KR20220062287A - Mtbr 타우 아이소폼 검출 방법 및 이의 용도 - Google Patents

Mtbr 타우 아이소폼 검출 방법 및 이의 용도 Download PDF

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칸타 호리
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Abstract

본원에 개시된 방법은 혈액 또는 CSF 샘플을 MTBR 타우 종들 및 기타 타우 종들을 정량하기에 적합한 샘플로 전환시키는 처리 단계들을 독특하게 조합하여 사용한다. 본 발명은 또한 진단, 병기결정 및/또는 주어진 질환 단계에 적절한 치료를 선택하고 주어진 치료 요법을 수정하기 위해 3R- 및 4R-타우병증의 병리학적 특징 및/또는 임상 증상을 측정하기 위한 혈액 또는 CSF에서의 MTBR 타우(MTBR tau) 종의 사용을 포함한다.

Description

MTBR TAU 아이소형 검출 방법 및 이의 용도
관련 출원들에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 8월 13일 출원된 미국 가특허출원 제 62/886,165호, 2020년 2월 6일 출원된 미국 가특허출원 제 62/970,950호, 및 2020년 6월 26일 출원된 미국 가특허출원 제 63/044,836호의 우선권을 주장하며, 이들 문헌 각각은 본원에 그 전문이 참고문헌으로 포함된다.
정부 권리
본 발명은 국립 보건원 (National Institutes of Health)이 수여한 계약 NS095773 하에서 정부의 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에서 일정한 권리를 가진다.
서열 목록에 대한 참조
본 출원에는 ASCII 형식으로 EFS-Web을 통해 제출된 서열 목록이 포함되어 있으며 이는 그 전체 내용이 본원에 참고로 포함된다.　 연월일별로 생성된 ASCII 사본은 파일명이 "665135_ST25.txt"이며, 14 KB 바이트 크기이다.
기술분야
본 발명은 혈액 또는 CSF 샘플을 질량 분석법, 면역검정법, 또는 당업계에 공지된 다른 검정법으로 MTBR 타우 종을 정량하기에 적합한 샘플로 형질전환시키는 방법을 포함한다. 본 발명은 또한 진단, 병기결정 및/또는 주어진 질환 단계에 적절한 치료를 선택하기 위해 3R- 및 4R-타우병증의 병리학적 특징 및/또는 임상 증상을 측정하기 위한 혈액 또는 CSF에서의 MTBR 타우(MTBR tau) 종의 사용을 포함한다.
배경기술
뇌에서 불용성 응집체로 타우(tau) 단백질이 축적되는 것은 알츠하이머 질환 및 타우병증이라고 하는 기타 신경퇴행성 질환의 특징 중 하나이다. 타우 병리는 특정한 병리학적 타우 종을 프리온과 유사한 방식으로 세포와 세포간에 전달함으로써 뇌 영역 전반에 전파되고 확산되는 것으로 보이지만 이러한 종들의 성질 (즉, 단량체, 올리고머 및 피브릴 종) 및 확산 과정은 불명확하다 (Frost 외, 2009; Goedert 외, 2010, 2017; Sanders 외, 2014; Wu 외, 2016; Mirbaha 외, 2018; Lasagna-Reeves 외, 2012). 타우의 전장 단백질에는 6가지 상이한 아이소폼이 있다. 또한, 타우는 여러 절단 부위 이외에도 인산화를 비롯하여 100개 이상의 잠재적인 번역 후 변형 부위를 가지고 있다 (Meredith 외, 2013; Sato 외, 2018; Barth
Figure pct00001
lemy 외, 2019; Cicognola 외, 2019; Blennow 외, 2020). 따라서 타우 확산에 관여하는 특정 병리학적 타우 종을 확인하기는 어렵다. 여러 질량 분석법(MS) 연구에 따르면 타우의 미세소관 결합 영역(MTBR)은 알츠하이머 질환 뇌의 응집체에 풍부하다 (Taniguchi-Watanabe 외, 2016; Roberts 외, 2020). 더욱이, 일련의 극저온 전자 현미경 (Cryo-EM) 연구는 타우 응집체의 코어 구조가 MTBR 도메인의 하위 세그먼트로 구성되고 특정 입체구조는 타우병증에 따라 달라진다는 것을 보여준다 (Fitzpatrick 외, 2017; Falcon 외, 2018, 2019; Zhang 외, 2020). 이러한 발견은 MTBR 타우가 타우 응집에 중요하다는 것을 강력하게 시사한다. 그러나 이러한 연구는 사후 뇌 조직을 사용했다. 살아있는 인간에서 뇌 타우 응집체의 대용 바이오마커 역할을 할 수 있는, CSF 및 혈액과 같은 생물학적 샘플 내 상응하는 세포외 MTBR-함유 타우 종들의 병태생리에 대해 거의 알려진 바가 없다.
CSF는 통상적으로 연구 참가자로부터 임상 방문 동안 요추 천자를 통해 얻는다. 이전의 CSF 타우 바이오마커 연구는 MTBR 타우가 CSF에서는 없었으며 N-말단 및 중간 도메인 영역들에 집중되어 있었음을 제시하였다 (Meredith 외, 2013; Sato 외, 2018). N-말단 내지 중간 도메인을 구성하는 종들은 중간 도메인 내지 MTBR-도메인 사이의 절단 후에 뉴런으로부터 세포외 공간으로 활발하게 분비되는 것으로 보인다 (Sato 외, 2018). MTBR 타우 종의 검출이 보고되었지만 (Barth
Figure pct00002
lemy 외, 2016b, a) 질환과의 관계에서 특성화되지 않았다. 최근, 반복 영역 4 (R4) 내부의 잔기 368 (tau368)에서 절단을 포함하는 타우 종이 CSF에서 확인되었다 (Blennow 외, 2020). 그러나 항체에 의해 포획되지 않는 영역, 절단 및 입체구조에 있어서의 변화를 감안할 때 tau368이 MTBR 타우 종의 전체 풀을 반영하는지 여부는 불분명하다.
고분해능 질량분석 기술의 발전으로 생물학적 샘플 내 단백질 풍부도을 측정하는 새로운 방법론이 탄생했다. 기기 및 데이터 분석 소프트웨어의 발전에도 불구하고 샘플 준비는 여전히 엄청난 도전이다. 샘플 준비 방법의 선택은 관찰된 대사 산물 프로파일과 데이터 품질에 영향을 미치며 궁극적으로 보고된 결과에 영향을 미칠 수 있다. 이는 생물학적 샘플에서 풍부도이 적은 단백질 및 펩타이드의 경우 특히 그러하다. 이러한 범위에 속하는 펩타이드에는 다양한 질환 과정으로부터 차등적으로 생성되는, 전장 단백질의 많은 단백질분해 단편이 포함된다.
따라서, 생물학적 유체에서 적은 풍부도의 MTBR 타우 종을 정량하기 위한 개선된 샘플 처리 방법이 당업계에 여전히 필요하다.
요약
본 발명의 다양한 측면들 중에는 타우의 상대 또는 절대 농도를 질량 분석법으로 측정하기 위해 사전에 얻은 생물학적 샘플을 처리하는 방법이 제공된다.
본 발명의 한 측면은 생물학적 샘플에서 타우를 측정하는 방법을 포함하며, 이 방법은 (a) 혈액 샘플 또는 CSF 샘플로부터 선택된 생물학적 샘플을 제공하는 단계; (b) 생물학적 샘플로부터 단백질 침전에 의해 단백질을 제거하고 침전된 단백질을 분리하여 상청액을 얻는 단계; (c) 상청액으로부터 고체상 추출에 의해 타우를 정제하는 단계; (d) 정제된 타우를 프로테아제로 절단한 다음, 선택적으로, 생성된 절단 생성물을 고체상 추출에 의해 탈염시켜 타우의 단백질분해 펩타이드를 포함하는 샘플을 얻는 단계; 및 (e) 타우의 단백질분해 펩타이드를 포함하는 샘플로 액체 크로마토그래피 - 질량 분석을 수행하여 타우의 적어도 하나의 단백질분해 펩타이드의 농도를 검출 및 측정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 생물학적 샘플에서 타우를 측정하는 방법을 포함하며, 이 방법은 (a) 생물학적 샘플에서 친화도 고갈에 의해 N-말단 타우, 중간 도메인 타우, 또는 N-말단 타우 및 중간 도메인 타우를 감소시키는 단계, 이때 생물학적 샘플은 혈액 샘플 또는 CSF 샘플이고; (b) 생물학적 샘플로부터 단백질 침전에 의해 단백질을 추가로 제거하고 침전된 단백질을 분리하여 상청액을 얻는 단계; (c) 상청액으로부터 고체상 추출에 의해 타우를 정제하는 단계; (d) 정제된 타우를 프로테아제로 절단한 다음, 선택적으로, 생성된 절단 생성물을 고체상 추출에 의해 탈염시켜 타우의 단백질분해 펩타이드를 포함하는 샘플을 얻는 단계; 및 (e) 타우 펩타이드를 포함하는 샘플로 액체 크로마토그래피 - 질량 분석을 수행하여 타우의 적어도 하나의 단백질분해 펩타이드의 농도를 검출 및 측정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 생물학적 샘플에서 타우를 측정하는 방법을 포함하며, 이 방법은 (a) 생물학적 샘플에서 친화도 고갈에 의해 N-말단 타우, 중간 도메인 타우, 또는 N-말단 타우 및 중간 도메인 타우를 감소시키는 단계, 이때 생물학적 샘플은 혈액 샘플 또는 CSF 샘플이고; (b) MTBR 타우를 친화도 정제하는 단계; (c) 정제된 MTBR 타우를 프로테아제로 절단한 다음, 선택적으로, 생성된 절단 생성물을 고체상 추출에 의해 탈염시켜 MTBR 타우의 단백질분해 펩타이드를 포함하는 샘플을 얻는 단계; 및 (d) MTBR 타우의 단백질분해 펩타이드를 포함하는 샘플로 액체 크로마토그래피 - 질량 분석을 수행하여 MTBR 타우의 적어도 하나의 단백질분해 펩타이드의 농도를 검출 및 측정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 생물학적 샘플에서 타우를 측정하는 방법을 포함하며, 이 방법은 (a) 생물학적 샘플에서 친화도 고갈에 의해 N-말단 타우, 중간 도메인 타우, 또는 N-말단 타우 및 중간 도메인 타우를 감소시키는 단계, 이때 생물학적 샘플은 혈액 샘플 또는 CSF 샘플이고, 이때 친화도 고갈은 생물학적 샘플을 tau-441의 아미노산 1 내지 221 이내 (이들을 포함), 바람직하게는 아미노산 50 내지 221 이내 (이들을 포함), 또는 더욱 바람직하게는 아미노산 104 내지 221 이내 (이들을 포함) (또는 유사하게 정의되는 다른 전장 아이소폼 영역들 이내)의 에피토프에 특이적으로 결합하는 에피토프 결합제와 접촉시키는 것을 포함하고; (b) MTBR 타우를 친화도 정제하는 단계, 이때 친화도 정제는 단계 (a)의 생성물을 단계 (a)의 에피토프 결합제에 의해 인식되는 에피토프에 대해 C-말단인 에피토프에 특이적으로 결합하는 에피토프 결합제와 접촉시키는 것을 포함하고; (c) 정제된 MTBR 타우를 프로테아제로 절단한 다음, 선택적으로, 생성된 절단 생성물을 고체상 추출에 의해 탈염시켜 MTBR 타우의 단백질분해 펩타이드를 포함하는 샘플을 얻는 단계; 및 (d) MTBR 타우의 단백질분해 펩타이드를 포함하는 샘플로 액체 크로마토그래피 - 질량 분석을 수행하여 MTBR 타우의 적어도 하나의 단백질분해 펩타이드의 농도를 검출 및 측정하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 단계 (b)의 에피토프 결합제는 tau-441의 아미노산 221 내지 441(이들을 포함) 내(또는 다른 전장 아이소폼에 대해 유사하게 정의된 영역 내) 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 단계 (b)의 에피토프 결합제는 tau-441의 아미노산 235 내지 441(이들을 포함) 내(또는 다른 전장 아이소폼에 대해 유사하게 정의된 영역 내) 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 단계 (b)의 에피토프 결합제는 tau-441의 아미노산 235 내지 368(이들을 포함) 내(또는 다른 전장 아이소폼에 대해 유사하게 정의된 영역 내) 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 단계 (b)의 에피토프 결합제는 tau-441의 아미노산 244 내지 368(이들을 포함) 내(또는 다른 전장 아이소폼에 대해 유사하게 정의된 영역 내) 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 단계 (b)의 에피토프 결합제는 tau-441의 아미노산 244 내지 299(이들을 포함) 내(또는 다른 전장 아이소폼에 대해 유사하게 정의된 영역 내) 에피토프에 특이적으로 결합한다.
본원에 개시된 방법에 사용하기 전에 생물학적 샘플은 세포 파편의 제거, 성분(예: 프로테아제 억제제, 동위원소 표지된 내부 표준, 세제(들), 카오트로픽제(들) 등)의 추가 및/또는 분석물(예: Aβ 펩타이드, N-말단 타우, 중간 도메인 타우 등)의 고갈에 의해 변형되었을 수 있다.
본원에 개시된 방법은 MTBR 타우를 측정하는 데 특히 적합하다. 상기 특정 구체예들에서, 본 발명의 방법들을 사용하여 IGST (서열 번호: 2), VQII (서열 번호: 4), LQTA (서열 번호: 3), LDLS (서열 번호: 5), HVPG (서열 번호: 6), IGSL (서열 번호: 7), 및 VQIV (서열 번호: 9)를 포함하는 (그러나 이에 제한되는 것은 아님) 하나, 또는 하나 이상의 타우 트립신 펩타이드의 농도를 측정할 수 있다. 일부 예에서, 2가지 이상의 타우 트립신 펩타이드의 농도를 측정한 다음 이들 2가지 값에 대한 비율을 계산하는 것이 바람직할 수 있다. 본원에 개시된 바와 같이, IGSL (서열 번호: 7)에 대한 HVPG (서열 번호: 6), IGSL (서열 번호: 7)에 대한 LQTA (서열 번호: 3), IGSL (서열 번호: 7)에 대한 IGST (서열 번호: 2), IGSL (서열 번호: 7)에 대한 VQII (서열 번호: 4), IGSL (서열 번호: 7)에 대한 LDLS (서열 번호: 5), HVPG (서열 번호: 6)에 대한 IGST (서열 번호: 2), HVPG (서열 번호: 6)에 대한 VQII (서열 번호: 4), HVPG (서열 번호: 6)에 대한 LDLS (서열 번호: 5), 및 LDLS (서열 번호: 5)에 대한 VQIV (서열 번호: 7)의 비율은 타우병증을 진단하고 치료 결정을 안내하기 위해 임상적으로 의미 있는 정보를 제공할 수 있다. 또 다른 예에서, 하나 이상의 추가 단백질의 존재/부재를 결정하고/하거나 생물학적 샘플에서 하나 이상의 추가 단백질의 농도를 측정하는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 대상체의 타우병증 관련 병리를 측정하는 방법을 제공하며, 이 방법은 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플, 예를 들어, 혈액 샘플 또는 CSF 샘플에서 하나 이상의 중간 도메인-결여 (mid-domain-independent) MTBR 타우 종들을 정량하는 단계를 포함하며, 이때 정량된 중간 도메인-결여 MTRB-타우 종들의 양, 또는 이들의 비율은 대상체 뇌에서의 타우병증 관련 병리를 나타내는 것이다. 타우병증은 3R-타우병증, 혼합 3R/4R-타우병증, 또는 4R-타우병증일 수 있다. 질환 관련 병리는 타우 침착, 타우 번역 후 변형, 뇌 및/또는 뇌 동맥의 아밀로이드 플라크, 또는 당업계에 공지된 기타 병리학적 특징일 수 있다. 대상체에게 타우병증의 임상 증상이 있을 수도 있고 없을 수도 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 대상체에서 타우병증을 진단하는 방법을 제공하며, 이 방법은 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플, 예컨대 혈액 샘플 또는 CSF 샘플에서 하나 이상의 중간 도메인-결여 MTBR 타우 종들을 정량하는 단계, 및 정량된 중간 도메인-결여 MTBR 타우 종들이 약 1.5σ 이상 상이한 경우 타우병증을 진단하는 단계를 포함하고, 이때 σ는 타우병증의 임상 징후나 증상이 없고 CSF에서 PET 영상화 및/또는 Aβ42/40 측정으로 측정 시 아밀로이드 음성인 대조군에서 측정한 정규 분포로 정의된 표준 편차이다. 타우병증은 3R-타우병증, 혼합 3R/4R-타우병증, 또는 4R-타우병증일 수 있다. 대상체에게 질환의 임상 증상이 있을 수도 있고 없을 수도 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 대상체에서 질환 안정성을 측정하는 방법을 제공하며, 이 방법은 대상체로부터 얻은 제1 생물학적 샘플에서 하나 이상의 중간 도메인-결여 MTBR 타우 종을 정량하는 단계 (이때 제2 생물학적 샘플은 제1 생물학적 샘플 이후 (예를 들어, 수 일, 수 주, 수 개월, 또는 수 년 이후 얻었음), 및 샘플들 간 정량된 MTBR 타우 종들의 차이를 계산하는 단계를 포함하고, 이때 제2 샘플에서 정량된 MTBR 타우 종의 통계적으로 유의한 증가는 질환 진행을 나타내고, 제2 샘플에서 정량된 MTBR 타우 종의 통계적으로 유의한 감소는 질환 개선을 나타내며, 변화가 없으면 안정적인 질환을 나타낸다. 대상체에게 질환의 임상 증상이 있을 수도 있고 없을 수도 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 타우병증 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 이 방법은 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플, 예컨대 혈액 샘플 또는 CSF 샘플에서 하나 이상의 중간 도메인-결여 MTBR 타우 종들을 정량하는 단계; 및 대상체에게 질환 관련 병리 및/또는 임상 증상 측정을 개선하기 위한 치료를 제공하는 단계를 포함하고, 이때 대상체는 약 1.5σ 이상 상이한 정량된 MTBR 타우 종을 가지며, 이때 σ는 타우병증의 임상 징후나 증상이 없고 CSF에서 PET 영상화 및/또는 Aβ42/40 측정으로 측정 시 아밀로이드 음성인 대조군에서 측정한 정규 분포로 정의된 표준 편차이다. 타우병증은 3R-타우병증, 혼합 3R/4R-타우병증, 또는 4R-타우병증일 수 있다. 질환 관련 병리의 측정은 MTBR 타우 종의 양 및/또는 PET 영상화에 의해 측정된 타우 침착, 질량 분석법 또는 기타 적절한 방법에 의해 측정된 타우 번역 후 변형, PET 영상화에 의해 측정된 뇌 또는 뇌 동맥의 아밀로이드 플라크, CSF에서 Aβ42/40에 의해 측정된 아밀로이드 플라크, 또는 당업계에 공지된 다른 병리학적 특징 일 수 있다. 임상 증상은 임상적으로 검증된 기기 (예를 들어, MMSE, CDR-SB 등)에 의해 측정된 치매 또는 3R-, 3R/4R- 및 4R-타우병증에 대해 당업계에 공지된 기타 임상 증상일 수 있다.
본 발명의 이러한 그리고 다른 측면 및 반복을 이하에서 보다 자세하게 설명한다.
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도 1은 가장 긴 인간 타우 아이소폼 (2N4R)의 개략도이다. 이러한 아이소폼에서 N-말단 (N term), 중간 도메인, MTBR, 및 C-말단 (C term)을 표시하고 이는 다른 타우 아이소폼들 (예를 들어, 2N3R, 1NR4, 1N3R, 0N4R, 및 0N3R)에서 예측가능한 방식으로 예측가능한 방식으로 달라질 것이다.
도 2A는 본 발명의 여러 방법을 예시하는 개략도이다. 파란색 상자 (오른쪽)에 자세히 도시된 방법이 하나의 방법이다. 빨간색 상자(왼쪽)와 파란색 상자(오른쪽)의 조합이 또 다른 방법이다.
도 2B는 본 발명의 여러 방법을 도시하는 개략도이다. 파란색 상자 (오른쪽)에 자세히 도시된 방법이 하나의 방법이다. 빨간색 상자(왼쪽)와 파란색 상자(오른쪽)의 조합이 또 다른 방법이다.
