354)的种类在来自阿尔茨海默氏病的脑的不溶性级分中高度富集，并且按疾病进展的临床阶段而特异性富集，如通过CDR测量的。MTBR tau-299和MTBR tau-354定位于细丝核心内部，而MTBR tau-243定位于阿尔茨海默氏病聚集物的核心外部(Fitzpatrick等人，2017)。值得注意的是，潜在地由于高度磷酸化，残基195-209在阿尔茨海默氏病的脑中降低。数据表示为箱线图，用Tukey方法描述中值、四分位数间隔、最小值、最大值和离群值的个别点。统计检验中的显著性：****p < 0.001，***p < 0.001，**p < 0.01，*p < 0.05。
图19A是来自tau的胰蛋白酶肽(灰色条)、以及抗体HJ8.5和Tau1的一般结合位点的示意图，所述肽在实施例3中进行定量，并且在图19B和图19C中进一步讨论。
图19B是显示了对照人CSF中的tau概况的图。通过集中于N末端至中部结构域tau的Tau1/HJ8.5免疫沉淀，定量来自淀粉样蛋白阴性和CDR=0患者的横断面队列(n=30)的对照人CSF中的tau肽。为了定量含有微管结合区(MTBR)和C末端区域的种类，对免疫沉淀后的CSF样品进行化学提取并进行序贯分析。使用Tau1/HJ8.5免疫沉淀方法(蓝色圆圈)，肽回收在残基222后急剧降低；因此，通过该方法仅定量了N末端至中部结构域tau (残基6-23至243-254)肽(Sato等人，2018)。相比之下，免疫沉淀后CSF的化学提取方法(红色正方形)允许在0.4 – 7 ng/mL之间的浓度下定量包括MTBR至C末端区域的tau的整个区域。数据表示为平均值。
图20A、图20B和图20C是显示了在来自横断面队列的IP后-CX CSF中，中部结构域不依赖性MTBR tau-243 (图20A)、中部结构域不依赖性MTBR tau-299 (图20B)和中部结构域不依赖性MTBR tau-354 (图20C)的量的图。中部结构域不依赖性MTBR tau-243、中部结构域不依赖性MTBR tau-299和中部结构域不依赖性MTBR tau-354显示对淀粉样斑块和临床痴呆阶段的不同概况。淀粉样蛋白阴性CDR=0 (对照，n=30)，淀粉样蛋白阳性CDR=0 (临床前AD，n=18)，淀粉样蛋白阳性CDR=0.5 (极轻度AD，n=28)，淀粉样蛋白阳性CDR≥1 (轻度-中度AD，n=12)和淀粉样蛋白阴性CDR≥0.5 (非AD认知损害，n=12)。中部结构域不依赖性MTBR tau-243显示了随着阿尔茨海默氏病进展在所有临床阶段自始至终的持续增加。中部结构域不依赖性MTBR tau-299和中部结构域不依赖性MTBR tau-354浓度类似地增加，直到极轻度阿尔茨海默氏病阶段(淀粉样蛋白阳性和CDR=0.5)，但随后在CDR≥1时饱和(MTBRtau-299)或降低(MTBR tau-354)。以红色或蓝色字体的p值分别指示了显著增加或降低。数据表示为个别结果(图)和平均值(条)。统计检验中的显著性：****p < 0.001，***p <0.001，**p < 0.01，*p < 0.05。NS = 不显著。
图21A、图21B和图21C是显示了在淀粉样蛋白阴性(-)或阳性(+)患者(来自纵向队列的总n=28)的CSF中，(图21A)中部结构域不依赖性MTBR tau-243、(图21B)中部结构域不依赖性MTBR tau-299和(图21C)中部结构域不依赖性MTBR tau-354的纵向变化率(ng/mL/年)的图。淀粉样蛋白阳性组进一步分为各种CDR变化，包括CDR=0 - 0 (n=7)、CDR=0 - 0.5(n=2)、CDR=0 - 1 (n=1)、CDR=0.5 - 0.5 (n=2)、CDR=0.5 - 1 (n=1)和CDR=1 - 2 (n=1，参与者A)。虽然淀粉样蛋白阴性组中的参与者并未显示显著的纵向变化(因为平均值接近于零)，但淀粉样蛋白阳性组中的大多数参与者显示MTBR tau浓度纵向增加。值得注意的是，在阿尔茨海默氏病临床发作后具有最大认知变化的参与者A (CDR=1至2)证实了，随着轻度AD (CDR=1)到中度AD (CDR=2)的进展，仅CSF MTBR tau-243增加，而MTBR tau-299和354降低。这些数据显示了CSF中部结构域不依赖性MTBR tau种类随着阿尔茨海默氏病临床阶段的推进而纵向增加。
图22A、图22B和图22C是显示了在IP后-CX CSF (来自tau PET队列的对照n=15和阿尔茨海默氏病(AD) n=20)中，(x轴) tau PET (AV-1451) SUVR以及(y轴)中部结构域不依赖性(图22A) MTBR tau-243、(图22B) MTBR tau-299和(图22C) MTBR tau-354浓度的图。空心圆圈：对照，实心正方形：AD。中部结构域不依赖性MTBR tau-243显示与tau PETSUVR的最显著关联性(r=0.7588，p<0.0001)。这些数据显示包含SEQ ID NO: 3(LQTAPVPMPDLK)的CSF中部结构域不依赖性MTBR tau种类与tau缠结的tau PET SUVR测量高度相关联，而其它中部结构域不依赖性MTBR tau区域与tau缠结具有较低的关联性。
图23A和图23B以图形方式描绘了与对照脑提取物相比，脑MTBR tau-243、MTBRtau-299和MTBR tau-354在阿尔茨海默氏病的脑可溶性提取物中并未富集。图23A显示了来自对照和阿尔茨海默氏病的脑(在发现队列中n=2，具有8 - 10个脑区域样品/组)的tau肽的富集概况，并且图23B显示了来自验证队列(总n=20)中的对照(淀粉样蛋白阴性，n=8)、极轻度至中度阿尔茨海默氏病(AD) (淀粉样蛋白阳性，CDR=0.5 – 2，n=5)、以及重度AD脑(淀粉样蛋白阳性，CDR=3，n=7)的tau肽的富集概况。tau肽的相对肽丰度相对于中部结构域(残基181-190)肽进行定量用于内部标准化。与在阿尔茨海默氏病的脑中增加的不溶性MTBRtau种类相形成对比，对于在可溶性tau种类中含有微管结合区(MTBR)结构域的tau种类没有观察到变化(图18)。数据表示为箱线图，用Tukey方法描述中值、四分位数间隔、最小值、最大值和离群值的个别点。统计检验中的显著性：**p < 0.01，*p < 0.05。
图24是显示了脑不溶性提取物中MTBR tau-354与tau368相关联的图，提示了每个种类并未由于tau病理状况的进展而区别。使用发现队列样品(总共23个脑样品，来自阿尔茨海默氏病#1参与者的6个脑区域、来自阿尔茨海默氏病#2参与者的8个脑区域、来自对照#1参与者的5个脑区域、来自对照#2参与者的4个脑区域)，对来自对照和阿尔茨海默氏病患者的脑不溶性提取物中的MTBR tau-354和tau368种类，进行质谱法分析。MTBR tau-354(残基354-369)及其截短形式tau368 (残基354-368)，在脑不溶性提取物中显示出紧密关联性(斯皮尔曼r=0.9783)。
图25A、图25B、图25C、图25D、图25E和图25F是显示了在通过IP后-CX方法处理后，随后为质谱法(MS)分析，人CSF样品中的MTBR tau的胰蛋白酶肽的定量的图。显示了中部结构域不依赖性MTBR tau-243 (图25A，图25D)、中部结构域不依赖性MTBR tau-299 (图25B，图25E)和中部结构域不依赖性MTBR tau-354 (图25C，图25F)的提取的MS层析图。人CSF得自来自横断面队列的淀粉样蛋白阳性和CDR=0.5的极轻度阿尔茨海默氏病参与者。图25A、图25B和图25C显示了来自内源性胰蛋白酶肽的峰，而图25D、图25E和图25F显示了来自内部标准(15N标记的tau)的峰。X轴和Y轴分别指示了每个峰的保留时间和MS强度。
图26A、图26B、图26C、图26D、图26E、图26F、图26G、图26H、图26I、图26J和图26K是显示了在通过IP方法的样品处理后，随后为MS分析，在人CSF中的N末端tau和中部结构域tau的胰蛋白酶肽浓度的图。N末端和中部结构域的CSF tau种类区别非常早期的痴呆与正常，但与痴呆阶段并不相关联。来自横断面队列内的各组的CSF中的tau种类，残基(图26A)6-23、(图26B) 25-44、(图26C)45-67、(图26D) 68-87、(图26E) 88-126、(图26F) 151-155、(图26G) 181-190、(图26H) 195-209、(图26I) 212-221、(图26J) 226-230和(图26K) 243-254浓度(残基编号基于tau-441)。淀粉样蛋白阴性CDR=0 (对照，n=29)，淀粉样蛋白阳性CDR=0 (临床前AD，n=18)，淀粉样蛋白阳性CDR=0.5 (极轻度AD，n=27)，淀粉样蛋白阳性CDR≥1 (轻度-中度AD，n=12)，以及淀粉样蛋白阴性CDR≥0.5 (非AD临床损害，n=12)。这些tau种类使用Tau1/HJ8.5免疫沉淀方法(IP方法)进行分离。以红色字体的p值指示显著性。数据表示为个别结果(图)和平均值(条)。统计检验中的显著性：****p < 0.001，***p <0.001，**p < 0.01，*p < 0.05。NS = 不显著。
图27A、图27B、图27C、图27D、图27E、图27F、图27G和图27H是显示了在通过IP后-CX方法的样品处理后，随后为MS分析，在人CSF中的MTBR tau的胰蛋白酶肽浓度的图。独特的阿尔茨海默氏病淀粉样蛋白和临床分期模式对于CSF中的中部结构域不依赖性MTBR tau种类是特异性的。仅中部结构域不依赖性MTBR tau-243区别更晚期的临床阶段。使用来自横断面队列内的参与者的免疫沉淀后样品的化学提取获得CSF中的tau种类，残基(图27A)243-254 (MTBR tau-243)、(图27B) 260-267、(图27C) 275-280、(图27D) 282-290、(图27E) 299-317 (MTBR tau-299)、(图27F) 354-369 (MTBR tau-354)、(图27G) 386-395和(图27H) 396-406 (残基编号基于tau-441)。淀粉样蛋白阴性CDR=0 (对照，n=30)，淀粉样蛋白阳性CDR=0 (临床前AD，n=18)，淀粉样蛋白阳性CDR=0.5 (极轻度AD，n=28)，淀粉样蛋白阳性CDR≥1 (轻度-中度AD，n=12)，以及淀粉样蛋白阴性CDR≥0.5 (非AD临床损害，n=12)。以红色或蓝色字体的p值分别指示了显著增加或降低。数据表示为个别结果(图)和平均值(条)。统计检验中的显著性：****p < 0.001，***p < 0.001，**p < 0.01，*p < 0.05。NS = 不显著。
图28A、图28B、图28C、图28D、图28E、图28F、图28G、图28H、图28I和图28J是显示了在通过IP后-CX方法的样品处理后，随后为MS分析，在人CSF中的N末端tau和中部结构域tau的胰蛋白酶肽浓度的图。不管纯化方法如何，N末端和中部结构域CSF tau种类与痴呆阶段并不相关联(还参见图26)。来自横断面队列内的各组的CSF中的tau种类，残基(图28A) 6-23、(图28B) 25-44、(图28C)45-67、(图28D) 68-87、(图28E) 88-126、(图28F) 151-155、(图28G) 181-190、(图28H) 195-209、(图28I) 212-221和(图28J) 226-230浓度。淀粉样蛋白阴性CDR=0 (对照，n=29)，淀粉样蛋白阳性CDR=0 (临床前AD，n=18)，淀粉样蛋白阳性CDR=0.5 (极轻度AD，n=27)，淀粉样蛋白阳性CDR≥1 (轻度-中度AD，n=12)，以及淀粉样蛋白阴性CDR≥0.5 (非AD临床损害，n=12)。使用Tau1/HJ8.5免疫沉淀方法，随后为免疫沉淀后的CSF的化学提取(IP后-CX)，来分离这些tau种类。对于N末端至中部结构域tau种类，显示了来自免疫沉淀后CSF的免疫沉淀方法和化学提取方法的浓度之和(作为总浓度)。以红色字体的p值指示了统计学显著性。数据表示为个别结果(图)和平均值(条)。统计检验中的显著性：****p < 0.001，***p < 0.001，**p < 0.01，*p < 0.05。NS = 不显著。
图28K是显示了含有残基243-254的tau种类的总浓度(来自IP方法和IP后-CX方法的总和浓度)的图。
图29以图形方式显示了在CSF中，中部结构域不依赖性MTBR tau-354与中结构域不依赖性tau368相关联。CSF通过如实施例3中一般描述的IP后-CX方法进行处理。中部结构域不依赖性MTBR tau-354 (残基354-369)及其截短形式tau368 (残基354-368)展示了紧密的关联性(斯皮尔曼r=0.8382)。结果得自横断面队列样品(n=100，包括所有临床阶段)。
图30A、图30B和图30C是显示了CSF中部结构域不依赖性MTBR tau-243与临床痴呆评级 – 总分(CDR-SB)高度相关联，而中部结构域不依赖性MTBR tau-299和中部结构域不依赖性MTBR tau-354并非如此的图。CDR-SB与CSF中的(图30A)中部结构域不依赖性MTBRtau-243、(图30B)中部结构域不依赖性MTBR tau-299、以及(图30C)中部结构域不依赖性MTBR tau-354浓度相关联。来自淀粉样蛋白阳性组的CSF中的中部结构域不依赖性MTBRtau-243显示了与CDR-SB的高度关联性(r=0.5562，p<0.0001)。结果得自横断面队列样品(淀粉样蛋白阴性n=42和淀粉样蛋白阳性n=58)。
图31A、图31B和图31C是显示了与中部结构域不依赖性MTBR tau-299和中部结构域不依赖性MTBR tau-354相比，CSF中部结构域不依赖性MTBR tau-243与简易精神状态检查表(MMSE)更高度相关联的图。MMSE)与CSF中的(图31A)中部结构域不依赖性MTBR tau-243、(图31B)中部结构域不依赖性MTBR tau-299、以及(图31C)中部结构域不依赖性MTBRtau-354浓度相关联。来自淀粉样蛋白阳性组的CSF中的中部结构域不依赖性MTBR tau-243显示了与MMSE的高度关联性(r=0.5433，p<0.0001)。结果得自横断面队列样品(淀粉样蛋白阴性n=42和淀粉样蛋白阳性n=58)。
图32A、图32B和图32C是显示了CSF中部结构域不依赖性MTBR tau-243、中部结构域不依赖性MTBR tau-299、中部结构域不依赖性MTBR tau-354随着阿尔茨海默氏病临床阶段的推进而纵向增加的图。显示了淀粉样蛋白阴性(-)或阳性(+)患者的CSF中的中部结构域不依赖性(图32A) MTBR tau-243、(图32B) MTBR tau-299和(图32C) MTBR tau-354的tau浓度的纵向变化。黑色圆圈：CDR=0，蓝色三角形：CDR=0.5，红色正方形：CDR=1，紫色倒三角形：CDR=2。具有稳定的(或降低的) CDR轨迹的参与者由虚线表示。在第1次就诊和第2次就诊之间具有CDR增加的参与者由实线表示。淀粉样蛋白阳性组中的粗体红线显示了在阿尔茨海默氏病发作后具有最大认知变化(CDR=1至2)的特定参与者(参与者A)的纵向轨迹，指示了CSF MTBR tau-243即使在轻度AD (CDR=1)至中度AD (CDR=2)中也是增加的。对于第1次就诊和第2次就诊(淀粉样蛋白阴性n=14和淀粉样蛋白阳性n=14)通过配对t检验评估了统计学显著性。**p < 0.01. NS = 不显著。
图33是说明本公开内容的方法的示意图。
图34A、图34B和图34C是描绘了在通过IP后-CX方法(上)相对于IP后-CX方法(下)处理的CSF样品中，所测量的胰蛋白酶肽LQTA (图34A)、HVPG (图34B)和IGSL (图34C)的量的图。
图35A以图形方式显示了在通过IP后-IP方法(y轴)相对于IP后-CX方法(x轴)处理的样品中，所测量的胰蛋白酶肽LQTA (左)、IGST (中)和VQII (右)的量。图上方的插图显示了每种胰蛋白酶肽在tau-441中的相对定位。两个轴均显示了绝对浓度(ng/ mL)。
图35B以图形方式显示了在通过IP后-IP方法(y轴)相对于IP后-CX方法(x轴)处理的样品中，所测量的胰蛋白酶肽LDLS (左)、HVPG (中)和IGSL (右)的量。图上方的插图显示了每种胰蛋白酶肽在tau-441中的相对定位。两个轴均显示了绝对浓度(ng/ mL)。
图36A以图形方式显示了在通过IP后-IP方法(y轴)相对于IP后-CX方法(x轴)处理的样品中，所测量的胰蛋白酶肽LQTA (左)、IGST (中)和VQII (右)的量。图上方的插图显示了每种胰蛋白酶肽在tau-441中的相对定位。两个轴均显示了绝对浓度(ng/ mL)。从对照受试者中获得的样品为蓝色圆圈；从没有认知损害(CDR<0.5)的淀粉样蛋白阳性受试者中获得的样品为红色正方形；并且从具有认知损害(CDR>0.5)的淀粉样蛋白阳性受试者中获得的样品为黑色三角形。
图36B以图形方式显示了在通过IP后-IP方法(y轴)相对于IP后-CX方法(x轴)处理的样品中，所测量的胰蛋白酶肽LDLS (左)、HVPG (中)和IGSL (右)的量。图上方的插图显示了每种胰蛋白酶肽在tau-441中的相对定位。两个轴均显示了绝对浓度(ng/ mL)。从对照受试者中获得的样品为蓝色圆圈；从没有认知损害(CDR<0.5)的淀粉样蛋白阳性受试者中获得的样品为红色正方形；并且从具有认知损害(CDR>0.5)的淀粉样蛋白阳性受试者中获得的样品为黑色三角形。
图37A是各种全长tau同种型的图示。指示了tau的几种胰蛋白酶肽的相对定位(例如LQTA、IGST、VQII、LDLS、HVPG、IGSL、VQIV)。每个“Y”表示在N末端(左)、中部结构域(中)和MTBR (右)区域内特异性结合的抗体。tau的主要切割位点(其在tau-441的氨基酸224处)描绘为虚线。
图37B以图形方式显示了在从对照受试者(左，蓝色圆圈)和患有非AD tau蛋白病的受试者(右，绿色圆圈)中获得的样品中，表示为比率的胰蛋白酶肽VQIV和LDLS的量，如通过经由实施例1中描述的IP方法的样品处理之后的LC-MS确定的。ns不显著；Tukey氏多重比较检验。
图37C以图形方式显示了在从对照受试者(左，蓝色圆圈)和患有非AD tau蛋白病的受试者(右，绿色圆圈)中获得的样品中，表示为比率的胰蛋白酶肽VQIV和LDLS的量，如通过经由实施例4中描述的IP后-IP方法的样品处理之后的LC-MS确定的。
图38以图形方式显示了在从对照受试者(蓝色圆圈)和患有非AD tau蛋白病的受试者(绿色三角形)中获得的样品中，胰蛋白酶肽VQIV (x轴)和LDLS (y轴)的量，如通过经由实施例4中描述的IP后-IP方法的样品处理之后的LC-MS确定的。**** p<0.0001；Tukey氏多重比较检验。
图39以图形方式显示了在从对照受试者(左，蓝色圆圈) 、患有AD的受试者(中，红色圆圈)和患有非AD tau蛋白病的受试者(右，绿色圆圈)中获得的样品中，表示为比率的胰蛋白酶肽VQIV和LDLS的量，如通过经由实施例4中描述的IP后-IP方法的样品处理之后的LC-MS确定的。ns不显著；**** p<0.0001；Tukey氏多重比较检验。
图40A、图40B、图40C、图40D、图40E和图40F以图形方式显示了在从对照受试者(蓝色圆圈)、患有AD的受试者(红色正方形)和患有非AD tau蛋白病的受试者(绿色三角形)中获得的样品中，tau的胰蛋白酶肽的量的比较，如通过经由实施例4中描述的IP后-IP方法的样品处理之后的LC-MS确定的。tau的胰蛋白酶肽是图40A中的IGST (x轴)和VQII (y轴)，图40B中的LDLS (x轴)和VQII (y轴)，图40C中的IGSL (x轴)和HVPG (y轴)，图40E中的IGST(x轴)和HPVG (y轴)，图40E中的VQII (x轴)和HPVG (y轴)，以及图40F中的IGST (x轴)和HPVG (y轴)。两个轴均显示了绝对浓度(ng/ mL)。
图41以图形方式显示了在从患有非AD tau蛋白病的受试者中获得的样品中，tau的胰蛋白酶肽IGST相对于HVPG (左上)、VQII相对于HVPG (右上)、以及LDLS相对于HVPG(下)的量的比较，如通过经由实施例4中描述的IP后-IP方法的样品处理之后的LC-MS确定的。在右侧上的图例标识了对于每个受试者的非AD tau蛋白病的诊断。两个轴均显示了绝对浓度(ng/ mL)。
图42A、图42B和图42C以图形方式显示了在从对照受试者(蓝色圆圈)、患有AD的受试者(红色正方形)和患有非AD tau蛋白病的受试者(绿色三角形)中获得的样品中，tau的胰蛋白酶肽IGST相对于IGSL (图42A)、VQII相对于IGSL (图42B)、以及LDLS相对于IGSL(图42C)的量的比较，如通过经由实施例4中描述的IP后-IP方法的样品处理之后的LC-MS确定的。两个轴均显示了绝对浓度(ng/ mL)。
图43A是tau的MTBR区域的图示。显示了胰蛋白酶肽IGST、VQII、LDLS、HVPG和IGSL的相对位置，其也是抗体77G7特异性结合的表位的相对位置。
图43B、图43C、图43D和图43E以图示方式显示了在从非AD受试者(左条)、患有AD的受试者(右条)中获得的样品中，tau的胰蛋白酶肽IGSL/IGST (图43B)、IGSL/VQII (图43C)、IGSL/LDLS (图43D)和IGSL/HVPG (图43E)的比率，如通过经由实施例4中描述的IP后-IP方法的样品处理之后的LC-MS确定的。对于非AD受试者，蓝色指示患有PSP的受试者，绿色指示患有FTD的受试者，红色指示患有CBD的受试者，并且紫色指示患有PSP-CBD连续的受试者。统计学显著性通过非配对t检验伴随Welch氏校正进行确定。
图44A、图44B、图44C、图44D和图44E以图形方式显示了在从非AD受试者(蓝色)和患有AD的受试者(红色)中获得的样品中，tau的胰蛋白酶肽IGSL相对于IGST (图44A)、IGSL相对于VQII (图44B)、IGSL相对于LDLS (图44C)、VQII相对于IGST (图44D)、VQII相对于LDLS (图44E)、IGSL相对于HVPG (图43E)的量的比较，如通过经由实施例4中描述的IP后-IP方法的样品处理之后的LC-MS确定的。在图44A、图44B和图44C中，非AD受试者显示了散点图，而在图44D、图44E和图44F中，AD和非AD显示了等同的关联性。
图45显示了如在来自患有AD和非AD tau蛋白病的受试者的CSF中测量的，tau的各种胰蛋白酶肽中的关系。方框中突出显示的数据提示了用于区分AD和非AD tau蛋白病的区别点。
图46是描述CSF tau如何区分非AD tau蛋白病的假设的图示。如所描绘的，在CSF中，非AD tau蛋白病含有(1)比AD更少的R1-R2和(2)更多的R3-R4，作为脑tau沉积的反映。
图47以图形方式显示了脑不溶性tau的各种胰蛋白酶肽的量。
图48A、图48B、图48C和图48D以图形方式显示了在从对照受试者(左条)、患有AD的受试者(中条)和非AD受试者(右条)中获得的样品中，tau的胰蛋白酶肽IGSL/IGST (图48A)、IGSL/VQII (图48B)、IGSL/LDLS (图48C)和IGSL/HVPG (图48D)的比率，如通过经由实施例4中描述的IP后-IP方法的样品处理之后的LC-MS确定的。对于非AD受试者，黑色三角形指示具有遗传上确认的P301L FTLD (4R-tau蛋白病)的受试者，并且黑色正方形指示具有遗传上确认的R406W FTLD (3R/4R混合)的受试者。
图49A、图49B、图49C、图49D、图49E和图49F以图形方式显示了在从对照受试者(蓝色)、患有AD的受试者(红色)和非AD受试者(绿色)中获得的CSF样品中，tau的胰蛋白酶肽IGSL相对于IGST (图49A)、IGSL相对于VQII (图49B)、IGSL相对于LDLS (图49C)、VQII相对于IGST (图49D)、VQII相对于LDLS (图49E)、IGSL相对于HVPG (图43F)的量的比较，如通过经由实施例4中描述的IP后-IP方法的样品处理之后的LC-MS确定的。在图49A、图49B和图49C中，非AD受试者显示了散点图，而在图49D、图49E和图49F中，对照、AD和非AD显示了等同的关联性。