도 3A는 하나의 CSF 테스트 샘플로부터 타우 펩타이드를 정량하는 능력에 대한 3가지 샘플 처리 방법의 효과를 비교하는 그래프이다. CSF의 테스트 샘플은 단일 개체의 것이 아니며 CSF와 관련된 질환 상태는 알 수 없다. Tau-441 펩타이드는 x-축에, 그리고 14N/15N 비율은 y-축에 표시한다. 항체 HJ8.5 및 Tau1(각각 "Y"로 표시됨)에 의해 인식되는 에피토프의 상대 위치가 표시된다. IP법(녹색 삼각형)으로 처리된 샘플에서, MTBR 영역의 타우 트립신 펩타이드가 검출될 수 있지만 N-말단으로부터 중간 도메인까지의 타우 트립신 펩타이드보다 훨씬 낮은 신호를 가지며 AD 및 건강한 지원자를 포함한 만성 신경퇴행성 질환의 인간 CSF에서는 정량할 수 없다. 대조적으로, 이러한 펩타이드는 CX 방법(파란색 원) 또는 PostIP-CX법(빨간색 사각형)으로 처리된 샘플에서 쉽게 검출된다.
도 3B는 샘플 처리가 하류 방법에 의해 검출된 타우 단백질의 집단에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지를 보여주는 예시이다. IP법(녹색 점선으로 표시됨)에서 항체에 의해 인식되는 N-말단 및 중간 도메인 에피토프(각각 HJ8.5 및 Tau1로 예시됨)가 있는 타우 종은 면역침전된다. PostIP-CX법(빨간색 점선으로 표시됨)에서 면역침전 및 침전 후에 존재하는 타우 종은 면역침전에 사용된 항체에 의해 인식되는 에피토프("MTBR-C" 그림으로 예시)가 없거나 또는 이러한 에피토프들은 접근불가능하다 (비선형 입체구조의 타우 그림으로 예시). 사전 면역침전 없이 발생하는 CX 방법(파란색 점선으로 표시됨)은 IP법 및 PostIP-CX법에서 생성된 타우 종을 포함하는 샘플을 생성한다.
도 4는 LOAD100 및 LOAD60 CSF 샘플에서 측정된 pT217%(x-축) vs. Aβ42/40 농도(y-축)의 그래프이다. 점선 수평선은 CSF Aβ42/40 농도로 정의된 아밀로이드 상태를 구분한다 (CSF Aβ42/40 > 0.1389 = 아밀로이드 양성, CSF Aβ42/40 < 0.1389 = 아밀로이드 음성). 도시된 바와 같이, p217%는 이 컷오프에 의해 정의된 아밀로이드 상태와 상관관계가 매우 우수하다.
도 5는 실시예 1에 설명된 IP법(IP_TPPS, 왼쪽 그래프) 또는 실시예 1 및 2(PostIP_HVPG, 오른쪽 그래프)에 설명된 PostIP-CX법으로 처리된 CSF 샘플에서 질량 분석법으로 정량한 타우, TPPS 및 HVPG의 2가지 트립신 펩타이드의 양을 그래프로 도시한다. CSF 샘플은 CDR 점수 및 아밀로이드 상태로 확인된다. 두 그래프 사이의 그림은 tau-441에서 트립신 펩타이드의 상대적 위치를 나타낸다. NS - 유의하지 않음.
도 6A는 실시예 1 및 2에 기재된 PostIP-CX법에 의해 처리된 CSF 샘플에서 Aβ42/40에 대한 타우, HVPG의 트립신 펩타이드의 양을 그래프로 도시한다. CSF 샘플은 아밀로이드 상태 - 아밀로이드 양성(빨간색) 또는 아밀로이드 음성(파란색))으로 확인된다. Aβ42/40 측면에서 아밀로이드 상태와의 밀접한 상관관계에 의해 입증된 바와 같이, 데이터는 실시예 1 및 2에 기술된 PostIP-CX법에 의해 처리된 CSF 샘플에서 HVPG의 측정이 뇌의 아밀로이드 상태를 요약함을 보여준다.
도 6B는 실시예 1 및 2에 기재된 PostIP-CX법에 의해 처리된 CSF 샘플에서 pT217%에 대한 타우의 트립신 펩타이드, HVPG의 양을 그래프로 도시한다. CSF 샘플은 아밀로이드 상태 - 아밀로이드 양성(빨간색) 또는 아밀로이드 음성(파란색))으로 확인된다. pT217% 측면에서 아밀로이드 상태와의 밀접한 상관관계에 의해 입증된 바와 같이, 데이터는 실시예 1 및 2에 기술된 PostIP-CX법에 의해 처리된 CSF 샘플에서 HVPG의 측정이 뇌의 아밀로이드 상태를 요약함을 보여준다.
도 7A, 도 7B, 및 도 7C는 실시예 1 및 2에 기술된 PostIP-CX법에 의해 처리된 CSF 샘플에서 타우의 3가지 트립신 펩타이드, LQTA (도 7A), HVPG (도 7B), 및 IGSL (도 7C)의 양을 그래프로 도시한다. CSF 샘플은 CDR 점수 및 아밀로이드 상태 별로 그룹화된다. 데이터는, LQTA가 아밀로이드 음성 대상체와 비교하여 아밀로이드 양성 대상체에서 심지어 증상 단계에서도 증가했고; HVPG는 특히 무증상 단계에서 아밀로이드 음성 대상체와 비교하여 아밀로이드 양성 대상체에서 증가했으며; 및 IGSL은 아밀로이드 음성 대상체에 비해 아밀로이드 양성 대상체에서 증가하고 증상 단계 후에 감소했음을 보여준다.
도 8A, 도 8B, 및 도 8C는 실시예 1 및 2에 기술된 PostIP-CX법에 의해 처리된 CSF 샘플에서 타우의 3가지 트립신 펩타이드, LQTA (도 8A), HVPG (도 8B), 및 IGSL (도 8C) 각각의 양을 그래프로 도시한다. 세로축의 개별 환자들의 샘플들을 아밀로이드 상태에 따라 기호로 (CDR0=검은색 원, CDR0.5=파란색 삼각형, CDR1=빨간색 사각형, CDR2=보라색 역삼각형) 나타내어 도시한다. 개별 참가자의 1차 및 2차 방문 결과에 대해 대응표본 t-검정을 사용하였다. 아밀로이드 양성 그룹은 각 환자에서 방향에 있어 유의한 변화를 보였다. 또한 타우-PET 신호가 높았고(>2 SUVR) CDR 점수가 CDR1에서 CDR2로 변경된 참가자 A(굵은 빨간색 선으로 표시)에서 관찰된 변화도 주목할 만하다. 이 환자의 경우, 타우 병리의 진행으로 인해 LQTA가 증가하고 (도 8A), HVPG가 감소했으며 (도 8B), IGSL이 감소했다 (도 8C).
도 9A, 도 9B, 및 도 9C는 실시예 1 및 2에 기재된 PostIP-CX법에 의해 처리된 CSF 샘플에서 타우의 3가지 트립신 펩타이드의 양 vs. 샘플을 얻은 대상체에 대한 CDR-SB 점수를 그래프로 도시한다. 타우의 3가지 트립신 펩타이드는 각각 LQTA, HVPG 및 IGSL이다. 아밀로이드 양성 대상체는 파란색 원이고; 아밀로이드 음성 대상체는 빨간색 사각형이다. 수반된 통계적 분석에 의해 나타난 바와 같이, LQTA만이 CDR-SB와 유의한 상관관계가 있다.
도 10A, 도 10B, 및 도 10C는 실시예 1 및 2에 기재된 PostIP-CX법에 의해 처리된 CSF 샘플에서 타우의 3가지 트립신 펩타이드의 양 vs. 샘플을 얻은 대상체에 대한 간이 정신 상태 검사(MMSE) 점수를 그래프로 도시한다. 타우의 3가지 트립신 펩타이드는 각각 LQTA, HVPG 및 IGSL이다. 아밀로이드 양성 대상체는 파란색 원이고; 아밀로이드 음성 대상체는 빨간색 사각형이다. 수반된 통계적 분석에서 나타난 바와 같이, LQTA만이 MMSE와 유의한 상관관계가 있다.
도 10A, 도 10B, 및 도 10C는 실시예 1 및 2에 기재된 PostIP-CX법에 의해 처리된 CSF 샘플에서 타우의 3가지 트립신 펩타이드의 양 vs. 샘플을 얻은 대상체에 대한 간이 정신 상태 검사(MMSE) 점수를 그래프로 도시한다. 타우의 3가지 트립신 펩타이드는 각각 LQTA, HVPG 및 IGSL이다. 아밀로이드 양성 대상체는 파란색 원이고; 아밀로이드 음성 대상체는 빨간색 사각형이다. 수반된 통계적 분석에서 나타난 바와 같이, LQTA만이 MMSE와 유의한 상관관계가 있다.
도 11A, 도 11B, 및 도 11C는 실시예 1 및 2에 기재된 PostIP-CX법에 의해 처리된 CSF 샘플에서 타우의 3가지 트립신 펩타이드의 양 vs. 샘플을 얻은 대상체에 대한 Tau-PET 점수를 그래프로 도시한다. 타우의 3가지 트립신 펩타이드는 각각 LQTA, HVPG 및 IGSL이다. 아밀로이드 양성 대상체는 파란색 원이고; 아밀로이드 음성 대상체는 빨간색 사각형이다. 수반된 통계적 분석에서 나타난 바와 같이, LQTA만이 Tau-PET와 유의한 상관관계가 있다. MTBR 타우의 다른 트립신 펩타이드는 그렇지 않았다.
도 12A 및 도 12B는 실시예 1 및 2에 기재된 PostIP-CX법에 의해 처리된 CSF 샘플에서 타우의 트립신 펩타이드, LQTA의 양 vs. CDR-SB(도 12A) 및 MMSE(도 12B)를 그래프로 도시한다. 이들 데이터는 2가지 다른 인지 장애 측정으로 평가시 LQTA가 인지 기능과 유의한 상관관계를 보여주었음을 나타낸다.
도 13A는 IP법(x축) 및 PostIP-CX법(y축)에 의해 처리된 샘플에서 타우의 트립신 펩타이드, LQTA의 양을 그래프로 도시한다. 아밀로이드 양성 대상체는 빨간색 기호로 확인된다; 아밀로이드 음성 대상체는 파란색 기호로 확인된다. 수반된 통계적 분석에서 나타난 바와 같이, 아밀로이드 음성 그룹에서보다 아밀로이드 양성 그룹에서 "MTBR 관련 LQTA"(PostIP-CX법으로 처리된 샘플에서 측정)만이 더 많은 증가를 보였다.
도 13B 및 도 13C는 실시예 1 및 2에 각각 기재된 PostIP-CX법 또는 IP법에 의해 처리된 CSF 샘플에서 타우의 트립신 펩타이드, LQTA의 양을 그래프로 도시한다. CSF 샘플은 CDR 점수 및 아밀로이드 상태 별로 그룹화된다. 데이터는 "MTBR 관련 LTQA"에서만 LQTA 특이적 특성(즉, 증상 단계 후 선형 증가)이 관찰되었음을 보여준다. 데이터를 개별 결과(플롯)와 평균(막대)으로 나타낸다. 통계적 검정에서 유의도: ****p <0.001, ***p <0.001, **p <0.01, *p <0.05. NS = 유의하지 않음. 통계적 차이는 FDR이 5%로 설정된 Benjamini-Hochberg 거짓 발견율 (FDR) 방법을 사용한 다중 비교 수정이 포함된 일원 분산 분석으로 평가되었.
도 14는 아밀로이드 상태를 결정하기 위해 IP법 또는 PostIP-CX법에 따라 질량분석으로 측정한 타우 트립신 펩타이드 LQTA의 민감도와 특이도를 비교한 수신자 조작 특성 곡선 (ROC)을 나타낸 그래프이다. 이들 곡선은 PostIP-LQTA(MTBR 관련 LQTA)가 IP-LQTA보다 아밀로이드 상태를 더 잘 판별한다는 것을 보여준다.
도 15A 및 도 15B는 HVPG에 대한 IGSL의 비율이 판별력을 증가시키는 것을 보여준다. 도 15A는 실시예 1 및 2에 기술된 PostIP-CX법에 의해 처리된 CSF 샘플에서 비율(IGSL/LQTA)로 표현된 타우의 트립신 펩타이드, IGSL 및 LQTA의 양을 그래프로 도시한다. CSF 샘플은 CDR 점수 및 아밀로이드 상태 별로 그룹화된다. 도 15B는 IGSL/LQTA 비율과 pT205% 사이의 관계를 그래프로 보여준다. pT205%는 전술한 바와 같이 측정되었다 (Barth
Figure pct00003
lemy, N.R., Li, Y., Joseph-Mathurin, N.　외　 Nat Med　26,　398-407 (2020)). IGSL/LQTA는 pT205와 매우 밀접한 상관관계를 보여주며, 이는 AD 발병에 근접한 시기에 조절된다.
도 15C 및 도 15D는 HVPG에 대한 IGSL의 비율이 판별력력을 증가시킴을 보여준다. 도 15C는 실시예 1 및 2에 기술된 PostIP-CX법에 의해 처리된 CSF 샘플에서 비율(IGSL/HVPG)로 표현된 타우의 트립신 펩타이드, IGSL 및 HVPG의 양을 그래프로 도시한다. CSF 샘플은 CDR 점수 및 아밀로이드 상태 별로 그룹화된다. 도 15D는 IGSL/LQTA 비율과 pT217% 사이의 관계를 그래프로 보여준다. IGSL/HVPG는 아밀로이드 상태를 요약하는 pT217과 매우 밀접한 상관관계를 보여준다.
도 16은 타우 병리가 별개의 알츠하이머 질환 단계들을 통해 진화하는 것을 보여주는 그림이다. 결정적 알츠하이머 질환 돌연변이가 있는 참가자 그룹에서 4가지 상이한 가용성 타우 종과 불용성 타우를 측정하면, 약 40년에 걸쳐 (x-축) 타우 관련 변화가 펼쳐지고 (y-축) 이들은 질환 단계 및 다른 측정가능한 바이오마커들에 기반하여 달라짐을 보여준다. 원섬유 아밀로이드 병리의 발달로 시작하여 위치 217(보라색)과 181(파란색)에서 인산화가 증가하기 시작한다. 신경 기능장애 (대사 변화 기반)가 증가함에 따라 위치 205에서의 인산화 (녹색)는 가용성 타우 (오렌지색)과 함께 증가하기 시작한다. 마지막으로, (뇌 위축 및 인지 저하에 기반한) 신경퇴행의 발병과 함께 타우 PET 엉킴(빨간색)이 발생하기 시작하면서 217과 181의 인산화가 감소하기 시작한다. 또한, 이는 질환 과정 동안 가용성 및 응집된 타우의 역동적 발산 패턴 및 아밀로이드 병리와의 밀접한 관계를 강조하는 것이다.
도 17은 절단에 대한 상이한 MTBR 타우 영역들의 접근성이 알츠하이머 질환(AD) 진행 동안 어떻게 변할 수 있는지, 그리고 서열 번호: 3의 아미노산 서열 (LQTAPVPMPDLK)을 포함하는 MTBR 타우 종이 모든 AD 단계 전반에 걸쳐 타우-병리에 대한 우수한 대용물인 이유를 보여주는 이론적 모델을 도시한다. 전임상 AD 단계에서, 뇌 타우 응집체는 미성숙 상태여서, 프로테아제가 더 많이 접근할 수 있게 한다. MTBR tau-243, MTBR tau-299, 및 MTBR tau-354를 포함하는 MTBR 타우 종들은 CSF 내부로 분비된다. 그러나, 타우 응집체가 질환 진행과 함께 성숙하고 점점 더 단단한 코어를 형성함에 따라, MTBR tau-354 및 MTBR tau-299에 대한 프로테아제 접근이 감소하고, MTBR tau-354, 그리고 그 후 MTBR tau-299를 포함하는 MTBR 종들이 CSF에서 안정화된다. 그러나 MTBR tau-243은 노출된 상태로 유지되어 모든 질환 단계에서 프로테아제 분해 및 CSF로의 방출을 가능하게 한다. CSF에서 이 3가지 종들의 불균형은 뇌 타우 응집체 형성으로 관찰된다. 참고: 이 도면에서 MTBR 타우 종들 간의 크기 차이는 도시되지 않는다.
도 18A는 실시예 3에서 정량되고 도 18B 및 도 18C에서 상세히 논의된, 타우의 트립신 펩타이드 (회색 막대)에 관한 개략도이다.
도 18B 및 도 18C는 MTBR tau-243, 299 및 354를 포함하는 뇌 MTBR 타우 종이 대조군 뇌 추출물에 비해 응집된 알츠하이머 질환 뇌 불용성 추출물에 농축됨을 보여주는 그래프로서, MTBR 타우가 알츠하이머 질환 뇌에 특이적으로 침착됨을 확인시켜 주는 것이다. 이들 그래프는 (도 18B) 대조군 및 알츠하이머 질환 뇌 (n=2, 발견 코호트 내 6-8개 뇌 영역 샘플들/그룹이 있음) 및 (도 18C) 대조군 (아밀로이드 음성, n=8), 매우 경증 내지 중등도 매우 경증 내지 중등도 알츠하이머 질환 (AD) (아밀로이드 양성, CDR=0.5 - 2, n=5), 및 중증 AD 뇌 (아밀로이드 양성, CDR=3, n=7) (검증 코호트 내 합계 n=20)의 타우 펩타이드에 관한 농축 프로파일을 보여준다. 타우 펩타이드의 상대적 풍부도는 내부 정규화를 위해 중간 도메인(잔기 181-190) 펩타이드에 대해 정량되었다. 미세소관 결합 영역 (MTBR) 도메인 (잔기 243-254, MTBR tau-243) 및 반복 영역 2 (R2) 내지 R3 및 R4 (각각, 잔기 299-317, MTBR tau-299 및 354-369, MTBR tau-354)의 상류 영역을 포함하는 종들은 대조군에 비해 알츠하이머 질환 뇌의 불용성 분획에 매우 농축되어 있었으며 CDR로 측정한 질환 진행의 임상 단계에 따라 특히 농축되어 있었다. MTBR tau-299 및 MTBR tau-354는 필라멘트 코어 내부에 위치하는 반면, MTBR tau-243은 알츠하이머 질환 응집체의 코어 외부에 위치한다 (Fitzpatrick 외, 2017). 참고로, 잔기 195-209는 알츠하이머 질환 뇌에서 감소하였는데, 이는 높은 인산화도로 인한 것일 수 있다. 데이터는 중앙값, 사분위수 간격, 최소값, 최대값 및 이상치에 대한 개개 점들을 기술하는 Tukey 방법을 사용하여 상자 수염 플롯으로 표시된다. 통계적 검정에서 유의도: ****p <0.001, ***p <0.001, **p <0.01, *p <0.05.
도 19A는 실시예 3에서 정량되고 도 19B 및 도 19C에서 상세히 논의된, 타우의 트립신 펩타이드 (회색 막대) 및 항체 HJ8.5 및 Tau1의 일반적인 결합 부위에 관한 개략도이다.
도 19B는 대조군 인간 CSF에서 타우 프로파일을 보여주는 그래프이다. 아밀로이드 음성 및 CDR=0 환자(n=30)의 단면 코호트로부터 얻은 대조군 인간 CSF의 타우 펩타이드는 N-말단에서 중간 도메인 타우에 초점을 맞춘 Tau1/HJ8.5 면역침전에 의해 정량되었다. 미세소관 결합 영역(MTBR) 및 C-말단 영역을 포함하는 종을 정량하기 위해 면역침전 후 CSF 샘플을 화학적으로 추출하고 순차적으로 분석했다. Tau1/HJ8.5 면역침전법(파란색 원)을 사용하면 잔기 222 이후의 펩타이드 회수율이 급격히 감소했으므로; N-말단 내지 중간 도메인 타우(잔기 6-23에서 243-254까지)의 펩타이드만이 이 방법으로 정량되었다 (Sato 외, 2018). 대조적으로, 면역침전 후 CSF(빨간색 사각형)의 화학적 추출 방법은 0.4 - 7 ng/mL 사이의 농도에서 MTBR 내지 C-말단 영역을 포함한 타우의 전체 영역을 정량할 수 있었다. 데이터는 평균으로 표시된다.
도 20A, 도 20B, 및 도 20C는 상기 단면 코호트의 PostIP-CX CSF에서 중간 도메인-결여 MTBR tau-243 (도 20A), 중간 도메인-결여 MTBR tau-299 (도 20B), 및 중간 도메인-결여 MTBR tau-354 (도 20C)의 양을 보여주는 그래프이다. 중간 도메인-결여 MTBR tau-243, 중간 도메인-결여 MTBR tau-299 및 중간 도메인-결여 MTBR tau-354는 아밀로이드 플라크 및 임상 치매 단계에 대해 상이한 프로파일을 보여준다. 아밀로이드 음성 CDR=0 (대조군, n=30), 아밀로이드 양성 CDR=0 (전임상 AD, n=18), 아밀로이드 양성 CDR=0.5 (매우 경증 AD, n=28), 아밀로이드 양성 CDR≥1 (경증-중등도 AD, n=12), 및 아밀로이드 음성 CDR≥0.5 (비AD 인지 장애, n=12). 중간 도메인-결여 MTBR tau-243는 모든 임상 단계에서 알츠하이머 병의 진행에 따라 지속적인 증가를 보였다. 중간 도메인-결여 MTBR tau-299 및 중간 도메인-결여 MTBR tau-354 농도는 매우 경증인 알츠하이머 질환 단계 (아밀로이드 양성 및 CDR=0.5)까지는 유사하게 증가하였으나, 그 이후 CDR≥1 에서 포화 (MTBR tau-299) 또는 감소(MTBR tau-354) 되었다. 빨간색 또는 파란색 글꼴의 p-값은 각각 상당한 증가 또는 감소를 나타낸다. 데이터를 개별 결과(플롯)와 평균(막대)으로 나타낸다. 통계적 검정에서 유의도: ****p <0.001, ***p <0.001, **p <0.01, *p <0.05. NS = 유의하지 않음.
도 21A, 도 21B, 및 도 21C는 아밀로이드 음성 (-) 또는 양성 (+) 환자의 CSF에서, (도 21A) 중간 도메인-결여 MTBR tau-243, (도 21B) 중간 도메인-결여 MTBR tau-299, 및 (도 21C) 중간 도메인-결여 MTBR tau-354의 종단 변화율 (ng/mL/년)을 보여주는 그래프이다 (종축 코호트로부터의 합계 n=28). 아밀로이드 양성 그룹들은 CDR=0 - 0 (n=7), CDR=0 - 0.5 (n=2), CDR=0 - 1 (n=1), CDR=0.5 - 0.5 (n=2), CDR=0.5 - 1 (n=1), 및 CDR=1 - 2 (n=1, 참가자 A)를 포함한 다양한 CDR 변화로 세분된다. 아밀로이드 음성 그룹의 참가자는 의미 있는 종단 변화를 나타내지 않았지만 (평균값이 0에 가까움), 아밀로이드 양성 그룹의 참가자 대부분은 MTBR 타우 농도가 종단적으로 증가하는 것으로 나타났다. 특히, 알츠하이머 질환 임상 발병 후 인지 변화가 가장 큰 참가자 A(CDR=1 내지 2)는 경증 AD(CDR=1)로부터 중등도 AD(CDR=2)로 진행됨에 따라 CSF MTBR tau-243만 증가했으며 MTBR 타우 -299와 354가 감소했음을 나타내었다. 이들 데이터는 CSF 중간 도메인-결여 MTBR 타우 종이 알츠하이머 질환 임상 단계 진행에 따라 종단적으로 증가함을 보여준다.
도 22A, 도 22B, 및 도 22C는 PostIP-CX CSF에서 (x-축) tau PET (AV-1451) SUVR 및 (y-축) 중간 도메인-결여 (도 22A) MTBR tau-243, (도 22B) MTBR tau-299, 및 (도 22C) MTBR tau-354 농도를 보여주는 그래프이다 (대조군 n=15 및 tau PET 코호트의 알츠하이머 질환 (AD) n=20). 열린 원: 대조군, 채워진 사각형: AD. 중간 도메인-결여 MTBR tau-243은 tau PET SUVR와 가장 유의한 상관관계를 보여주었다 (r=0.7588, p<0.0001). 이들 데이터는 서열 번호: 3 (LQTAPVPMPDLK)를 포함하는 CSF 중간 도메인-결여 MTBR 타우 종이 타우 엉킴의 tau PET SUVR과 높은 상관관계가 있는 반면, 다른 중간 도메인-결여 MTBR 타우 영역들은 타우 엉킴과 낮은 상관관계가 있음을 보여준다.
도 23A 및 도 23B는 뇌 MTBR tau-243, MTBR tau-299, 및 MTBR tau-354가 대조군 뇌 추출물에 비해 알츠하이머 질환 뇌 가용성 추출물이 농축되어 있지 않음을 그래프로 도시한다. 도 23A는 대조군 및 알츠하이머 질환 뇌 (n=2, 발견 코호트 내 6-8개 뇌 영역 샘플들/그룹이 있음)의 타우 펩타이드의 농축 프로파일을 보여주며 도 23B는 검증 코호트의 대조군 (아밀로이드 음성, n=8), 매우 경증 내지 중등도 알츠하이머 질환 (AD) (아밀로이드 양성, CDR=0.5 - 2, n=5), 및 중증 AD 뇌 (아밀로이드 양성, CDR=3, n=7) (합계 n=20)의 타우 펩타이드의 농축 프로파일을 보여준다. 타우 펩타이드의 상대 펩타이드 풍부도는 내부 정규화를 위해 중간 도메인(잔기 181-190) 펩타이드에 대해 정량되었다. 알츠하이머 질환 뇌에서 증가된 불용성 MTBR 타우 종과 대조적으로 가용성 타우 종에서 미세소관 결합 영역(MTBR) 도메인을 포함하는 타우 종에서는 변화가 관찰되지 않았다 (도 18). 데이터는 중앙값, 사분위수 간격, 최소값, 최대값 및 이상치에 대한 개개 점들을 기술하는 Tukey 방법을 사용하여 상자 수염 플롯으로 표시된다. 통계적 검정에서 유의도: **p <0.01, *p <0.05.
도 24는 MTBR tau-354가 뇌 불용성 추출물에서 tau368과 상관관계가 있음을 보여주는 그래프로서, 각 종이 타우 병리의 진행 별로 구별되지 않음을 시사한다. 대조군 및 알츠하이머 질환 환자의 뇌 불용성 추출물에서 MTBR tau-354 및 tau368 종의 질량 분석법은 발견 코호트 샘플 (총 23개의 뇌 샘플, 알츠하이머 질환 #1 참가자의 뇌 영역 6개, 알츠하이머 질환 #2 참가자의 뇌 영역 8개, 대조군 #1 참가자의 뇌 영역 5개, 대조군 #2 참가자의 뇌 영역 4개)을 사용하여 수행되었다. MTBR tau-354(잔기 354-369)와 이의 절단된 형태인 tau368(잔기 354-368)은 뇌 불용성 추출물에서 밀접한 상관관계를 나타냈다 (Spearman r=0.9783).
도 25A, 도 25B, 도 25C, 도 25D, 도 25E 및 도 25F는 PostIP-CX법으로 가공하고 이어서 질량 분석법 (MS)을 수행한 후 인간 CSF 샘플에서 MTBR 타우의 트립신 펩타이드의 정량화를 보여주는 그래프이다. 중간 도메인-결여 MTBR tau-243 (도 25A, 도 25D), 중간 도메인-결여 MTBR tau-299 (도 25B, 도 25E), 및 중간 도메인-결여 MTBR tau-354 (도 25C, 도 25F)의 추출된 MS 크모마토그램을 도시한다. 인간 CSF는 상기 단면 코호트의 아밀로이드 양성 및 CDR=0.5의 매우 경증인 알츠하이머 질환 참가자로부터 얻었다. 도 25A, 도 25B, 및 도 25C는 내인성 트립신 펩타이드로부터 얻은 피크들을 보여주는 반면, 도 25D, 도 25E, 및 도 25F는 내부 표준 (15N-표지 타우)으로부터 얻은 피크들을 보여준다. X-축 및 Y-축은 각각 각 피크의 체류 시간 및 강도를 표시한다.
도 26A, 도 26B, 도 26C, 도 26D, 도 26E, 도 26F, 도 26G, 도 26H, 도 26I, 도 26J, 및 도 26K는 IP법으로 샘플을 가공하고 MS 분석 후 인간 CSF에서 N-말단 타우 및 중간 도메인 타우의 트립신 펩타이드 농도를 나타내는 그래프이다. N-말단 및 중간 도메인 CSF 타우 종은 매우 초기의 치매를 정상과 구분하지만, 치매 단계와 상관관계는 없다. 상기 단면 코호트에 속하는 그룹들의 CSF에서 타우 종들, 잔기 (도 26A) 6-23, (도 26B) 25-44, (도 26C) 45-67, (도 26D) 68-87, (도 26E) 88-126, (도 26F) 151-155, (도 26G) 181-190, (도 26H) 195-209, (도 26I) 212-221, (도 26J) 226-230, 및 (도 26K) 243-254 농도 (잔기 넘버링은 tau-441에 기반). 아밀로이드 음성 CDR=0 (대조군, n=29), 아밀로이드 양성 CDR=0 (전임상 AD, n=18), 아밀로이드 양성 CDR=0.5 (매우 경증 AD, n=27), 아밀로이드 양성 CDR≥1 (경증-중등도 AD, n=12), 및 아밀로이드 음성 CDR≥0.5 (비AD 임상 손상, n=12). 이들 타우 종은 Tau1/HJ8.5 면역침전법(IP법)을 사용하여 단리되었다. 빨간색 글꼴의 p-값은 유의도를 나타낸다. 데이터를 개별 결과(플롯)와 평균(막대)으로 나타낸다. 통계적 검정에서 유의도: ****p <0.001, ***p <0.001, **p <0.01, *p <0.05. NS = 유의하지 않음.
도 27A, 도 27B, 도 27C, 도 27D, 도 27E, 도 27F, 도 27G, 및 도 27H는 PostIP-CX법으로 샘플을 가공한 다음 MS로 분석 후 인간 CSF에서 MTBR 타우의 트립신 펩타이드 농도를 보여주는 그래프이다. 독특한 알츠하이머 질환 아밀로이드 및 임상 단계 패턴은 CSF에서 중간 도메인-결여 MTBR 타우 종에 특이적인 것이다. 중간 도메인-결여 MTBR tau-243만이 임상 단계 진행 별로 더 많이 구분된다. 상기 단면 코호트에 속하는 참가자들의 면역침전후 샘플로부터 화학추출법을 사용하여 얻은 CSF에서 타우 종들, 잔기 (도 27A) 243-254 (MTBR tau-243), (도 27B) 260-267, (도 27C) 275-280, (도 27D) 282-290, (도 27E) 299-317 (MTBR tau-299), (도 27F) 354-369 (MTBR tau-354), (도 27G) 386-395, 및 (도 27H) 396-406의 농도 (잔기 넘버링은 tau-441에 기반). 아밀로이드 음성 CDR=0 (대조군, n=30), 아밀로이드 양성 CDR=0 (전임상 AD, n=18), 아밀로이드 양성 CDR=0.5 (매우 경증 AD, n=28), 아밀로이드 양성 CDR≥1 (경증-중등도 AD, n=12), 및 아밀로이드 음성 CDR≥0.5 (비AD 임상 장애, n=12). 빨간색 또는 파란색 글꼴의 p-값은 각각 상당한 증가 또는 감소를 나타낸다. 데이터를 개별 결과(플롯)와 평균(막대)으로 나타낸다. 통계적 검정에서 유의도: ****p <0.001, ***p <0.001, **p <0.01, *p <0.05. NS = 유의하지 않음.
도 28A, 도 28B, 도 28C, 도 28D, 도 28E, 도 28F, 도 28G, 도 28H, 도 28I, 및 도 28J는 PostIP-CX법으로 샘플을 가공하고 MS 분석 후 인간 CSF에서 N-말단 타우 및 중간 도메인 타우의 트립신 펩타이드 농도를 나타내는 그래프이다. N 말단 및 중간 도메인 CSF 타우 종은 정제 방법에 관계없이 치매 단계와 상관관계가 없다 (도 26을 또한 참조). 상기 단면 코호트에 속하는 그룹들의 CSF에서 타우 종들, 잔기 (도 28A) 6-23, (도 28B) 25-44, (도 28C) 45-67, (도 28D) 68-87, (도 28E) 88-126, (도 28F) 151-155, (도 28G) 181-190, (도 28H) 195-209, (도 28I) 212-221, 및 (도 28J) 226-230의 농도. 아밀로이드 음성 CDR=0 (대조군, n=29), 아밀로이드 양성 CDR=0 (전임상 AD, n=18), 아밀로이드 양성 CDR=0.5 (매우 경증 AD, n=27), 아밀로이드 양성 CDR≥1 (경증-중등도 AD, n=12), 및 아밀로이드 음성 CDR≥0.5 (비AD 임상 손상, n=12). 이들 타우 종들은 Tau1/HJ8.5 면역침전법 이후 면역침전후 CSF (PostIP-CX)의 화학추출을 사용하여 단리되었다. N-말단 내지 중간 도메인 타우 종들에 대한, 면역침전법 및 면역침전후 CSF의 화학추출법으로부터 얻은 농도의 합을 보여준다 (총 농도로). 빨간색 글꼴의 p-값은 통계적 유의도를 나타낸다. 데이터를 개별 결과(플롯)와 평균(막대)으로 나타낸다. 통계적 검정에서 유의도: ****p <0.001, ***p <0.001, **p <0.01, *p <0.05. NS = 유의하지 않음.
도 28K는 잔기 243-254를 함유하는 타우 종들의 총 농도(IP법 및 PostIP-CX법으로 얻은 합계 농도)를 나타내는 그래프이다.
도 29는 CSF에서 중간 도메인-결여 MTBR tau-354가 중간 도메인-결여 tau368과 상관관계가 있음을 그래프로 보여준다. CSF는 일반적으로 실시예 3에 기술된 PostIP-CX법에 의해 처리되었다. 중간 도메인-결여 MTBR tau-354 (잔기 354-369) 및 이의 절단된 형태인 tau368 (잔기 354-368)은 밀접한 상관관계를 나타냈다 (Spearman r=0.8382). 결과들을 단면 코호트 샘플에서 얻었다 (n=100, 모든 임상 단계 포함).
도 30A, 도 30B, 및 도 30C는 CSF 중간 도메인-결여 MTBR tau-243이 임상 치매 등급 - 상자들의 합 (CDR-SB)과 높은 상관관계가 있는 반면, 중간 도메인-결여 MTBR tau-299 및 중간 도메인-결여 MTBR tau-354는 그렇지 않음을 보여주는 그래프이다. CDR-SB는 CSF 내 (도 30A) 중간 도메인-결여 MTBR tau-243, (도 30B) 중간 도메인-결여 MTBR tau-299, 및 (도 30C) 중간 도메인-결여 MTBR tau-354 농도와 상관관계가 있다. 아밀로이드 양성 그룹들의 CSF 내 중간 도메인-결여 MTBR tau-243은 CDR-SB와 높은 상관관계를 보여주었다 (r=0.5562, p<0.0001). 결과들을 단면 코호트 샘플에서 얻었다 (아밀로이드 음성 n=42 및 아밀로이드 양성 n=58).
도 31A, 도 31B, 및 도 31C는 CSF 중간 도메인-결여 MTBR tau-243이 중간 도메인-결여 MTBR tau-299 및 중간 도메인-결여 MTBR tau-354 보다 간이 정신 상태 검사 (MMSE)와 상관관계가 높음을 보여주는 그래프이다. MMSE는 CSF 내 (도 31A) 중간 도메인-결여 MTBR tau-243, (도 31B) 중간 도메인-결여 MTBR tau-299, 및 (도 31C) 중간 도메인-결여 MTBR tau-354 농도와 상관관계가 있다. 아밀로이드 양성 그룹들의 CSF 내 중간 도메인-결여 MTBR tau-243은 MMSE와 높은 상관관계를 보여주었다 (r=0.5433, p<0.0001). 결과들을 단면 코호트 샘플에서 얻었다 (아밀로이드 음성 n=42 및 아밀로이드 양성 n=58).
도 32A, 도 32B, 및 도 32C는 CSF 중간 도메인-결여 MTBR tau-243, 중간 도메인-결여 MTBR tau-299, 중간 도메인-결여 MTBR tau-354가 알츠하이머 질환 임상 단계 진행에 따라 종단적으로 증가함을 보여주는 그래프이다. 아밀로이드 음성 (-) 또는 양성 (+) 환자들의 CSF에서 중간 도메인-결여 (도 32A) MTBR tau-243, (도 32B) MTBR tau-299, 및 (도 32C) MTBR tau-354 tau 농도의 종단적 변화를 보여준다. 검은색 원: CDR=0, 파란색 삼각형: CDR=0.5, 빨간색 사각형: CDR=1, 보라색 역-삼각형: CDR=2. 안정적인(또는 감소하는) CDR 궤적을 가진 참가자는 점선으로 표시된다. 1차와 2차 방문 사이에 CDR이 증가하는 참가자는 실선으로 표시된다. 아밀로이드 양성 그룹에서 볼드체 빨간색 선은 알츠하이머 질환 발병 후 최대 인지 변화 (CDR=1 내지 2)를 보인 특정 참가자 (참가자 A)의 종단 궤적을 보여주며, CSF MTBR tau-243이 경증 AD (CDR=1) 내지 중등도 AD (CDR=2)에서도 증가하였음을 나타낸다. 통계적 유의도는 1차 및 2차 방문시 대응표본 t-검정에 의해 평가되었다 (아밀로이드 음성 n=14 및 아밀로이드 양성 n=14). **p <0.01. NS = 유의하지 않음.
도 33은 본 발명의 한 방법을 예시하는 개략도이다.
도 34A, 도 34B, 및 도 34C는 PostIP-CX법 (상단) vs. PostIP-CX법 (하단)으로 처리된 CSF 샘플들에서 측정된 트립신 펩타이드 LQTA (도 34A), HVPG (도 34B) 및 IGSL (도 34C)의 양을 도시하는 그래프이다.
도 35A는 PostIP-IP법(y-축) vs. PostIP-CX법(x-축)에 의해 처리된 샘플에서 측정된 트립신 펩타이드 LQTA(왼쪽), IGST(중간) 및 VQII(오른쪽)의 양을 그래프로 보여준다. 그래프 위의 그림은 tau-441에서 각 트립신 펩타이드의 상대적 위치를 보여준다. 두 축 모두 절대 농도(ng/mL)를 나타낸다.
도 35B는 PostIP-IP법(y-축) vs. PostIP-CX법(x-축)에 의해 처리된 샘플에서 측정된 트립신 펩타이드 LDLS (왼쪽), HVPG (중간) 및 IGSL (오른쪽)의 양을 그래프로 보여준다. 그래프 위의 그림은 tau-441에서 각 트립신 펩타이드의 상대적 위치를 보여준다. 두 축 모두 절대 농도(ng/mL)를 나타낸다.
도 36A는 PostIP-IP법(y-축) vs. PostIP-CX법(x-축)에 의해 처리된 샘플에서 측정된 트립신 펩타이드 LQTA(왼쪽), IGST(중간) 및 VQII(오른쪽)의 양을 그래프로 보여준다. 그래프 위의 그림은 tau-441에서 각 트립신 펩타이드의 상대적 위치를 보여준다. 두 축 모두 절대 농도(ng/mL)를 나타낸다. 대조군에서 얻은 샘플은 파란색 원이고; 인지 장애가 없는(CDR<0.5) 아밀로이드 양성 대상체로부터 얻은 샘플은 빨간색 사각형이고; 인지 장애가 있는(CDR>0.5) 아밀로이드 양성 대상체로부터 얻은 샘플은 검은색 삼각형이다.
도 36B는 PostIP-IP법(y-축) vs. PostIP-CX법(x-축)에 의해 처리된 샘플에서 측정된 트립신 펩타이드 LDLS (왼쪽), HVPG (중간) 및 IGSL (오른쪽)의 양을 그래프로 보여준다. 그래프 위의 그림은 tau-441에서 각 트립신 펩타이드의 상대적 위치를 보여준다. 두 축 모두 절대 농도(ng/mL)를 나타낸다. 대조군에서 얻은 샘플은 파란색 원이고; 인지 장애가 없는(CDR<0.5) 아밀로이드 양성 대상체로부터 얻은 샘플은 빨간색 사각형이고; 인지 장애가 있는(CDR>0.5) 아밀로이드 양성 대상체로부터 얻은 샘플은 검은색 삼각형이다.
도 37A는 다양한 전장 타우 아이소폼의 예시이다. 타우의 여러 트립신 펩타이드의 상대적 위치가 표시된다 (예를 들어, LQTA, IGST, VQII, LDLS, HVPG, IGSL, VQIV). 각 "Y"는 N-말단(왼쪽) 및 중간 도메인(중간) 및 MTBR(오른쪽) 영역 내에서 특이적으로 결합하는 항체를 나타낸다. tau-441의 아미노산 224에 있는 타우의 주요 절단 부위는 점선으로 표시된다.