具体实施方式
MTBR tau作为多种肽存在于血液和CSF中。由于这些多肽的极低丰度，这些生物样品中的MTBR tau的检测和定量已受到阻碍。本文公开的方法采用独特的处理步骤组合，其将生物样品转化成适合于定量MTBR tau以及其它tau种类的样品。例如，在本公开内容的一些方法中，处理步骤耗尽某些蛋白质，同时富集多种tau蛋白。在本公开内容的其它方法中，处理步骤耗尽某些蛋白质，同时富集多种MTBR tau蛋白。本文公开的某些方法特别适合于定量中部结构域不依赖性MTBR tau种类。本文还描述的是中部结构域不依赖性MTBR tau种类测量tau蛋白病的临床体征和症状，诊断tau蛋白病，并指导tau蛋白病的治疗的用途。本发明的这些和其它方面以及迭代在下文更全面地描述。
I. 定义
为了使本发明更容易理解，首先定义了某些术语。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与本发明的实施方案所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。与本文描述的方法和材料相似、相对于所述方法和材料修改或与所述方法和材料等价的许多方法和材料可以用于本发明的实施方案的实践中，而无需过度实验，优选的材料和方法在本文中进行描述。在描述且请求保护本发明的实施方案时，将依照下文阐述的定义使用下述术语。
如本文使用的，术语“约”指关于任何可定量的变量，例如通过通常的测量技术和设备，在数值数量方面可以发生的变化，所述变量包括但不限于质量、体积、时间、距离和量。进一步地，鉴于现实世界中使用的固体和液体处理程序，存在某些非故意的误差和变化，其很可能通过用于制备组合物或执行方法等等的成分的制造、来源或纯度方面的差异而出现。术语“约”也涵盖这些变化，其可以是至多± 5%，但也可以是± 4%、3%、2%、1%等。无论是否被术语“约”修饰，权利要求都包括数量的等价物。
如本文使用的，抗体指如本领域理解的完整抗体，即由两条重链和两条轻链组成，并且还指具有抗原结合区的任何抗体样分子，包括但不限于抗体片段例如Fab'、Fab、F(ab') 2、单结构域抗体、Fv和单链Fv。术语抗体还指多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体和人源化抗体。用于制备且使用各种基于抗体的构建体和片段的技术是本领域众所周知的。用于制备且表征抗体的手段也是本领域众所周知的(参见例如，Antibodies: ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988；通过引用以其整体并入本文)。
如本文使用的，术语“适体”指在生化活性、分子识别或结合属性方面具有有用的生物活性的多核苷酸，一般为RNA或DNA。通常，适体具有分子活性例如在特定表位(区域)处与靶分子的结合。一般公认的是，在其与多肽结合方面特异性的适体可以通过体外进化方法进行合成和/或鉴定。包括通过体外进化方法用于制备且表征适体的手段是本领域众所周知的。参见例如，通过引用以其整体并入本文的US 7,939,313。
术语“Aβ”指衍生自更大的蛋白质(称为淀粉样前体蛋白(APP))的羧基末端中的区域的肽。编码APP的基因定位于染色体21上。存在可能具有毒性效应的许多形式的Aβ：Aβ肽通常序列长度为37-43个氨基酸，尽管它们可以具有改变其总体大小的截短和修饰。它们可以在可溶性和不可溶性区室内，以单体、低聚和聚集形式，在细胞内或细胞外发现，并且可能与其它蛋白质或分子复合。Aβ的不利效应或毒性效应可以归于上文注明形式中的任何或全部，以及未具体描述的其它形式。例如，两种此类Aβ同种型包括Aβ40和Aβ42；其中Aβ42同种型特别是纤维原性或不溶性的，并且与疾病状态相关。术语“Aβ”通常指多个Aβ种类，而不区分各个Aβ种类。具体的Aβ种类由肽的大小进行鉴定，例如Aβ42、Aβ40、Aβ38等。
如本文使用的，术语“Aβ42/ Aβ40值”意指在从受试者中获得的样品中，Aβ42的量与同一样品中Aβ40的量相比的比率。
“Aβ淀粉样变性”定义为临床上异常的脑中的Aβ沉积。确定为具有Aβ淀粉样变性的受试者在本文中被称为“淀粉样变性阳性”，而确定为没有Aβ淀粉样变性的受试者在本文中被称为“淀粉样变性阴性”。本领域中存在Aβ淀粉样变性的公认指标。在本公开内容之时，Aβ淀粉样变性通过淀粉样变性成像(例如PiB PET、fluorbetapir或本领域已知的其它成像方法)直接进行测量，或通过降低的脑脊液(CSF) Aβ42或降低的CSF Aβ42/40比率间接进行测量。具有平均皮质结合电位(MCBP)分数> 0.18的[11C]PIB-PET成像是Aβ淀粉样变性的指标，与通过免疫沉淀和质谱法(IP/MS))测量的约1 ng/ml的脑脊液(CSF) Aβ42浓度一样。可替代地，可以使用CSF Aβ42/40的截断比率，其使预测淀粉样蛋白阳性的准确度达到最大，如通过PIB-PET确定的。例如此类的值或本领域已知的和/或实施例中使用的其它值可以单独或组合使用，以在临床上确认Aβ淀粉样变性。参见例如，Klunk W E等人Ann Neurol 55(3) 2004，Fagan A M等人Ann Neurol，2006，59 (3)，Patterson等人，Annals ofNeurology，2015，78 (3): 439-453，或Johnson等人，J. Nuc. Med.，2013，54 (7): 1011-1013，所述参考文献各自在此通过引用以其整体并入。具有Aβ淀粉样变性的受试者可能是有症状的或可能是没有症状的，并且有症状的受试者可能满足或可能不满足与Aβ淀粉样变性相关的疾病的临床标准。与Aβ淀粉样变性相关的症状的非限制性实例可以包括认知功能受损、行为改变、语言功能异常、情绪失调、癫痫发作、痴呆以及神经系统结构或功能受损。与Aβ淀粉样变性相关的疾病包括但不限于阿尔茨海默氏病(AD)、脑淀粉样蛋白血管病(CAA)、路易体痴呆和包涵体肌炎。具有Aβ淀粉样变性的受试者处于发展与Aβ淀粉样变性相关的疾病的增加风险中。
“Aβ淀粉样变性的临床体征”指本领域已知的Aβ沉积的测量。Aβ淀粉样变性的临床体征可以包括但不限于通过淀粉样蛋白成像(例如PiB PET、fluorbetapir或本领域已知的其它成像方法)，或通过降低的脑脊液(CSF) Aβ42或Aβ42/40比率而鉴定的Aβ的沉积。参见例如，Klunk WE等人Ann Neurol 55 (3) 2004，以及Fagan AM等人Ann Neurol 59 (3)2006，所述参考文献各自在此通过引用以其整体并入。Aβ淀粉样变性的临床体征也可以包括Aβ代谢的测量，特别是单独的Aβ42代谢的测量或与其它Aβ变体(例如Aβ37、Aβ38、Aβ39、Aβ40和/或总Aβ)代谢的测量的比较，如美国专利序列号14/366,831、14/523,148和14/747,453中所述，所述专利各自在此通过引用以其整体并入。另外的方法在Albert等人Alzheimer’s & Dementia 2007，第7卷，第170-179页；McKhann等人，Alzheimer’s &Dementia 2007，第7卷，第263-269页；以及Sperling等人，Alzheimer’s & Dementia 2007，第7卷，第280-292页中进行描述，所述参考文献各自在此通过引用以其整体并入。重要的是，具有Aβ淀粉样变性的临床体征的受试者可能具有或可能没有与Aβ沉积相关的症状。然而，具有Aβ淀粉样变性的临床体征的受试者处于发展与Aβ淀粉样变性相关的疾病的增加风险中。
“用于淀粉样蛋白成像的候选者”指已通过临床医生鉴定为淀粉样蛋白成像对于其可能是临床上必要的个体的受试者。作为非限制性实例，用于淀粉样蛋白成像的候选者可以是具有Aβ淀粉样变性的一种或多种临床体征、一种或多种Aβ斑块相关症状、一种或多种CAA相关症状或其组合的受试者。临床医生可以对于此类受试者推荐淀粉样蛋白成像，以指导他或她的临床护理。作为另一个非限制性实例，用于淀粉样蛋白成像的候选者可以是在与Aβ淀粉样变性相关的疾病的临床试验中的潜在参与者(对照受试者或测试受试者)。
“Aβ斑块相关症状”或“CAA相关症状”分别指由淀粉样斑块或CAA的形成引起或者与之相关的任何症状，所述淀粉样斑块或CAA由称为淀粉样原纤维的规则有序的纤维状聚集物构成。示例性Aβ斑块相关症状可以包括但不限于神经元变性、认知功能受损、记忆受损、行为改变、情绪失调、癫痫发作、神经系统结构或功能受损、以及阿尔茨海默氏病或CAA的发展或恶化的风险增加。神经元变性可能包括神经元结构的变化(包括分子变化，如有毒蛋白质、蛋白质聚集物等的细胞内累积，以及宏观水平的变化，如轴突或树突的形状或长度的变化、髓鞘组成的变化、髓鞘的丧失等)，神经元功能的变化，神经元功能的丧失，神经元的死亡或其任何组合。认知功能受损可能包括但不限于关于记忆、注意力、集中力、语言、抽象思维、创造力、执行功能、计划和组织的困难。行为改变可能包括但不限于身体或言语攻击，冲动，抑制力降低，冷漠，主动性降低，个性改变，酒精、烟草或药物滥用，以及其它成瘾有关的行为。情绪失调可能包括但不限于抑郁、焦虑、躁狂、易怒和情绪失禁。癫痫发作可能包括但不限于全身性强直阵挛性癫痫发作、复杂部分性癫痫发作和非癫痫性心因性癫痫发作。神经系统结构或功能受损可能包括但不限于脑积水、帕金森症、睡眠障碍、精神病、平衡和协调损害。这可能包括运动损害，如单肢轻瘫、轻偏瘫、四肢轻瘫、共济失调、颤搐和震颤。这也可能包括感觉丧失或功能障碍，包括嗅觉、触觉、味觉、视觉和听觉。此外，这可能包括自主神经系统损害，如肠道和膀胱功能障碍、性功能障碍、血压和体温失调。最后，这可能包括可归于下丘脑和垂体功能障碍的激素损害，如生长激素、促甲状腺激素、促黄体素、促卵泡激素、促性腺激素释放激素、催乳素以及众多其它激素和调节剂的缺乏和失调。
如本文使用的，术语“受试者”指哺乳动物，优选人。哺乳动物包括但不限于人、灵长类动物、牲畜、啮齿类动物和宠物。受试者可能正在等待医疗护理或治疗，可能处于医疗护理或治疗下，或者可能已接受医疗护理或治疗。
如本文使用的，术语“对照群体”、“正常群体”或来自“健康”受试者的样品指这样的受试者或一组受试者，基于定性或定量测试结果，其在临床上确定为没有tau蛋白病或Aβ淀粉样变性、或者与Aβ淀粉样变性相关的临床疾病(包括但不限于阿尔茨海默氏病)。
如本文使用的，术语“血液样品”指衍生自血液的生物样品，优选外周(或循环)血。血液样品可以是全血、血浆或血清，但通常优选血浆。
如本文使用的，术语“同种型”指同一蛋白质变体的几种不同形式中的任一种，其由于编码蛋白质的mRNA的可变剪接、蛋白质的翻译后修饰、蛋白质的蛋白酶解处理、遗传变异和体细胞重组而出现。术语“同种型”和“变体”可互换使用。
术语“tau”指由基因MAPT (或其同源物)编码的多种同种型，以及其在体内C末端截短、在体内N末端截短、在体内翻译后修饰或其任何组合的种类。如本文使用的，术语“tau”和“tau蛋白”和“tau种类”可以互换使用。在许多动物包括但不限于人、非人灵长类动物、啮齿类动物、鱼、牛、青蛙、山羊和鸡中，tau由基因MAPT编码。在其中基因未被鉴定为MAPT的动物中，可以通过本领域内众所周知的方法鉴定同源物。
在人中，存在tau的六种同种型，其由MAPT的外显子2、3和10的可变剪接生成。这些同种型的长度范围为352至441个氨基酸。外显子2和3编码各自在N末端中的29氨基酸的插入片段(称为N)，并且全长的人tau同种型可能具有两个插入片段(2N)、一个插入片段(1N)、或没有插入片段(0N)。所有全长的人tau同种型也具有微管结合结构域的三个重复(称为R)。在C末端处的外显子10的包括导致由外显子10编码的第四个微管结合结构域的包括。因此，全长的人tau同种型可以由微管结合结构域的四个重复(包括外显子10：R1、R2、R3和R4)或微管结合结构域的三个重复(排除外显子10：R1、R3和R4)组成。人tau可能进行或可能不进行翻译后修饰。例如，本领域已知的是，tau可以进行磷酸化、泛素化、糖基化和糖化。人tau也可以在体内在C末端处、在N末端处或在C末端和N末端处进行或不进行蛋白酶解处理。相应地，术语“人tau”涵盖2N3R、2N4R、1N3R、1N4R、0N3R和0N4R同种型，以及其在体内C末端截短、在体内N末端截短、在体内翻译后修饰或其任何组合的种类。编码tau的基因的可变剪接类似地在其它动物中发生。
如本文使用的，术语“tau-441”指最长的人tau同种型(2N4R)，其长度为441个氨基酸。tau-441的氨基酸序列作为SEQ ID NO: 1提供。关于这种同种型在图1中鉴定了N末端(Nterm)、中部结构域、MTBR和C末端(C term)。这些区域对于其它tau同种型(例如2N3R、1NR4、1N3R、0N4R和0N3R)将以可预测的方式改变。相应地，当鉴定了相对于tau-441的氨基酸位置时，技术人员将能够确定其它同种型的相应氨基酸位置。
如本文使用的，术语“N末端tau”指包含tau的N末端(例如tau-441的氨基酸1-103等)的两个或更多个氨基酸的tau蛋白或多个tau蛋白。
如本文使用的，术语“中部结构域tau”指包含tau的中部结构域(例如tau-441的氨基酸104-243等)的两个或更多个氨基酸的tau蛋白或多个tau蛋白。
如本文使用的，术语“MTBR tau”指包含tau的微管结合区(MTBR) (例如tau-441的氨基酸244-368等)的两个或更多个氨基酸的tau蛋白或多个tau蛋白。
如本文使用的，术语“C末端tau”指包含tau的C末端(例如tau-441的氨基酸369-441等)的两个或更多个氨基酸的tau蛋白或多个tau蛋白。
“tau的蛋白酶解肽”指通过体外蛋白酶解切割而产生的tau蛋白的肽片段。“tau的胰蛋白酶肽”指通过用胰蛋白酶的体外切割而产生的tau蛋白的肽片段。tau蛋白的胰蛋白酶肽在本文中可以通过其前四个氨基酸来提及。例如，“LQTA”指胰蛋白酶肽LQTAPVPMPDLK(SEQ ID NO: 3)。由其前四个氨基酸标识的其它胰蛋白酶肽的非限制性实例包括IGST(SEQ ID NO: 2)、VQII (SEQ ID NO: 4)、LDLS (SEQ ID NO: 5)、HVPG (SEQ ID NO: 6)、IGSL (SEQ ID NO: 7)、VQIV (SEQ ID NO: 9)和TPPS (SEQ ID NO: 10)。
与脑中的tau沉积相关的疾病在本文中被称为“tau蛋白病”。术语“tau沉积”包含所有形式的病理性tau沉积在内，包括但不限于神经原纤维缠结、神经毡细丝和营养不良性神经突中的tau聚集物。本领域已知的tau蛋白病包括但不限于进行性核上麻痹(PSP)、拳击员痴呆、慢性创伤性脑病、染色体17连锁的额颞叶痴呆和帕金森病、Lytico-Bodig病、关岛帕金森-痴呆复合征、缠结优势型痴呆、神经节胶质瘤和神经节细胞瘤、脑膜血管瘤病、亚急性硬化性全脑炎、铅脑病、结节性硬化症、哈-斯二氏病(Hallervorden-Spatz disease)、脂褐质沉着症、皮克氏病、皮质基底节变性(CBD)、嗜银颗粒病(AGD)、额颞叶变性(FTLD)、阿尔茨海默氏病(AD)和额颞叶痴呆(FTD)。
Tau蛋白病按病理性tau沉积中发现的tau同种型的优势进行分类。含有占优势地由具有三个MTBR的tau组成的tau沉积的tau蛋白病被称为“3R-tau蛋白病”。皮克氏病是3R-tau蛋白病的非限制性实例。对于分类，一些3R-tau蛋白病的病理性tau沉积可能是3R和4Rtau同种型的混合物，其中3R同种型占优势。阿尔茨海默氏病的受试者的脑中的细胞内神经原纤维缠结(即tau沉积)一般被认为含有大约等量的3R和4R同种型两者。含有占优势地由具有四个MTBR的tau组成的tau沉积的tau蛋白病被称为“4R-tau蛋白病”。PSP、CBD和AGD是4R-tau蛋白病的非限制性实例，与FTLD的一些形式一样。值得注意的是，具有遗传上确认的FTLD病例的一些受试者，如一些V334M和R406W突变携带者的脑中的病理性tau沉积显示为3R和4R的混合物。
tau蛋白病的临床体征可能是脑中的tau聚集物，包括但不限于神经原纤维缠结。用于检测且定量脑中的tau聚集物的方法是本领域已知的(例如，使用tau特异性配体如[18F]THK5317、[18F]THK5351、[18F]AV1451、[11C]PBB3、[18F]MK-6240、[18F]RO-948、[18F]PI-2620、[18F]GTP1、[18F]PM-PBB3和[18F]JNJ64349311、[18F]JNJ-067)等的tauPET)。
如本文使用的，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”指由受过训练和有执照的专业人员向有需要的受试者提供医疗护理。医疗护理可以是诊断性测试、治疗性治疗和/或预防性或防范性措施。治疗性和预防性治疗的目的是防止或减缓(减轻)不希望有的生理变化或疾病/病症。治疗性或预防性治疗的有益或期望的临床结果包括但不限于症状的减轻、疾病程度的减弱、疾病状态的稳定(即不恶化)、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善或缓和、以及缓解(无论是部分还是全部)，无论是可检测还是不可检测的。“治疗”也可以意指与如果不接受治疗的预计存活相比的延长存活。需要治疗的人包括已经患有疾病、状况或病症的人，以及易于患有疾病、状况或病症的人，或者其中待预防疾病、状况或病症的人。相应地，需要治疗的受试者可能具有或可能没有疾病的任何症状或临床体征。
短语“tau疗法”共同地指任何成像剂、治疗性治疗和/或预防性或防范性措施，其考虑用于或用于处于发展tau蛋白病的风险中的受试者、或临床上诊断为患有tau蛋白病的受试者。成像剂的非限制性实例包括功能成像剂(例如氟脱氧葡萄糖等)和分子成像剂(例如匹兹堡化合物B、氟比他班、氟贝他吡、氟美他莫、放射性标记的tau特异性配体、放射性核素标记的抗体等)。治疗剂的非限制性实例包括胆碱酯酶抑制剂、N-甲基D-天冬氨酸(NMDA)拮抗剂、抗抑郁药(例如选择性血清素再摄取抑制剂、非典型抗抑郁药、氨基酮、选择性血清素和去甲肾上腺素再摄取抑制剂、三环抗抑郁药等)、γ-分泌酶抑制剂、β-分泌酶抑制剂、抗Aβ抗体(包括其抗原结合片段、变体或衍生物)、抗tau抗体(包括其抗原结合片段、变体或衍生物)、干细胞、饮食补充剂(例如锂水、含硫辛酸的ω-3脂肪酸、长链甘油三酯、染料木黄酮、白藜芦醇、姜黄素和葡萄籽提取物等)、血清素受体6的拮抗剂、p38α MAPK抑制剂、重组粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、被动免疫疗法、主动疫苗(例如CAD106、AF20513等)、tau蛋白聚集抑制剂(例如TRx0237、甲硫鎓氯化物(methylthionimium chloride)等)、改善血糖控制的疗法(例如胰岛素、艾塞那肽、利拉鲁肽、吡格列酮等)、消炎药、磷酸二酯酶9A抑制剂、σ-1受体激动剂、激酶抑制剂、磷酸酶激活剂、磷酸酶抑制剂、血管紧张素受体阻断剂、CB1和/或CB2内源性大麻素受体部分激动剂、β-2肾上腺素能受体激动剂、烟碱乙酰胆碱受体激动剂、5-HT2A反向激动剂、α-2c肾上腺素能受体拮抗剂、5-HT 1A和1D受体激动剂、谷氨酰肽环转移酶抑制剂、APP产生的选择性抑制剂、单胺氧化酶B抑制剂、谷氨酸受体拮抗剂、AMPA受体激动剂、神经生长因子刺激剂、HMG-CoA还原酶抑制剂、神经营养剂、毒蕈碱M1受体激动剂、GABA受体调节剂、PPAR-γ激动剂、微管蛋白调节剂、钙通道阻断剂、抗高血压药、他汀类药物及其任何组合。
II. 用于测量tau的方法
本公开内容提供了通过质谱法用于测量生物样品中的tau的方法。一般而言，本公开内容的用于测量生物样品中的tau的方法包括提供生物样品，通过耗尽一种或多种蛋白质来处理生物样品，然后纯化tau，用蛋白酶切割纯化的tau，然后任选地通过固相提取使所得的切割产物脱盐，以获得包含tau的蛋白酶解肽的样品，并且对包含tau的蛋白酶解肽的样品执行液相层析 - 质谱法，以检测且测量tau的至少一种蛋白酶解肽的浓度(相对或绝对)。因此，在实践中，所公开的方法使用tau的至少一种蛋白酶解肽，以检测且测量生物样品中存在的tau量。
在一个实例中，本公开内容的方法包括(a)提供选自血液样品或CSF样品的生物样品；(b)通过蛋白质沉淀从生物样品中去除蛋白质，并分离沉淀的蛋白质以获得上清液；(c)通过固相提取从上清液中纯化tau；(d)用蛋白酶切割纯化的tau，然后任选地通过固相提取使所得的切割产物脱盐，以获得包含tau的蛋白酶解肽的样品；并且(e)对包含tau的蛋白酶解肽的样品执行液相层析 - 质谱法，以检测且测量tau的至少一种蛋白酶解肽的浓度。
在另一个实例中，本公开内容的方法包括(a)通过亲和力耗尽降低生物样品中的N末端tau、中部结构域tau或N末端tau和中部结构域tau，其中所述生物样品是血液样品或CSF样品；(b)通过包括以下的方法富集在亲和力耗尽后剩余的tau，其可以被称为N末端不依赖性tau和/或中部结构域不依赖性tau：(i)通过蛋白质沉淀从生物样品中去除另外的蛋白质，并分离沉淀的蛋白质以获得上清液，然后通过固相提取从上清液中纯化tau，或(ii)使MTBR tau亲和纯化，从而通过(i)或(ii)产生富集的tau；(c)用蛋白酶切割富集的tau，然后任选地通过固相提取使所得的切割产物脱盐，以获得包含tau的蛋白酶解肽的样品；并且(d)对包含tau的蛋白酶解肽的样品执行液相层析 - 质谱法(LC/MS)，以检测且测量tau的至少一种蛋白酶解肽的浓度。
在另一个实例中，本公开内容的方法包括(a)通过亲和力耗尽降低生物样品中的N末端tau、中部结构域tau或N末端tau和中部结构域tau，其中所述生物样品是血液样品或CSF样品；(b)通过蛋白质沉淀从生物样品中去除另外的蛋白质，并分离沉淀的蛋白质以获得上清液；(c)通过固相提取从上清液中纯化tau；(d)用蛋白酶切割纯化的tau，然后任选地通过固相提取使所得的切割产物脱盐，以获得包含tau的蛋白酶解肽的样品；并且(e)对包含tau的蛋白酶解肽的样品执行液相层析 - 质谱法，以检测且测量tau的至少一种蛋白酶解肽的浓度。
在另一个实例中，本公开内容的方法包括(a)通过亲和力耗尽降低生物样品中的N末端tau、中部结构域tau或N末端tau和中部结构域tau，其中所述生物样品是血液样品或CSF样品；(b)使MTBR tau亲和纯化；(c)用蛋白酶切割纯化的MTBR tau，然后任选地通过固相提取使所得的切割产物脱盐，以获得包含MTBR tau的蛋白酶解肽的样品；并且(d)对包含MTBR tau的蛋白酶解肽的样品执行液相层析 - 质谱法，以检测且测量MTBR tau的至少一种蛋白酶解肽的浓度。
在另一个实例中，本公开内容的方法包括(a)从生物样品中亲和纯化MTBR tau，其中所述生物样品是血液样品或CSF样品；(b)用蛋白酶切割纯化的MTBR tau，然后任选地通过固相提取使所得的切割产物脱盐，以获得包含MTBR tau的蛋白酶解肽的样品；并且(c)对包含MTBR tau的蛋白酶解肽的样品执行液相层析 - 质谱法，以检测且测量MTBR tau的至少一种蛋白酶解肽的浓度。
本公开内容进一步考虑在上述方法各自中，确定生物样品中的一种或多种蛋白质的存在/不存在、和/或测量生物样品中的一种或多种另外蛋白质的浓度。在一些实施方案中，一种或多种蛋白质可以是在tau纯化之前从生物样品中耗尽的蛋白质。例如，在某些实施方案中，N末端tau和/或中部结构域tau种类可以与通过本文公开的方法定量的tau种类(例如MTBR tau、C末端tau)分开进行鉴定和/或定量。可替代地或另外，Aβ、ApoE或任何其它感兴趣的蛋白质可以通过以下进行鉴定和/或定量：平行处理生物样品的一部分、在本文公开的方法中利用之前从生物样品中耗尽感兴趣的蛋白质、或在本文公开的样品处理步骤期间从生物样品中耗尽感兴趣的蛋白质。
下文更详细地描述了生物样品，合适的内部标准，以及耗尽一种或多种蛋白质、纯化tau、用蛋白酶切割纯化的tau和质谱法的步骤。
生物样品