도 37B는 대조군 대상체 (왼쪽, 파란색 원) 및 비AD 타우병증 대상체 (오른쪽, 녹색 원)로부터 얻은 샘플들에서, 샘플을 실시예 1에 기재된 IP법으로 처리한 후 LC-MS로 결정된 비율로 표현한 트립신 펩타이드 VQIV 및 LDLS의 양을 그래프로 보여준다. ns 유의하지 않음; Tukey의 다중 비교 검정.
도 37C는 대조군 대상체 (왼쪽, 파란색 원) 및 비AD 타우병증 대상체 (오른쪽, 녹색 원)로부터 얻은 샘플들에서, 샘플을 실시예 4에 기재된 PostIP-IP법으로 처리한 후 LC-MS로 결정된 비율로 표현한 트립신 펩타이드 VQIV 및 LDLS의 양을 그래프로 보여준다.
도 38은 대조군 대상체 (파란색 원) 및 비AD 타우병증 대상체 (녹색 원)로부터 얻은 샘플들에서, 샘플을 실시예 4에 기재된 PostIP-IP법으로 처리한 후 LC-MS로 결정된 트립신 펩타이드 VQIV (x-축) 및 LDLS (y-축)의 양을 그래프로 보여준다. **** p<0.0001; Tukey의 다중 비교 검정.
도 39는 대조군 대상체 (왼쪽, 파란색 원), AD 대상체 (중간, 빨간색 원), 및 비AD 타우병증 대상체 (오른쪽, 녹색 원)로부터 얻은 샘플들에서, 샘플을 실시예 4에 기재된 PostIP-IP법으로 처리한 후 LC-MS로 결정된 비율로 표현한 트립신 펩타이드 VQIV 및 LDLS의 양을 그래프로 보여준다. ns 유의하지 않음; **** p<0.0001; Tukey의 다중 비교 검정.
도 40A, 도 40B, 도 40C, 도 40D, 도 40E, 및 도 40F는 대조군 대상체 (파란색 원), AD 대상체 (빨간색 사각형), 및 비AD 타우병증 대상체 (녹색 삼각형)로부터 얻은 샘플에서, 샘플을 실시예 4에 기재된 PostIP-IP법으로 처리한 후 LC-MS로 결정된, 타우의 트립신 펩타이드의 양을 비교하여 그래프로 보여준다. 타우의 트립신 펩타이드는 도 40A에서 IGST (x-축) 및 VQII (y-축), 도 40B에서 LDLS (x-축) 및 VQII (y-축), 도 40C에서 IGSL (x-축) 및 HVPG (y-축), 도 40E에서 IGST (x-축) 및 HPVG (y-축), 도 40E에서 VQII (x-축) 및 HPVG (y-축), 및 도 40F에서 IGST (x-축) 및 HPVG (y-축)이다. 두 축 모두 절대 농도(ng/mL)를 나타낸다.
도 41은 비-AD 타우병증을 갖는 대상체로부터 수득된 샘플에서 샘플을 실시예 4에 기재된 PostIP-IP법으로 처리한 후 LC-MS로 결정된 타우의 트립신 펩타이드 IGST vs. HVPG (상단 왼쪽), VQII vs. HVPG (상단 오른쪽), 및 LDLS vs. HVPG (하단)의 양을 비교하여 그래프로 보여준다. 오른쪽의 요소들은 각 대상체에 대한 비AD 타우병증 진단을 나타낸다. 두 축 모두 절대 농도(ng/mL)를 나타낸다.
도 42A, 도 42B, 및 도 42C는 대조군 대상체 (파란색 원), AD 대상체 (빨간색 사각형), 및 비AD 타우병증 대상체 (녹색 삼각형)로부터 얻은 샘플에서, 샘플을 실시예 4에 기재된 PostIP-IP법으로 처리한 후 LC-MS로 결정된, 타우의 트립신 펩타이드 IGST vs. IGSL (도 42A), VQII vs. IGSL (도 42B), 및 LDLS vs. IGSL (도 42C)의 양을 비교하여 그래프로 보여준다. 두 축 모두 절대 농도(ng/mL)를 나타낸다.
도 43A는 타우의 MTBR 영역의 예시이다. 트립신 펩타이드 IGST, VQII, LDLS, HVPG 및 IGSL의 상대 위치가 표시되며, 항체 77G7이 특이적으로 결합하는 에피토프의 상대 위치도 표시된다.
도 43B, 도 43C, 도 43D, 및 도 43E는 비AD 대상체 (왼쪽 막대), AD 대상체 (오른쪽 막대)로부터 얻은 샘플에서, 실시예 4에 기재된 PostIP-IP법으로 처리한 후 LC-MS로 결정된, 타우의 트립신 펩타이드의 비율 IGSL/IGST (도 43B), IGSL/VQII (도 43C), IGSL/LDLS (도 43D), 및 IGSL/HVPG (도 43E)을 그래프로 보여준다. 비AD 대상체의 경우 파란색은 PSP가 있는 대상체를 나타내고 녹색은 FTD가 있는 대상체를 나타내고 빨간색은 CBD가 있는 대상체를 나타내고 보라색은 PSP-CBD 연속성을 가진 대상체를 나타낸다. 통계적 유의도는 Welch 교정과 함께 비대응표본 t-검정을 사용하여 결정되었다.
도 44A, 도 44B, 도 44C, 도 44D, 및 도 44E는 비AD 대상체 (파란색), 및 AD 대상체 (빨간색)로부터 얻은 샘플에서, 샘플을 실시예 4에 기재된 PostIP-IP법으로 처리한 후 LC-MS로 결정된, 타우의 트립신 펩타이드 IGSL vs. IGST (도 44A), IGSL vs. VQII (도 44B), IGSL vs. LDLS (도 44C), VQII vs. IGST (도 44D), VQII vs. LDLS (도 44E), IGSL vs. HVPG (도 43E)의 양을 비교하여 그래프로 보여준다. 도 44A, 도 44B, 및 도 44C에서 비AD 대상체는 산점도를 보여준 반면, 도 44D, 도 44E 및 도 44F에서 AD 및 비AD는 동일한 상관관계를 보여주었다.
도 45는 AD 및 비AD 타우병증 대상체의 CSF에서 측정된 타우의 다양한 트립신 펩타이드 간의 관계를 보여준다. 상자에 강조 표시된 데이터는 AD 및 비AD 타우병증을 구별하기 위한 차별화 지점을 제시한다.
도 46은 CSF 타우가 비AD 타우병증을 어떻게 구별하는지에 대한 가설을 도시하는 예시이다. 도시된 바와 같이, CSF에서, 비AD 타우병증은 AD에 비해 (1) 더 적은 R1-R2 및 (2) 더 많은 R3-R4를 포함하며 이는 뇌 타우 침착을 나타낸다.
도 47은 뇌 불용성 타우의 다양한 트립신 펩타이드의 양을 그래프로 보여준다.
도 48A, 도 48B, 도 48C, 및 도 48D는 대조군 대상체 (왼쪽 막대), AD 대상체 (중간 막대), 및 비AD 대상체 (오른쪽 막대)로부터 얻은 샘플에서, 실시예 4에 기재된 PostIP-IP법으로 처리한 후 LC-MS로 결정된, 타우의 트립신 펩타이드의 비율 IGSL/IGST (도 48A), IGSL/VQII (도 48B), IGSL/LDLS (도 48C), 및 IGSL/HVPG (도 48D)을 그래프로 보여준다. 비AD 대상체의 경우, 검은색 삼각형은 유전자 확인된 P301L FTLD(4R-타우병증) 대상체를 나타내고 검은색 사각형은 유전자 확인된 R406W FTLD (3R/4R 혼합) 대상체를 나타낸다.
도 49A, 도 49B, 도 49C, 도 49D, 도 49E, 및 도 49F는 대조군 대상체 (파란색), AD 대상체 (빨간색), 및 비AD 대상체 (녹색)로부터 얻은 CSF 샘플에서, 샘플을 실시예 4에 기재된 PostIP-IP법으로 처리한 후 LC-MS로 결정된, 타우의 트립신 펩타이드 IGSL vs. IGST (도 49A), IGSL vs. VQII (도 49B), IGSL vs. LDLS (도 49C), VQII vs. IGST (도 49D), VQII vs. LDLS (도 49E), IGSL vs. HVPG (도 43F)의 양을 비교하여 그래프로 보여준다. 도 49A, 도 49B, 및 도 49C에서, 비AD 대상체는 산점도를 보여준 반면, 도 49D, 도 49E, 및 도 49F에서 대조군, AD 및 비AD는 동일한 상관관계를 보여주었다.
상세한 설명
MTBR 타우는 혈액과 CSF에 다수의 펩타이드로 존재한다. 이러한 생물학적 샘플에서 MTBR 타우의 검출 및 정량화는 이러한 폴리펩타이드의 양이 매우 적기 때문에 방해를 받았다. 본원에 개시된 방법은 생물학적 샘플을 MTBR 타우 및 기타 타우 종들을 정량하기에 적합한 샘플로 전환시키는 처리 단계들을 독특하게 조합하여 사용한다. 예를 들어, 본 발명의 일부 방법에서, 처리 단계는 복수의 타우 단백질을 농축시키면서 특정 단백질을 고갈시킨다. 본 발명의 다른 방법에서, 처리 단계는 복수의 MTBR 타우 단백질을 농축시키면서 특정 단백질을 고갈시킨다. 본원에 개시된 특정 방법은 중간 도메인-결여 MTBR 타우 종을 정량하는 데 특히 적합하다. 또한 본원은 타우병증의 임상 징후 및 증상을 측정, 타우병증을 진단, 및 타우병증을 직접 치료하기 위한 중간 도메인-결여 MTBR 타우 종의 용도를 기재한다. 본 발명의 이러한 그리고 다른 측면 및 반복을 이하에서 보다 자세하게 설명한다.
I. 정의
본 발명이 보다 용이하게 이해될 수 있도록, 특정 용어를 먼저 정의한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 해당 분야의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 같은 동일한 의미를 가진다. 본원에 기재된 것과 유사하거나, 변형되거나, 동등한 많은 방법 및 재료가 과도한 실험 없이 본 발명의 실시예의 실시에 사용될 수 있으며, 바람직한 재료 및 방법이 본원에 기재되어 있다. 본 발명의 실시예를 설명하고 청구함에 있어서, 하기 정의에 따라 하기 용어가 사용될 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "약"은, 질량, 부피, 시간, 거리 및 양을 비롯한 (그러나 이에 제한되지 않는) 임의의 정량화 가능한 변수와 관련하여, 예를 들어, 일반적인 측정 기술 및 장비를 통해 발생할 수 있는 수치적인 양의 변동을 지칭한다. 또한 실제 세계에서 사용되는 고체 및 액체 취급 절차를 고려할 때 조성물을 만들거나 방법 등을 수행하는 데 사용되는 성분의 제조, 출처 또는 순도의 차이를 통해 발생할 수 있는 특정 의도하지 않은 오류 및 변동이 존재한다. "약"이라는 용어는 이러한 변동을 포함하며, 이는 최대 ± 5%일 수 있지만 ± 4%, 3%, 2%, 1% 등이 될 수도 있다. 용어 "약"에 의해 변형되든 아니든, 청구범위는 상기 양들에 대한 균등구성을 포함한다.
본원에 사용된 항체는 당업계에서 이해되는 바와 같은 완전한 항체, 즉 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄로 이루어진 완전한 항체, 및 또한 항체 단편, 예를 들어, Fab', Fab, F(ab')2, 단일 도메인 항체, Fv, 및 단일 사슬 Fv를 포함하는 (그러나 이에 제한되는 것은 아님)항체 결합 영역을 가지는 임의의 항체-유사 분자를 지칭한다. 항체라는 용어는 또한 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 키메라 항체 및 인간화 항체를 지칭한다. 다양한 항체-기반 구조체 및 단편을 제조하고 사용하는 기술은 당업계에 잘 알려져 있다. 항체를 제조하고 특성화하는 수단 또한 당업계에 잘 알려져 있다 (예를 들어, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 참조; 본원에 그 전문이 참고문헌으로 포함됨).
본원에 사용된 용어 "압타머"는 생화학적 활성, 분자 인식 또는 결합 속성의 관점에서 유용한 생물학적 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드, 일반적으로 RNA 또는 DNA를 지칭한다. 일반적으로 압타머는 특정 에피토프 (영역)에서 표적 분자에 결합하는 등의 분자 활성을 갖는다. 일반적으로 폴리펩타이드에 결합함에 있어서 특이적인 압타머는 시험관내 진화 방법에 의해 합성 및/또는 확인될 수 있는 것으로 받아들여진다. 시험관내 진화 방법을 비롯하여 압타머를 제조하고 특성화하는 수단은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 본원에 그 전문이 참고로 포함되는 US 7,939,313을 참조하라.
"Aβ" 라는 용어는 아밀로이드 전구체 단백질(APP)이라고 하는 더 큰 단백질의 카르복시 말단 영역에서 유래된 펩타이드를 의미한다. APP를 인코딩하는 유전자는 21번 염색체에 위치한다. 독성 영향을 미칠 수 있는 여러 형태의 Aβ가 있다: Aβ 펩타이드들은 통상적으로 37-43개 아미노산 서열 길이이지만, 그 전체 크기를 변화시키는 절단 및 변형이 있을 수 있다. 이들은 가용성 및 불용성 구획들에서, 모노머, 올리고머 및 응집된 형태로, 세포내 또는 세포외에서 발견될 수 있으며, 다른 단백질 또는 분자와 복합체를 형성할 수 있다. Aβ의 역효과 또는 독성 효과는 상기 형태들 중 일부 또는 전부, 그리고 구체적으로 설명되지 않은 다른 형태로 인한 것일 수 있다. 예를 들어, 이러한 2가지 Aβ 아이소폼에는 Aβ40 및 Aβ42가 있으며; Aβ42 아이소폼은 특히 원섬유형성 또는 불용성이며 질환 상태와 관련이 있다. 용어 "Aβ"는 일반적으로 개별 Aβ 종들을 구별하지 않고 복수의 Aβ 종들을 지칭한다. 특정 Aβ 종들은 펩타이드 크기 별로, 예를 들어, Aβ42, Aβ40, Aβ38 등으로 확인된다.
본원에서 사용되는 용어 "Aβ42/Aβ40 값"은 대상체로부터 수득된 샘플 내의 Aβ42의 양을 동일한 샘플 내의 Aβ40의 양과 비교한 비율을 의미한다.
"Aβ 아밀로이드증"은 뇌에서의 임상적으로 비정상적인 Aβ 침착으로 정의된다. Aβ 아밀로이드증을 갖는 것으로 결정된 대상체는 본원에서 "아밀로이드 양성"으로 지칭되는 반면, Aβ 아밀로이드증이 없는 것으로 결정된 대상체는 본원에서 "아밀로이드 음성"으로 지칭된다. 당업계에서 인정되는 Aβ 아밀로이드증 지표가 존재한다. 본 발명의 출원시, Aβ 아밀로이드증은 아밀로이드 영상화 (예를 들어, PiB PET, 플루오르베타피어, 또는 당업계에 공지된 다른 영상화 방법)에 의해 직접 측정되거나 감소된 뇌척수액(CSF) Aβ42 또는 감소된 CSF Aβ42/40 비율에 의해 간접적으로 측정된다. 평균 피질 결합 가능성 (MCBP) 점수 > 0.18인 [11C]PIB-PET 영상화는, 면역침전 및 질량 분석법 (IP/MS)으로 측정한 약 1 ng/ml의 뇌척수액 (CSF) Aβ42 농도와 마찬가지로 Aβ 아밀로이드증의 지표이다. 또는 PIB-PET에 의해 결정되는 아밀로이드 양성 예측의 정확도를 최대화시키는 CSF Aβ42/40에 대한 컷오프 비율을 사용할 수 있다. 이 와 같은 값 또는 당업계에 공지된 다른 값은 Aβ 아밀로이드증을 임상적으로 확인하기 위해 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 에를 들어, Klunk W E 외 Ann Neurol 55(3) 2004, Fagan A M 외 Ann Neurol, 2006, 59(3), Patterson et. al, Annals of Neurology, 2015, 78(3): 439-453, 또는 Johnson 외, J. Nuc. Med., 2013, 54(7): 1011-1013를 참조하며, 이들 문헌 각각은 본원에 그 전문이 참고로 포함된다. Aβ 아밀로이드증이 있는 대상체는 증상이 있거나 없을 수 있으며, 증상이 있는 대상체는 Aβ 아밀로이드증과 연관된 질환에 대한 임상 기준을 충족하거나 충족하지 않을 수 있다. Aβ 아밀로이드증과 연관된 증상의 비-제한적인 예는 인지 기능 손상, 행동 변화, 비정상 언어 기능, 정서 조절이상, 발작, 치매 및 신경계 구조 또는 기능의 손상을 포함 할 수 있다. Aβ 아밀로이드증과 연관된 질환은 알츠하이머 질환(AD), 대뇌 아밀로이드 혈관병증 (CAA), 루이소체 치매 및 봉입체 근염을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. Aβ 아밀로이드증이 있는 대상체는 Aβ 아밀로이드증과 연관된 질환이 발생할 위험이 증가한다.
"Aβ 아밀로이드증의 임상 징후"는 당업계에 공지된 Aβ 침착의 척도를 지칭한다. Aβ 아밀로이드증의 임상 징후는 아밀로이드 영상화(예컨대, PiB PET, 플루오르베타피르 또는 당업계에 알려진 다른 영상화 방법)에 의해 또는 감소된 뇌척수액(CSF) Aβ42 또는 Aβ42/40 비율에 의해 확인되는 Aβ 침착을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, Klunk WE 외 Ann Neurol 55(3) 2004, 및 Fagan AM 외 Ann Neurol 59(3) 2006을 참고하며, 각각은 그 전문이 본원에 참고로 인용된다. 각각은 그 전문이 본원에 참고로 원용되는, 미국 특허 일련 번호 14/366,831, 14/523,148 및 14/747,453에 기재된 바와 같이, Aβ 아밀로이드증의 임상 징후는 또한 Aβ의 물질대사 측정, 특히 Aβ42 물질대사 단독 측정 또는 다른 Aβ 변이체(예컨대, Aβ37, Aβ38, Aβ39, Aβ40 및/또는 총 Aβ)의 물질대사 측정과의 비교를 포함할 수 있다. 추가 방법은 Albert 외 Alzheimer's & Dementia 2007 Vol. 7, pp. 170-179; McKhann 외, Alzheimer's & Dementia 2007 Vol. 7, pp. 263-269; 및 Sperling 외 Alzheimer's & Dementia 2007 Vol. 7, pp. 280-292에 기재되어 있으며, 각각은 그 전문이 본원에 참고로 인용된다. 중요한 것은, Aβ 아밀로이드증의 임상 징후가 있는 대상체는 Aβ 침착과 연관된 증상이 있을 수도 있고 없을 수도 있다는 것이다. 그러나 Aβ 아밀로이드증의 임상 징후가 있는 대상체는 Aβ 아밀로이드증과 연관된 질환이 발생할 위험이 증가한다.
"아밀로이드 영상화 후보자"는 임상의가 아밀로이드 영상을 임상적으로 확보할 수 있는 개체로 확인한 대상체를 지칭한다. 비-제한적인 예로서, 아밀로이드 영상화 후보자는 Aβ 아밀로이드증의 하나 이상의 임상 징후, 하나 이상의 Aβ 플라크 연관 증상, 하나 이상의 CAA 연관 증상, 또는 이들의 조합을 갖는 대상체일 수 있다. 임상의는 이러한 대상체의 임상 치료를 지시하기 위해 이러한 대상체에 대한 아밀로이드 영상화를 추천할 수 있다. 또 다른 비-제한적인 예로서, 아밀로이드 영상화 후보자는 Aβ 아밀로이드증과 연관된 질환에 대한 임상 시험에 잠재적인 참가자가 될 수 있다 (대조군 대상체 또는 테스트 대상체).
"Aβ 플라크 연관 증상" 또는 "CAA 연관 증상"은 각각 아밀로이드 원섬유로 불리는 규칙적으로 정렬된 원섬유 응집체로 구성된 아밀로이드 플라크 또는 CAA의 형성에 의해 유발되거나 이와 연관된 임의의 증상을 지칭한다. 예시적인 Aβ 플라크 연관 증상은 뉴런의 변성, 인지 기능 손상, 기억력 손상, 행동 변화, 정서 조절이상, 발작, 신경계 구조 또는 기능의 손상 및 알츠하이머 질환 또는 CAA의 발생 또는 악화 위험 증가를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 신경 퇴행은 뉴런의 구조 변화 (분자 변화, 예컨대, 독성 단백질, 단백질 응집체 등의 세포 내 축적 또는 거시적 수준 변화, 예컨대, 엑손 또는 수상돌기의 모양 또는 길이의 변화, 미엘린 수초 구성의 변화, 미엘린 수초의 소실 등), 뉴런의 기능 변화, 뉴런의 기능 소실, 뉴런의 사멸, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 인지 기능 손상은 기억력, 주의력, 집중력, 언어, 추상적 사고, 창의성, 실행 기능, 계획 및 조직의 어려움을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 행동 변화에는 신체적 또는 언어적 공격, 충동, 억제 감소, 무관심, 결단력 감소, 성격 변화, 알콜, 담배 또는 약물 남용, 및 기타 중독 관련 행동을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 정서 조절이상은 우울증, 불안, 조증, 과민성 및 정서적 실금을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 발작은 전신성 긴장성 간대성 간질 발작, 복합 부분 발작 및 비-간질성 정신병학적 발작을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 신경계 구조 또는 기능 손상은 뇌수종, 파킨슨증, 수면 장애, 정신병, 균형 및 조정의 기능장애를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 이는 운동 기능장애, 예컨대, 홑팔다리마비, 편측마비, 사지마비, 운동실조, 발리스무스 및 떨림을 포함할 수 있다. 이는 또한 후각, 촉각, 미각, 시각 및 청각 감각을 포함한 감각 소실 또는 기능이상을 포함할 수 있다. 또한, 이는 자율 신경계 기능장애, 예컨대, 장 및 방광 기능이상, 성 기능이상, 혈압 및 체온 조절이상을 포함할 수 있다. 마지막으로, 이는 시상 하부 및 뇌하수체의 기능이상, 예컨대, 성장 호르몬, 갑상선 자극 호르몬, 루텐화 호르몬, 난포 자극 호르몬, 성선 자극 호르몬 방출 호르몬, 프로락틴 및 기타 수많은 호르몬 및 조절인자의 결핍 및 조절이상으로 인한 호르몬 기능장애를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "대상체"는 포유류, 바람직하게는 인간을 지칭한다. 포유류는 인간, 영장류, 가축, 설치류 및 애완 동물을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 대상체는 의료 조치 또는 치료를 기다리고 있을 수 있거나, 의료 조치 또는 치료를 받고 있을 수 있거나, 의료 조치 또는 치료를 받았을 수 있다.
본원에 사용된 용어 "대조군 집단", "정상 집단" 또는 "건강한" 대상체의 샘플은 정성적 또는 정량적 테스트 결과를 기초로 타우병증 또는 Aβ 아밀로이드증, 또는 Aβ 아밀로이드증과 연관된 임상 질환 (알츠하이머 질환을 포함하나 이에 제한되지는 않음)이 없는 것으로 임상적으로 결정된 대상체 또는 대상체들의 그룹을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "혈액 샘플"은 혈액, 바람직하게는 말초(또는 순환하는) 혈액으로부터 유래된 생물학적 샘플을 지칭한다. 혈액 샘플은 전혈, 혈장 또는 혈청일 수 있지만 일반적으로 혈장이 선호된다.
본원에 사용된 용어 "아이소폼"은 단백질을 인코딩하는 mRNA의 선택적 스플라이싱, 단백질의 번역 후 변형, 단백질의 단백질분해 가공, 유전적 변이 및 체세포 재조합으로 인해 발생하는 동일한 단백질 변이체의 여러 상이한 형태들 중 어느 하나를 지칭한다. 용어 "아이소폼" 및 "변이체"는 상호교환적으로 사용된다.
용어 "타우"는 유전자 MAPT(또는 그의 상동체)에 의해 인코딩되는 복수의 아이소폼, 뿐만 아니라 생체내에서 C-말단이 절단된, 생체내에서 N-말단이 절단된, 생체내에서 번역후 변형된, 또는 이들이 조합된 이의 종들을 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "타우" 및 "타우 단백질" 및 "타우 종"은 상호교환적으로 사용될 수 있다. 인간, 비-인간 영장류, 설치류, 어류, 소, 개구리, 염소 및 닭을 비롯한, 그러나 이에 제한되지 않는 많은 동물에서, 타우는 MAPT 유전자에 의해 인코딩된다. 유전자가 MAPT로 확인되지 않은 동물에서 상동체는 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 확인될 수 있다.
인간의 경우, MAPT의 엑손 2, 3 및 10의 선택적 스플라이싱에 의해 생성되는 6개의 타우 아이소폼이 있다. 이들 아이소폼의 길이는 352 내지 441개의 아미노산 범위이다. 엑손 2 및 3은 각각 N-말단(N으로 칭함)에서 29개-아미노산 인서트를 인코딩하고, 전장 인간 타우 아이소폼은 2개 인서트 모두 (2N), 하나의 인서트 (1N)를 가질 수 있거나, 인서트가 없을 수 있다 (0N). 모든 전장 인간 타우 아이소폼은 또한 3개의 미세소관 결합 도메인 (R로 칭함) 반복을 가지고 있다. C-말단에 엑손 10을 포함하면 엑손 10에 의해 인코딩되는 제4 미세소관 결합 도메인이 포함되게 된다. 따라서, 전장 인간 타우 아이소폼은 4개의 미세소관 결합 도메인 반복 (엑손 10 포함: R1, R2, R3, 및 R4) 또는 3개의 미세소관 결합 도메인 반복(엑손 10 제외: R1, R3, 및 R4)을 포함할 수 있다. 인간 타우는 번역 후 변형될 수 있거나 변형되지 않을 수 있다. 예를 들어, 타우가 인산화, 유비퀴틴화, 글리코실화 및 당화(glycated) 될 수 있음은 당업계에 공지되어 있다. 인간 타우는 또한 C-말단에서, N-말단에서, 또는 C-말단 및 N-말단에서 생체내에서 단백질분해 가공되거나 가공되지 않을 수 있다. 따라서, 용어 "인간 타우"는 2N3R, 2N4R, 1N3R, 1N4R, 0N3R, 및 0N4R 아이소폼, 그리고 생체내에서 C-말단이 절단된, 생체내에서 N-말단이 절단된, 생체내에서 번역후 변형된, 또는 이들이 조합된 이의 종들을 포함한다. 타우를 인코딩하는 유전자의 선택적 스플라이싱은 다른 동물에서도 유사하게 발생한다.
본원에 사용된 용어 "타우-441"은 441개 아미노산 길이의 가장 긴 인간 타우 아이소폼 (2N4R)을 지칭한다. tau-441의 아미노산 서열이 서열 번호: 1에 제공된다. 도 1에는 이러한 아이소폼에 대한 N-말단 (N 말단), 중간 도메인, MTBR, 및 C-말단 (C 말단)이 확인되어 있다. 이들 영역은 그 외 타우 아이소폼 (예를 들어, 2N3R, 1NR4, 1N3R, 0N4R, 및 0N3R)에서 예측가능한 방식으로 변화할 것이다. 따라서, tau-441에 대한 아미노산 위치가 확인되면, 당업자는 다른 아이소폼들에서 상응하는 아미노산 위치를 결정할 수 있을 것이다.
본원에 사용된 용어 "N-말단 타우"는, 타우의 N-말단의 둘 이상의 아미노산 (예를 들어, tau-441의 아미노산 1-103 등)을 포함하는 타우 단백질 또는 복수의 타우 단백질을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "중간 도메인 타우"는, 타우의 중간 도메인의 둘 이상의 아미노산 (예를 들어, tau-441의 아미노산 104-243 등)을 포함하는 타우 단백질 또는 복수의 타우 단백질을 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "MTBR 타우"는, 타우의 미세소관 결합 영역 (MTBR)의 둘 이상의 아미노산 (예를 들어, tau-441의 아미노산 244-368 등)을 포함하는 타우 단백질 또는 복수의 타우 단백질을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "C-말단 타우"는, 타우의 C-말단의 둘 이상의 아미노산 (예를 들어, tau-441의 아미노산 369-441 등)을 포함하는 타우 단백질 또는 복수의 타우 단백질을 지칭한다.
"타우의 단백질분해 펩타이드"는 시험관내 단백질분해 절단에 의해 생성된 타우 단백질의 펩타이드 단편을 지칭한다. "타우의 트립신 펩타이드"는 시험관내 트립신에 의한 절단에 의해 생성된 타우 단백질의 펩타이드 단편을 지칭한다. 타우의 트립신 펩타이드는 본원에서 이의 첫 4개 아미노산으로 지칭될 수 있다. 예를 들어, "LQTA"는 트립신 펩타이드 LQTAPVPMPDLK (서열 번호: 3)를 지칭한다. 그 첫 4개 아미노산으로 확인되는 다른 트립신 펩타이드의 비제한적 예에는 IGST (서열 번호: 2), VQII (서열 번호: 4), LDLS (서열 번호: 5), HVPG (서열 번호: 6), IGSL (서열 번호: 7), VQIV (서열 번호: 9), 및 TPPS (서열 번호: 10)가 포함된다.
뇌의 타우 침착과 관련된 질환은 본원에서 "타우병증"으로 지칭된다. 용어 "타우 침착"은 비정상 신경돌기 내 신경원섬유 엉킴, 신경그물 실, 및 타우 응집체를 비롯한 (그러나 이에 제한되는 것은 아님) 모든 형태의 병리학적 타우 침착물을 포함한다. 당업계에 공지된 타우병증은 진행성 핵상 마비 (PSP), 권투 선수 치매, 만성 외상성 뇌병증, 전두측두엽 치매 및 17번 염색체와 관련된 파킨슨증, 리티코-보딕 질환, 괌의 파킨슨-치매 복합증, 엉킴-우세 치매, 신경절신경아교종 및 신경절세포종, 수막혈관종증, 아급성 경화성 범뇌염, 납 독성뇌증, 결절성 경화증,할러포르덴-스파츠 질환, 라이포푸신증, 픽병, 피질기저핵 변성 (CBD), 은친화과립 질환(AGD), 전두측두엽 변성 (FTLD), 알츠하이머 질환 (AD), 및 전두측두엽 치매 (FTD)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
타우병증은 병리학적 타우 침착물에서 발견되는 타우 아이소폼들의 우세도에 따라 분류된다. 3개의 MTBR을 갖는 타우로 주로 구성된 타우 침착물을 갖는 타우병증은 "3R-타우병증"으로 지칭된다. 픽병은 3R-타우병증의 비제한적 예이다. 명확히 하자면, 일부 3R-타우병증의 병리학적 타우 침착물은 3R 아이소폼이 우세한, 3R과 4R 타우 아이소폼들의 혼합물일 수 있다. 알츠하이머 질환 환자의 뇌에 있는 세포내 신경원섬유 엉킴 (즉, 타우 침착물)은 3R 및 4R 아이소폼 모두를 일반적으로 거의 동일한 양 포함하는 것으로 생각된다. 4개의 MTBR을 갖는 타우로 주로 구성된 타우 침착물을 갖는 타우병증은 "4R-타우병증"으로 지칭된다. PSP, CBD 및 AGD는 FTLD의 일부 형태와 마찬가지로 4R-타우병증의 비제한적인 예이다. 특히, 유전적으로 확인된 FTLD 사례, 예를 들어, 일부 V334M 및 R406W 돌연변이 담체가 있는 일부 대상체들의 뇌에서 병리학적 타우 침착물은, 3R과 4R 아이소폼들이 혼합된 것을 보여준다.
타우병증의 임상 징후는 신경원섬유 엉킴을 포함하는 (그러나 이에 제한되지 않음) 뇌의 타우 응집체일 수 있다. 뇌에서 타우 응집체를 검출 및 정량하는 방법은 당업계에 공지이다 (예를 들어, 타우 특이적 리간드, 예를 들어, [18F]THK5317, [18F]THK5351, [18F]AV1451, [11C]PBB3, [18F]MK-6240, [18F]RO-948, [18F]PI-2620, [18F]GTP1, [18F]PM-PBB3, 및 [18F]JNJ64349311, [18F]JNJ-067), 등을 사용하는 타우 PET).
본원에서 사용된 용어 "치료하다", "치료하는" 또는 "치료"는 훈련되고 면허가 있는 전문가가 이를 필요로 하는 대상체에게 의료 서비스를 제공하는 것을 의미한다. 의료 서비스는 진단 검사, 치료적 치료 및/또는 예방 또는 방지 조치일 수 있다. 치료 및 예방 치료의 목적은 원하지 않는 생리학적 변화 또는 질환/장애를 예방하거나 늦추는 (약화시키는) 것이다. 치료 또는 예방 치료의 유익한 또는 원하는 임상적 결과들에는 증상들의 완화, 질환 정도의 감소, 질환의 안정화 (즉, 악화되지 않는) 상태, 질환 진행의 지연 또는 저하, 질환 상태의 경감 또는 일시적 완화, 및 차도 (부분적이든 또는 전체적이든), 검출가능한지 또는 검출불가능한지 여부가 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. "치료"는 또한 치료를 받지 않을 경우 예상되는 생존과 비교하여 생존을 연장하는 것을 의미할 수 있다. 치료를 필요로 하는 사람들은 이미 질환, 병태 또는 장애가 있는 사람들, 뿐만 아니라 질환, 병태 또는 장애에 걸리기 쉬운 사람들 또는 질환, 병태 또는 장애가 예방되어야 하는 사람들을 포함한다. 따라서, 치료를 필요로 하는 대상체는 임의의 질환 증상 또는 임상 징후를 가질 수도 있고 없을 수도 있다.
문구 "타우 요법"은 타우병증이 발병할 위험이 있는 대상체 또는 임상적으로 타우병증이 있는 것으로 진단된 대상체를 위해 고려되거나 함께 사용되는 임의의 영상화제, 치료제 및/또는 예방 또는 예방 조치를 총칭한다. 영상화제의 비제한적인 예는 기능적 영상화제 (예: 플루오로데옥시글루코스 등) 및 분자 영상화제(예: 피츠버그 화합물 B, 플로베타벤, 플로르베타피르, 플루테메타몰, 방사성 표지된 타우 특이적 리간드, 방사성 핵종 표지 항체 등)를 포함한다. 치료제의 비제한적 예는 콜린에스테라제 억제제, N-메틸 D-아스파테이트(NMDA) 길항제, 항우울제(예: 선택적 세로토닌 재흡수 억제제, 비정형 항우울제, 아미노케톤, 선택적 세로토닌 및 노르에피네프린 재흡수 억제제, 삼환계 항우울제 등), 감마-세크레타제 억제제, 베타-세크레타제 억제제, 항-Aβ 항체(이의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체 포함), 항-타우 항체(이의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체 포함), 줄기 세포, 식이 보충제(예: 리튬 물, 리포산 함유 오메가-3 지방산, 장쇄 트리글리세리드, 제니스테인, 레스베라트롤, 커큐민, 포도씨 추출물 등), 세로토닌 수용체 6의 길항제, p38알파 MAPK 억제제, 재조합 과립구 대식세포 집락 자극 인자, 수동 면역 요법, 활성 백신(예: CAD106, AF20513 등), 타우 단백질 응집 억제제(예: TRx0237, 메틸티오니뮴 클로라이드 등), 혈당 조절을 개선하기 위한 요법(예: 인슐린, 엑세나타이드, 리라글루티드 피오글리타존 등), 항염증제, 포스포디에스테라제 9A 억제제, 시그마-1 수용체 효능제, 키나제 억제제, 포스파타제 활성화제, 포스파타제 억제제, 안지오텐신 수용체 차단제, CB1 및/또는 CB2 엔도칸나비노이드 수용체 부분 효능제,
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-2 아드레날린 수용체 효능제, 니코틴 아세틸콜린 수용체 효능제, 5-HT2A 역 효능제, 알파-2c 아드레날린 수용체 길항제, 5-HT 1A 및 1D 수용체 작용제, 글루타미닐-펩타이드 사이클로트랜스퍼라제 억제제, APP 생성의 선택적 억제제, 모노아민 산화효소 B 억제제, 글루타메이트 수용체 길항제, AMPA 수용체 작용제, 신경 성장 인자 자극제, HMG-CoA 환원효소 억제제, 신경영양제, 무스카린성 M1 수용체 효능제, GABA 수용체 조절제, PPAR-감마 효능제, 미세소관 단백질 조절제, 칼슘 채널 차단제, 항고혈압제, 스타틴, 및 이들의 임의의 조합이 포함된다.
II. 타우의 측정 방법
본 발명은 생물학적 샘플에서 타우를 질량 분석법으로 측정하는 방법을 제공한다. 일반적으로 말하면, 생물학적 샘플에서 타우를 측정하는 본 발명의 방법은 생물학적 샘플을 제공하는 단계, 하나 이상의 단백질을 고갈시킨 다음, 타우를 정제함으로써 생물학적 샘플을 처리하는 단계, 정제된 타우를 프로테아제로 절단한 다음 선택적으로 생성된 절단 생성물을 고체상 추출에 의해 탈염시켜 타우의 단백질분해 펩타이드를 포함하는 샘플을 얻는 단계, 및 이러한 타우의 단백질분해 펩타이드를 포함하는 샘플로 액체 크로마토그래피 - 질량 분석을 수행하여, 타우의 적어도 하나의 단백질분해 펩타이드의 농도 (상대 또는 절대)를 검출 및 측정하는 단계를 포함한다. 따라서, 실제로, 개시된 방법은 타우의 적어도 하나의 단백질분해 펩타이드를 사용하여 생물학적 샘플에 존재하는 타우의 양을 검출하고 측정한다.
한 예에서, 본 발명의 방법은 (a) 혈액 샘플 또는 CSF 샘플로부터 선택된 생물학적 샘플을 제공하는 단계; (b) 생물학적 샘플로부터 단백질 침전에 의해 단백질을 제거하고 침전된 단백질을 분리하여 상청액을 얻는 단계; (c) 상청액으로부터 고체상 추출에 의해 타우를 정제하는 단계; (d) 정제된 타우를 프로테아제로 절단한 다음, 선택적으로, 생성된 절단 생성물을 고체상 추출에 의해 탈염시켜 타우의 단백질분해 펩타이드를 포함하는 샘플을 얻는 단계; 및 (e) 타우의 단백질분해 펩타이드를 포함하는 샘플로 액체 크로마토그래피 - 질량 분석을 수행하여 타우의 적어도 하나의 단백질분해 펩타이드의 농도를 검출 및 측정하는 단계를 포함한다.
또 다른 예에서, 본 발명의 방법은 (a) 생물학적 샘플에서 친화도 고갈에 의해 N-말단 타우, 중간 도메인 타우, 또는 N-말단 타우 및 중간 도메인 타우를 감소시키는 단계, 이때 생물학적 샘플은 혈액 샘플 또는 CSF 샘플이고; (b) N-말단-결여 타우 및/또는 중간 도메인-결여 타우로 지칭될 수 있는, 친화도 고갈 후 남아있는 타우를, 다음 단계를 포함하는 방법으로 농축시키는 단계: (i) 생물학적 샘플로부터 단백질 침전에 의해 단백질을 추가로 제거하고 침전된 단백질을 분리하여 상청액을 얻은 다음, 상청액으로부터 고체상 추출에 의해 타우를 정제, 또는 (ii) MTBR 타우를 친화도 정제함으로써, (i) 또는 (ii)에 의해 농축된 타우를 생성하는 단계; (c) 농축된 타우를 프로테아제로 절단한 다음, 선택적으로, 생성된 절단 생성물을 고체상 추출에 의해 탈염시켜 타우의 단백질분해 펩타이드를 포함하는 샘플을 얻는 단계; 및 (d) 이러한 타우의 단백질분해 펩타이드를 포함하는 샘플로 액체 크로마토그래피 - 질량 분석법 (LC/MS)을 수행하여 타우의 적어도 하나의 단백질분해 펩타이드의 농도를 검출 및 측정하는 단계를 포함한다.
또 다른 예에서, 본 발명의 방법은 (a) 생물학적 샘플에서 친화도 고갈에 의해 N-말단 타우, 중간 도메인 타우, 또는 N-말단 타우 및 중간 도메인 타우를 감소시키는 단계, 이때 생물학적 샘플은 혈액 샘플 또는 CSF 샘플이고; (b) 생물학적 샘플로부터 단백질 침전에 의해 단백질을 추가로 제거하고 침전된 단백질을 분리하여 상청액을 얻는 단계; (c) 상청액으로부터 고체상 추출에 의해 타우를 정제하는 단계; (d) 정제된 타우를 프로테아제로 절단한 다음, 선택적으로, 생성된 절단 생성물을 고체상 추출에 의해 탈염시켜 타우의 단백질분해 펩타이드를 포함하는 샘플을 얻는 단계; 및 (e) 타우의 단백질분해 펩타이드를 포함하는 샘플로 액체 크로마토그래피 - 질량 분석을 수행하여 타우의 적어도 하나의 단백질분해 펩타이드의 농도를 검출 및 측정하는 단계를 포함한다.