合适的生物样品包括从受试者中获得的血液样品或脑脊液(CSF)样品。在一些实施方案中，受试者是人。人受试者可能正在等待医疗护理或治疗，可能处于医疗护理或治疗下，或者可能已接受医疗护理或治疗。在各个实施方案中，人受试者可能是健康受试者、处于发展神经退行性疾病的风险中的受试者、具有神经退行性疾病的体征和/或症状的受试者、或诊断有神经退行性疾病的受试者。在进一步的实施方案中，神经退行性疾病可以是tau蛋白病。在具体实例中，tau蛋白病可以是阿尔茨海默氏病(AD)、进行性核上麻痹(PSP)、皮质基底节变性(CBD)或额颞叶变性(FTLD)。在其它实施方案中，受试者是实验室动物。在一个进一步实施方案中，受试者是遗传改造为表达人tau和任选地一种或多种另外的人蛋白(例如人Aβ、人ApoE等)的实验室动物。
CSF可以通过伴随或不伴随留置CSF导管的腰椎穿刺获得。同时从受试者中收集的多重血液或CSF样品可以合并。血液可以已通过伴随或不伴随静脉内导管的静脉穿刺，或通过手指针刺(或其等价物)进行收集。一旦收集，血液或CSF样品就可以根据本领域已知的方法进行处理(例如，离心以去除整个细胞和细胞碎片；在分析测试之前使用设计为稳定且保存样本的添加剂等)。血液或CSF样品可以立即使用，或可以无限期地冷冻且贮存。在用于本文公开的方法之前，如果需要或期望的话，生物样品也可以进行修饰，以包括蛋白酶抑制剂、同位素标记的内部标准、去污剂和离液剂，和/或耗尽其它分析物(例如蛋白质肽、代谢物)。
所使用的样品的大小可以并且将取决于样品类型、样品由其获得的受试者的健康状态和待分析的分析物(除tau之外)而变。CSF样品体积可以是约0.01 mL至约5 mL、或约0.05 mL至约5 mL。在一个具体实例中，样品的大小可以是约0.05 mL至约1 mL CSF。血浆样品体积可以是约0.01 mL至约20 mL。
(b)同位素标记的内部tau标准
同位素标记的tau可以用作内部标准，以解释在样品处理自始至终的变化性，并且任选地计算绝对浓度。一般地，同位素标记的内部tau标准在显著的样品处理前添加，并且需要时，它可以添加多于一次。参见例如，图2和图33中描绘的方法。
在本文中描述了多重同位素标记的内部tau标准。所有的标准都具有掺入至少一个氨基酸残基内的重同位素标记。可以使用一种或多种全长同种型。可替代地或另外，也可以使用具有翻译后修饰的tau同种型和/或tau的肽片段，如本领域已知的。一般而言，所掺入的标记的氨基酸残基应该增加肽的质量而不影响其化学性质，并且起因于同位素标记的存在的质量偏移必须足以允许质谱法方法区别内部标准(IS)与内源性tau分析物信号。如本文所示，合适的重同位素标记包括但不限于 2H、13C和15N。通常，约1-10 ng的内部标准通常是足够的。
(c)耗尽一种或多种蛋白质
本公开内容的方法包括其中从样品中耗尽一种或多种蛋白质的步骤。术语“耗尽”意指在数量或数目方面的减小。相应地，耗尽蛋白质的样品可以具有蛋白质的任何量，其可测量地少于原始样品中的量，包括不含蛋白质的量。
可以通过特异性靶向一种或多种蛋白质的方法，例如通过亲和力耗尽、固相提取或本领域已知的其它方法，从样品中耗尽蛋白质。在其中期望蛋白质的下游分析(例如鉴定、定量、翻译后修饰的分析等)的情形下，可以使用一种或多重蛋白质的靶向耗尽。例如，在Aβ用合适的表位结合剂的亲和力耗尽之后，可以通过本领域已知的方法对Aβ肽进行鉴定且定量。作为另一个非限制性实例，在ApoE的亲和力耗尽和ApoE同种型的鉴定之后，可以通过本领域已知的方法确定载脂蛋白E (ApoE)的状态。靶向耗尽也可以用于分离用于后续分析的其它蛋白质，包括但不限于载脂蛋白J、突触核蛋白、可溶性淀粉样前体蛋白、α-2巨球蛋白、S100B、髓鞘碱性蛋白、白细胞介素、TNF、TREM-2、TDP-43、YKL-40、VILIP-1、NFL、朊病毒蛋白、pNFH和DJ-1。某些tau蛋白的靶向耗尽在本文中也用于富集其它tau蛋白和/或消除混淆(cofound)质谱法分析的蛋白质。例如，在本公开内容的某些实施方案中，在进一步处理样品用于通过质谱法分析之前，从样品中耗尽N末端tau蛋白和/或中部结构域tau蛋白。耗尽的tau蛋白的下游分析可能发生或可能不发生，但两个选项均由本公开内容的方法加以考虑。
在一些实施方案中，靶向耗尽可以通过亲和力耗尽而发生。亲和力耗尽指通过其与分子的特异性结合性质，从样品中耗尽感兴趣的蛋白质的方法。通常，该分子是附着至固体支持物如珠、树脂、组织培养板等的配体(被称为固定化配体)。配体固定至固体支持物也可能在配体-蛋白质相互作用发生后发生。合适的配体包括抗体、适体和其它表位结合剂。该分子也可以是聚合物或其它材料，其可以选择性吸附感兴趣的蛋白质。作为非限制性实例，由脂肪氧乙醇取代的聚羟基亚甲基(例如PHM-L LIPOSORB，Sigma Aldrich)可以用于选择性吸附来自血清的脂蛋白(包括ApoE)。两种或更多种亲和力耗尽试剂可以进行组合，以序贯或同时耗尽多重蛋白质。
在一些实施方案中，本公开内容的方法包括使用至少一种表位结合剂，从样品中亲和力耗尽一种或多种蛋白质，所述表位结合剂与tau-441的包含端点在内的氨基酸1至243内(或者对于0N或1N同种型的类似限定区域内)的表位特异性结合。在各个实施方案中，可以使用一种、两种、三种或更多种表位结合剂。当使用两种或更多种表位结合剂时，它们可以序贯或同时使用。
在一些实施方案中，本公开内容的方法包括使用与tau的N末端(例如tau-441的包含端点在内的氨基酸1至103)内的表位特异性结合的表位结合剂、以及与tau的中部结构域(例如tau-441的包含端点在内的氨基酸104至243)内的表位特异性结合的表位结合剂，从样品中亲和力耗尽一种或多种蛋白质。表位结合剂可以序贯或同时使用。
在一些实施方案中，本公开内容的方法包括使用与tau-441的包含端点在内的氨基酸1至35内的表位特异性结合的表位结合剂、以及与tau-441的包含端点在内的氨基酸104至243内(或者对于0N或1N同种型的类似限定区域内)的表位特异性结合的表位结合剂，从样品中亲和力耗尽一种或多种蛋白质。表位结合剂可以序贯或同时使用。
在一些实施方案中，本公开内容的方法包括使用与tau-441的包含端点在内的氨基酸1至103内(或者对于0N或1N同种型的类似限定区域内)的表位特异性结合的表位结合剂；与tau-441的包含端点在内的氨基酸104至243内(或者对于0N或1N同种型的类似限定区域内)的表位特异性结合的表位结合剂；以及与淀粉样蛋白β的表位特异性结合的表位结合剂，从样品中亲和力耗尽一种或多种蛋白质。表位结合剂可以序贯或同时使用。
在一些实施方案中，本公开内容的方法包括使用与tau-441的包含端点在内的氨基酸1至35内(或者对于0N或1N同种型的类似限定区域内)的表位特异性结合的表位结合剂；与tau-441的包含端点在内的氨基酸104至243内(或者对于0N或1N同种型的类似限定区域内)的表位特异性结合的表位结合剂；以及与淀粉样蛋白β的表位特异性结合的表位结合剂，从样品中亲和力耗尽一种或多种蛋白质。表位结合剂可以序贯或同时使用。
在一些实施方案中，本公开内容的方法包括使用与tau-441的包含端点在内的氨基酸1至103内(或者对于0N或1N同种型的类似限定区域内)的表位特异性结合的表位结合剂；以及与淀粉样蛋白β的表位特异性结合的表位结合剂，从样品中亲和力耗尽一种或多种蛋白质。表位结合剂可以序贯或同时使用。
在一些实施方案中，本公开内容的方法包括使用与tau-441的包含端点在内的氨基酸1至35内(或者对于0N或1N同种型的类似限定区域内)的表位特异性结合的表位结合剂；以及与淀粉样蛋白β的表位特异性结合的表位结合剂，从样品中亲和力耗尽一种或多种蛋白质。表位结合剂可以序贯或同时使用。
在一些实施方案中，本公开内容的方法包括使用与tau-441的包含端点在内的氨基酸104至243内(或者对于0N或1N同种型的类似限定区域内)的表位特异性结合的表位结合剂；以及与淀粉样蛋白β的表位特异性结合的表位结合剂，从样品中亲和力耗尽一种或多种蛋白质。表位结合剂可以序贯或同时使用。
在上述实施方案各自中，表位结合剂可以包含抗体或适体。在一些实施方案中，与淀粉样蛋白β特异性结合的表位结合剂是HJ5.1，或者是结合与HJ5.1相同的表位和/或竞争性抑制HJ5.1的表位结合剂。在一些实施方案中，与tau-441的包含端点在内的氨基酸1至103内的表位特异性结合的表位结合剂是HJ8.5，或者是结合与HJ8.5相同的表位和/或竞争性抑制HJ8.5的表位结合剂。在一些实施方案中，与tau-441的包含端点在内的氨基酸104至221内的表位特异性结合的表位结合剂是Tau1，或者是结合与Tau1相同的表位和/或竞争性抑制Tau1的表位结合剂。用于鉴定抗体与之特异性结合的表位的方法，以及评估两种抗体之间的竞争性抑制的测定法是本领域已知的。
可替代地，可以通过更一般的方法，例如通过超滤或者用酸、有机溶剂或盐的蛋白质沉淀，从样品中耗尽蛋白质。一般而言，这些方法用于可靠地减少高丰度和高分子量的蛋白质，其依次又富集低分子量和/或低丰度的蛋白质和肽(例如tau、Aβ等)。
在一些实施方案中，可以通过沉淀从样品中耗尽蛋白质。简言之，沉淀包括将沉淀剂加入样品中并充分混合，使样品与沉淀剂一起温育以使蛋白质沉淀，并且通过离心或过滤分离沉淀的蛋白质。所得到的上清液然后可以用于下游应用中。所需试剂的量可以通过本领域已知的方法在实验上进行确定。合适的沉淀剂包括高氯酸、三氯乙酸、乙腈、甲醇等等。在一个示例性的实施方案中，通过酸沉淀从样品中耗尽蛋白质。在一个进一步实施方案中，通过使用高氯酸的酸沉淀，从样品中耗尽蛋白质。
作为非限制性实例，可以通过使用高氯酸的酸沉淀从样品中耗尽蛋白质。如本文使用的，除非另有说明，否则“高氯酸”指70%的高氯酸。在一些实施方案中，将高氯酸加入至约1% v/v至约15% v/v的最终浓度。在其它实施方案中，将高氯酸加入至约1% v/v至约10%v/v的最终浓度。在其它实施方案中，将高氯酸加入至约1% v/v至约5% v/v的最终浓度。在其它实施方案中，将高氯酸加入至约3% v/v至约15% v/v的最终浓度。在其它实施方案中，将高氯酸加入至约3% v/v至约10% v/v的最终浓度。在其它实施方案中，将高氯酸加入至约3% v/v至约5% v/v的最终浓度。在其它实施方案中，将高氯酸加入至3.5% v/v至约15% v/v、3.5% v/v至约10% v/v、或3.5% v/v至约5% v/v的最终浓度。在其它实施方案中，将高氯酸加入至约3.5% v/v的最终浓度。在高氯酸添加之后，将样品充分混合(例如，通过涡旋混合器)，并且保持在低温下，通常约10分钟或更长时间，以促进沉淀。例如，样品可以保持约10分钟至约60分钟、约20分钟至约60分钟、或约30分钟至约60分钟。在其它实例中，样品可以保持约15分钟至约45分钟、或约30分钟至约45分钟。在其它实例中，样品可以保持约15分钟至约30分钟、或约20分钟至约40分钟。在其它实例中，样品保持约30分钟。样品然后在低温下离心，以使沉淀的蛋白质形成团块，并且将包含可溶性tau的上清液(即，酸溶性级分)转移到新鲜容器。如在上文的背景下使用的，“低温”指10°C或更低的温度。例如，低温可以是约1℃、约2℃、约3℃、约4℃、约5℃、约6℃、约7℃、约8℃、约9℃或约10℃。在某些实施方案中，可以优选较窄的温度范围，例如约3℃至约5℃、或甚至约4℃。在某些实施方案中，可以通过将样品放在冰上来实现低温。
来自上述方法之一或两者的两种或更多种方法可以进行组合，以序贯或同时耗尽多重蛋白质。例如，可以使一种或多种蛋白质选择性地耗尽(靶向耗尽)，随后为高丰度/分子量的蛋白质的耗尽。可替代地，可以首先使高丰度/分子量的蛋白质耗尽，随后为一种或多种蛋白质的靶向耗尽。在另外一个替代方案中，可以首先使高丰度/分子量的蛋白质耗尽，随后为一种或多种蛋白质的第一轮靶向耗尽，然后是与第一轮中靶向的不同的一种或多种蛋白质的第二轮靶向耗尽。其它的迭代对于技术人员将是显而易见的。
(d)纯化tau
本文公开的方法的另一个步骤包括纯化tau，特别是MTBR tau。在一些实例中，MTBR tau是N末端不依赖性和/或中部结构域不依赖性MTBR tau。纯化的tau可以是部分纯化或完全纯化的。
在一些实施方案中，本公开内容的方法包括通过固相提取纯化tau。通过固相提取纯化tau包括使包含tau的样品与包含吸附tau的吸附剂的固相接触，一个或多个洗涤步骤，以及从吸附剂中洗脱tau。合适的吸附剂包括反相吸附剂。合适的反相吸附剂是本领域已知的，并且包括但不限于烷基键合二氧化硅、芳基键合二氧化硅、苯乙烯/二乙烯苯材料、N-乙烯基吡咯烷酮/二乙烯苯材料。在一个示例性的实施方案中，反相材料是包含N-乙烯基吡咯烷酮和二乙烯苯的聚合物或包含苯乙烯和二乙烯苯的聚合物。在一个示例性的实施方案中，吸附剂是Oasis HLB (Waters)。在与包含tau的上清液接触之前，通常按照制造商的说明书或如本领域已知的，对吸附剂进行预处理(例如，用水混溶性有机溶剂，然后用构成流动相的缓冲液)。另外，上清液可以任选地进行酸化，因为一些反相材料比其它材料更强地保留电离的分析物。在流动相和洗脱中使用挥发性组分是优选的，因为它们促进样品干燥。在示例性的实施方案中，洗涤步骤可以包括使用包含约0.05% v/v三氟乙酸(TFA)至约1%v/v TFA的液相或其等价物。在一些实例中，洗涤可以是使用包含约0.05% v/v至约0.5% v/v TFA、或约0.05% v/v至约0.1% v/v TFA的液相。在一些实例中，洗涤可以是使用包含约0.1% v/v至约1.0% v/v TFA、或约0.1% v/v至约0.5% v/v TFA的液相。然后用包含约20%v/v至约50% v/v乙腈(ACN)或其等价物的液相洗脱结合的tau。在一些实例中，可以用包含约20% v/v至约40% v/v ACN、或约20% v/v至约30% v/v ACN的液相洗脱tau。在一些实例中，可以用包含约30% v/v至约50% v/v ACN、或约30% v/v至约40% v/v ACN的液相洗脱tau。洗出物可以通过本领域已知的方法(例如，真空干燥(如speed-vac)、冻干、在氮流下蒸发等)进行干燥。
在一些实施方案中，本公开内容的方法包括通过亲和纯化来纯化MTBR tau。亲和纯化指通过其与分子的特异性结合性质来富集感兴趣的蛋白质的方法。通常，该分子是附着至固体支持物如珠、树脂、组织培养板等的配体(被称为固定化配体)。配体固定至固体支持物也可能在配体-蛋白质相互作用发生后发生。合适的配体包括抗体、适体和其它表位结合剂。通过亲和纯化来纯化MTBR tau包括使包含tau的样品与合适的固定化配体接触，一个或多个洗涤步骤，以及从固定化配体中洗脱MTBR tau。
在一些实施方案中，本公开内容的方法包括通过使用至少一种表位结合剂的亲和纯化来纯化MTBR tau，所述表位结合剂与tau-441的包含端点在内的氨基酸235至368内、或tau-441的包含端点在内的氨基酸244至368内(或对于其它全长同种型的类似限定区域内)的表位特异性结合。在各个实施方案中，可以使用一种、两种、三种或更多种表位结合剂。当使用两种或更多种表位结合剂时，它们可以序贯或同时使用。合适的表位结合剂的非限制性实例包括Vandermeeren等人，J Alzheimers Dis，2018，65:265-281中描述的抗体77G7、RD3、RD4、UCB1017和PT76，以及Roberts等人，Acta Neuropathol Commun，2020，8: 13中描述的抗体E2814和7G6，以及特异性结合与这些抗体相同的表位的其它表位结合剂。在进一步的实施方案中，本公开内容的方法包括通过使用以下的表位结合剂的亲和纯化来纯化MTBR tau：与MTBR tau的R1内的表位特异性结合的表位结合剂、与MTBR tau的R2内的表位特异性结合的表位结合剂、与MTBR tau的R3内的表位特异性结合的表位结合剂、与MTBRtau的R4内的表位特异性结合的表位结合剂、与3R tau特有的表位特异性结合的表位结合剂、与4R tau特有的表位特异性结合的表位结合剂、与跨越MTBR tau的R1和R2的表位特异性结合的表位结合剂、与跨越MTBR tau的R2和R3的表位特异性结合的表位结合剂、与跨越MTBR tau的R3和R4的表位特异性结合的表位结合剂或其任何组合。在一个具体实例中，本公开内容的方法包括通过使用表位结合剂的亲和纯化来纯化MTBR tau，所述表位结合剂与包含tau-441的氨基酸316至355 (或对于其它全长同种型的相同区域)的表位特异性结合。在各个实施方案中，可以使用一种、两种、三种或更多种表位结合剂。当使用两种或更多种表位结合剂时，它们可以序贯或同时使用。
在上述实施方案各自中，表位结合剂可以包含抗体或适体。在一些实施方案中，与MTBR tau的R3和R4内的表位特异性结合的表位结合剂是77G7，或者是结合与77G7(BioLegend)相同的表位和/或竞争性抑制77G7的表位结合剂。在一些实施方案中，与3Rtau特有的表位特异性结合的表位结合剂是RD3 (de Silva等人，Neuropathology andApplied Neurobiology，2003，29: 288-302)，或者是结合与RD3相同的表位和/或竞争性抑制RD3的表位结合剂。在一些实施方案中，与4R tau特有的表位特异性结合的表位结合剂是RD4 (de Silva等人，Neuropathology and Applied Neurobiology，2003，29: 288-302)，或者是结合与RD4相同的表位和/或竞争性抑制RD4的表位结合剂。
(e)用蛋白酶切割纯化的tau
本文公开的方法的另一个步骤包括用蛋白酶切割纯化的tau。用蛋白酶切割纯化的tau包括在适合于消化tau的条件下，使包含纯化的tau的样品与蛋白酶接触。当使用亲和纯化时，消化可以在从固定化配体中洗脱tau后或在tau结合时发生。合适的蛋白酶包括但不限于胰蛋白酶、Lys-N、Lys-C和Arg-N。在一个优选的实施方案中，蛋白酶是胰蛋白酶。所得的切割产物是包含tau的蛋白酶解肽的组合物。当蛋白酶是胰蛋白酶时，所得的切割产物包含tau的胰蛋白酶肽。在蛋白酶解切割之后，所得的切割产物通常通过固相提取进行脱盐。
(f) LC-MS
本文公开的方法的另一个步骤包括对包含tau的蛋白酶解肽的样品执行液相层析- 质谱法(LC-MS)，以检测且测量tau的至少一种蛋白酶解肽的浓度。因此，在实践中，所公开的方法使用tau的一种或多种蛋白酶解肽，以检测且测量生物样品中存在的tau蛋白的量。
在其中胰蛋白酶是蛋白酶的实施方案中，指示MTBR tau存在的tau的蛋白酶解肽包括但不限于表A中列出的肽。当使用替代酶用于消化时，所得到的蛋白酶解肽可能略微不同，但可以由本领域普通技术人员容易地确定。不希望受理论的束缚，认为相同类型的两个生物样品之间的胰蛋白酶肽的量中的变化反映了构成这些生物样品的MTBR tau种类中的差异。如本文公开的，MTBR tau的某些蛋白酶解肽的量以及MTBR tau的某些蛋白酶解肽的比率，可以提供有临床意义的信息来指导治疗决定。因此，允许检测和定量MTBR tau的胰蛋白酶肽的方法在许多神经退行性疾病的诊断和治疗中具有效用。
表A：指示MTBR tau存在的tau的胰蛋白酶肽
| 胰蛋白酶肽名称 | 氨基酸序列 | SEQ ID NO: |
| IGST | IGSTENLK | 2 |
| LQTA | LQTAPVPMPDLK | 3 |
| VQII | VQIINK | 4 |
| LDLS | LDLSNVQSK | 5 |
| HVPG | HVPGGGSVQIVYKPVDLSK | 6 |
| IGSL | IGSLDNITHVPGGGNK | 7 |
| tau368 | IGSLDNITHVPGGGN | 8 |
| VQIV | VQIVYKPVDLSK | 9 |
tau的蛋白酶解肽可以通过与高分辨质谱仪界面连接的液相层析系统进行分离。合适的LC-MS系统可以包含<1.0 mm ID柱，并且使用小于约100 μl/分钟的流速。在优选的实施方案中，使用纳米流LC-MS系统(例如，约50-100 µm ID柱和< 1 μL/分钟，优选约100-800 nL/分钟，更优选约200-600 nL/分钟的流速)。在一个示例性的实施方案中，LC-MS系统可以包含0.05 mM ID柱，并且使用约400 nL/分钟的流速。
串联质谱法可以用于改善分辨率，如本领域已知的，或者技术可以改善，以用单个质量分析器来达到串联质谱法的分辨率。合适类型的质谱仪是本领域已知的。这些包括但不限于四极杆、飞行时间、离子阱和Orbitrap，以及将不同类型的质量分析器组合到一个体系结构内的混合质谱仪(例如各自来自ThermoFisher Scientific的Orbitrap Fusion™Tribrid™ Mass Spectrometer、Orbitrap Fusion™ Lumos™ Mass Spectrometer、Orbitrap Tribrid™ Eclipse™ Mass Spectrometer、Q Exactive Mass Spectrometer)。在一个示例性的实施方案中，LC-MS系统可以包括选自Orbitrap Fusion™ Tribrid™Mass Spectrometer、Orbitrap Fusion™ Lumos™ Mass Spectrometer、OrbitrapTribrid™ Eclipse™ Mass Spectrometer的质谱仪，或者在四极杆处具有类似或改善的离子聚焦和离子透明度的质谱仪。可以通过优化在分析之前收集的离子数目(例如，使用orbitrap的AGC设置)和/或注射时间，来开发合适的质谱法方案。在一个示例性的实施方案中，使用实施例中概述的质谱法方案。
III. MTBR tau测量的用途
本公开内容还涵盖血液或CSF中的MTBR tau种类，特别是中部结构域不依赖性MTBR tau种类的测量，作为tau蛋白病的病理特征和/或临床症状的生物标记物的用途，以便诊断、分期、选择对于给定疾病阶段适当的治疗，并且修改给定的治疗方案(例如，改变剂量、转变为不同的药物或治疗模式等)。病理特征可以是tau病理状况的一个方面(例如，tau沉积的量、翻译后修饰的存在/不存在、翻译后修饰的量等)。可替代地或除tau沉积之外，病理特征可能是tau不依赖性的。例如，当tau蛋白病为阿尔茨海默氏病时，在脑或脑动脉中的淀粉样蛋白β (Aβ)沉积。临床症状可以是如通过临床验证的仪器(例如MMSE、CDR-SB等)测量的痴呆，或与tau蛋白病相关的任何其它临床症状。还考虑的是血液或CSF中的MTBR tau种类，特别是中部结构域不依赖性MTBR tau种类的测量，作为3R-和4R-tau蛋白病的本领域已知的其它病理特征和临床症状的生物标记物的用途。有利地，MTBR tau种类包括但不限于中部结构域不依赖性MTBR tau种类，不仅将疾病状态与健康状态区分开，还将各种tau蛋白病区分开。
相应地，在一个方面，本公开内容提供了用于测量受试者中的tau蛋白病有关病理状况的方法，该方法包括在从受试者中获得的生物样品例如血液样品或CSF样品中，定量一个或多个MTBR tau种类，其中所述定量的MTRB-tau种类的量是受试者的脑中的tau蛋白病有关病理状况的表示。tau蛋白病可以是3R-tau蛋白病、混合性3R/4R-tau蛋白病或4R-tau蛋白病。疾病有关病理状况可以是tau沉积、tau翻译后修饰、脑和/或脑动脉中的淀粉样斑块、或本领域已知的其它病理特征。受试者可能具有或可能没有tau蛋白病的临床症状。在优选的实施方案中，定量的至少一个MTBR tau种类是中部结构域不依赖性MTBR tau种类。在进一步的实施方案中，定量的两个或更多个MTBR tau种类是中部结构域不依赖性MTBRtau种类。在再进一步的实施方案中，定量的每个MTBR tau种类都是中部结构域不依赖性MTBR tau种类。
在另一个方面，本公开内容提供了用于诊断受试者中的tau蛋白病的方法，该方法包括在从受试者中获得的生物样品例如血液样品或CSF样品中，定量一个或多个MTBR tau种类，并且当所述定量的MTBR tau种类是约1.5σ或超过约1.5σ时，诊断tau蛋白病，其中σ是由对照群体中测量的正态分布定义的标准差，所述对照群体没有tau蛋白病的临床体征或症状，并且如通过PET成像和/或CSF中的Aβ42/40测量所测量的呈淀粉样蛋白阴性。tau蛋白病可以是3R-tau蛋白病、混合性3R/4R-tau蛋白病或4R-tau蛋白病。受试者可能具有或可能没有疾病的临床症状。在优选的实施方案中，定量的至少一个MTBR tau种类是中部结构域不依赖性MTBR tau种类。在进一步的实施方案中，定量的两个或更多个MTBR tau种类是中部结构域不依赖性MTBR tau种类。在再进一步的实施方案中，定量的每个MTBR tau种类都是中部结构域不依赖性MTBR tau种类。