또 다른 예에서, 본 발명의 방법은 (a) 생물학적 샘플에서 친화도 고갈에 의해 N-말단 타우, 중간 도메인 타우, 또는 N-말단 타우 및 중간 도메인 타우를 감소시키는 단계, 이때 생물학적 샘플은 혈액 샘플 또는 CSF 샘플이고; (b) MTBR 타우를 친화도 정제하는 단계; (c) 정제된 MTBR 타우를 프로테아제로 절단한 다음, 선택적으로, 생성된 절단 생성물을 고체상 추출에 의해 탈염시켜 MTBR 타우의 단백질분해 펩타이드를 포함하는 샘플을 얻는 단계; 및 (d) MTBR 타우의 단백질분해 펩타이드를 포함하는 샘플로 액체 크로마토그래피 - 질량 분석을 수행하여 MTBR 타우의 적어도 하나의 단백질분해 펩타이드의 농도를 검출 및 측정하는 단계를 포함한다.
또 다른 예에서, 본 발명의 방법은 (a) 생물학적 샘플로부터 MTBR 타우를 친화도 정제하는 단계, 이때 생물학적 샘플은 혈액 샘플 또는 CSF 샘플이고; (b) 정제된 MTBR 타우를 프로테아제로 절단한 다음, 선택적으로, 생성된 절단 생성물을 고체상 추출에 의해 탈염시켜 MTBR 타우의 단백질분해 펩타이드를 포함하는 샘플을 얻는 단계; 및 (c) MTBR 타우의 단백질분해 펩타이드를 포함하는 샘플로 액체 크로마토그래피 - 질량 분석을 수행하여 MTBR 타우의 적어도 하나의 단백질분해 펩타이드의 농도를 검출 및 측정하는 단계를 포함한다.
본 발명은 상기 방법 각각에서 생물학적 샘플에서 하나 이상의 단백질의 존재/부재를 결정하는 단계 및/또는 생물학적 샘플에서 하나 이상의 추가 단백질의 농도를 측정하는 단계를 추가로 고려한다. 일부 구체예에서, 상기 하나 이상의 단백질은 타우의 정제 전에 생물학적 샘플로부터 고갈된 단백질일 수 있다. 예를 들어, 특정 구체예에서, N-말단 타우 및/또는 중간 도메인 타우 종은 본원에 개시된 방법에 의해 정량된 타우 종 (예를 들어, MTBR 타우, C-말단 타우)과 별도로 확인 및/또는 정량될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, Aβ, ApoE, 또는 임의의 다른 관심 단백질은 생물학적 샘플 일부를 병행하여 처리함으로써, 본원에 개시된 방법을 이용하기 전에 생물학적 샘플로부터 이러한 관심 단백질을 고갈시킴으로써, 또는 본원에 개시된 샘플 처리 단계 동안 생물학적 샘플로부터 이러한 관심 단백질을 고갈시킴으로써 확인 및/또는 정량될 수 있다.
생물학적 시료, 적합한 내부 표준, 하나 이상의 단백질을 고갈시키는 단계, 타우를 정제하는 단계, 정제된 타우를 프로테아제로 절단하는 단계 및 질량 분석법은 아래에 더 자세히 설명되어 있다.
생물학적 샘플
적합한 생물학적 샘플에는 대상체로부터 얻은 혈액 샘플 또는 뇌척수액(CSF) 샘플이 포함된다. 일부 구체예들에서, 대상체는 인간이다. 인간 대상체는 의료 조치 또는 치료를 기다리고 있을 수 있거나, 의료 조치 또는 치료를 받고 있을 수 있거나, 의료 조치 또는 치료를 받았을 수 있다. 다양한 구체예에서, 인간 대상체는 건강한 대상체, 신경퇴행성 질환 발병 위험이 있는 대상체, 신경퇴행성 질환의 징후 및/또는 증상이 있는 대상체, 또는 신경퇴행성 질환을 진단받은 대상체일 수 있다. 추가 구체예에서, 신경퇴행성 질환은 타우병증 일 수 있다. 특정 예에서, 타우병증은 알츠하이머 질환(AD), 진행성 핵상 마비(PSP), 피질기저 변성(CBD) 또는 전두측두엽 변성(FTLD)일 수 있다. 다른 구체예에서, 대상체는 실험 동물이다. 추가 구체예에서, 대상체는 인간 타우 및 임의로 하나 이상의 추가 인간 단백질(예를 들어, 인간 Aβ, 인간 ApoE 등)을 발현하도록 유전자 조작된 실험 동물이다.
CSF는 내재형 CSF 카테터를 사용 또는 사용하지 않고 요추 천자를 통해 얻을 수 있다. 대상체로부터 동시에 수집된 여러 혈액 또는 CSF 샘플을 모을 수 있다. 혈액은 정맥 카테터를 사용하거나 사용하지 않고 정맥 천자하거나 천자침 (또는 이와 동등한 것)으로 채혈할 수 있다. 일단 수집되면, 혈액 또는 CSF 샘플은 당업계에 알려진 방법 (예: 전체 세포 및 세포 파편을 제거하기 위한 원심분리, 분석 테스트 전에 표본을 안정화 및 보존하도록 고안된 첨가제 사용 등)에 따라 처리될 수 있다. 혈액 또는 CSF 샘플은 즉시 사용하거나 냉동 및 무기한 보관할 수 있다. 본원에 개시된 방법에서 사용하기 전에, 생물학적 샘플은 필요하거나 원하는 경우 프로테아제 억제제, 동위원소 표지된 내부 표준물질, 세제(들) 및 카오트로픽제(들)를 포함 및/또는 다른 분석물(예: 단백질 펩타이드, 대사물)을 고갈시키기 위해 변형되어 있을 수도 있다.
사용되는 샘플의 크기는 샘플 유형, 샘플을 얻은 대상체의 건강 상태, (타우 이외) 분석할 분석물에 따라 달라질 수 있고 달라질 수 것이다. CSF 샘플 부피는 약 0.01mL 내지 약 5mL, 또는 약 0.05mL 내지 약 5mL 일 수 있다. 특정 예에서, 샘플의 크기는 약 0.05 mL 내지 약 1 mL CSF일 수 있다. 혈장 샘플 부피는 약 0.01mL 내지 약 20mL일 수 있다.
(b) 동위원소-표지된, 내부 타우 표준
동위원소-표지된 타우는 샘플 처리 전반에 걸친 변동성을 설명하며 선택적으로 절대 농도를 계산하기 위한 내부 표준으로 사용할 수 있다. 일반적으로 동위원소-표지된 내부 타우 표준물질은 중요한 샘플 처리 전에 추가되며 필요한 경우 두 번 이상 추가할 수 있다. 예를 들어, 도 2 및 도 33에 도시된 방법을 참고하라.
여러 동위원소-표지된 내부 타우 표준이 본원에 기재되어 있다. 하나 이상의 아미노산 잔기에 혼입된 무거운 동위원소 표지를 모두가 가지고 있다. 하나 이상의 전장 아이소폼이 사용될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 당업계에 공지된 번역 후 변형된 타우 아이소폼 및/또는 타우의 펩타이드 단편 또한 사용될 수 있다. 일반적으로 말해서, 혼입되어 있는 이러한 표지된 아미노산 잔기는 화학적 특성에 영향을 미치지 않으면서 펩타이드의 질량을 증가시켜야 하며, 동위원소 표지의 존재로 인한 질량 이동은 질량 분석법이 내인성 타우 분석물 신호에서 내부 표준(IS)을 구별할 수 있도록 하기에 충분해야 한다. 본원에서 보는 바와 같이, 적합한 무거운 동위원소 표지에는 　2H,　13C, 및 　15N이 포함되지만 이에 제한되는 것은 아니다. 일반적으로 내부 표준의 약 1-10ng이면 충분하다.
(c) 하나 이상의 단백질을 고갈
본 발명의 방법은 하나 이상의 단백질이 샘플로부터 고갈되는 단계를 포함한다. 용어 "고갈"은 양이나 수가 감소하는 것을 의미한다. 따라서, 단백질이 고갈된 샘플은 원래 샘플의 양보다 측정 가능하게 적은 임의의 양의 단백질을 가질 수 있으며, 단백질의 양이 없는 것을 포함한다.
단백질(들)은 하나 이상의 단백질을 특이적으로 표적화하는 방법, 예를 들어 친화도 고갈, 고체상 추출 또는 당업계에 공지된 다른 방법에 의해 샘플로부터 고갈될 수 있다. 단백질 또는 다수 단백질의 표적화 고갈은 해당 단백질의 하류 분석이 필요한 상황(예: 확인, 정량화, 번역 후 변형 분석 등)에서 사용할 수 있다. 예를 들어, Aβ 펩타이드는 Aβ의 친화도 고갈 후에 적합한 에피토프-결합제를 사용하여 당업계에 공지된 방법에 의해 확인 및 정량될 수 있다. 또 다른 비제한적 예로서, 아포지단백질 E(ApoE) 상태는 ApoE의 친화도 고갈 및 ApoE 아이소폼의 확인 후 당업계에 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다. 표적화 고갈은 또한 아포지단백질 J, 시누클레인, 가용성 아밀로이드 전구체 단백질, 알파-2 마크로글로불린, S100B, 미엘린 염기성 단백질, 인터루킨, TNF, TREM-2, TDP-43, YKL-40, VILIP-1, NFL, 프리온 단백질, pNFH 및 DJ-1을 비롯한 (그러나 이에 제한되는 것은 아님) 다른 단백질들을, 후속 분석을 위해 단리하기 위해 사용될 수도 있다. 특정 타우 단백질의 표적화 고갈은 또한 본원에서 다른 타우 단백질을 농축 및/또는 질량 분석법을 혼동시키는 단백질들을 제거하기 위해 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 특정 구체예에서, N-말단 타우 단백질 및/또는 중간 도메인 타우 단백질은 질량 분석에 의한 분석을 위해 샘플을 추가로 처리하기 전에 샘플로부터 고갈된다. 고갈된 타우 단백질의 하류 분석을 실시 또는 실시하지 않을 수 있으나, 두 가지 옵션 모두 본 발명의 방법에 의해 고려된다.
일부 구체예에서, 표적화 고갈은 친화도 고갈에 의해 발생할 수 있다. 친화도 고갈은 분자에 대한 특이적 결합 특성에 의해 샘플에서 관심 단백질을 고갈시키는 방법을 나타낸다. 일반적으로 분자는 비드, 수지, 조직 배양 플레이트 등과 같은 고체 지지체에 부착된 리간드(고정 리간드라 함)이다. 리간드-단백질 상호작용이 발생한 후에 고체 지지체에 리간드가 고정화될 수도 있다. 적합한 리간드에는 항체, 압타머 및 기타 에피토프 결합제가 포함된다. 이러한 분자는 또한 관심 있는 단백질을 선택적으로 흡착하는 폴리머 또는 기타 물질일 수 있다. 비제한적인 예로서, 지방 옥세틸화 알코올로 치환된 폴리하이드록시메틸렌 (예: PHM-L LIPOSORB, Sigma Aldrich)을 사용하여 혈청으로부터 지단백질(ApoE 포함)을 선택적으로 흡착할 수 있다. 2가지 이상의 친화도 고갈제를 조합하여 다수의 단백질을 순차적으로 또는 동시에 고갈시킬 수 있다.
일부 구체예들에서, 본 발명의 방법은 tau-441의 아미노산 1 - 243 내부 (이들 아미노산 포함) (또는 0N 또는 1N 아이소폼에 대해 유사하게 정의된 영역 내부)의 에피토프에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 에피토프 결합제를 사용하여 샘플로부터 하나 이상의 단백질을 친화도 고갈시키는 단계를 포함한다. 다양한 구체예에서, 1, 2, 3가지 또는 그 이상의 에피토프-결합제가 사용될 수 있다. 2가지 이상의 에피토프 결합제가 사용되는 경우, 이들은 순차적으로 또는 동시에 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 타우의 N-말단 내부 (예를 들어, tau-441의 아미노산 1 - 103, 이를 포함)의 에피토프에 특이적으로 결합하는 에피토프-결합제, 및 타우의 중간 도메인 내부 (예를 들어, tau-441의 아미노산 104 - 243, 이를 포함)의 에피토프에 특이적으로 결합하는 에피토프-결합제를 사용하여 샘플로부터 하나 이상의 단백질을 친화도 고갈시키는 단계를 포함한다. 에피토프 결합제는 순차적으로 또는 동시에 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 tau-441의 아미노산 1 - 35 내부 (이들을 포함)의 에피토프에 특이적으로 결합하는 에피토프-결합제, 및 tau-441의 아미노산 104 - 243 내부 (이들을 포함)(또는 0N 또는 1N 아이소폼에 대해 유사하게 정의된 영역 내부)의 에피토프에 특이적으로 결합하는 에피토프-결합제를 사용하여 샘플로부터 하나 이상의 단백질을 친화도 고갈시키는 단계를 포함한다. 에피토프 결합제는 순차적으로 또는 동시에 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 tau-441의 아미노산 1 - 103 내부 (이들을 포함) (또는 0N 또는 1N 아이소폼에 대해 유사하게 정의된 영역 내부)의 에피토프에 특이적으로 결합하는 에피토프-결합제; tau-441의 아미노산 104 - 243 내부 (이들을 포함)(또는 0N 또는 1N 아이소폼에 대해 유사하게 정의된 영역 내부)의 에피토프에 특이적으로 결합하는 에피토프-결합제; 및 아밀로이드 베타의 에피토프에 특이적으로 결합하는 에피토프 결합제를 사용하여 샘플로부터 하나 이상의 단백질을 친화도 고갈시키는 단계를 포함한다. 에피토프 결합제는 순차적으로 또는 동시에 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 tau-441의 아미노산 1 - 35 내부 (이들을 포함) (또는 0N 또는 1N 아이소폼에 대해 유사하게 정의된 영역 내부)의 에피토프에 특이적으로 결합하는 에피토프-결합제; tau-441의 아미노산 104 - 243 내부 (이들을 포함)(또는 0N 또는 1N 아이소폼에 대해 유사하게 정의된 영역 내부)의 에피토프에 특이적으로 결합하는 에피토프-결합제; 및 아밀로이드 베타의 에피토프에 특이적으로 결합하는 에피토프 결합제를 사용하여 샘플로부터 하나 이상의 단백질을 친화도 고갈시키는 단계를 포함한다. 에피토프 결합제는 순차적으로 또는 동시에 사용될 수 있다.
일부 구체예들에서, 본 발명의 방법은 tau-441의 아미노산 1 - 103 내부 (이들 아미노산 포함) (또는 0N 또는 1N 아이소폼에 대해 유사하게 정의된 영역 내부)의 에피토프에 특이적으로 결합하는 에피토프 결합제; 및 아밀로이드 베타의 에피토프에 특이적으로 결합하는 에피토프 결합제를 사용하여 샘플로부터 하나 이상의 단백질을 친화도 고갈시키는 단계를 포함한다. 에피토프 결합제는 순차적으로 또는 동시에 사용될 수 있다.
일부 구체예들에서, 본 발명의 방법은 tau-441의 아미노산 1 - 35 내부 (이들 아미노산 포함) (또는 0N 또는 1N 아이소폼에 대해 유사하게 정의된 영역 내부)의 에피토프에 특이적으로 결합하는 에피토프 결합제; 및 아밀로이드 베타의 에피토프에 특이적으로 결합하는 에피토프 결합제를 사용하여 샘플로부터 하나 이상의 단백질을 친화도 고갈시키는 단계를 포함한다. 에피토프 결합제는 순차적으로 또는 동시에 사용될 수 있다.
일부 구체예들에서, 본 발명의 방법은 tau-441의 아미노산 104 - 243 내부 (이들 아미노산 포함) (또는 0N 또는 1N 아이소폼에 대해 유사하게 정의된 영역 내부)의 에피토프에 특이적으로 결합하는 에피토프 결합제; 및 아밀로이드 베타의 에피토프에 특이적으로 결합하는 에피토프 결합제를 사용하여 샘플로부터 하나 이상의 단백질을 친화도 고갈시키는 단계를 포함한다. 에피토프 결합제는 순차적으로 또는 동시에 사용될 수 있다.
각각의 상기 구체예에서, 에피토프 결합제는 항체 또는 압타머를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 아밀로이드 베타에 특이적으로 결합하는 에피토프-결합제는 HJ5.1이고, 또는 HJ5.1과 동일한 에피토프에 결합 및/또는 HJ5.1을 경쟁적으로 억제하는 에피토프-결합제이다. 일부 구체예에서, tau-441의 아미노산 1 - 103 내부의 에피토프에 특이적으로 결합하는 에피토프-결합제는 HJ8.5이고, 또는 HJ8.5와 동일한 에피토프에 결합 및/또는 HJ8.5를 경쟁적으로 억제하는 에피토프-결합제이다. 일부 구체예에서, tau-441의 아미노산 104 - 221 내부의 에피토프에 특이적으로 결합하는 에피토프-결합제는 Tau1이고, 또는 Tau1과 동일한 에피토프에 결합 및/또는 Tau1을 경쟁적으로 억제하는 에피토프-결합제이다. 항체가 특이적으로 결합하는 에피토프를 확인하는 방법, 및 2개의 항체 사이의 경쟁적 억제를 평가하기 위한 검정은 당업계에 공지되어 있다.
대안적으로, 단백질(들)은 더 일반적인 방법, 예를 들어 산, 유기 용매 또는 염을 사용한 한외여과 또는 단백질 침전에 의해 샘플에서 고갈될 수 있다. 일반적으로 말해서, 이러한 방법은 고 풍부도 및 고 분자량 단백질을 안정적으로 감소시키는 데 사용되며, 이는 차례로 저 분자량 및/또는 저 풍부도 단백질 및 펩타이드(예: 타우, Aβ 등)를 농축시킨다.
일부 구체예에서, 단백질은 샘플로부터 침전에 의해 고갈될 수 있다. 간단히 말해서, 침전은 침전제를 샘플에 추가하여 완전히 혼합하고, 샘플을 침전제와 함께 배양하여 단백질을 침전시키고, 침전된 단백질을 원심분리 또는 여과에 의해 분리하는 것을 포함한다. 생성된 상청액은 이후 하류 응용에서 사용될 수 있다. 필요한 시약의 양은 당업계에 공지된 방법에 의해 실험적으로 결정될 수 있다. 적합한 침전제는 과염소산, 트리클로로아세트산, 아세토니트릴, 메탄올 등을 포함한다. 한 예시적 구체예에서, 단백질은 샘플로부터 산 침전에 의해 고갈된다. 추가 구체예에서, 단백질은 과염소산을 사용한 산 침전에 의해 샘플로부터 고갈된다.
비-제한적 예로서, 단백질은 과염소산을 사용한 산 침전에 의해 샘플로부터 고갈될 수 있다. 본원에서 사용되는 "과염소산"은 달리 명시되지 않는 한 70% 과염소산을 의미한다. 일부 구체예에서, 과염소산은 약 1% v/v 내지 약 15% v/v의 최종 농도로 추가된다. 다른 구체예에서, 과염소산은 약 1% v/v 내지 약 10% v/v의 최종 농도로 추가된다. 다른 구체예에서, 과염소산은 약 1% v/v 내지 약 5% v/v의 최종 농도로 추가된다. 다른 구체예에서, 과염소산은 약 3% v/v 내지 약 15% v/v의 최종 농도로 추가된다. 다른 구체예에서, 과염소산은 약 3% v/v 내지 약 10% v/v의 최종 농도로 추가된다. 다른 구체예에서, 과염소산은 약 3% v/v 내지 약 5% v/v의 최종 농도로 추가된다. 다른 구체예에서, 과염소산은 3.5% v/v 내지 약 15% v/v, 3.5% v/v 내지 약 10% v/v, 또는 3.5% v/v 내지 약 5% v/v의 최종 농도로 추가된다. 다른 구체예에서, 과염소산은 약 3.5% v/v의 최종 농도로 추가된다. 과염소산을 추가한 후, 샘플을 잘 혼합하고(예: 와류 혼합기에 의해) 침전을 촉진하기 위해 일반적으로 약 10분 이상 동안 저온에서 홀드시킨다. 예를 들어, 샘플은 약 10분 내지 약 60분, 약 20분 내지 약 60분, 또는 약 30분 내지 약 60분 동안 홀드될 수 있다. 다른 예에서, 샘플은 약 15분 내지 약 45분, 또는 약 30분 내지 약 45분 동안 홀드될 수 있다. 다른 예에서, 샘플은 약 15분 내지 약 30분, 또는 약 20분 내지 약 40분 동안 홀드될 수 있다. 다른 예에서 샘플은 약 30분 동안 홀드된다. 그 다음, 샘플을 저온에서 원심분리하여 침전된 단백질을 펠릿화하고, 가용성 타우를 포함하는 상청액(즉, 산 가용성 분획)을 새로운 용기로 옮긴다. 상기 내용에서 사용되는 "저온"은 10℃이하의 온도를 지칭한다. 예를 들어, 저온은 약 1℃ 약 2℃ 약 3℃ 약 4℃, 약 5℃, 약 6℃, 약 7℃, 약 8℃, 약 9℃ 또는 약 10℃ 일 수 있다. 일부 구체예에서, 더 좁은 온도 범위, 예를 들어 약 3℃ 내지 약 5℃ 또는 심지어 약 4℃가 바람직할 수 있다. 특정 실시예에서, 샘플을 얼음 위에 올려놓음으로써 저온에 도달할 수 있다.
위의 접근법 중 하나 또는 둘 모두의 둘 이상의 방법을 조합하여 여러 단백질을 순차적으로 또는 동시에 고갈시킬 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 단백질이 선택적으로 고갈 (표적화 고갈)된 후 높은 풍부도/분자량의 단백질이 고갈될 수 있다. 대안적으로, 높은 풍부도/분자량의 단백질이 먼저 고갈된 후 하나 이상의 단백질의 표적화 고갈이 후속될 수 있다. 또 다른 대안예에서, 높은 풍부도 / 분자량의 단백질이 먼저 고갈된 다음, 하나 이상의 단백질들의 제1 라운드 표적화 고갈, 이후, 제1 라운드에서 표적화된 것 이외의 하나 이상의 다른 단백질(들)의 제2 라운드 표적화 고갈이 후속될 수 있다. 당업자는 그 외 반복을 쉽게 잘 알 것이다.
(d) 타우를 정제
본원에 개시된 방법의 또 다른 단계는 타우, 특히 MTBR 타우를 정제하는 단계를 포함한다. 일부 예에서, MTBR 타우는 N-말단-결여 및/또는 중간 도메인-결여 MTBR 타우이다. 정제된 타우는 부분적으로 정제 또는 완전히 정제될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 타우를 고체상 추출로 정제하는 단계를 포함한다. 고체상 추출에 의한 타우의 정제 단계는 타우를 흡착하는 흡착제를 포함하는 고체상과 타우를 포함하는 샘플을 접촉시키는 것, 하나 이상의 세척 단계, 및 흡착제로부터의 타우의 용리를 포함한다. 적합한 흡착제는 역상 흡착제를 포함한다. 적합한 역상 흡착제는 당업계에 공지되어 있으며, 알킬-결합된 실리카, 아릴-결합된 실리카, 스티렌/디비닐벤젠 물질, N-비닐피롤리돈/디비닐벤젠 물질을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 예시 구체예에서, 역상 물질은 N-비닐피롤리돈 및 디비닐벤젠을 포함하는 중합체 또는 스티렌 및 디비닐벤젠을 포함하는 중합체이다. 예시 구체예에서, 흡착제는 Oasis HLB (Waters)이다. 타우를 포함하는 상청액과 접촉하기 전에, 흡착제는 일반적으로 제조업체의 지침에 따라 또는 당업계에 공지된 바와 같이 전처리된다(예: 수혼화성 유기 용매, 그리고 이후 이동상을 포함하는 완충액으로). 또한, 일부 역상 물질은 이온화된 분석 물질을 다른 물질보다 더 강하게 보유하기 때문에 상층액은 선택적으로 산성화될 수 있다. 이동상에서 그리고 용리를 위해 휘발성 성분을 사용하는 것이 샘플 건조를 용이하게 하기 때문에 선호된다. 예시 구체예에서, 세척 단계는 약 0.05% v/v 트리플루오로아세트산(TFA) 내지 약 1% v/v TFA, 또는 이의 등가물을 포함하는 액체상의 사용을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 세척은 약 0.05% v/v 내지 약 0.5% v/v TFA 또는 약 0.05% v/v 내지 약 0.1% v/v TFA를 포함하는 액체상을 사용할 수 있다. 일부 예에서, 세척은 약 0.1% v/v 내지 약 1.0% v/v TFA 또는 약 0.1% v/v 내지 약 0.5% v/v TFA를 포함하는 액체상을 사용할 수 있다. 이어서, 결합된 타우는 약 20% v/v 내지 약 50% v/v 아세토니트릴(ACN), 또는 그의 등가물을 포함하는 액체상을 사용하여 용리된다. 일부 예에서, 타우는 약 20% v/v 내지 약 40% v/v ACN, 또는 약 20% v/v 내지 약 30% v/v ACN을 포함하는 액체상을 사용하여 용리될 수 있다. 일부 예에서, 타우는 약 30% v/v 내지 약 50% v/v ACN, 또는 약 30% v/v 내지 약 40% v/v ACN을 포함하는 액체상을 사용하여 용리될 수 있다. 용리액은 당업계에 공지된 방법(예: 진공 건조(예: 고속 진공), 동결건조, 질소 스트림 하에서의 증발 등)에 의해 건조될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 MTBR 타우를 친화도 정제로 정제하는 단계를 포함한다. 친화도 정제는 분자에 대한 특이적 결합 특성에 의해 관심 단백질을 농축시키는 방법을 지칭한다. 일반적으로 분자는 비드, 수지, 조직 배양 플레이트 등과 같은 고체 지지체에 부착된 리간드(고정 리간드라 함)이다. 리간드-단백질 상호작용이 발생한 후에 고체 지지체에 리간드가 고정화될 수도 있다. 적합한 리간드에는 항체, 압타머 및 기타 에피토프 결합제가 포함된다. 친화도 정제에 의한 MTBR 타우의 정제는 타우를 포함하는 샘플을 적합한 고정화된 리간드와 접촉시키는 것, 하나 이상의 세척 단계, 및 고정화된 리간드로부터 MTBR 타우의 용리를 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 tau-441의 아미노산 235 - 368 내부 (이들 아미노산 포함), 또는 tau-441의 아미노산 244 - 368 내부 (이들 아미노산 포함) (또는 기타 전장 아이소폼에 대해 유사하게 정의된 영역 내부)의 에피토프에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 에피토프 결합제를 사용하여 MTBR 타우를 친화도 정제로 정제하는 단계를 포함한다. 다양한 구체예에서, 1, 2, 3가지 또는 그 이상의 에피토프-결합제가 사용될 수 있다. 2가지 이상의 에피토프 결합제가 사용되는 경우, 이들은 순차적으로 또는 동시에 사용될 수 있다. 적합한 에피토프 결합제의 비-제한적 예에는 Vandermeeren 외, J Alzheimers Dis, 2018, 65:265-281에 기재된 항체 77G7, RD3, RD4, UCB1017, 및 PT76, 및 Roberts 외, Acta Neuropathol Commun, 2020, 8: 13에 기재된 항체 E2814 및 7G6, 뿐만 아니라 이들 항체들과 동일한 에피토프에 특이적으로 결합하는 그 외 에피토프 결합제가 포함된다. 추가 구체예에서, 본 발명의 방법은 MTBR 타우의 R1 내부의 에피토프에 특이적으로 결합하는 에피토프 결합제, MTBR 타우의 R2 내부의 에피토프에 특이적으로 결합하는 에피토프 결합제, MTBR 타우의 R3 내부의 에피토프에 특이적으로 결합하는 에피토프 결합제, MTBR 타우의 R4 내부의 에피토프에 특이적으로 결합하는 에피토프 결합제, 3R 타우에 고유한 에피토프에 특이적으로 결합하는 에피토프 결합제, 4R 타우에 고유한 에피토프에 특이적으로 결합하는 에피토프 결합제, MTBR 타우의 R1 내지 R2에 걸친 에피토프에 특이적으로 결합하는 에피토프 결합제, MTBR 타우의 R2 내지 R3에 걸친 에피토프에 특이적으로 결합하는 에피토프 결합제, 구체예MTBR 타우의 R3 내지 R4에 걸친 에피토프에 특이적으로 결합하는 에피토프 결합제, 또는 이의 임의의 조합을 사용하는 친화도 정제로 MTBR 타우를 정제하는 단계를 포함한다. 특정 예에서, 본 발명의 방법은 tau-441의 아미노산 316 - 355 (또는 다른 하나의 전장 아이소폼에서 동일한 영역)을 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 에피토프-결합제를 사용하는 친화도 정제로 MTBR 타우를 정제하는 단계를 포함한다. 다양한 구체예에서, 1, 2, 3가지 또는 그 이상의 에피토프-결합제가 사용될 수 있다. 2가지 이상의 에피토프 결합제가 사용되는 경우, 이들은 순차적으로 또는 동시에 사용될 수 있다.
각각의 상기 구체예에서, 에피토프 결합제는 항체 또는 압타머를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, MTBR 타우의 R3 및 R4 내부의 에피토프에 특이적으로 결합하는 에피토프 결합제는 77G7이고, 또는 77G7와 동일한 에피토프에 결합 및/또는 77G7 (BioLegend)을 경쟁적으로 억제하는 에피토프-결합제이다 일부 구체예에서, 3R 타우에 고유한 에피토프에 특이적으로 결합하는 에피토프 결합제는 RD3이고 (de Silva 외, Neuropathology and Applied Neurobiology, 2003, 29: 288-302), 또는 RD3와 동일한 에피토프에 결합 및/또는 RD3를 경쟁적으로 억제하는 에피토프-결합제이다. 일부 구체예에서, 4R 타우에 고유한 에피토프에 특이적으로 결합하는 에피토프 결합제는 RD4이고 (de Silva 외, Neuropathology and Applied Neurobiology, 2003, 29: 288-302), 또는 RD4와 동일한 에피토프에 결합 및/또는 RD4를 경쟁적으로 억제하는 에피토프-결합제이다.
(e) 정제된 타우를 프로테아제로 절단
본원에 개시된 방법의 또 다른 단계는 정제된 타우를 프로테아제로 절단하는 단계를 포함한다. 정제된 타우를 프로테아제로 절단하는 단계는 정제된 타우를 포함하는 샘플을 타우를 분해하기에 적합한 조건하에 프로테아제와 접촉시키는 것을 포함한다. 친화도 정제를 사용하는 경우 고정된 리간드에서 타우를 용리한 후 또는 타우가 결합된 상태에서 분해가 발생할 수 있다. 적합한 프로테아제는 트립신, Lys-N, Lys-C 및 Arg-N을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 바람직한 구체예에서, 프로테아제는 트립신이다. 생성된 절단 생성물은 타우의 단백질분해 펩타이드를 포함하는 조성물이다. 프로테아제가 트립신일 때, 생성된 절단 생성물은 타우의 트립신 펩타이드를 포함한다. 단백질분해 절단 후, 생성된 절단 생성물은 일반적으로 고체상 추출에 의해 탈염된다.
(f) LC-MS
본원에 개시된 방법의 또 다른 단계는 타우의 단백질분해 펩타이드를 포함하는 샘플로 액체 크로마토그래피 - 질량 분석법(LC-MS)을 수행하여 타우의 적어도 하나의 단백질분해 펩타이드의 농도를 검출하고 측정하는 것을 포함한다. 따라서, 실제로, 개시된 방법은 타우의 하나 이상의 단백질분해 펩타이드를 사용하여 생물학적 샘플에 존재하는 타우 단백질의 양을 검출하고 측정한다.
트립신이 프로테아제인 구체예에서, MTBR 타우의 존재를 나타내는 타우의 단백질분해 펩타이드는 표 A에 열거된 펩타이드를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 대체 소화 효소를 사용할 때, 생성된 단백질분해 펩타이드는 약간 다를 수 있지만 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 이론에 얽매이지 않고, 동일한 유형의 2개의 생물학적 샘플 사이의 트립신 펩타이드 양의 변화는 이러한 생물학적 샘플을 구성하는 MTBR 타우 종의 차이를 반영하는 것으로 여겨진다. 본원에 개시된 바와 같이, MTBR 타우의 특정 단백질분해 펩타이드의 양, 뿐만 아니라 MTBR 타우의 특정 단백질분해 펩타이드의 비율은 치료 결정을 안내하기 위해 임상적으로 의미 있는 정보를 제공할 수 있다. 따라서, MTBR 타우의 트립신 펩타이드의 검출 및 정량화를 가능하게 하는 방법은 많은 신경퇴행성 질환의 진단 및 치료에 유용하다.
표 A: MTBR 타우의 존재를 나타내는 타우의 트립신 펩타이드
Figure pct00005
타우의 단백질분해 펩타이드는 고해상도 질량 분석기와 연결된 액체 크로마토그래피 시스템에 의해 분리될 수 있다. 적합한 LC-MS 시스템은 <1.0mm ID 컬럼을 포함하고 약 100μl/분 미만의 유속을 사용할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 나노플로우 LC-MS 시스템이 사용된다 (예를 들어, 약 50-100μm ID 컬럼 및 < 1μL/분, 바람직하게는 약 100-800nL/분, 보다 바람직하게는 약 200-600nL/분의 유속). 예시 구체예에서, LC-MS 시스템은 0.05mM ID 컬럼을 포함할 수 있고 약 400nL/분의 유속을 사용할 수 있다.
탠덤 질량 분석법은 당업계에 알려진 바와 같이 분해능을 개선하기 위해 사용될 수 있고, 또는 이 기술은 단일 질량 분석기로 탠덤 질량 분석기의 분해능을 구현하기 위해 향상될 수 있다. 적합한 유형의 질량 분석기는 당업계에 공지되어 있다. 여기에는 사중극자, 비행시간법(Time-of-Flight), 이온 트랩 및 Orbitrap 뿐만 아니라 상이한 유형의 질량 분석기를 하나의 아키텍처로 결합하는 하이브리드 질량 분석기 (예를 들어, Orbitrap Fusion?? Tribrid?? 질량 분석기, Orbitrap Fusion?? Lumos?? 질량 분석기, Orbitrap Tribrid?? Eclipse?? 질량 분석기, Q Exactive 질량 분석기, 각각 ThermoFisher Scientific사로부터 구입)가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 예시 구체예에서, LC-MS 시스템은 Orbitrap Fusion?? Tribrid?? 질량 분석기, Orbitrap Fusion?? Lumos?? 질량 분석기, Orbitrap Tribrid?? Eclipse?? 질량 분석기, 또는 사중극자에서 유사한 또는 개선된 이온-포커싱 및 이온-투명도를 가지는 질량 분석기에서 선택된 질량 분석기를 포함할 수 있다. 적절한 질량 분석 프로토콜은 주입 시간 및/또는 분석 전에 수집된 이온 수 (예: 오비트랩을 사용한 AGC 설정)를 최적화하여 개발될 수 있다. 예시 구체예에서, 실시예에 개략적으로 설명된 질량 분석법 프로토콜이 사용된다.
III. MTBR 타우 측정값의 사용
본 발명은 또한 진단, 병기결정, 주어진 질환 단계에 적합한 치료를 선택, 및 주어진 치료 요법을 수정 (예를 들어, 용량 변경, 다른 약물 또는 치료 방식으로 전환 등)하기 위한, 타우병증의 병리학적 특징 및/또는 임상 증상의 바이오마커로서의 혈액 또는 CSF에서 MTBR 타우 종, 특히, 중간 도메인-결여 MTBR 타우 종의 측정치의 용도를 포함한다. 병리학적 특징은 타우 병리의 양상(예를 들어, 타우 침착의 양, 번역후 변형의 존재/부재, 번역후 변형의 양 등) 일 수 있다. 대안적으로, 또는 타우 침착 이외에도, 병리학적 특징은 타우-독립성일 수 있다. 예를 들어, 타우병증이 알츠하이머 질환인 경우 뇌 또는 뇌 동맥에서의 아밀로이드 베타(Aβ) 침착이다. 임상 증상은 임상적으로 검증된 기기 (예: MMSE, CDR-SB 등)로 측정한 치매 또는 타우병증과 관련된 기타 임상 증상일 수 있다. 또한, 3R- 및 4R-타우병증에 대해 당업계에 공지된 다른 병리학적 특징 및 임상 증상의 바이오마커로서 혈액 또는 CSF에서 MTBR 타우 종, 특히 중간 도메인-결여 MTBR 타우 종의 측정치를 사용하는 것이 고려된다. 유리하게는, 중간 도메인-결여 MTBR 타우 종을 비롯한 (그러나 이에 제한되지 않는) MTBR 타우 종은 질환 상태를 건강한 상태와 구별할 뿐만 아니라 다양한 타우병증을 구별한다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 대상체의 타우병증 관련 병리를 측정하는 방법을 제공하며, 이 방법은 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플, 예를 들어, 혈액 샘플 또는 CSF 샘플에서 하나 이상의 MTBR 타우 종들을 정량하는 단계를 포함하며, 이때 정량된 MTRB-타우 종들의 양은 대상체 뇌에서의 타우병증 관련 병리를 나타내는 것이다. 타우병증은 3R-타우병증, 혼합 3R/4R-타우병증, 또는 4R-타우병증일 수 있다. 질환 관련 병리는 타우 침착, 타우 번역 후 변형, 뇌 및/또는 뇌 동맥의 아밀로이드 플라크, 또는 당업계에 공지된 기타 병리학적 특징일 수 있다. 대상체에게 타우병증의 임상 증상이 있을 수도 있고 없을 수도 있다. 바람직한 구체예들에서, 정량된 적어도 하나의 MTBR 타우 종은 중간 도메인-결여 MTBR 타우 종이다. 추가 구체예들에서, 정량된 둘 이상의 MTBR 타우 종은 중간 도메인-결여 MTBR 타우 종이다. 또한 추가 구체예들에서, 정량된 MTBR 타우 종은 중간 도메인-결여 MTBR 타우 종이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체에서 타우병증을 진단하는 방법을 제공하며, 이 방법은 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플, 예컨대 혈액 샘플 또는 CSF 샘플에서 하나 이상의 MTBR 타우 종들을 정량하는 단계, 및 정량된 MTBR 타우 종들이 약 1.5σ 이상인 경우 타우병증을 진단하는 단계를 포함하고, 이때 σ는 타우병증의 임상 징후나 증상이 없고 CSF에서 PET 영상화 및/또는 Aβ42/40 측정으로 측정 시 아밀로이드 음성인 대조군에서 측정한 정규 분포로 정의된 표준 편차이다. 타우병증은 3R-타우병증, 혼합 3R/4R-타우병증, 또는 4R-타우병증일 수 있다. 대상체에게 질환의 임상 증상이 있을 수도 있고 없을 수도 있다. 바람직한 구체예들에서, 정량된 적어도 하나의 MTBR 타우 종은 중간 도메인-결여 MTBR 타우 종이다. 추가 구체예들에서, 정량된 둘 이상의 MTBR 타우 종은 중간 도메인-결여 MTBR 타우 종이다. 또한 추가 구체예들에서, 정량된 MTBR 타우 종은 중간 도메인-결여 MTBR 타우 종이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체에서 타우병증 질환 안정성을 측정하는 방법을 제공하며, 이 방법은 대상체로부터 얻은 제1 생물학적 샘플에서, 그리고 이후 (예를 들어, 수 주, 수 개월, 또는 수 년) 동일한 대상체로부터 얻은 제2 생물학적 샘플에서 하나 이상의 MTBR 타우 종을 정량하는 단계, 및 샘플들 간 정량된 MTBR 타우 종들 간의 차이를 계산하는 단계를 포함하고, 이때 제2 샘플에서 정량된 MTBR 타우 종의 통계적으로 유의한 증가는 질환 진행을 나타내고, 제2 샘플에서 정량된 MTBR 타우 종의 통계적으로 유의한 감소는 질환 개선을 나타내며, 변화가 없으면 안정적인 질환을 나타낸다. 타우병증은 3R-타우병증, 혼합 3R/4R-타우병증, 또는 4R-타우병증일 수 있다. 대상체는 질환의 임상 증상을 갖거나 갖지 않을 수 있으며, 타우 요법을 받을 수도 있고 받지 않을 수도 있다. 일부 예에서, 타우 요법은 제1 생물학적 샘플과 제2 생물학적 샘플의 수집 사이의 시기에 대상체에게 1회 이상 투여되고, 질환 안정성의 척도는 타우 요법의 효과 또는 효과없음의 지표이다. 바람직한 구체예들에서, 정량된 적어도 하나의 MTBR 타우 종은 중간 도메인-결여 MTBR 타우 종이다. 추가 구체예들에서, 정량된 둘 이상의 MTBR 타우 종은 중간 도메인-결여 MTBR 타우 종이다. 또한 추가 구체예들에서, 정량된 MTBR 타우 종은 중간 도메인-결여 MTBR 타우 종이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 타우병증 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 이 방법은 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플, 예컨대 혈액 샘플 또는 CSF 샘플에서 하나 이상의 MTBR 타우 종을 정량하는 단계; 및 질환 관련 병리 또는 임상 증상 측정을 개선하기 위하여 대상체에게 타우 요법을 제공하는 단계를 포함하고, 이때 대상체는 1 이상의 표준 편차, 바람직하게는 1.3 이상의 표준 편차, 더욱 바람직하게는 1.5 이상의 표준 편차, 또는 더더욱 바람직하게는 2이상의 표준 편차의 정량된 MTBR 타우 종을 가지며 (즉, 각각 1σ, 1.3σ, 1.5σ, 또는 1.5σ 만큼 상이남), 이때 σ는 타우병증의 임상 징후나 증상이 없고 CSF에서 PET 영상화 및/또는 Aβ42/40 측정으로 측정 시 아밀로이드 음성인 대조군에서 측정한 정규 분포로 정의된 표준 편차이다. 임계값(예를 들어, 평균 위 또는 아래로 1 이상의 표준 편차)을 사용하는 것 외에도, 일부 구체예에서 평균 위 또는 아래로의 변화 정도가 대상체를 치료하기 위한 기준으로 사용될 수 있다. 타우병증은 3R-타우병증, 혼합 3R/4R-타우병증, 또는 4R-타우병증일 수 있다. 질환 관련 병리의 측정은 PET 영상화에 의해 측정된 타우 침착, 질량 분석법 또는 기타 적절한 방법에 의해 측정된 타우 번역 후 변형, PET 영상화에 의해 측정된 뇌 또는 뇌 동맥의 아밀로이드 플라크, CSF에서 Aβ42/40에 의해 측정된 아밀로이드 플라크, 또는 당업계에 공지된 다른 병리학적 특징 일 수 있다. 임상 증상은 임상적으로 검증된 기기 (예를 들어, MMSE, CDR-SB 등)에 의해 측정된 치매 또는 3R-, 및 4R-타우병증에 대해 당업계에 공지된 기타 임상 증상일 수 있다. 바람직한 구체예들에서, 정량된 적어도 하나의 MTBR 타우 종은 중간 도메인-결여 MTBR 타우 종이다. 추가 구체예들에서, 정량된 둘 이상의 MTBR 타우 종은 중간 도메인-결여 MTBR 타우 종이다. 또한 추가 구체예들에서, 정량된 MTBR 타우 종은 중간 도메인-결여 MTBR 타우 종이다. 많은 타우 요법은 특정 병태생리학적 변화를 목표로 한다. 예를 들어, Aβ 표적화 요법은 일반적으로 Aβ 생산을 감소시키고, Aβ 응집을 길항하거나, 뇌 Aβ 제거율을 증가시키도록 고안되었으며; 타우 표적화 요법은 일반적으로 타우 인산화 패턴을 변경하거나, 타우 응집을 길항 (타우의 일반적인 길항 또는 특정 타우 아이소폼의 길항)하거나, NFT 제거를 증가시키도록 고안되었으며; CNS 염증이나 뇌 인슐린 저항성을 줄이기 위해 다양한 요법이 고안되는 등이다. 그러나 모든 타우병증이 동일한 병태생리학적 변화를 공유하는 것은 아니다. 따라서 이러한 다양한 타우 요법의 효능은 3R-타우병증, 혼합 3R/4R-타우병증 또는 4R-타우병증이 있는 것으로 올바르게 확인된 대상체에 투여함으로써 향상될 수 있다.