在另一个方面，本公开内容提供了用于测量受试者中的tau蛋白病的疾病稳定性的方法，该方法包括在从受试者中获得的第一生物样品中，然后在以后的时间(例如几周、几个月或几年后)从同一受试者中获得的第二生物样品中，定量一个或多个MTBR tau种类，并且计算样品之间定量的MTBR tau种类的差异，其中所述第二样品中定量的MTBR tau种类的统计学显著增加指示疾病进展，所述第二样品中定量的MTBR tau种类的统计学显著降低指示疾病改善，而没有变化指示稳定疾病。tau蛋白病可以是3R-tau蛋白病、混合性3R/4R-tau蛋白病或4R-tau蛋白病。受试者可能具有或可能没有疾病的临床症状，并且可能正在接受或可能没有接受tau蛋白病疗法。在一些实例中，在第一生物样品和第二生物样品的收集之间的时间段内，向受试者施用一次或多次tau疗法，并且疾病稳定性的测量是tau疗法的有效性或其缺乏的指示。在优选的实施方案中，定量的至少一个MTBR tau种类是中部结构域不依赖性MTBR tau种类。在进一步的实施方案中，定量的两个或更多个MTBR tau种类是中部结构域不依赖性MTBR tau种类。在再进一步的实施方案中，定量的每个MTBR tau种类都是中部结构域不依赖性MTBR tau种类。
在另一个方面，本公开内容提供了用于治疗患有tau蛋白病的受试者的方法，该方法包括在从受试者中获得的生物样品例如血液样品或CSF样品中，定量一个或多个MTBRtau种类；并且向受试者提供tau疗法以改善疾病有关病理状况的测量或临床症状，其中所述受试者具有高于或低于平均值至少1个标准差，优选至少1.3个标准差，更优选至少1.5个标准差或甚至更优选至少2个标准差的定量的MTBR tau种类(即，分别相差1σ、1.3σ、1.5σ或1.5σ，其中σ是由对照群体中测量的正态分布定义的标准差，所述对照群体没有tau蛋白病的临床体征或症状，并且如通过PET成像和/或CSF中的Aβ42/40测量所测量的呈淀粉样蛋白阴性。除使用阈值(例如高于或低于平均值至少1个标准差)之外，在一些实施方案中，高于或低于平均值的变化程度也可以用作治疗受试者的标准。tau蛋白病可以是3R-tau蛋白病、混合性3R/4R-tau蛋白病或4R-tau蛋白病。疾病有关病理状况的测量可以是如通过PET成像测量的tau沉积，如通过质谱法或其它合适的方法测量的tau翻译后修饰，如通过PET成像测量的脑或脑动脉中的淀粉样斑块，如通过CSF中的Aβ42/40测量的淀粉样斑块，或本领域已知的其它病理特征。临床症状可以是如通过临床验证的仪器(例如MMSE、CDR-SB等)测量的痴呆，或3R-、3R/4R-和4R-tau蛋白病的本领域已知的其它临床症状。在优选的实施方案中，定量的至少一个MTBR tau种类是中部结构域不依赖性MTBR tau种类。在进一步的实施方案中，定量的两个或更多个MTBR tau种类是中部结构域不依赖性MTBR tau种类。在再进一步的实施方案中，定量的每个MTBR tau种类都是中部结构域不依赖性MTBR tau种类。许多tau疗法靶向特定病理生理学变化。例如，Aβ靶向疗法一般设计为降低Aβ产生，拮抗Aβ聚集或增加脑Aβ清除率；tau靶向疗法一般设计为改变tau磷酸化模式，拮抗tau聚集(tau的一般拮抗或特定tau同种型的拮抗)，或增加NFT清除率；各种疗法设计为减少CNS炎症或脑胰岛素抗性等。然而，并非所有的tau蛋白病都共享相同的病理生理学变化。因此，通过将这些各种tau疗法施用于正确鉴定为患有3R-tau蛋白病、混合性3R/4R-tau蛋白病或4R-tau蛋白病的受试者，可以改善它们的功效。
术语“中部结构域不依赖性MTBR tau”指多个MTBR tau种类，其缺乏tau的中部结构域区域的全部或基本上全部，并且因此也缺乏N末端区域。在包含中部结构域tau的tau种类已从生物样品，优选血液或CSF样品中部分或完全耗尽后，剩下这些中部结构域不依赖性MTBR tau种类。合适的生物样品在第II (a)节中进行描述，其公开内容通过引用并入本节内。中部结构域tau的耗尽可以通过这些tau种类的靶向耗尽，例如通过使用表位结合剂的亲和力耗尽而发生，所述表位结合剂与tau的N末端或中部结构域内的表位特异性结合。还可以使用多重表位结合剂 - 例如，与tau的N末端内的表位特异性结合的第一表位结合剂、以及与tau的中部结构域内的表位特异性结合的第二表位结合剂。进一步的细节可以在第II (c)节中找到，其公开内容通过引用并入本节内。通常，原材料中的至少50% (例如50%、60%、70%、80%、90%或更多)的靶蛋白被耗尽。在一些实施方案中，原材料中的约70%或更多、约80%或更多、或约90%或更多的靶蛋白被耗尽。在从生物样品中耗尽中部结构域tau后，可以采取步骤以(1)例如通过经由沉淀去除其它蛋白质和/或通过固相提取纯化tau蛋白，富集包括中部结构域不依赖性MTBR tau的剩余tau种类，或(2)例如通过使用与MTBR内的表位结合剂特异性结合的表位结合剂的亲和纯化，选择性富集中部结构域不依赖性MTBR tau种类。术语“富集”意指数量或数目中的增加。进一步的细节可以在第II 节中找到，其公开内容通过引用并入本节内。优选地，中部结构域不依赖性MTBR tau种类比其在CSF中的量富集至少100倍。在一些实例中，中部结构域不依赖性MTBR tau种类可以富集约100倍至约1000倍 - 例如，约100倍、约200倍、约300倍、约400倍、约500倍、约600倍、约700倍、约800倍、约900倍、约1000倍。在一些实例中，中部结构域不依赖性MTBR tau种类可以富集约500倍至约1000倍、或甚至更多。MTBR tau可以在从受试者中获得的处理的CSF或血液样品中进行定量，其中使所述CSF或血液样品耗尽中部结构域tau，然后通过如第II节或实施例中所述的LC-MS、或通过本领域已知的其它方法(例如多重测定法(例如通过Luminex的xMAP技术、单分子蛋白质检测(例如Simoa®珠技术)等等)，来富集MTBR tau。在其中并未从生物样品中耗尽中部结构域tau的实施方案中，tau通常仍通过如上所述的方法富集到上述程度。
在上述方面各自中，合适的MTBR tau种类可以包括但不限于包含以下的MTBR tau种类和/或中部结构域不依赖性MTBR种类：SEQ ID NO: 2 (IGSTENLK)、SEQ ID NO: 3(LQTAPVPMPDLK)、SEQ ID NO: 4 (VQIINK)、SEQ ID NO: 5 (LDLSNVQSK)、SEQ ID NO: 6(HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)、SEQ ID NO: 8 (IGSLDNITHVPGGGN)、SEQ ID NO: 9(VQIVYKPVDLSK)的氨基酸序列或其组合。测量的MTBR种类的选择可能取决于该方法的预期目的。例如，当tau蛋白病是3R-tau蛋白病时，与混合性3R/4R-tau蛋白病或4R-tau蛋白病相比，包含SEQ ID NO: 9 (VQIVYKPVDLSK)的MTBR tau种类可能是降低的，而与其它tau蛋白病相比，包含SEQ ID NO: 2 (IGSTENLK)、SEQ ID NO: 4 (VQIINK)、SEQ ID NO: 5(LDLSNVQSK)、SEQ ID NO: 6 (HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)和/或SEQ ID NO: 8(IGSLDNITHVPGGGN)的MTBR tau种类可能是无变化的或增加的。相反，当tau蛋白病是4R-tau蛋白病时，与混合性3R/4R-tau蛋白病或3R-tau蛋白病相比，包含SEQ ID NO: 9(VQIVYKPVDLSK)的MTBR种类可能是增加的，而与其它tau蛋白病相比，包含SEQ ID NO: 2(IGSTENLK)、SEQ ID NO: 4 (VQIINK)、SEQ ID NO: 5 (LDLSNVQSK)、SEQ ID NO: 6(HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)和/或SEQ ID NO: 8 (IGSLDNITHVPGGGN)的MTBR tau种类可能是无变化的或降低的。作为另外的实例，4R tau蛋白病可以通过定量包含SEQ ID NO: 2(IGSTENLK)、SEQ ID NO: 4 (VQIINK)、SEQ ID NO: 5 (LDLSNVQSK)、SEQ ID NO: 6(HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)和/或SEQ ID NO: 8 (IGSLDNITHVPGGGN)的MTBR tau种类，与AD区分开。中部结构域不依赖性MTBR tau种类的使用可以加强区分力，其可以通过使用两个不同的中部结构域不依赖性MTBR tau种类的比率得到进一步加强。例如，当tau蛋白病是3R-tau蛋白病或混合性3R/4R-tau蛋白病时，可以使用SEQ ID NO: 3与SEQ ID NO: 6的比率、SEQ ID NO: 3与SEQ ID NO: 8的比率、或SEQ ID NO: 6与SEQ ID NO: 8的比率。当tau蛋白病是4R-tau蛋白病时，可以使用SEQ ID NO: 2、4、5或9与SEQ ID NO: 6、7或8的比率。也可以使用除比率外的数学运算。
中部结构域不依赖性MTBR tau-243的示例性用途可以作用于说明上述讨论的各个方面，但此类讨论并不限制本发明的范围。“中部结构域不依赖性MTBR tau-243”在实施例3中详细描述。它具有SEQ ID NO: 3 (LQTAPVPMPDLK)的氨基酸序列，并且是全部包含SEQID NO: 3的氨基酸序列的多个中部结构域不依赖性MTBR tau种类的胰蛋白酶肽。测量中部结构域不依赖性MTBR tau-243的量是一种手段，在给定的样品中，通过所述手段测量该特定组的中部结构域不依赖性MTBR tau种类的量。如实施例2和3中所示，CSF中部结构域不依赖性MTBR tau-243量的增加概括了与阿尔茨海默氏病(AD)相关的脑中的Aβ沉积和tau沉积增加的直接测量。换言之，CSF中部结构域不依赖性MTBR tau-243的量(并且因此包含SEQID NO: 3的CSF中部结构域不依赖性MTBR tau的量)是AD有关病理状况(例如，脑中的tau沉积、脑中的Aβ沉积等)的表示。因此，这些量可以用于测量AD有关病理状况，确定受试者的淀粉样蛋白状态，并且在没有该疾病的临床症状的受试者中诊断AD。CSF中部结构域不依赖性MTBR tau-243的量也概括了在AD的临床阶段期间测量的变化，例如，如通过MMSE或CDR-SB测试的结果所定义的。相应地，中部结构域不依赖性MTBR tau-243的量(并且因此包含SEQID NO: 3的中部结构域不依赖性MTBR tau的量)也可以用于跨越整个疾病谱(例如，临床前到临床)诊断且分期受试者中的AD。对于中部结构域不依赖性MTBR tau的每一种胰蛋白酶肽，并未观察到用于跨越整个疾病谱诊断且分期受试者中的AD的效用。参见例如，实施例3中的中部结构域不依赖性MTBR tau-299和中部结构域不依赖性MTBR tau-354数据。这证实了构成“包含SEQ ID NO: 3的中部结构域不依赖性MTBR tau”的肽组可以不同于与构成“包含SEQ ID NO: 6的中部结构域不依赖性MTBR tau”的肽组(尽管可能存在重叠)，并且支持SEQ ID NO: 3 (除了其它之外)的丰度作为用于AD (和潜在的其它tau蛋白病，不依赖于其测量方法(例如质谱法、ELISA等)的疾病特异性生物标记物的用途。在对疾病进行诊断和/或分期后，可以向受试者提供治疗，以降低或预防CSF中的中部结构域不依赖性MTBR tau-243的量的进一步增加，和/或降低或预防AD的另一种临床体征或症状的任何进一步增加。治疗的选择可以进一步由特定疾病阶段的了解进行指导，所述疾病阶段由中部结构域不依赖性MTBR tau-243的量告知 - 例如，设计为预防Aβ沉积、逆转Aβ沉积、预防tau沉积、逆转tau沉积和改善疾病的临床体征的疗法，将用于具有中部结构域不依赖性MTBR tau-243的不同(尽管潜在地重叠的)量的受试者中。该实施例进一步显示了，虽然CSF中部结构域不依赖性MTBR tau-243作为AD的生物标记物非常有用，但对于非AD tau蛋白病，它并不那么有用。可以通过定量包含SEQ ID NO: 2 (IGSTENLK)、SEQ ID NO: 4 (VQIINK)、SEQ ID NO: 5(LDLSNVQSK)、SEQ ID NO: 6 (HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)或SEQ ID NO: 8(IGSLDNITHVPGGGN)的中部结构域不依赖性MTBR tau种类及其比率，来区分非AD tau蛋白病。尽管实施例用CSF样品证实了上述原理，但血液样品被视为合适的替代物。
在一个具体实施方案中，本公开内容提供了用于测量受试者中的阿尔茨海默氏病(AD)有关病理状况的方法，该方法包括提供从受试者中获得的处理的CSF或血液样品，其中使所述CSF或血液样品耗尽中部结构域tau且富集MTBR tau；并且在处理的样品中，定量包含SEQ ID NO: 3 (LQTAPVPMPDLK)的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 6(HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 7(IGSLDNITHVPGGGNK)的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 8(IGSLDNITHVPGGGN)的氨基酸序列的MTBR tau种类或其组合，其中所述定量的MTRB-tau种类的量或其比率是受试者的脑中的AD有关病理状况的表示。
在另一个具体实施方案中，本公开内容提供了用于测量受试者的脑中的阿尔茨海默氏病(AD)有关tau沉积的方法，该方法包括提供从受试者中获得的处理的CSF或血液样品，其中使所述处理的CSF或血液样品耗尽中部结构域tau且富集MTBR tau；并且在处理的样品中，定量处理的CSF或血液样品中的包含SEQ ID NO: 3 (LQTAPVPMPDLK)的氨基酸序列的MTBR tau种类，其中所述定量的MTRB-tau种类的量是受试者的脑中的AD有关tau沉积的表示。
在另一个具体实施方案中，本公开内容提供了用于测量受试者的脑中的阿尔茨海默氏病(AD)有关tau沉积的方法，该方法包括提供从受试者中获得的处理的CSF或血液样品，其中使所述CSF或血液样品耗尽中部结构域tau且富集MTBR tau；并且在处理的样品中，定量包含SEQ ID NO: 3 (LQTAPVPMPDLK)的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO:6 (HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 7(IGSLDNITHVPGGGNK)的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 8(IGSLDNITHVPGGGN)的氨基酸序列的MTBR tau种类或其组合，其中所述定量的MTRB-tau种类的量或其比率是受试者的脑中的AD有关tau沉积的表示。
在另一个具体实施方案中，本公开内容提供了用于确定受试者的淀粉样蛋白状态的方法，该方法包括提供从受试者中获得的处理的CSF或血液样品，其中使所述CSF或血液样品耗尽中部结构域tau且富集MTBR tau；并且在处理的样品中，定量包含SEQ ID NO: 6(HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)的氨基酸序列的MTBR tau种类，其中所述定量的MTRB-tau种类的量是受试者的脑中的AD有关淀粉样蛋白β沉积的表示，并且如通过PIB-PET例如通过如Ann Neurol 2016；80:379–387中所述的PiB-PET SUVR确定的，预测淀粉样蛋白阳性。
在另一个具体实施方案中，本公开内容提供了用于诊断阿尔茨海默氏病的方法，该方法包括提供从受试者中获得的处理的CSF或血液样品，其中使所述CSF或血液样品耗尽中部结构域tau且富集MTBR tau；并且在处理的样品中，定量包含SEQ ID NO: 3(LQTAPVPMPDLK)的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 6(HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 7(IGSLDNITHVPGGGNK)的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 8(IGSLDNITHVPGGGN)的氨基酸序列的MTBR tau种类或其组合，并且当所述定量的MTBR tau种类相差约1.5σ或更多时，诊断阿尔茨海默氏病，其中σ是由对照群体中测量的正态分布定义的标准差，所述对照群体没有tau蛋白病的临床体征或症状，并且如通过PET成像(例如通过如Ann Neurol 2016；80:379–387中所述的PiB-PET SUVR)和/或CSF中的Aβ42/40测量(例如，由PiB-PET SUVR (Ann Neurol 2016；80:379–387)计算的CSF Aβ42/40的截断值，其使灵敏度% + 特异性%达到最大)所测量的呈淀粉样蛋白阴性。
在另一个具体实施方案中，本公开内容提供了用于测量受试者中的阿尔茨海默氏病(AD)进展的方法，该方法包括提供第一处理的CSF或血液样品和第二处理的CSF或血液样品，其中每个处理的样品从单个受试者中获得，并且使每个处理的样品耗尽中部结构域tau且富集MTBR tau；并且对于每个处理的样品，定量包含SEQ ID NO: 3 (LQTAPVPMPDLK)的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 6 (HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 7 (IGSLDNITHVPGGGNK)的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 8 (IGSLDNITHVPGGGN)的氨基酸序列的MTBR tau种类或其组合；并且计算第二样品与第一样品中定量的MTBR tau种类之间的差异，其中所述第二样品中定量的MTBRtau种类的统计学显著增加指示了受试者的阿尔茨海默氏病的进展。
在另一个具体实施方案中，本公开内容提供了用于区分4R-tau蛋白病的方法，该方法包括提供从受试者中获得的处理的CSF或血液样品，其中使所述CSF或血液样品耗尽中部结构域tau且富集MTBR tau；并且在处理的样品中，定量(i)包含SEQ ID NO: 9(VQIVYKPVDLSK)的氨基酸序列的MTBR tau种类，以及(ii)包含SEQ ID NO: 7(IGSLDNITHVPGGGNK)的氨基酸序列的MTBR tau种类、或包含SEQ ID NO: 8(IGSLDNITHVPGGGN)的氨基酸序列的MTBR tau种类；其中来自(i)和(ii)的定量的MTBR种类的比率将4R-tau蛋白病与阿尔茨海默氏病和健康状态区分开。
在另一个具体实施方案中，本公开内容提供了用于区分4R-tau蛋白病的方法，该方法包括提供从受试者中获得的处理的CSF或血液样品，其中使所述CSF或血液样品耗尽中部结构域tau且富集MTBR tau；并且在处理的样品中，定量(i)包含SEQ ID NO: 9(VQIVYKPVDLSK)的氨基酸序列的MTBR tau种类，以及(ii)包含SEQ ID NO: 4 (VQIINK)的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 5 (LDLSNVQSK)的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 6 (HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)的氨基酸序列的MTBR tau种类或其任何组合；其中来自(i)和(ii)的定量的MTBR种类的比率将4R-tau蛋白病与阿尔茨海默氏病和健康状态区分开。
在另一个具体实施方案中，本公开内容提供了用于区分4R-tau蛋白病的方法，该方法包括提供从受试者中获得的处理的CSF或血液样品，其中使所述CSF或血液样品(a)耗尽N末端tau和中部结构域tau，且(b)富集MTBR tau；并且在处理的样品中，定量(i)包含SEQID NO: 2 (IGSTENLK)的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 4 (VQIINK)的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 5 (LDLSNVQSK)的氨基酸序列的MTBR tau种类或其组合，以及(ii)包含SEQ ID NO: 6 (HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 7 (IGSLDNITHVPGGGNK)的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ IDNO: 8 (IGSLDNITHVPGGGN)的氨基酸序列的MTBR tau种类或其组合，其中来自(i)和(ii)的定量的MTBR种类的比率将4R-tau蛋白病与阿尔茨海默氏病和健康状态区分开。
在另一个具体实施方案中，本公开内容提供了用于区分4R-tau蛋白病的方法，该方法包括提供从受试者中获得的处理的CSF或血液样品，其中使所述CSF或血液样品(a)耗尽N末端tau和中部结构域tau，且(b)富集MTBR tau；并且在处理的样品中，定量(i)包含SEQID NO: 2 (IGSTENLK)的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 4 (VQIINK)的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 5 (LDLSNVQSK)的氨基酸序列的MTBR tau种类或其组合，以及(ii)包含SEQ ID NO: 7 (IGSLDNITHVPGGGNK)的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 8 (IGSLDNITHVPGGGN)的氨基酸序列的MTBR tau种类或其组合，其中来自(i)和(ii)的定量的MTBR种类的比率将4R-tau蛋白病与阿尔茨海默氏病和健康状态区分开。
在另一个具体实施方案中，本公开内容提供了用于区分4R-tau蛋白病的方法，该方法包括提供从受试者中获得的处理的CSF或血液样品，其中使所述CSF或血液样品(a)耗尽N末端tau和中部结构域tau，且(b)富集MTBR tau；并且在处理的样品中，定量(a)包含SEQID NO: 6 (HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)的氨基酸序列的MTBR tau种类，以及(b)包含SEQ IDNO: 7 (IGSLDNITHVPGGGNK)的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 8(IGSLDNITHVPGGGN)的氨基酸序列的MTBR tau种类或其组合，其中来自(a)和(b)的定量的MTBR种类的比率将4R-tau蛋白病与其它tau蛋白病和健康状态区分开。
在另一个具体实施方案中，本公开内容提供了用于区分3R-tau蛋白病的方法，该方法包括提供从受试者中获得的处理的CSF或血液样品，其中使所述CSF或血液样品(a)耗尽N末端tau和中部结构域tau，且(b)富集MTBR tau；并且在处理的样品中，定量(a)包含SEQID NO: 9 (VQIVYKPVDLSK)的氨基酸序列的MTBR tau种类，以及(b)包含SEQ ID NO: 2(IGSTENLK)、SEQ ID NO: 4 (VQIINK)、SEQ ID NO: 5 (LDLSNVQSK)、SEQ ID NO: 6(HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)、SEQ ID NO: 7 (IGSLDNITHVPGGGNK)、SEQ ID NO: 8(IGSLDNITHVPGGGN)的氨基酸序列的MTBR tau种类或其组合，其中来自(a)和(b)的定量的MTBR种类的比率将3R-tau蛋白病与其它tau蛋白病和健康状态区分开。
在另一个具体实施方案中，本公开内容提供了用于测量受试者中的tau蛋白病有关病理状况的方法，该方法包括提供从受试者中获得的处理的CSF或血液样品，其中使所述CSF或血液样品耗尽中部结构域tau且富集MTBR tau；并且在处理的样品中，定量包含SEQID NO: 2 (IGSTENLK)的氨基酸序列的MTBR种类、包含SEQ ID NO: 3 (LQTAPVPMPDLK)的氨基酸序列的MTBR种类、包含SEQ ID NO: 4 (VQIINK)、SEQ ID NO: 5 (LDLSNVQSK)的氨基酸序列的MTBR种类、包含SEQ ID NO: 6 (HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)、SEQ ID NO: 8(IGSLDNITHVPGGGN)的氨基酸序列的MTBR种类、包含SEQ ID NO: 9 (VQIVYKPVDLSK)的氨基酸序列的MTBR种类或其组合，其中所述定量的MTRB-tau种类的量或其比率是受试者的脑中的tau蛋白病有关病理状况的表示。
在另一个具体实施方案中，本公开内容提供了用于测量受试者的脑中的tau沉积的方法，该方法包括提供从受试者中获得的处理的CSF或血液样品，其中使所述CSF或血液样品耗尽中部结构域tau且富集MTBR tau；并且在处理的样品中，定量包含SEQ ID NO: 2(IGSTENLK)的氨基酸序列的MTBR种类、包含SEQ ID NO: 3 (LQTAPVPMPDLK)的氨基酸序列的MTBR种类、包含SEQ ID NO: 4 (VQIINK)、SEQ ID NO: 5 (LDLSNVQSK)的氨基酸序列的MTBR种类、包含SEQ ID NO: 6 (HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)、SEQ ID NO: 8(IGSLDNITHVPGGGN)的氨基酸序列的MTBR种类、包含SEQ ID NO: 9 (VQIVYKPVDLSK)的氨基酸序列的MTBR种类或其组合，其中所述定量的MTRB-tau种类的量或其比率是受试者的脑中的tau沉积的表示。
在另一个具体实施方案中，本公开内容提供了用于测量受试者的脑中的tau沉积的方法，该方法包括提供从受试者中获得的处理的CSF或血液样品，其中使所述CSF或血液样品耗尽中部结构域tau且富集MTBR tau；并且在处理的样品中，定量包含SEQ ID NO: 2(IGSTENLK)的氨基酸序列的MTBR种类、包含SEQ ID NO: 4 (VQIINK)、SEQ ID NO: 5(LDLSNVQSK)的氨基酸序列的MTBR种类、包含SEQ ID NO: 6 (HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)、SEQID NO: 8 (IGSLDNITHVPGGGN)的氨基酸序列的MTBR种类、包含SEQ ID NO: 9(VQIVYKPVDLSK)的氨基酸序列的MTBR种类或其组合，其中所述定量的MTRB-tau种类的量或其比率是患有3R-tau蛋白病或4R-tau蛋白病(即，非AD tau蛋白病)的受试者的脑中的tau沉积的表示。
下述具体实施方案针对包括用于测量生物样品中的tau的方法的方法。在这些实施方案的各自中，用于测量生物样品中的tau的方法可以包括：(a)通过亲和力耗尽降低生物样品中的N末端tau、中部结构域tau或N末端tau和中部结构域tau，并且任选地通过亲和力耗尽降低淀粉样蛋白β，其中所述生物样品是血液样品或CSF样品，并且所述生物样品任选地包含同位素标记的tau的内部标准；(b)通过包括以下的方法富集tau：(i)通过蛋白质沉淀从生物样品中去除另外的蛋白质，并分离沉淀的蛋白质以获得上清液，然后通过固相提取从上清液中纯化tau，或(ii)使MTBR tau亲和纯化，从而通过(i)或(ii)产生富集的tau；(c)用蛋白酶切割富集的tau，然后任选地通过固相提取使所得的切割产物脱盐，以获得包含tau的蛋白酶解肽的样品；并且(d)对包含tau的蛋白酶解肽的样品执行液相层析 -质谱法(LC/MS)，以检测且测量tau的至少一种蛋白酶解肽的量。关于步骤(a)至(d)各自的进一步细节可以在通过引用并入本文的第II节中找到。
在另一个具体实施方案中，本公开内容提供了用于测量受试者中的阿尔茨海默氏病(AD)有关病理状况的方法，该方法包括根据上文提及的方法测量生物样品中的tau，其中所述测量的tau是包含SEQ ID NO: 3 (LQTAPVPMPDLK)的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 6 (HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 8(IGSLDNITHVPGGGN)的氨基酸序列的MTBR tau种类或其组合，其中所述MTRB-tau种类的量是受试者的脑中的AD有关病理状况的表示。
在另一个具体实施方案中，本公开内容提供了用于测量受试者的脑中的阿尔茨海默氏病(AD)有关tau沉积的方法，该方法包括根据上文提及的方法测量生物样品中的tau，其中所述测量的tau是包含SEQ ID NO: 3 (LQTAPVPMPDLK)的氨基酸序列的MTBR tau种类，并且其中所述MTRB-tau种类的量是受试者的脑中的AD有关病理状况的表示。
在另一个具体实施方案中，本公开内容提供了用于测量受试者的脑中的阿尔茨海默氏病(AD)有关tau沉积的方法，该方法包括根据上文提及的方法测量生物样品中的tau，其中所述测量的tau是包含SEQ ID NO: 3 (LQTAPVPMPDLK)的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 6 (HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ IDNO: 7 (IGSLDNITHVPGGGNK)的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 8(IGSLDNITHVPGGGN)的氨基酸序列的MTBR tau种类或其组合，并且其中所述MTRB-tau种类的量是受试者的脑中的AD有关病理状况的表示。
在另一个具体实施方案中，本公开内容提供了用于确定受试者的淀粉样蛋白状态的方法，该方法包括根据上文提及的方法测量生物样品中的tau，其中所述测量的tau是包含SEQ ID NO: 6 (HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)的氨基酸序列的MTBR tau种类，并且其中所述MTRB-tau种类的量是受试者的脑中的AD有关淀粉样蛋白β沉积的表示，并且如通过PIB-PET确定的，预测淀粉样蛋白阳性。
在另一个具体实施方案中，本公开内容提供了用于诊断阿尔茨海默氏病的方法，该方法包括根据上文提及的方法测量生物样品中的tau，其中所述测量的tau是包含SEQ IDNO: 3 (LQTAPVPMPDLK)的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 6(HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 7(IGSLDNITHVPGGGNK)的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 8(IGSLDNITHVPGGGN)的氨基酸序列的MTBR tau种类或其组合；并且当所述定量的MTBR tau种类相差约1.5σ或更多时，诊断阿尔茨海默氏病，其中σ是由对照群体中测量的正态分布定义的标准差，所述对照群体没有tau蛋白病的临床体征或症状，并且如通过PET成像和/或CSF中的Aβ42/40测量所测量的呈淀粉样蛋白阴性。
在另一个具体实施方案中，本公开内容提供了用于测量受试者中的阿尔茨海默氏病(AD)进展的方法，该方法包括根据上文提及的方法测量生物样品中的tau，其中所述测量的tau是包含SEQ ID NO: 3 (LQTAPVPMPDLK)的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ IDNO: 6 (HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 7(IGSLDNITHVPGGGNK)的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 8(IGSLDNITHVPGGGN)的氨基酸序列的MTBR tau种类或其组合；并且计算第二样品与第一样品中定量的MTBR tau种类的差异，其中所述第二样品中定量的MTBR tau种类的统计学显著增加指示了受试者的阿尔茨海默氏病的进展。
在另一个具体实施方案中，本公开内容提供了用于区分4R-tau蛋白病的方法，该方法包括根据上文提及的方法测量生物样品中的tau，其中所述测量的tau是(i)包含SEQID NO: 9 (VQIVYKPVDLSK)的氨基酸序列的MTBR tau种类，以及(ii)包含SEQ ID NO: 7(IGSLDNITHVPGGGNK)的氨基酸序列的MTBR tau种类、或包含SEQ ID NO: 8(IGSLDNITHVPGGGN)的氨基酸序列的MTBR tau种类；其中来自(i)和(ii)的定量的MTBR种类的比率将4R-tau蛋白病与阿尔茨海默氏病和健康状态区分开。
在另一个具体实施方案中，本公开内容提供了用于区分4R-tau蛋白病的方法，该方法包括根据上文提及的方法测量生物样品中的tau，其中所述测量的tau是(i)包含SEQID NO: 9 (VQIVYKPVDLSK)的氨基酸序列的MTBR tau种类，以及(ii)包含SEQ ID NO: 4(VQIINK)的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 5 (LDLSNVQSK)的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 6 (HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)的氨基酸序列的MTBR tau种类或其任何组合；其中来自(i)和(ii)的定量的MTBR种类的比率将4R-tau蛋白病与阿尔茨海默氏病和健康状态区分开。
在另一个具体实施方案中，本公开内容提供了用于区分4R-tau蛋白病的方法，该方法包括根据权利要求6至17中任一项的方法测量生物样品中的tau，其中所述测量的tau是(i)包含SEQ ID NO: 2 (IGSTENLK)的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 4(VQIINK)的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 5 (LDLSNVQSK)的氨基酸序列的MTBR tau种类或其组合，以及(ii)包含SEQ ID NO: 6 (HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 7 (IGSLDNITHVPGGGNK)的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 8 (IGSLDNITHVPGGGN)的氨基酸序列的MTBR tau种类或其组合，其中来自(i)和(ii)的定量的MTBR种类的比率将4R-tau蛋白病与阿尔茨海默氏病和健康状态区分开。
在另一个具体实施方案中，本公开内容提供了用于区分4R-tau蛋白病的方法，该方法包括根据上文提及的方法测量生物样品中的tau，其中所述测量的tau是(i)包含SEQID NO: 2 (IGSTENLK)的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 4 (VQIINK)的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 5 (LDLSNVQSK)的氨基酸序列的MTBR tau种类或其组合，以及(ii)包含SEQ ID NO: 7 (IGSLDNITHVPGGGNK)的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 8 (IGSLDNITHVPGGGN)的氨基酸序列的MTBR tau种类或其组合，其中来自(i)和(ii)的定量的MTBR种类的比率将4R-tau蛋白病与阿尔茨海默氏病和健康状态区分开。
在另一个具体实施方案中，本公开内容提供了用于区分4R-tau蛋白病的方法，该方法包括根据上文提及的方法测量生物样品中的tau，其中所述测量的tau是(i)包含SEQID NO: 6 (HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)的氨基酸序列的MTBR tau种类，以及(ii)包含SEQ IDNO: 7 (IGSLDNITHVPGGGNK)的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 8(IGSLDNITHVPGGGN)的氨基酸序列的MTBR tau种类或其组合，其中来自(i)和(ii)的定量的MTBR种类的比率将4R-tau蛋白病与阿尔茨海默氏病和健康状态区分开。
在另一个具体实施方案中，本公开内容提供了用于测量受试者中的tau蛋白病有关病理状况的方法，该方法包括根据上文提及的方法测量生物样品中的tau，其中使所述CSF或血液样品耗尽中部结构域tau且富集MTBR tau；并且在处理的样品中，定量包含SEQID NO: 2 (IGSTENLK)的氨基酸序列的MTBR种类、包含SEQ ID NO: 3 (LQTAPVPMPDLK)的氨基酸序列的MTBR种类、包含SEQ ID NO: 4 (VQIINK)、SEQ ID NO: 5 (LDLSNVQSK)的氨基酸序列的MTBR种类、包含SEQ ID NO: 6 (HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)、SEQ ID NO: 8(IGSLDNITHVPGGGN)的氨基酸序列的MTBR种类、包含SEQ ID NO: 9 (VQIVYKPVDLSK)的氨基酸序列的MTBR种类或其组合，其中所述定量的MTRB-tau种类的量或其比率是受试者的脑中的tau蛋白病有关病理状况的表示。
在一个具体实施方案中，本公开内容提供了用于测量受试者的脑中的tau沉积的方法，该方法包括根据上文提及的方法测量生物样品中的tau，其中使所述CSF或血液样品耗尽中部结构域tau且富集MTBR tau；并且在处理的样品中，定量包含SEQ ID NO: 2(IGSTENLK)的氨基酸序列的MTBR种类、包含SEQ ID NO: 3 (LQTAPVPMPDLK)的氨基酸序列的MTBR种类、包含SEQ ID NO: 4 (VQIINK)、SEQ ID NO: 5 (LDLSNVQSK)的氨基酸序列的MTBR种类、包含SEQ ID NO: 6 (HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)、SEQ ID NO: 8(IGSLDNITHVPGGGN)的氨基酸序列的MTBR种类、包含SEQ ID NO: 9 (VQIVYKPVDLSK)的氨基酸序列的MTBR种类或其组合，其中所述定量的MTRB-tau种类的量或其比率是受试者的脑中的tau沉积的表示。
在另一个具体实施方案中，本公开内容提供了用于治疗有需要的受试者的方法，该方法包括(a)提供从受试者中获得的处理的CSF或血液样品，其中使所述CSF或血液样品(i)耗尽中部结构域tau，且(ii)富集MTBR tau；(b)在处理的样品中，定量包含SEQ ID NO:2 (IGSTENLK)的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 3 (LQTAPVPMPDLK)的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 4 (VQIINK)的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 5 (LDLSNVQSK)的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 6(HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 7(IGSLDNITHVPGGGNK)的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 8(IGSLDNITHVPGGGN)的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 9 (VQIVYKPVDLSK)的氨基酸序列的MTBR tau种类或其组合；并且(c)向受试者施用治疗以改变tau病理状况，其中所述受试者的处理的CSF或血液样品具有相差约1.5σ或更多的定量的MTBR tau种类、或定量的MTBR tau种类的比率，其中σ是由对照群体中测量的正态分布定义的标准差，所述对照群体没有tau蛋白病的临床体征或症状，并且如通过PET成像和/或CSF中的Aβ42/40测量所测量的呈淀粉样蛋白阴性，并且其中所述定量的MTRB-tau种类的量或其比率是受试者的脑中的tau病理状况的表示。在一些实施方案中，向受试者施用治疗以改变tau病理状况，改变或稳定所定量的MTBR种类的量。在一些实施方案中，治疗是药物组合物，其包含胆碱酯酶抑制剂、N-甲基D-天冬氨酸(NMDA)拮抗剂、抗抑郁药(例如选择性血清素再摄取抑制剂、非典型抗抑郁药、氨基酮、选择性血清素和去甲肾上腺素再摄取抑制剂、三环抗抑郁药等)、γ-分泌酶抑制剂、β-分泌酶抑制剂、抗Aβ抗体(包括其抗原结合片段、变体或衍生物)、抗tau抗体(包括其抗原结合片段、变体或衍生物)、抗TREM2抗体(包括其抗原结合片段、变体或衍生物)、TREM2激动剂、干细胞、饮食补充剂(例如锂水、含硫辛酸的ω-3脂肪酸、长链甘油三酯、染料木黄酮、白藜芦醇、姜黄素和葡萄籽提取物等)、血清素受体6的拮抗剂、p38αMAPK抑制剂、重组粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、被动免疫疗法、主动疫苗(例如CAD106、AF20513等)、tau蛋白聚集抑制剂(例如TRx0237、甲硫鎓氯化物等)、改善血糖控制的疗法(例如胰岛素、艾塞那肽、利拉鲁肽、吡格列酮等)、消炎药、磷酸二酯酶9A抑制剂、σ-1受体激动剂、激酶抑制剂、磷酸酶激活剂、磷酸酶抑制剂、血管紧张素受体阻断剂、CB1和/或CB2内源性大麻素受体部分激动剂、β-2肾上腺素能受体激动剂、烟碱乙酰胆碱受体激动剂、5-HT2A反向激动剂、α-2c肾上腺素能受体拮抗剂、5-HT 1A和1D受体激动剂、谷氨酰肽环转移酶抑制剂、APP产生的选择性抑制剂、单胺氧化酶B抑制剂、谷氨酸受体拮抗剂、AMPA受体激动剂、神经生长因子刺激剂、HMG-CoA还原酶抑制剂、神经营养剂、毒蕈碱M1受体激动剂、GABA受体调节剂、PPAR-γ激动剂、微管蛋白调节剂、钙通道阻断剂、抗高血压药、他汀类药物及其任何组合。在一个示例性的实施方案中，药物组合物可以包含激酶抑制剂。合适的激酶抑制剂可以抑制一千零一氨基酸激酶(thousand-and-one amino acid kinase, TAOK)、CDK、GSK-3β、MARK、CDK5或Fyn。在另一个示例性的实施方案中，药物组合物可以包含磷酸酶激活剂。作为非限制性实例，磷酸酶激活剂可以增加蛋白质磷酸酶2A的活性。在一些实施方案中，治疗是包含tau靶向疗法的药物组合物，所述tau靶向疗法包括但不限于改变tau磷酸化模式、拮抗tau聚集、或增加病理tau同种型和/或聚集物的清除率的活性药物成分。在一些实施方案中，治疗是抗Aβ抗体、抗tau抗体、抗TREM2抗体、TREM2激动剂、γ-分泌酶抑制剂、β-分泌酶抑制剂、激酶抑制剂、磷酸酶激活剂、疫苗或tau蛋白聚集抑制剂。
在另一个具体实施方案中，本公开内容提供了用于治疗有需要的受试者的方法，该方法包括(a)提供从受试者中获得的处理的CSF或血液样品，其中使所述CSF或血液样品(i)耗尽中部结构域tau，且(ii)富集MTBR tau；(b)在处理的样品中，定量包含SEQ ID NO:3 (LQTAPVPMPDLK)的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 6(HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 7(IGSLDNITHVPGGGNK)的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 8(IGSLDNITHVPGGGN)的氨基酸序列的MTBR tau种类或其组合；并且(c)向受试者施用治疗以改变tau病理状况，其中所述受试者的处理的CSF或血液样品具有相差约1.5σ或更多的定量的MTBR tau种类、或定量的MTBR tau种类的比率，其中σ是由对照群体中测量的正态分布定义的标准差，所述对照群体没有tau蛋白病的临床体征或症状，并且如通过PET成像和/或CSF中的Aβ42/40测量所测量的呈淀粉样蛋白阴性，并且其中所述定量的MTRB-tau种类的量或其比率是受试者的脑中的tau病理状况的表示。在一些实施方案中，向受试者施用治疗以改变tau病理状况，改变或稳定所定量的MTBR种类的量。在一些实施方案中，治疗是药物组合物，其包含胆碱酯酶抑制剂、N-甲基D-天冬氨酸(NMDA)拮抗剂、抗抑郁药(例如选择性血清素再摄取抑制剂、非典型抗抑郁药、氨基酮、选择性血清素和去甲肾上腺素再摄取抑制剂、三环抗抑郁药等)、γ-分泌酶抑制剂、β-分泌酶抑制剂、抗Aβ抗体(包括其抗原结合片段、变体或衍生物)、抗tau抗体(包括其抗原结合片段、变体或衍生物)、抗TREM2抗体(包括其抗原结合片段、变体或衍生物)、TREM2激动剂、干细胞、饮食补充剂(例如锂水、含硫辛酸的ω-3脂肪酸、长链甘油三酯、染料木黄酮、白藜芦醇、姜黄素和葡萄籽提取物等)、血清素受体6的拮抗剂、p38α MAPK抑制剂、重组粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、被动免疫疗法、主动疫苗(例如CAD106、AF20513等)、tau蛋白聚集抑制剂(例如TRx0237、甲硫鎓氯化物等)、改善血糖控制的疗法(例如胰岛素、艾塞那肽、利拉鲁肽、吡格列酮等)、消炎药、磷酸二酯酶9A抑制剂、σ-1受体激动剂、激酶抑制剂、磷酸酶激活剂、磷酸酶抑制剂、血管紧张素受体阻断剂、CB1和/或CB2内源性大麻素受体部分激动剂、β-2肾上腺素能受体激动剂、烟碱乙酰胆碱受体激动剂、5-HT2A反向激动剂、α-2c肾上腺素能受体拮抗剂、5-HT 1A和1D受体激动剂、谷氨酰肽环转移酶抑制剂、APP产生的选择性抑制剂、单胺氧化酶B抑制剂、谷氨酸受体拮抗剂、AMPA受体激动剂、神经生长因子刺激剂、HMG-CoA还原酶抑制剂、神经营养剂、毒蕈碱M1受体激动剂、GABA受体调节剂、PPAR-γ激动剂、微管蛋白调节剂、钙通道阻断剂、抗高血压药、他汀类药物及其任何组合。在一个示例性的实施方案中，药物组合物可以包含激酶抑制剂。合适的激酶抑制剂可以抑制一千零一氨基酸激酶(TAOK)、CDK、GSK-3β、MARK、CDK5或Fyn。在另一个示例性的实施方案中，药物组合物可以包含磷酸酶激活剂。作为非限制性实例，磷酸酶激活剂可以增加蛋白质磷酸酶2A的活性。在一些实施方案中，治疗是包含tau靶向疗法的药物组合物，所述tau靶向疗法包括但不限于改变tau磷酸化模式、拮抗tau聚集、或增加病理tau同种型和/或聚集物的清除率的活性药物成分。在一些实施方案中，治疗是抗Aβ抗体、抗tau抗体、抗TREM2抗体、TREM2激动剂、γ-分泌酶抑制剂、β-分泌酶抑制剂、激酶抑制剂、磷酸酶激活剂、疫苗或tau蛋白聚集抑制剂。
实施例
下述实施例说明了本发明的各种迭代。本领域的技术人员应该了解，下述实施例中公开的技术代表了由本发明人发现在本发明的实践中良好发挥功能的技术。然而，按照本公开内容，本领域的技术人员应该了解，可以在所公开的具体实施方案中进行改变，并且仍获得相同或相似的结果，而不脱离本发明的精神和范围。因此，在附图中阐述或显示的所有事项都应解释为说明性的，而不是限制性含义。
实施例1
开发了几种样品处理方法 - Sato等人，2018中描述的用于N末端tau和中部结构域tau的免疫沉淀方法(IP)；化学提取方法(CX)；以及将IP和CX方法组合以富集MTBR tau的过程(IP后-CX)。CX和IP后-CX方法为检测且定量MTBR tau而特别开发。图2中提供了这些方法的概述。
简言之，将CSF (约475 μL)与含有15N Tau-441 (2N4R) Uniform Labeled的溶液(大约10 μL的100 pg/μL溶液、或大约5μL的200 pg/μL溶液)混合作为内部标准。N末端tau和中部结构域tau种类用Tau1和HJ8.5抗体进行免疫沉淀，然后如先前所述的(Sato等人，2018)进行处理和胰蛋白酶消化。
对于CX方法，将CSF (约475 μL)与含有15N Tau-441 (2N4R) Uniform Labeled的溶液(大约10 μL的100 pg/μL溶液、或大约5μL的200 pg/μL溶液)混合作为内部标准。然后，对tau进行化学提取。使用25 μL的高氯酸使高度丰富的CSF蛋白沉淀。在混合并在冰上温育15分钟后，将混合物在4℃下以20,000 g离心15分钟，并且根据下述步骤，使用Oasis HLB96-well µElution Plate (Waters)进一步纯化上清液。将板用300 μL甲醇洗涤一次，并且用500 μL 0.1% FA的水溶液平衡一次。将上清液加入Oasis HLB 96-well µElution Plate中，并且吸附至固相。然后，将固相用500 μL 0.1% FA的水溶液洗涤一次。加入洗脱缓冲液(100 μL；35%乙腈和0.1% FA的水溶液)，并且通过Speed-vac使洗出物干燥。干燥的样品通过50 μL在50 mM TEABC中的胰蛋白酶溶液(10 ng/μL)溶解，并且在37℃下温育20小时。
对于IP后-CX方法，免疫沉淀后的CSF (即，在上述IP方法后剩余的上清液)如CX方法中所述的进行处理。
在胰蛋白酶消化之后，所有样品都通过在C18 TopTip上的固相提取进行纯化。在这个纯化过程中，掺料了各5 fmol用于残基354-369 (MTBR tau-354)和354-368 (tau368)的AQUA内部标准肽，用于差异定量。在洗脱样品前，将3%过氧化氢和3% FA的水溶液加入珠中，随后为在4℃下的过夜温育，以使含有甲硫氨酸的肽氧化。在与以PRM模式操作的Orbitrap Fusion Lumos Tribrid或Orbitrap Tribrid Eclipse质谱仪(ThermoScientific)连接的nanoAcquity UPLC系统上的MS分析之前，使洗出物冻干并重悬浮于27.5 µL 2%乙腈和0.1% FA的水溶液中。
如图3A中所示，CX和IP后-CX方法产生包含可通过质谱仪检测和定量的MTBR tau的样品。通过IP方法并未获得MTBR tau的可定量信号。虽然并未证实，但认为也可以使用具有类似灵敏度的用于检测且定量MTBR tau的替代方法。
实施例2
在该实施例中，分析了来自患有迟发型阿尔茨海默氏病的受试者的两个临床队列(LOAD100和LOAD60)的CSF样品。表1和表2中提供了这一分析中使用的样品的临床痴呆评级(CDR)分数和淀粉样蛋白状态。CSF样品(各自约500 µl)通过IP后-CX方法进行处理，并且通过质谱法进行评估，如实施例1中所述。如先前所述的(Patterson BW等人，Ann Neurol2015，78: 439–453)，通过质谱法测量从CSF中免疫沉淀的CSF Aβ42和Aβ40。如先前所述的(Barthélemy，N.R.等人，Alz Res Therapy，2020，12: 26)，通过质谱法测量pT217%。
根据PiB-PET SUVR结果计算CSF Aβ42/40的截断值，以确定淀粉样蛋白状态。基于对于PiB-PET SUVR确定的截断>1.42 (Ann Neurol 2016；80:379–387)，对于CSF Aβ42/40，(灵敏度% + 特异性%)在0.1389下达到最大。值得注意的是，pT217%显示与通过确定截断定义的淀粉样蛋白状态的极佳关联性，仅具有单个离群值(图4)。
如图5-7中所示，在IP后-CX样品中测量的与MTBR相关的tau的胰蛋白酶肽，在淀粉样蛋白阳性受试者中特异性增加。即使在临床无症状阶段下，HVPG也是最显著增加的(图5-6)。HVPG和IGSL的增加在症状发作后是饱和的，而LQTA即使在临床发作后仍继续增加(图7-8)。如通过正电子发射断层扫描(PET)对于tau测量的，LQTA的浓度显示与tau病理状况的最高度关联性(皮尔森r=0.84，n=35)，以及与认知测试测量的最高度关联性(图9-12)。对于上述分析中的一些，将淀粉样蛋白阳性CDR 1和CDR 2样品的数据合并为CDR>1，并且将淀粉样蛋白阴性CDR 0.5和CDR 1的数据合并为CDR>0.5。统计分析通过单因素ANOVA进行，所述单因素ANOVA使用Benjamini - Hochberg FDR方法对于多重比较进行调整，其中FDR设定为5%。
重要的是，样品处理显示为影响tau的诊断效用。例如，虽然在IP后-CX样品中，MTBR tau的胰蛋白酶肽HVPG区别临床前阶段中的淀粉样蛋白阳性与淀粉样蛋白阴性受试者，但在IP样品中，用中部结构域tau的胰蛋白酶肽TPPS并未观察到这种区分力(图5)。TPPS胰蛋白酶肽的氨基酸序列是TPPSSGEPPK (SEQ ID NO: 10)。样品处理也显示为显著影响区分各种CSF样品之间的MTBR tau量的变化的能力。例如，胰蛋白酶肽LQTA在IP后-CX样品的有症状阶段后的CSF样品中显示线性增长，但在IP样品中并非如此(图13)，指示了IP后-LQTA (中部结构域不依赖性MTBR tau-243)明确地比IP-LQTA更好地区分淀粉样蛋白状态(图14)。
上文数据提示了，在AD脑聚集物中富集的MTBR tau在AD CSF中也是增加的。假设胰蛋白酶肽LQTA和HVPG分别是tau细丝聚集的绒毛状外被(fuzzy-coat)和起点的部分，而IGSL在核心内部。LQTA肽作为绒毛状外被在细丝的表面上的位置可能总是使其暴露，增加了其释放到CSF内的可能性。鉴于HVPG在聚集中的作用，未成熟的细丝可能仍使HPVG在表面上暴露，而肽可能募集到成熟细丝的核心中。IGSL在细丝的核心中的断定位置甚至在AD的早期阶段也可预期。
不管潜在机制如何，数据提示了CSF中的胰蛋白酶HVPG和LQTA可以分别用作生物标记物，以概括AD中的淀粉样蛋白状态和tau病理状况。值得注意的是，仅LQTA显示在tau-PET以及淀粉样蛋白状态和认知能力下降方面随着疾病进展的持续增加，其提示了该区域是区别AD中的tau病理状况的关键。当对受试者的疾病轨迹进行分期时，与胰蛋白酶IGSL和/或其它生物标记物组合的这些肽的使用将加强区分力(图15-17)。另外，LQTA和其它MTBR tau肽可以用作生物标记物，以区别各种tau蛋白病。
表1：LOAD100的人口统计学
表2：LOAD60的人口统计学
实施例3
在该实施例中，详细描述了MTBR tau种类作为阿尔茨海默氏病生物标记物的存在和潜在效用。结果显示了CSF中存在显著量的中部结构域不依赖性MTBR tau - 即，已在多肽序列的中心附近(例如tau-441的氨基酸224周围)切割的tau种类，导致缺乏N末端和中部结构域区域的C末端片段(“C末端残端”)。此外，CSF MTBR tau的不同区域对疾病进展进行分期，并且与阿尔茨海默氏病的脑内的tau聚集相关联。这些发现为脑和CSF中的MTBR tau之间的关系提供了新的见解，并且支持CSF tau作为用于阿尔茨海默氏病的流体生物标记物的用途。
材料：该实施例的实验中使用了人脑样品的两个不同队列 - 发现队列和验证队列。发现队列含有来自具有阿尔茨海默氏病病理状况的两个参与者和没有病理状况的两个对照参与者的死后冷冻的脑组织样品，其由Washington University School of Medicine的Knight ADRC Pathology Core提供。根据美国国家老龄化研究所(National Instituteon Aging)和阿尔茨海默氏病协会(Alzheimer’s Association)，每个样品对于淀粉样蛋白沉积分类为淀粉样蛋白A3期(Thal阶段)，并且对于tau聚集分类为Tau Braak VI，B3期。来自每个参与者的样品从六到十个脑区域中进行收集，所述脑区域包括小脑、额上回、额极、颞叶、枕骨、丘脑、杏仁核、脑桥、顶叶和纹状体。分析了来自顶叶的另外的死后冷冻的脑组织样品，其来自作为验证队列的20个参与者(根据CSF Aβ 42/40比率，8个淀粉样蛋白阴性和12个淀粉样蛋白阳性)。12个淀粉样蛋白阳性的样品根据其临床痴呆分级(CDR)分数进一步分成临床组，并且分类为极轻度至中度阿尔茨海默氏病(淀粉样蛋白阳性，CDR=0.5 - 2，n=5)或重度阿尔茨海默氏病(淀粉样蛋白阳性，CDR=3，n=7)。这些人研究得到了华盛顿大学机构审查委员会(Washington University Institutional Review Board)的批准。
该实施例的实验中还使用了人CSF样品的三个不同队列 - 横断面队列、纵向队列和Tau PET队列(表3A和表3B)。从淀粉样蛋白β (Aβ)稳定同位素标记动力学(SILK)研究(Patterson等人，2015)中收集来自100个参与者的CSF样品，用于作为横断面队列的分析。该队列在实施例2中也被称为LOAD100队列。CSF收集如先前所述的(Patterson等人，2015)执行。简言之，在基线时收集CSF。接下来，参与者接受经过10分钟的亮氨酸推注输注。每小时获得6 mL CSF共36小时。在这项研究中，在第30小时收集的CSF等分试样用于tau种类的MS测量。淀粉样蛋白状态使用CSF Aβ 42/40比率进行定义，如先前报道的(Patterson等人，2015)。相应的截断比率(0.1389)使预测淀粉样蛋白阳性方面的准确度达到最大，如通过匹兹堡化合物B (PiB) PET确定的。如表3A中所示，根据其CDR分数，将淀粉样蛋白组进一步划分成临床组。从横断面队列中，对28个参与者(14个淀粉样蛋白阳性和14个淀粉样蛋白阴性)跟踪了2至9年，以评价CSF中的tau种类的纵向轨迹。CSF样品以与横断面队列相同的方式进行收集且分析。Tau PET队列含有35个参与者(20个淀粉样蛋白阳性和15个淀粉样蛋白阴性，包括来自纵向队列的16个参与者)，其在CSF收集时间起的三年内具有tau PET AV-1451标准化摄取值比(SUVR)测量。PET扫描如先前所述的(Sato等人，2018)执行，并且使用区域扩散函数技术(Su等人，2015)，对于SUVR执行部分体积校正。CSF样品以与其它队列相同的方式进行收集且分析。
表3A - 横断面队列
表3B - 纵向队列和Tau PET队列
通过MS的脑tau分析：在-20℃下使用低温恒温器将冷冻的脑组织样品切片，并收集在管中。组织(300 - 400 mg)在冰冷的缓冲液中进行超声处理，所述缓冲液含有25 mMtris盐酸盐(pH 7.4)、150 mM氯化钠、10 mM乙二胺四乙酸、10 mM乙二醇四乙酸、磷酸酶抑制剂混合物和浓度为0.3 mg/μL脑组织的蛋白酶抑制剂混合物。通过在4℃下以11,000 g离心20分钟，使匀浆澄清。将上清液(全脑提取物)等分到新管内，并且保持在-80℃下直至使用。使全脑提取物与1% sarkosyl一起在冰上温育60分钟，随后为在4℃下以100,000 g的超速离心共60分钟，以获得不溶性团块。不溶性团块用200 μL PBS重悬浮，随后为超声处理，并且不溶性悬浮液保持在-80℃下直至使用。
对于可溶性tau分析，用Tau1和HJ8.5抗体使全脑提取物中的tau种类免疫沉淀。免疫沉淀的可溶性tau种类如先前所述的(Sato等人，2018)进行处理且消化。
对于不溶性tau分析，将不溶性悬浮液(10至20 μL，含有2.5 μg总蛋白)与200 μL裂解缓冲液(7 M尿素、2M硫脲、3% 3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸酯、1.5%正辛基葡糖苷、100 mM三乙基碳酸氢铵(TEABC))混合，随后用5 μL作为内部标准的含有15N Tau-441 (2N4R) Uniform Labeled的溶液(2 ng/μL，来自Dr. Guy Lippens，LilleUniversity，法国的馈赠)掺料。将5 μL的500 mM二硫苏糖醇加入悬浮液中，随后为超声处理。将所得到的溶液与15 μL的500 mM碘乙酰胺混合，并且在室温下在黑暗中温育30分钟。如先前报道的(Roberts等人，2020)，蛋白质消化使用过滤辅助的样品制备方法来进行。简言之，将每种制备溶液装载到Nanosep 10K过滤单元(PALL)上并离心。在用8 M尿素的100mM TEABC溶液洗涤过滤单元上的样品后，在37℃下使用0.25 μg内切蛋白酶Lys-C消化过滤器上的固定化蛋白质共60分钟。然后，在37℃下使用0.4 μg胰蛋白酶将样品进一步消化过夜。
消化的样品(可溶性和不可溶性tau种类)通过离心进行收集，然后通过C18TopTip (Glygen)进行脱盐。在这个纯化过程中，掺料了各50 fmol用于残基354-369 (MTBRtau-354)和354-368 (tau368)的AQUA内部标准肽，用于差异定量。在洗脱样品前，将3%过氧化氢和3%甲酸(FA)的水溶液加入珠上，随后为在4℃下的过夜温育，以使含有甲硫氨酸的肽氧化。在与以平行反应监测(PRM)模式操作的Orbitrap Fusion Tribrid或OrbitrapTribrid Eclipse (Thermo Scientific)连接的nanoAcquity UPLC系统(Waters)上的MS分析之前，使洗出物冻干并重悬浮于27.5 µL 2%乙腈和0.1% FA的水溶液中。
通过与来自15N或AQUA内部标准的相应同位素异构体(isotopomer)信号的比较，定量来自可溶性和不溶性tau种类两者的16种脑tau肽(表4)。通过经由中部结构域tau肽(残基181-190)将每种肽的量标准化，执行跨越脑样品的肽概况比较。
表4
通过MS的CSF tau分析：将CSF (455 μL)与10 μL含有15N Tau-441 (2N4R)Uniform Labeled (100 pg/µL)的溶液混合作为内部标准。用Tau1和HJ8.5抗体使主要由N末端至中部结构域区域组成的tau种类免疫沉淀。免疫沉淀的tau种类如先前所述的(Sato等人，2018)进行处理且消化。随后，将20 μL的15N-tau内部标准(100 pg/μL)掺料到免疫沉淀后的CSF内。然后，如先前报道的(Barthélemy等人，2016b)，伴随一些修改，对tau进行化学提取。使用25 μL的高氯酸使高度丰富的CSF蛋白沉淀。在混合并在冰上温育15分钟后，将混合物在4℃下以20,000 g离心15分钟，并且根据下述步骤，使用Oasis HLB 96-well µElution Plate (Waters)进一步纯化上清液。将板用300 μL甲醇洗涤一次，并且用500 μL0.1% FA的水溶液平衡一次。将上清液加入Oasis HLB 96-well µElution Plate中，并且吸附至固相。然后，将固相用500 μL 0.1% FA的水溶液洗涤一次。加入洗脱缓冲液(100 μL；35%乙腈和0.1% FA的水溶液)，并且通过Speed-vac使洗出物干燥。干燥的样品通过50 μL在50 mM TEABC中的胰蛋白酶溶液(10 ng/μL)溶解，并且在37℃下温育20小时。
对于免疫沉淀和化学提取的样品两者，在温育后，每种胰蛋白酶消化物通过在C18TopTip上的固相提取进行纯化。在这个纯化过程中，掺料了各5 fmol用于残基354-369(MTBR tau-354)和354-368 (tau368)的AQUA内部标准肽，用于差异定量。在洗脱样品前，将3%过氧化氢和3% FA的水溶液加入珠中，随后为在4℃下的过夜温育，以使含有甲硫氨酸的肽氧化。在与以PRM模式操作的Orbitrap Fusion Lumos Tribrid或Orbitrap TribridEclipse质谱仪(Thermo Scientific)连接的nanoAcquity UPLC系统上的MS分析之前，使洗出物冻干并重悬浮于27.5 µL 2%乙腈和0.1% FA的水溶液中。定量了19种CSF tau肽(表4)。图2A中描述了CSF tau分析的示意性程序。
统计分析：除非另有说明，否则生物标记物值的差异用单因素ANOVA进行评价。双侧p<0.05被视为统计学显著的，并且使用Benjamini-Hochberg错误发现率(FDR)方法对于多重比较进行校正，其中FDR设定为5% (Benjamini和Hochberg，1995)。斯皮尔曼相关性用于评价tau生物标记物与认知测试测量和tau PET SUVR之间的关联。
结果 - 阿尔茨海默氏病的脑中的tau种类的富集概况分析：假设阿尔茨海默氏病的脑中的tau聚集将在CSF中的tau概况中得到反映。因此，首先分析了来自阿尔茨海默氏病和对照脑的不溶性提取物中的tau概况(图18B：发现队列)，以稍后与CSF tau概况进行比较。确定含有分别定位于R2和R3结构域之间和R4结构域内的残基299-317 (MTBR tau-299)和354-369 (MTBR tau-354)的种类在来自阿尔茨海默氏病的脑的不溶性提取物中的富集是对照的3-4倍。含有残基243-254的MTBR的上游区域(MTBR tau-243)在阿尔茨海默氏病的脑中也是对照的约3倍，而含有分别定位于R1和R2结构域内的残基260-267和275-280的种类，在阿尔茨海默氏病和对照组织之间并无不同。与对照相比，阿尔茨海默氏病的脑中没有tau的其它区域富集。值得注意的是，与对照相比，含有在中部结构域内的残基195-209的种类在阿尔茨海默氏病的脑中特别低，很可能是在不溶性tau聚集物的残基199、202、205和208上发生的广泛过度磷酸化的结果(Malia等人，2016)。值得注意的是，在对照和阿尔茨海默氏病之间，对于可溶性tau (全脑提取物)中鉴定的MTBR tau种类没有观察到变化(图23A)。这些结果在来自对照(淀粉样蛋白阴性，n=8)、极轻度至中度阿尔茨海默氏病(淀粉样蛋白阳性，CDR=0.5 - 2，n=5)、以及重度阿尔茨海默氏病(淀粉样蛋白阳性，CDR=3，n=7)参与者(图18C和图23B：验证队列)的脑样品中得到再现，其提示了MTBR tau-243、299和354种类在疾病进展的各阶段在不溶性tau聚集物中特别富集。
接下来，最近报道的通过天冬酰胺内肽酶生成的截短的tau368 (残基354-368)种类(Zhang等人，2014；Blennow等人，2020)针对其配对的非截短种类MTBR tau-354进行检查，并且对脑不溶性提取物中的两个种类进行定量(图24)。发现了tau368和MTBR tau-354之间的高度关联性(r=0.9783)，提示了在脑病理状况的不同阶段，在残基368处的截短以相同速率发生。
结果- CSF中的MTBR tau的定量：为了确定阿尔茨海默氏病的脑聚集物中的MTBRtau的富集是否与CSF中的可溶性tau种类的水平有关，我们开发了方法来分析CSF中的MTBRtau。该方法利用免疫沉淀后(Tau1/HJ8.5) CSF中的tau化学提取，随后为MS分析(图2A)。这种方法提供了用于定量MTBR肽的充分回收(图25)。在化学提取前通过Tau1/HJ8.5免疫沉淀方法回收的Tau肽丰度在残基222后急剧降低(Sato等人，2018)。相比之下，通过IP后-CX方法定量的MTBR tau种类的浓度与N末端至中部结构域区域相比相对较低，但仍可与通过免疫沉淀的其它tau区域比较(图19)。来自正常对照参与者的CSF浓度(计算为来自免疫沉淀和化学提取方法的总值)，对于中部结构域种类(残基151-155、181-190、195-209和212-221)范围为8.2至32.0 ng/mL，对于MTBR tau种类(残基243-254、260-267、275-280、282-290、299-317和354-369)范围为0. 4至3.7 ng/mL，并且对于非MTBR C末端tau种类(残基386-395和396-406)范围为6.5和5.1 ng/mL。含有C末端的截短tau种类的CSF浓度在与含有中部结构域(残基195-209和212-221)的tau种类相似的范围内，提示了tau的C末端侧在神经元细胞中也是截短的，并且以与N末端至中部结构域tau相同的方式细胞外分泌(Sato等人，2018)。
结果 - 阿尔茨海默氏病横断面队列中的CSF MTBR tau：为了确定细胞外空间中存在的含有MTBR的种类是否反映阿尔茨海默氏病有关的变化，分析了来自处于不同临床阶段的淀粉样蛋白阴性和淀粉样蛋白阳性参与者的横断面队列的CSF：淀粉样蛋白阴性CDR=0(对照，n=30)，淀粉样蛋白阳性CDR=0 (临床前AD，n=18)，淀粉样蛋白阳性CDR=0.5 (极轻度AD，n=28)，淀粉样蛋白阳性CDR≥1 (轻度-中度AD，n=12)，以及淀粉样蛋白阴性CDR≥0.5(非AD认知损害，n=12)。
首先，调查了在阿尔茨海默氏病的脑中特别富集的三个MTBR tau种类(MTBR tau-243、MTBR tau-299和MTBR tau-354)的CSF水平(图20)。所有三个种类都存在于阿尔茨海默氏病和对照CSF两者中，并且当与对照组相比时，即使对于无症状阶段(CDR=0)，淀粉样蛋白阳性组中的水平也是更大的(MTBR tau-243 p=0.0170、MTBR tau-299 p=0.0002和MTBRtau-354 p=0.0076)。值得注意的是，这些种类在临床疾病发作后的CSF中具有独特特性。与对照相比，MTBR tau-299水平在临床前AD中为204%，但在极轻度AD (CDR=0.5)和轻度-中度AD (CDR≥1)之间是饱和的(p=0.2541)，而MTBR tau-354水平在症状发作后收集的样品中显著更低(p=0.0345)。相比之下，MTBR tau-243水平跨越所有疾病阶段(包括在症状发作后)都是逐渐升高的(p=0.0025)。这些结果提示了，即使在MTBR tau种类内的区域特异性也可以区别不同的阿尔茨海默氏病阶段，并且MTBR tau-243是良好的阿尔茨海默氏病阶段特异性标记物。
接下来调查的是，当与含有其它区域的tau种类相比时，CSF MTBR tau种类是否在对阿尔茨海默氏病进行分期方面提供增强的灵敏度和特异性。通过区域特异性方法来定量含有N末端、中部结构域、MTBR和C末端结构域的多重种类(图26、图27、图28)。通过免疫沉淀(IP方法)以及免疫沉淀后CSF的化学提取(IP后-CX方法)，来定量N末端和中部结构域种类，而MTBR至C末端种类仅通过免疫沉淀后CSF的化学提取方法(IP后-CX方法)进行定量，因为通过免疫沉淀没有获得可定量的信号。通过免疫沉淀方法定量的含有N末端结构的种类水平在对照和无症状阶段(除了残基6-23之外，p=0.0362)或其它相邻疾病阶段之间并无不同。根据免疫沉淀方法的中部结构域种类水平在无症状淀粉样蛋白阶段明显大于对照(除了残基212-221之外，p=0.0762)，但与MTBR tau种类相比，效应量相对适中(相对于对照123% – 168%) (例如，MTBR tau-299水平在临床前AD阶段为对照的>200%)，并且跨越晚期疾病阶段并无不同。不管提取方法如何，与N末端至中部结构域种类(残基6-23至226-230，图28)相比，MTBR tau-243、299和354种类在对照和疾病阶段之间显示更大的差异。来自含有MTBR至C末端结构域的其它种类(残基260-267、275-280、282-290、386-395和396-406)的概况类似于中部结构域种类，并且对于阿尔茨海默氏病的临床痴呆阶段并非特异性的。
总之，在阿尔茨海默氏病的脑中富集的含有MTBR的三个代表性种类(MTBR tau-243、MTBR tau-299和MTBR tau-354) (图18)在CSF中具有相似的特性，其中MTBR tau-243显示出对阿尔茨海默氏病的痴呆阶段的最大特异性。值得注意的是，在CSF中的tau368截短形式和MTBR tau-354非截短形式之间观察到高度关联性(r=0.8382) (图29)。可以可靠地区别阿尔茨海默氏病的临床阶段的唯一种类是MTBR tau-243。
结果 - 中部结构域不依赖性MTBR tau-243作为对阿尔茨海默氏病进行分期的特异性生物标记物：MTBR tau-243种类跨越阿尔茨海默氏病的临床痴呆阶段逐渐更大的水平，提示了它可能是疾病进展的可靠预测因素。接下来调查的是，哪些MTBR tau种类(MTBRtau-243、MTBR tau-299和MTBR tau-354)与认知测试如CDR总分(CDR-SB)和简易精神状态检查表(MMSE)的结果具有最高关联性。发现淀粉样蛋白阳性组中的中部结构域不依赖性MTBR tau-243种类与CDR-SB和MMSE两者高度相关联(分别为r=0.5562，p<0.0001和r=-0.5433，p<0.0001) (图30和图31)。其它种类水平与认知测试具有低得多的关联性或没有显著关联性(表5)，其提示了CSF MTBR tau-243在阿尔茨海默氏病的各临床阶段自始至终进展时，特异性区别临床阶段和总体疾病进展与无症状阶段。
表5：每个CSF tau种类和认知测量之间的关联性：与其它tau种类相比，中部结构域不依赖性MTBR tau-243 (IP后-CX方法)与认知测量更好地相关联
结果 - 阿尔茨海默氏病纵向队列中的CSF MTBR tau：从横断面队列中，对参与者子集(n=28)跟踪了2至9年，以测量CSF中的MTBR tau的纵向轨迹(表6)。在阿尔茨海默氏病的脑中富集的MTBR tau种类(MTBR tau-243、MTBR tau-299和MTBR tau-354)在淀粉样蛋白阳性组中随着时间过去而显著增加(通过第1次就诊和第2次就诊之间的双尾配对t检验，p<0.01)，但在淀粉样蛋白阴性组中并非如此，除了MTBR tau-243之外(图32)。淀粉样蛋白阴性组也显示MTBR tau-243的轻微纵向增加，但低于对于淀粉样蛋白阳性组观察到的(淀粉样蛋白阴性组和阳性组中的差异平均值分别为=0.4926和2.208)。
图21显示了各个参与者中的MTBR tau种类浓度的纵向变化率。值得注意的是，在疾病发作后具有最高CDR的一个参与者(参与者A) (在7年内，从CDR=1变为2)显示了对于每个MTBR tau种类的特定轨迹概况。即使从轻度AD (CDR=1)到中度AD (CDR=2)，MTBR tau-243也持续增加，而MTBR tau-299和MTBR tau-354在轻度AD后在该参与者的CSF中显示了降低。淀粉样蛋白阳性组中的其它参与者在第1次就诊时分类为临床前AD或极轻度AD (分别为CDR=0或0.5)，并且对于大多数参与者，可见每个种类水平渐增的趋势，其支持了来自横断面队列的发现。
表6
结果 - 与tau PET成像的关联性：如通过tau PET扫描测量的Tau病理状况与阿尔茨海默氏病的认知衰退和临床阶段强烈相关联(Arriagada等人，1992；Johnson等人，2016；Ossenkoppele等人，2016；Bejanin等人，2017；Jack等人，2018；Gordon等人，2019)。接下来调查的是，CSF中的MTBR tau是否与通过tau PET测量的脑tau病理状况相关联(图22)。中部结构域不依赖性MTBR tau-243与tau PET SUVR显著相关联(r=0.7588，p<0.0001)，而MTBRtau-299和MTBR tau-354的关联性低得多(分别为r=0.4584，p=0.0056和r=0.4375，p=0.0086)。含有残基226-230的tau种类也显示与tau PET SUVR的高度关联性(r=0.6248，p<0.0001，表7)，但低于对于MTBR tau-243观察到的。这提示了CSF MTBR tau-243和周围区域可能是脑中的tau聚集的替代生物标记物。特异性且定量地追踪脑中的tau病理状况的能力是对于阿尔茨海默氏病临床研究更需要的生物标记物。
表7：每个CSF tau种类和tau PET SUVR之间的关联性：与其它tau种类相比，中部结构域不依赖性MTBR tau-243与tau病理状况更好地相关联
| 残基(缩写) | 制备方法 | r | p值 |
| 6–23 | IP | 0.5361 | 0.0011 |
| 25–44 | IP | 0.4411 | 0.0090 |
| 45-67 | IP | 0.5276 | 0.0013 |
| 68-87 | IP | 0.4700 | 0.0050 |
| 88-126 | IP | 0.3928 | 0.0215 |
| 151-155 | IP | 0.5501 | 0.0006 |
| 181-190 | IP | 0.5315 | 0.0010 |
| 195-209 | IP | 0.5471 | 0.0007 |
| 212-221 | IP | 0.4779 | 0.0037 |
| 226-230 | IP | 0.6248 | <0.0001 |
| 243-254 | IP | 0.6346 | <0.0001 |
| 243-254 (MTBR tau-243) | IP后-CX | 0.7588 | <0.0001 |
| 260-267 | IP后-CX | 0.3787 | 0.0249 |
| 275-280 | IP后-CX | 0.5263 | 0.0012 |
| 282-290 | IP后-CX | 0.5003 | 0.0022 |
| 299-317 (MTBR tau-299) | IP后-CX | 0.4584 | 0.0056 |
| 354-369 (MTBR tau-354) | IP后-CX | 0.4375 | 0.0086 |
| 386-395 | IP后-CX | 0.4139 | 0.0185 |
| 396-406 | IP后-CX | 0.3843 | 0.0248 |
讨论：tau的MTBR区域已主要在脑聚集物中进行调查，但在CSF中并未进行广泛调查。在这项研究中，使用灵敏且不依赖抗体的方法来分析CSF tau，显示了来自人参与者的CSF样品中tau的MTBR区域的存在和定量。由于测定法局限性包括抗体特异性或敏感性、或者恢复由CSF中的MTBR种类采用的潜在构象的能力，利用抗体依赖性测定法的过去研究(Meredith等人，2013；Sato等人，2018)可能未能检测到CSF中的含有MTBR的tau种类。可替代地，MTBR tau可能被各种蛋白酶截短，生成在常规免疫测定法中或免疫沉淀随后为MS测定法无法检测到的片段(Gamblin等人，2003；Cotman等人，2005；Zhang等人，2014；Zhao等人，2016；Chen等人，2018；Quinn等人，2018)。在这项研究中，通过使用IP后-CX方法，随后为质谱法，与中部结构域tau种类相比，测量到以约1%至10%的令人惊讶地稳固的MTBR tau种类浓度(图19和图2A)。
迄今为止，MTBR tau是否可以涉及细胞外tau传播还不清楚，因为细胞外水平被认为太低而无法播种且扩散病理状况。关于CSF中MTBR的化学计量学的这些新发现支持了含有MTBR的种类可以作为病理性种类在细胞外扩散的假设。这些测量也告知了用于阿尔茨海默氏病的开发中的抗tau药物的潜在靶，并且提供了靶的定量测量，如通过来自阿尔茨海默氏病患者的CSF中的MTBR tau种类的2倍至3倍增加显示的。然而，局限性在于病理性种类可能存在于间质液(ISF)而不是CSF中(Colin等人，2020)。尽管一些报道揭示了CSF tau主要源于ISF (Reiber，2001)，并且来自阿尔茨海默氏病患者的人CSF可以在转基因小鼠模型中诱导tau播种(Skachokova等人，2019)，但需要进一步调查以解决CSF中检测到的tau种类是否反映可以在人脑中传播的病理性tau的问题。
先前研究显示了，将阿尔茨海默氏病的脑tau聚集物接种到小鼠脑内，诱导严重的tau病理状况(Guo等人，2016；Narasimhan等人，2017)；然而，并不存在鉴定细胞外空间内的病理性tau种类也与人中的疾病进展相联系的报道。这导致CSF MTBR tau种类是否在阿尔茨海默氏病中改变的测试，以及其作为新型阿尔茨海默氏病生物标记物的适合性的探索。发现CSF MTBR tau水平在阿尔茨海默氏病中升高，并且与阿尔茨海默氏病的脑不溶性级分中富集的种类一致。CSF MTBR tau与阿尔茨海默氏病的临床阶段和tau病理状况相关联的发现，提示了MTBR tau与阿尔茨海默氏病中的tau传播机制有关，尽管细胞外CSF MTBR tau的性质(即单体、低聚物或原纤维种类)和起源仍是未知的。CSF MTBR tau可以源于脑聚集物或活跃分泌单体种类的神经元是可能的，并且未来的研究应该设计为解决这个问题。
有趣的是，发现CSF MTBR tau种类的变化轨迹跨越MTBR的不同区域并且在阿尔茨海默氏病的每个临床阶段是独特的。我们断定这一发现是由于如通过最近的Cryo-EM发现确定的tau的结构变化。Cryo-EM分析提示了，tau聚集物的有序β-片层核心在残基306处起始(Fitzpatrick等人，2017)。因此，MTBR tau-354 (含有残基354-369)、MTBR tau-299 (含有残基299-317)和MTBR tau-243 (含有残基243-254)分别代表细丝核心的内侧、边界和外侧。与MTBR tau-354和MTBR tau-299两者形成对比，MTBR tau-243水平跨越所有疾病阶段都是逐渐更大的。CSF中的MTBR tau-243和附近区域(即残基226-230)水平也与tau PETSUVR表现高度相关联(图22和表7)，其支持了MTBR tau-243和潜在地附近区域沉积到脑tau聚集物内，并且也在细胞外分泌的假设(图17)。
MTBR tau与阿尔茨海默氏病的病理状况和临床进展阶段高度相关联的发现，提供了用于治疗tau蛋白病的治疗性抗tau药物的有希望靶的重要见解。例如，识别MTBR的上游区域中的表位(残基235-250)的新型tau抗体，在基于细胞的测定法中，证实了减轻来自阿尔茨海默氏病和进行性核上麻痹的脑的tau播种的显著和选择性能力(Courade等人，2018)。这些发现提示了，MTBR的上游区域可以与细胞外的病理性tau有关。这得到以下支持：在已用人阿尔茨海默氏病的脑提取物进行注射的转基因小鼠中，抗体减轻了tau病理状况向远端脑区域的传播(Albert等人，2019)。识别MTBR的上游区域中的表位(残基249-258)的另一种新型tau抗体，证实了在通过人阿尔茨海默氏病的脑提取物播种的细胞和体内转基因小鼠模型中，诱导tau病理状况的减少(Vandermeeren等人，2018)。靶向MTBR tau-299和MTBR tau-354种类的抗体也减轻了通过P301L tau或阿尔茨海默氏病的脑提取物的播种诱导的tau病理状况(Weisová等人，2019；Roberts等人，2020)，这支持了含有MTBR特定区域的种类导致tau蛋白病中的tau病理状况扩散的假设。
总之，发现CSF中的MTBR tau种类作为C末端片段存在，并且在阿尔茨海默氏病中特异性增加，反映了在阿尔茨海默氏病的脑聚集物中可见的富集。该发现提示了，特定的含有MTBR的种类(MTBR tau-299和MTBR tau-243)是测量阿尔茨海默氏病中的淀粉样蛋白和tau病理状况的有希望的CSF生物标记物。特别地，中部结构域不依赖性MTBR tau-243与阿尔茨海默氏病中的疾病进展和tau病理状况相平行，并且可以用作tau病理状况的生物标记物和新型抗tau抗体疗法的靶。
实施例4
开发了被称为“IP后-IP”的另外的样品处理方法，并且与实施例1和2中描述的IP后-CX方法进行比较。图33中提供了IP后-IP方法的示例性工作流。
从实施例2中描述的LOAD100队列中获得的CSF样品通过IP后-CX方法(实施例1)或IP后-IP方法(该实施例)进行处理，然后如实施例2中一般描述的通过LC-MS进行分析。
如图34A中所示，胰蛋白酶肽LQTA显示了在两个样品之间不同的概况。例如，即使在临床发作后，在通过IP后-CX方法处理的样品中也测量到的LQTA量的持续增加，在通过IP后-IP方法处理的样品中并未观察到。相比之下，在通过IP后-CX和IP后-IP方法处理的样品之间，胰蛋白酶肽HVPG和IGSL显示了相似的概况(图34B和图34C)。另外的胰蛋白酶肽的进一步分析提示了，在LQTA和IGST肽之间的氨基酸序列内的R1中可能发生重要的切割事件(图35A)。
尽管在LQTA下游(即C末端)的所有胰蛋白酶肽的丰度显示了在样品处理方法之间较好的关联性(基于R2值，参见图35)，但在胰蛋白酶肽HVPG和IGSL之间的R2值中存在明显的降低。为了进一步探索这一点，将样品按CDR分数分组 - 更具体而言，认知受损的受试者(CI，CDR>0.5)和认知未受损的受试者(CDR<0.5)。如图36B中所示，对于HVPG和IGSL胰蛋白酶肽，仅认知受损的受试者显示了在通过IP后-CX相对于IP后-IP方法处理的样品之间的低关联性。这可能反映了脑中发生的tau-聚集，其将包含HVPG和IGSL胰蛋白酶肽的tau区域募集到聚集物内，从而导致CSF和其它生物流体中包含这些肽的tau种类的量改变。
总的来说，这些数据指示了，样品处理方法的选择影响在CSF和其它生物流体中检测到概括CNS中的tau病理状况的MTBR tau种类的能力。
实施例5
在该实施例中，来自受试者的三个临床队列的CSF样品通过IP方法(实施例1)和IP后-IP方法(实施例4)进行处理，并且如实施例3中一般描述的，通过质谱法进行评估。样品得自对照受试者(n=93)，淀粉样蛋白阳性的患有AD的受试者(n=41)，患有非AD tau蛋白病的受试者(n=87)。患有非AD tau蛋白病的受试者在临床上诊断有CBD或CBD/PSP (n=20)，FTD (n=29)，FTLD (R406W n=7，P301L n=3)，PSP (n=18)和未限定的非AD痴呆(n=3)。对3R和4R同种型特异性的胰蛋白酶是特别感兴趣的。CSF Aβ42/40通过质谱法进行测量，如Ovod等人，Alzheimers Dement J. Alzheimers Assoc，2017，13:841-849中一般描述的。淀粉样蛋白状态使用0.085的截断值进行定义(即淀粉样蛋白阳性> 0.085，淀粉样蛋白阴性<0.085)。pT217%通过质谱法进行测量，如先前所述的。
如图37中所示，在通过IP后-IP方法(图37C)而不是IP方法(图37B)处理的样品中，样品中的胰蛋白酶肽VQIV/LDLS的比率将非ADtau蛋白病与对照区分开。通过IP后-IP方法处理的样品的进一步分析指示了，与对照受试者相比，来自患有非AD tau蛋白病的受试者的CSF中较低丰度的LDLS (图38)。
在从患有非AD tau蛋白病的受试者中获得的IP后-IP处理的样品中，而不是在从患有AD的受试者或对照受试者中获得的样品中，测量到VQIV/LDLS比率的增加(图39)。在IP后-IP样品处理后的另外胰蛋白酶肽的分析鉴定了，与患有AD的受试者或对照受试者相比，在患有非AD tau蛋白病的受试者中的R1-R2胰蛋白酶肽(例如IGST、VQII、LDLS等)和以后的R2-R3胰蛋白酶肽(例如HVPG等)之间的更低关联性(图40，表8)。在非AD tau蛋白病中进行比较，患有PSP、CBD和FTD的某些受试者是离群值(图41)。与胰蛋白酶肽IGSL而不是HPVG的比较也获得类似的结果(图42)。
总的来说，这些数据提示了，在IP后-IP样品处理后测量的CSF tau概况可以反映脑tau的聚集状态。例如，4R-tau蛋白病含有富集R2区域的脑不溶性tau，其包含VQII胰蛋白酶肽，并且来自患有4R-tau蛋白病的受试者的一些CSF样品显示胰蛋白酶肽IGST、VQII和LDLS相对于HVPG或IGSL减少的量。这在患有AD的受试者中并未观察到。鉴于这些数据，区分4R-tau蛋白病的方法应该集中于富集MTBR tau的R2区域。
表8
实施例6
在该实施例中，从包括非AD tau蛋白病的受试者的单一临床队列中获得的CSF和脑样品的进一步分析提供了以下的另外证据：中部结构域不依赖性MTBR tau将从患有非ADtau蛋白病的受试者中获得的CSF样品与从患有AD的受试者中获得的CSF样品区分开的效用。这个队列中的受试者包括患有AD的受试者(n=28)，临床上诊断有CBD或CBD/PSP的受试者(n=20)，临床上诊断有FTD的受试者(n=22)，以及临床上诊断有PSP的受试者(n=11)。从这些受试者中获得的CSF样品通过如实施例4中一般描述的IP后-IP方法进行处理，并且通过如实施例3中一般描述的质谱法进行评估。如实施例3所述的评估脑不溶性tau。
如实施例5中注意到的，在CSF的IP后-IP样品处理后的胰蛋白酶肽分析鉴定了在患有非AD tau蛋白病的受试者中，在R1和早期R2胰蛋白酶肽(例如IGST、VQII、LDLS等)与晚期R2、R3和/或R4胰蛋白酶肽(例如IGSL等)之间的低关联性(图43、图44和图45)。假设在CSF中，非AD tau蛋白病的tau种类含有比AD的tau种类(1)更少的R1和R2、以及(2)更多的R3和R4，并且这是脑tau沉积的反映(图46)。为了测试这一假设，对脑不溶性tau进行分析。如图47中所示，胰蛋白酶肽VQII在4R-tau蛋白病的脑tau聚集物中富集。胰蛋白酶肽HVPG和IGSL也在脑tau聚集物中富集，但与AD相比更少。这些数据进一步支持了使用R1或R2与R3或R4的比率作为将非AD tau蛋白病与AD区分开的方式。
然后扩展分析以包括从遗传上确认的FTLD病例中获得的CSF样品(R406W，n=7；P301L，n=3)，从对照受试者中获得的CSF样品(n=44)，以及来自患有AD的受试者的另外CSF样品(n=41)。从这些受试者中获得的CSF样品通过如实施例4中一般描述的IP后-IP方法进行处理，并且通过如实施例3中一般描述的质谱法进行评估。在CSF的IP后-IP样品处理后的胰蛋白酶肽分析再次鉴定了在患有非AD tau蛋白病的受试者中，在R1和早期R2胰蛋白酶肽(例如IGST、VQII、LDLS等)与晚期R2、R3和/或R4胰蛋白酶肽(例如IGSL等)之间的低关联性(图48和图49)。这些数据确认了使用R1或R2与R3或R4的量的比率作为将非AD tau蛋白病与AD区分开的方式，并且还证实了将对照受试者与非AD tau蛋白病区分开的能力。值得注意的是，从遗传上确认的FTLD病例中获得的CSF样品的使用对分析提供了进一步的严谨性。
Claims (75)
1.一种用于测量生物样品中的tau的方法，所述方法包括：
(a)提供选自血液样品或CSF样品的生物样品，其中所述生物样品(i)任选地包含同位素标记的tau的内部标准，并且(ii)任选地耗尽淀粉样蛋白β、N末端tau、中部结构域tau或其任何组合；
(b)通过蛋白质沉淀从生物样品中去除蛋白质，并分离沉淀的蛋白质以获得上清液；
(c)通过固相提取从上清液中纯化tau；
(d)用蛋白酶切割纯化的tau，并且然后任选地通过固相提取使所得的切割产物脱盐，以获得包含tau的蛋白酶解肽的样品；和
(e)对包含tau的蛋白酶解肽的样品执行液相层析 - 质谱法，以检测且测量tau的至少一种蛋白酶解肽的量。
2.权利要求1的方法，其中使所述生物样品耗尽淀粉样蛋白β、N末端tau、中部结构域tau或其任何组合。
3.权利要求2的方法，其中(i)使所述生物样品耗尽淀粉样蛋白β、N末端tau和中部结构域tau，(ii)使所述生物样品耗尽N末端tau和中部结构域tau，或(iii)使所述生物样品耗尽中部结构域tau。
4.权利要求1的方法，其中所述步骤(c)中的固相包含吸附tau的反相吸附剂。
5. 前述权利要求中任一项的方法，其中：
步骤(b)包括混合酸以沉淀生物样品的蛋白质，任选地其中所述酸是高氯酸；和/或
在步骤(e)中，所述液相层析 - 质谱法通过纳米-LC/MS系统来执行。
6.一种用于测量生物样品中的tau的方法，所述方法包括：
(a)通过亲和力耗尽降低生物样品中的N末端tau、中部结构域tau或N末端tau和中部结构域tau，并且任选地通过亲和力耗尽降低淀粉样蛋白β，其中所述生物样品是血液样品或CSF样品，并且所述生物样品任选地包含同位素标记的tau的内部标准；
(b)通过包括以下的方法富集MTBR tau：(i)通过蛋白质沉淀从生物样品中去除另外的蛋白质，并分离沉淀的蛋白质以获得上清液，并且然后通过固相提取从上清液中纯化tau，或(ii)使MTBR tau亲和纯化，从而通过(i)或(ii)产生富集的MTBR tau；
(c)用蛋白酶切割富集的MTBR tau，并且然后任选地通过固相提取使所得的切割产物脱盐，以获得包含tau的蛋白酶解肽的样品；和
(d)对包含tau的蛋白酶解肽的样品执行液相层析 - 质谱法(LC/MS)，以检测且测量tau的至少一种蛋白酶解肽的量。
7. 权利要求6的方法，其中步骤(a)包括降低(i) N末端tau、中部结构域tau或N末端tau和中部结构域tau，和(ii)淀粉样蛋白β。
8. 权利要求6的方法，其中所述生物样品包含人tau，并且其中步骤(a)进一步包括
使生物样品与至少一种表位结合剂接触，所述表位结合剂与tau-441的包含端点在内的氨基酸1至243内的表位特异性结合；或
使生物样品与第一表位结合剂和第二表位结合剂接触，所述第一表位结合剂与tau-441的包含端点在内的氨基酸1至103内的表位特异性结合，所述第二表位结合剂与tau-441的包含端点在内的氨基酸104至243内的表位特异性结合；或
使生物样品与第一表位结合剂、第二表位结合剂和第三表位结合剂接触，所述第一表位结合剂与tau-441的包含端点在内的氨基酸1至103内的表位特异性结合，所述第二表位结合剂与tau-441的包含端点在内的氨基酸104至243内的表位特异性结合，所述第三表位结合剂与淀粉样蛋白β的表位特异性结合；或
使生物样品与第一表位结合剂、第二表位结合剂接触，所述第一表位结合剂与tau-441的包含端点在内的氨基酸1至103内的表位特异性结合，所述第二表位结合剂与淀粉样蛋白β的表位特异性结合；或
使生物样品与第一表位结合剂和第三表位结合剂接触，所述第一表位结合剂与tau-441的包含端点在内的氨基酸104至243内的表位特异性结合，所述第三表位结合剂与淀粉样蛋白β的表位特异性结合。
9.权利要求8的方法，其中与淀粉样蛋白β特异性结合的表位结合剂是HJ5.1。
10.权利要求8的方法，其中与tau-441的包含端点在内的氨基酸1至103内的表位特异性结合的表位结合剂是HJ8.5。
11.权利要求8的方法，其中与tau-441的包含端点在内的氨基酸104至243内的表位特异性结合的表位结合剂是Tau1。
12. 权利要求6至11中任一项的方法，其中固相提取包含吸附tau的反相吸附剂。
13. 权利要求6至11中任一项的方法，其中
用于富集MTBR tau的方法包括步骤(b) (i)，并且其中所述蛋白质沉淀包括混合酸以沉淀生物样品的蛋白质，任选地其中所述酸是高氯酸；和/或
在步骤(e)中，所述液相层析 - 质谱法通过纳米-LC/MS系统来执行。
14. 权利要求13的方法，其中在步骤(b)和(c)中执行的所述固相提取包含吸附tau的反相吸附剂。
15. 权利要求8至11中任一项的方法，其中
用于富集MTBR tau的方法包括步骤(b) (ii)，并且其中使MTBR tau亲和纯化包括使步骤(a)的产物与表位结合剂接触，所述表位结合剂与对于步骤(a)的表位为C末端的表位特异性结合；和/或
在步骤(e)中，所述液相层析 - 质谱法通过纳米-LC/MS系统来执行。
16. 权利要求15的方法，其中步骤(b)的所述表位结合剂与以下的表位特异性结合：
tau-441的氨基酸221至441内(包含端点在内)，或
tau-441的氨基酸235至441内(包含端点在内)，或
tau-441的氨基酸235至368内(包含端点在内)，或
tau-441的氨基酸244至368内(包含端点在内)，或
tau-441的氨基酸244至299内(包含端点在内)。
17.权利要求16的方法，其中所述表位结合剂是选自77G7、RD3、RD4、UCB0107、PT76、E2814和7G6的抗体。
18.权利要求15、16或17的方法，其中在步骤(c)中执行的所述固相提取包含吸附tau的反相吸附剂。
19.权利要求1至5中任一项的方法，其中所述蛋白酶是胰蛋白酶。
20. 权利要求19的方法，其中步骤(d)包括检测且测量tau的至少一种蛋白酶解肽的量，其中所述tau的蛋白酶解肽具有选自SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 3、SEQID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 9的氨基酸序列。
21. 权利要求19的方法，其中步骤(d)包括检测且测量tau的至少两种蛋白酶解肽的浓度，其中所述tau的两种蛋白酶解肽具有选自SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8和SEQ ID NO: 9的氨基酸序列。
22. 权利要求21的方法，其中所述tau的至少两种蛋白酶解肽具有SEQ ID NO: 6和SEQID NO: 7、SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 4和SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 4和SEQ ID NO: 8、SEQ IDNO: 5和SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 6、SEQID NO: 4和SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 6、或者SEQ ID NO: 9和SEQ IDNO: 5的氨基酸序列。
23.权利要求6至11中任一项的方法，其中所述蛋白酶是胰蛋白酶。
24. 权利要求23的方法，其中步骤(d)包括检测且测量MTBR tau的至少一种蛋白酶解肽的浓度，其中所述tau的蛋白酶解肽具有选自SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8和SEQ ID NO: 9的氨基酸序列。
25. 权利要求23的方法，其中步骤(d)包括检测且测量MTBR tau的至少两种蛋白酶解肽的浓度，其中所述tau的两种蛋白酶解肽具有选自SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4、SEQ IDNO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8和SEQ ID NO: 9的氨基酸序列。
26. 权利要求25的方法，其中所述MTBR tau的至少两种蛋白酶解肽具有SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 6、SEQ IDNO: 3和SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 7、SEQID NO: 2和SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 4和SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 4和SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 2和SEQ IDNO: 6、SEQ ID NO: 4和SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 6、以及SEQ ID NO: 9和SEQ ID NO: 5的氨基酸序列。
27.权利要求12的方法，其中所述蛋白酶是胰蛋白酶。
28.权利要求13的方法，其中所述蛋白酶是胰蛋白酶。
29.权利要求15的方法，其中所述蛋白酶是胰蛋白酶。
30. 权利要求27、28或29中任一项的方法，其中步骤(d)包括检测且测量MTBR tau的至少一种蛋白酶解肽的浓度，其中所述tau的蛋白酶解肽具有选自SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8和SEQ IDNO: 9的氨基酸序列。
31. 权利要求27、28或29中任一项的方法，其中步骤(d)包括检测且测量MTBR tau的至少两种蛋白酶解肽的浓度，其中所述tau的蛋白酶解肽具有选自SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8和SEQ IDNO: 9的氨基酸序列。
32. 权利要求31的方法，其中所述MTBR tau的至少两种蛋白酶解肽具有SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 7、SEQ IDNO: 3和SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 8、SEQID NO: 4和SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 4和SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 4和SEQ IDNO: 6、SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 6、以及SEQ ID NO: 9和SEQ ID NO: 5的氨基酸序列。
33.权利要求6至32中任一项的方法，其中所述方法进一步包括检测且测量在步骤(a)中从生物样品中去除的N末端tau、中部结构域tau或淀粉样蛋白β的浓度。
34. 一种用于测量受试者中的阿尔茨海默氏病(AD)有关病理状况的方法，所述方法包括：
提供从受试者中获得的处理的CSF或血液样品，其中使所述CSF或血液样品耗尽中部结构域tau且富集MTBR tau；和
在所述处理的样品中，定量包含SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQID NO: 6的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 8的氨基酸序列的MTBR tau种类或其组合，其中所述定量的MTRB-tau种类的量或其比率是受试者的脑中的AD有关病理状况的表示。
35.一种用于测量受试者中的阿尔茨海默氏病(AD)有关病理状况的方法，所述方法包括根据权利要求6至18中任一项的方法测量CSF或血液样品中的tau，
其中所述测量的tau是包含SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ IDNO: 6的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 8的氨基酸序列的MTBR tau种类或其组合，其中所述测量的MTRB-tau种类的量或其比率是受试者的脑中的AD有关病理状况的表示。
36.权利要求34或35的方法，其中所述AD有关病理状况是受试者的脑中的tau沉积。
37.权利要求34或35的方法，其中所述AD有关病理状况是受试者的脑或脑动脉中的淀粉样蛋白β沉积。
38. 一种用于测量受试者的脑中的阿尔茨海默氏病(AD)有关tau沉积的方法，所述方法包括：
提供从受试者中获得的处理的CSF或血液样品，其中使所述处理的CSF或血液样品耗尽中部结构域tau且富集MTBR tau；和
在所述处理的样品中，定量所述处理的CSF或血液样品中的包含SEQ ID NO: 3(LQTAPVPMPDLK)的氨基酸序列的MTBR tau种类，其中所述定量的MTRB-tau种类的量是受试者的脑中的AD有关tau沉积的表示。
39.一种用于测量受试者的脑中的阿尔茨海默氏病(AD)有关tau沉积的方法，所述方法包括根据权利要求6至18中任一项的方法测量CSF或血液样品中的tau，
其中所述测量的tau是包含SEQ ID NO: 3 (LQTAPVPMPDLK)的氨基酸序列的MTBR tau种类，并且其中所述测量的MTRB-tau种类的量是受试者的脑中的AD有关病理状况的表示。
40. 一种用于测量受试者的脑中的阿尔茨海默氏病(AD)有关tau沉积的方法，所述方法包括：
提供从受试者中获得的处理的CSF或血液样品，其中使所述CSF或血液样品耗尽中部结构域tau且富集MTBR tau；和
在所述处理的样品中，定量包含SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQID NO: 6的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 8的氨基酸序列的MTBR tau种类或其组合，其中所述定量的MTRB-tau种类的量或其比率是受试者的脑中的AD有关tau沉积的表示。
41.一种用于测量受试者的脑中的阿尔茨海默氏病(AD)有关tau沉积的方法，所述方法包括根据权利要求6至18中任一项的方法测量CSF或血液样品中的tau，
其中所述测量的tau是包含SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ IDNO: 6的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 8的氨基酸序列的MTBR tau种类或其组合，并且其中所述测量的MTRB-tau种类的量或其比率是受试者的脑中的AD有关病理状况的表示。
42. 一种用于诊断阿尔茨海默氏病的方法，所述方法包括：
提供从受试者中获得的处理的CSF或血液样品，其中使所述CSF或血液样品耗尽中部结构域tau且富集MTBR tau；和
在所述处理的样品中，定量包含SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQID NO: 6的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 8的氨基酸序列的MTBR tau种类或其组合；和
当所述定量的MTBR tau种类相差约1.5σ或更多时，诊断阿尔茨海默氏病，其中σ是由对照群体中测量的正态分布定义的标准差，所述对照群体如通过PET成像和/或CSF中的Aβ42/40测量所测量的呈淀粉样蛋白阴性。
43. 一种用于诊断阿尔茨海默氏病的方法，所述方法包括：
根据权利要求6至18中任一项的方法测量CSF或血液样品中的tau，其中所述测量的tau是包含SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 8的氨基酸序列的MTBR tau种类或其组合；和
当所述定量的MTBR tau种类相差约1.5σ或更多时，诊断阿尔茨海默氏病，其中σ是由对照群体中测量的正态分布定义的标准差，所述对照群体如通过PET成像和/或CSF中的Aβ42/40测量所测量的呈淀粉样蛋白阴性。
44. 一种用于测量受试者中的阿尔茨海默氏病(AD)进展的方法，所述方法包括：
提供第一处理的CSF或血液样品和第二处理的CSF或血液样品，其中每个处理的样品从单个受试者中获得，并且使每个处理的样品耗尽中部结构域tau且富集MTBR tau；和
对于每个处理的样品，定量包含SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQID NO: 6的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 8的氨基酸序列的MTBR tau种类或其组合；和
计算第二样品与第一样品中定量的MTBR tau种类之间的差异，其中所述第二样品中定量的MTBR tau种类的统计学显著增加指示了受试者的阿尔茨海默氏病的进展。
45. 一种用于测量受试者中的阿尔茨海默氏病(AD)进展的方法，所述方法包括：
根据权利要求6至18中任一项的方法测量第一CSF或血液样品和第二CSF或血液样品中的tau，其中所述测量的tau是包含SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQID NO: 6的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 8的氨基酸序列的MTBR tau种类或其组合；和
计算第二样品与第一样品中定量的MTBR tau种类之间的差异，其中所述第二样品中定量的MTBR tau种类的统计学显著增加指示了受试者的阿尔茨海默氏病的进展。
46.权利要求38至45中任一项的方法，其中所述受试者是淀粉样蛋白阴性的。
47.权利要求46的方法，其中所述受试者没有痴呆。
48.权利要求46的方法，其中受试者患有痴呆。
49.权利要求38至45中任一项的方法，其中所述受试者是淀粉样蛋白阳性的。
50.权利要求49的方法，其中所述受试者没有痴呆。
51.权利要求49的方法，其中受试者患有痴呆。
52.权利要求46或权利要求49的方法，其中受试者具有0.5至1.0的CDR分数。
53. 权利要求46或权利要求49的方法，其中受试者具有> 1.0至2.0的CDR分数(中度AD)。
54. 权利要求46或权利要求49的方法，其中受试者具有> 2.0的CDR分数。
55.权利要求38至54中任一项的方法，所述方法进一步包括在生物样品或CSF样品中定量淀粉样蛋白β、定量N末端tau、定量中部结构域tau、定量tau的翻译后修饰、或鉴定ApoE同种型。
56. 一种用于测量受试者的脑中的tau病理状况的方法，所述方法包括：
提供从受试者中获得的处理的CSF或血液样品，其中使所述CSF或血液样品耗尽中部结构域tau且富集MTBR tau；和
在所述处理的样品中，定量包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQID NO: 3的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 8的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列的MTBR tau种类或其组合，其中所述定量的MTRB-tau种类的量或其比率是受试者的脑中的tau病理状况的表示。
57. 一种用于测量受试者的脑中的tau病理状况的方法，所述方法包括根据权利要求6至18中任一项的方法测量CSF或血液样品中的tau，其中所述测量的tau是包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 8的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列的MTBR tau种类或其组合，其中所述定量的MTRB-tau种类的量或其比率是受试者的脑中的tau病理状况的表示。
58. 一种用于区分4R-tau蛋白病的方法，所述方法包括：
提供从受试者中获得的处理的CSF或血液样品，其中使所述CSF或血液样品耗尽中部结构域tau且富集MTBR tau；和
在所述处理的样品中，定量(a)包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列的MTBR tau种类，以及(b)包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列的MTBR tau种类、或包含SEQ ID NO: 8的氨基酸序列的MTBR tau种类；
其中来自(a)的定量的MTBR种类与来自(b)的定量的MTBR种类的比率区分4R-tau蛋白病。
59. 一种用于区分4R-tau蛋白病的方法，所述方法包括根据权利要求6至17中任一项的方法测量生物样品中的tau，其中所述测量的tau是(a)包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列的MTBR tau种类，以及(b)包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ IDNO: 5的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列的MTBR tau种类、或包含SEQ ID NO: 8的氨基酸序列的MTBRtau种类；
其中来自(a)的定量的MTBR种类与来自(b)的定量的MTBR种类的比率区分4R-tau蛋白病。
60. 一种用于将3R-tau蛋白病或4R-tau蛋白病与阿尔茨海默氏病区分开的方法，所述方法包括：
提供从受试者中获得的处理的CSF或血液样品，其中使所述CSF或血液样品(a)耗尽中部结构域tau，且(b)富集MTBR tau；和
在所述处理的样品中，定量(a)包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的MTBR tau种类或其组合，以及(b)包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 8的氨基酸序列的MTBR tau种类或其组合，
其中来自(a)的定量的MTBR种类与来自(b)的定量的MTBR种类的比率将3R-tau蛋白病或4R-tau蛋白病与阿尔茨海默氏病区分开。
61. 一种用于将3R-tau蛋白病或4R-tau蛋白病与阿尔茨海默氏病区分开的方法，所述方法包括根据权利要求6至18中任一项的方法测量生物样品中的tau，其中所述测量的tau是(a)包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的MTBR tau种类或其组合，以及(b)包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 8的氨基酸序列的MTBR tau种类或其组合，
其中来自(a)的定量的MTBR种类与来自(b)的定量的MTBR种类的比率将3R-tau蛋白病或4R-tau蛋白病与阿尔茨海默氏病区分开。
62. 一种用于诊断4R-tau蛋白病的方法，所述方法包括：
根据权利要求6至18中任一项的方法测量CSF或血液样品中的tau，其中所述测量的tau是(a)包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的MTBR tau种类或其组合，以及(b)包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 8的氨基酸序列的MTBR tau种类或其组合；和
当所述定量的MTBR tau种类相差约1.5σ或更多时，诊断4R-tau蛋白病，其中σ是由对照群体中测量的正态分布定义的标准差，所述对照群体没有tau蛋白病的临床体征或症状，并且如通过PET成像和/或CSF中的Aβ42/40测量所测量的呈淀粉样蛋白阴性。
63.权利要求56至62中任一项的方法，其中所述受试者没有痴呆。
64.权利要求63的方法，其中所述4R-tau蛋白病是皮质基底节变性、额颞叶变性、额颞叶痴呆或进行性核上瘫痪。
65.权利要求56至62中任一项的方法，其中所述受试者患有痴呆。
66.权利要求65的方法，其中所述4R-tau蛋白病是皮质基底节变性、额颞叶变性、额颞叶痴呆或进行性核上瘫痪。
67.一种用于治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括：
提供从受试者中获得的处理的CSF或血液样品，其中使所述CSF或血液样品(a)耗尽中部结构域tau，且(b)富集MTBR tau；
在所述处理的样品中，定量包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQID NO: 3的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 8的氨基酸序列的MTBR tau种类、包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列的MTBR tau种类或其组合；和
向受试者施用治疗以改变tau病理状况，其中所述受试者的处理的CSF或血液样品具有相差约1.5σ或更多的定量的MTBR tau种类、或定量的MTBR tau种类的比率，其中σ是由对照群体中测量的正态分布定义的标准差，所述对照群体没有tau蛋白病的临床体征或症状，并且如通过PET成像和/或CSF中的Aβ42/40测量所测量的呈淀粉样蛋白阴性，并且其中所述定量的MTRB-tau种类的量或其比率是受试者的脑中的tau病理状况的表示。
68.权利要求67的方法，其中所述治疗改变或稳定所述定量的MTBR种类的量。
69. 权利要求67或68的方法，其中所述治疗选自胆碱酯酶抑制剂、N-甲基D-天冬氨酸(NMDA)拮抗剂、抗抑郁药、γ-分泌酶抑制剂、β-分泌酶抑制剂、抗Aβ抗体、抗tau抗体、抗TREM2抗体、TREM2激动剂、干细胞、饮食补充剂、血清素受体6的拮抗剂、p38α MAPK抑制剂、重组粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、被动免疫疗法、主动疫苗、tau蛋白聚集抑制剂、改善血糖控制的疗法、消炎药、磷酸二酯酶9A抑制剂、σ-1受体激动剂、激酶抑制剂、磷酸酶激活剂、磷酸酶抑制剂、血管紧张素受体阻断剂、CB1和/或CB2内源性大麻素受体部分激动剂、β-2肾上腺素能受体激动剂、烟碱乙酰胆碱受体激动剂、5-HT2A反向激动剂、α-2c肾上腺素能受体拮抗剂、5-HT 1A和1D受体激动剂、谷氨酰肽环转移酶抑制剂、APP产生的选择性抑制剂、单胺氧化酶B抑制剂、谷氨酸受体拮抗剂、AMPA受体激动剂、神经生长因子刺激剂、HMG-CoA还原酶抑制剂、神经营养剂、毒蕈碱M1受体激动剂、GABA受体调节剂、PPAR-γ激动剂、微管蛋白调节剂、钙通道阻断剂、抗高血压药和他汀类药物。
70.权利要求69的方法，其中所述治疗选自抗Aβ抗体、抗tau抗体、抗TREM2抗体、TREM2激动剂、γ-分泌酶抑制剂、β-分泌酶抑制剂、激酶抑制剂、磷酸酶激活剂、疫苗和tau蛋白聚集抑制剂。
71.权利要求70的方法，其中所述激酶抑制剂是一千零一氨基酸激酶(TAOK)、CDK、GSK-3β、MARK、CDK5或Fyn的抑制剂。
72.权利要求70的方法，其中所述磷酸酶激活剂增加蛋白质磷酸酶2A的活性。
73.权利要求70的方法，其中所述疫苗是CAD106或AF20513。
74.权利要求70的方法，其中所述tau蛋白聚集抑制剂是TRx0237或甲硫鎓氯化物。
75.权利要求70的方法，其中所述的抗Aβ抗体是阿杜那单抗(aducanumab)。
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