용어 "중간 도메인-결여(mid-domain-independent) MTBR 타우"는 타우의 중간 도메인 영역 모두 또는 실질적으로 모두, 그리하여 N-말단 영역 또한 결여된 복수의 MTBR 타우 종을 지칭한다. 이러한 중간 도메인-결여 MTBR 타우 종들은 중간 도메인 타우를 포함하는 타우 종들이 생물학적 샘플들로부터, 바람직하게는 혈액 또는 CSF 샘플로부터 부분적으로 또는 완전히 고갈된 이후에도 잔존한다. 적절한 생물학적 샘플은 섹션 II(a)에 설명되어 있으며, 그 내용은 본 섹션에 참고로 포함된다. 중간 도메인 타우의 고갈은 이러한 타우 종의 표적화된 고갈, 예를 들어, 타우의 N-말단 또는 중간 도메인 내부의 에피토프에 특이적으로 결합하는 에피토프-결합제를 사용한 친화도 고갈에 의해 발생할 수 있다. 여러 에피토프 결합제 - 예를 들어, 타우의 N-말단 내부의 에피토프에 특이적으로 결합하는 제1 에피토프 결합제와 중간 도메인 내부의 에피토프에 특이적으로 결합하는 제2 에피토프 결합제가 사용될 수도 있다. 더 자세한 내용은 섹션 II(c)에서 찾을 수 있으며, 그 내용은 본 섹션에 참고로 포함된다. 일반적으로, 출발 물질에서 표적된 단백질의 적어도 50%(예를 들어, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상)가 고갈된다. 일부 구체예에서, 출발 물질에서 표적된 단백질의 약 70% 이상, 약 80% 이상, 또는 약 90% 이상이 고갈된다. 생물학적 샘플에서 중간 도메인 타우가 고갈된 후, (1) 예를 들어, 다른 단백질들을 침전으로 제거 및/또는 타우 단백질을 고체상 추출로 정제함으로써, 중간 도메인-결여 MTBR 타우를 포함할 잔여 타우 종들을 농축시키거나, 또는 (2) 예를 들어, MTBR 내부의 에피토프에 특이적으로 결합하는 에피토프 결합제를 사용한 친화도 정제에 의해 중간 도메인-결여 MTBR 타우 종을 선택적으로 농축시키기 위한 단계들이 수행될 수 있다. 용어 "농축시키다"는 양 또는 수를 증가시키는 것을 의미한다. 더 자세한 내용은 섹션 II에서 찾을 수 있으며, 그 내용은 본 섹션에 참고로 포함된다. 바람직하게는, 중간 도메인-결여 MTBR 타우 종은 CSF에서의 그들의 양에 비해 적어도 100배 농축된다. 일부 예에서, 중간 도메인-결여 MTBR 타우 종은 약 100배 내지 약 1000배 - 예를 들어, 약 100배, 약 200배, 약 300배, 약 400배, 약 500배, 600배, 약 700배, 약 800배, 약 900배, 약 1000배 농축될 수 있다. 일부 예에서, 중간 도메인-결여 MTBR 타우 종은 약 500배 내지 약 1000배, 또는 그 이상 농축될 수 있다. MTBR 타우는 대상체로부터 얻은 처리된 CSF 또는 혈액 샘플에서 정량될 수 있으며, 이때 CSF 또는 혈액 샘플에서 중간 도메인 타우가 고갈된 다음, 섹션 II 또는 실시예에 설명된 LC-MS에 의하여, 또는 당업계에 공지된 다른 방법 (예를 들어, 다중 분석법 (예를 들어, Luminex사의 xMAP 기술, 단일 분자 단백질 검출 (예를 들어, Simoa® 비드 기술), 등)에 의하여 MTBR 타우가 농축된다. 생물학적 샘플에서 중간 도메인 타우가 고갈되지 않은 구체예들에서, 타우는 여전히 일반적으로 상기 설명된 방법으로 그리고 상기 설명된 정도로 농축된다.
각각의 상기 측면들에서, 적합한 MTBR 타우 종은 서열 번호: 2 (IGSTENLK), 서열 번호: 3 (LQTAPVPMPDLK), 서열 번호: 4 (VQIINK), 서열 번호: 5 (LDLSNVQSK), 서열 번호: 6 (HVPGGGSVQIVYKPVDLSK), 서열 번호: 8 (IGSLDNITHVPGGGN), 서열 번호: 9 (VQIVYKPVDLSK), 또는 이의 조합의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종 및/또는 중간 도메인-결여 MTBR 종을 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 측정할 MTBR 종의 선택은 해당 방법의 의도 목적에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 타우병증이 3R-타우병증인 경우, 서열 번호: 9 (VQIVYKPVDLSK)를 포함하는 MTBR 타우 종은 혼합형 3R/4R-타우병증 또는 4R-타우병증과 비교하여 감소될 수 있는 반면, 서열 번호: 2 (IGSTENLK), 서열 번호: 4 (VQIINK), 서열 번호: 5 (LDLSNVQSK), 서열 번호: 6 (HVPGGGSVQIVYKPVDLSK), 및/또는 서열 번호: 8 (IGSLDNITHVPGGGN)을 포함하는 MTBR 타우 종은 다른 타우병증에 비해 변화없거나 증가될 수 있다. 역으로, 타우병증이 4R-타우병증인 경우, 서열 번호: 9 (VQIVYKPVDLSK)를 포함하는 MTBR 타우 종은 혼합된 3R/4R-타우병증 또는 3R-타우병증과 비교하여 증가될 수 있는 반면, 서열 번호: 2 (IGSTENLK), 서열 번호: 4 (VQIINK), 서열 번호: 5 (LDLSNVQSK), 서열 번호: 6 (HVPGGGSVQIVYKPVDLSK), 및/또는 서열 번호: 8 (IGSLDNITHVPGGGN)을 포함하는 MTBR 타우 종은 다른 타우병증에 비해 변화없거나 감소될 수 있다. 추가 예로서, 4R 타우병증은 서열 번호: 2 (IGSTENLK), 서열 번호: 4 (VQIINK), 서열 번호: 5 (LDLSNVQSK), 서열 번호: 6 (HVPGGGSVQIVYKPVDLSK), 및/또는 서열 번호: 8 (IGSLDNITHVPGGGN)을 포함하는 MTBR 타우 종을 정량함으로써 AD와 구별될 수 있다. 중간 도메인-결여 MTBR 타우 종을 사용하면 판별력을 높일 수 있으며, 이는 두 개의 서로 다른 중간 도메인-결여 MTBR 타우 종들의 비율을 사용하여 더욱 높아질 수 있다. 예를 들어, 타우병증이 3R-타우병증 또는 혼합형 3R/4R-타우병증인 경우, 서열 번호: 6에 대한 서열 번호: 3, 서열 번호: 8에 대한 서열 번호: 3, 또는 서열 번호: 8에 대한 서열 번호: 6의 비율이 사용될 수 있다. 타우병증이 4R-타우병증인 경우, 서열 번호: 6, 7 또는 8에 대한 서열 번호: 2, 4, 5, 또는 9의 비율이 사용될 수 있다. 비율 이외의 수학 연산도 사용할 수 있다.
중간 도메인-결여 MTBR tau-243의 사용 예시가 상기 논의한 다양한 측면들을 설명할 수 있으나, 이러한 논의는 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. "중간 도메인-결여 MTBR tau-243"은 실시예 3에 상세히 기재되어 있다. 이것은 서열 번호: 3의 아미노산 서열 (LQTAPVPMPDLK)을 가지며, 모두가 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 복수의 중간 도메인-결여 MTBR 타우 종의 트립신 펩타이드이다. 중간 도메인-결여 MTBR tau-243의 양을 측정하는 것은, 주어진 샘플에서, 중간 도메인-결여 MTBR 타우 종의 이러한 특정 그룹의 양을 측정하는 한 가지 수단이다. 실시예 2 및 3에서 보는 바와 같이, CSF 중간 도메인-결여 MTBR 타우-243 양의 증가는 알츠하이머 질환(AD)과 관련된 뇌에서 Aβ 침착 및 타우 침착 증가의 직접 측정으로 다시 확인된다. 달리 말하면, CSF 중간 도메인-결여 MTBR tau-243의 양 (그리고 그에 따른 서열 번호: 3을 포함하는 CSF 중간 도메인-결여 MTBR 타우의 양)은 AD 관련 병리 (예를 들어, 뇌에서 타우 침착, 뇌에서 Aβ 침착 등)를 나타낸다. 따라서 이러한 양은 AD 관련 병리를 측정하고, 대상의 아밀로이드 상태를 결정하고, 질환의 임상 증상이 없는 대상에서 AD를 진단하는 데 사용될 수 있다. CSF 중간 도메인-결여 MTBR tau-243의 양은 또한, 예를 들어, MMSE 또는 CDR-SB 테스팅 결과로 정의되는 AD의 임상 단계들 동안 측정된 변화를 요약한다. 따라서, 중간 도메인-결여 MTBR tau-243의 양 (그리고 그에 따른 서열 번호: 3을 포함하는 중간 도메인-결여 MTBR 타우의 양)은 전체 질환 스펙트럼 (예를 들어, 전임상 내지 임상)에 걸쳐 대상체에서 AD를 진단 및 병기결정하는데 사용될 수 있다. 전체 질환 스펙트럼에 걸쳐 대상체에서 AD를 진단하고 병기결정하는 것에 대한 유용성은 중간 도메인-결여 MTBR 타우의 모든 트립신 펩타이드에서 관찰되는 것은 아니었다. 실시예 3의 중간 도메인-결여 MTBR tau-299 및 중간 도메인-결여 MTBR tau-354 데이터가 그 예이다. 이는 "서열 번호: 3을 포함하는 중간 도메인-결여 MTBR 타우"를 구성하는 펩타이드들의 그룹이 "서열 번호: 6을 포함하는 중간 도메인-결여 MTBR 타우"를 구성하는 펩타이드들의 그룹과 상이할 수 있음을 입증하며 (중복이 있을 수 있음), 타우병증을 측정하는 방법 (예를 들어, 질량 분석법, ELISA, 등)과 무관하게 AD (그리고 가능한 그 외 타우병증)에 대한 질환-특이적 바이오마커로서 (특히) 서열 번호: 3의 풍부도의 용도를 뒷받침한다. 질환을 진단 및/또는 병기 결정한 후, CSF에서 중간 도메인-결여 MTBR tau-243의 양을 감소시키거나 임의의 추가 증가를 방지하기 위한 및/또는 AD의 또 다른 임상 징후 또는 증상의 임의의 추가 증가를 감소 또는 방지하기 위한 치료가 대상체에게 제공될 수 있다. 치료 선택은 중간 도메인-결여 MTBR tau-243의 양으로 알게되는 특정 질환 단계에 관한 지식에 의해 추가로 안내될 수 있다 - 예를 들어, Aβ 침착을 방지하고, Aβ 침착을 역전시키고, 타우 침착을 방지하고, 타우 침착을 역전시키고, 질환의 임상 징후를 개선하도록 고안된 요법이 중간 도메인-결여 MTBR tau-243의 양이 (중복될 수 있긴 하지만) 상이한 대상체에서 사용될 것이다. 이 실시예들은 CSF 중간 도메인-결여 MTBR tau-243이 AD의 바이오마커로서는 매우 유용하지만, 비AD 타우병증에서는 그리 유용하지 않음을 또한 보여준다. 비AD 타우병증은 서열 번호: 2 (IGSTENLK), 서열 번호: 4 (VQIINK), 서열 번호: 5 (LDLSNVQSK), 서열 번호: 6 (HVPGGGSVQIVYKPVDLSK) 또는 서열 번호: 8 (IGSLDNITHVPGGGN)을 포함하는 중간 도메인-결여 MTBR 타우 종, 및 이들의 비율을 정량함으로써 구별될 수 있다. 이 실시예들은 CSF 샘플에서 상기 원칙을 보여주지만, 혈액 샘플도 적합한 대안으로 고려된다.
특정 구체예들에서, 본 발명은 대상체에서 알츠하이머 질환(AD) 관련 병리를 측정하는 방법을 제공하며, 이러한 방법은 대상체로부터 얻은 처리된 CSF 또는 혈액 샘플을 제공하는 단계, 이때 CSF 또는 혈액 샘플은 중간 도메인 타우가 고갈되어 있고 MTBR 타우가 농축되어 있으며; 및 처리된 샘플에서 서열 번호: 3의 아미노산 서열 (LQTAPVPMPDLK)을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 6의 아미노산 서열 (HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 7의 아미노산 서열 (IGSLDNITHVPGGGNK)을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 8의 아미노산 서열 (IGSLDNITHVPGGGN)을 포함하는 MTBR 타우 종, 또는 이의 조합을 정량하는 단계를 포함하며, 이때 정량된 MTRB-타우 종들의 양, 또는 이들의 비율은 대상체의 뇌에서 AD 관련 병리를 나타낸다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명은 대상체의 뇌에서 알츠하이머 질환(AD) 관련 타우 침착을 측정하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 대상체로부터 얻은 처리된 CSF 또는 혈액 샘플을 제공하는 단계, 이때 처리된 CSF 또는 혈액 샘플은 중간 도메인 타우가 고갈되어 있고 MTBR 타우가 농축되어 있으며; 및 처리된 CSF 또는 AD 관련혈액 샘플에서 서열 번호: 3의 아미노산 서열 (LQTAPVPMPDLK)을 포함하는 MTBR 타우 종을 정량하는 단계를 포함하며, 이때 정량된 MTRB-타우 종들의 양은 대상체의 뇌에서 AD 관련 타우 침착을 나타낸다.
또 다른 구체예들에서, 본 발명은 대상체의 뇌에서 알츠하이머 질환(AD) 관련 타우 침착을 측정하는 방법을 제공하며, 이러한 방법은 대상체로부터 얻은 처리된 CSF 또는 혈액 샘플을 제공하는 단계, 이때 CSF 또는 혈액 샘플은 중간 도메인 타우가 고갈되어 있고 MTBR 타우가 농축되어 있으며; 및 처리된 샘플에서 서열 번호: 3의 아미노산 서열 (LQTAPVPMPDLK)을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 6의 아미노산 서열 (HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 7의 아미노산 서열 (IGSLDNITHVPGGGNK)을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 8의 아미노산 서열 (IGSLDNITHVPGGGN)을 포함하는 MTBR 타우 종, 또는 이의 조합을 정량하는 단계를 포함하며, 이때 정량된 MTRB-타우 종들의 양, 또는 이들의 비율은 대상체의 뇌에서 AD 관련 타우 침착을 나타낸다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명은 대상체의 아밀로이드 상태를 결정하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 대상체로부터 얻은 처리된 CSF 또는 혈액 샘플을 제공하는 단계, 이때 CSF 또는 혈액 샘플은 중간 도메인 타우가 고갈되어 있고 MTBR 타우가 농축되어 있으며; 및 처리된 샘플에서 서열 번호: 6의 아미노산 서열 (HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)을 포함하는 MTBR 타우 종을 정량하는 단계, 이때 정량된 MTRB-타우 종들의 양은 대상체의 뇌에서 AD 관련 아밀로이드 베타 침착을 나타내고 IB-PET, 예를 들어, Ann Neurol 2016; 80:379-387에 기재된 바와 같이 PiB-PET SUVR로 결정하여 아밀로이드-양성을 예측한다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명은 알츠하이머 질환을 진단하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 대상체로부터 얻은 처리된 CSF 또는 혈액 샘플을 제공하는 단계, 이때 CSF 또는 혈액 샘플은 중간 도메인 타우가 고갈되어 있고 MTBR 타우가 농축되어 있으며; 및 처리된 샘플에서, 서열 번호: 3의 아미노산 서열 (LQTAPVPMPDLK)을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 6의 아미노산 서열 (HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 7의 아미노산 서열 (IGSLDNITHVPGGGNK)을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 8의 아미노산 서열 (IGSLDNITHVPGGGN)을 포함하는 MTBR 타우 종, 또는 이의 조합을 정량하는 단계; 및 정량된 MTBR 타우 종이 약 1.5σ 이상 상이한 경우 알츠하이머 질환을 진단하는 단계를 포함하고, 이때 σ는 타우병증의 임상 징후 또는 증상이 없고 PET 영상화 (예를 들어, Ann Neurol 2016; 80:379-387에 기재되어 있는 PiB-PET SUVR) 및/또는 CSF에서의 Aβ42/40 측정값 (예를 들어, PiB-PET SUVR (Ann Neurol 2016; 80:379-387)로부터 계산된 CSF Aβ42/40에 대한, 민감도% + 특이도%를 최대화시키는, 컷오프 값)으로 측정시 아밀로이드 음성인 대조군 집단에서 측정된 정규 분포로 정의되는 표준 편차이다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명은 대상체에서 알츠하이머 질환 (AD) 진행을 측정하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 처리된 제1 CSF 또는 혈액 샘플 및 처리된 제2 CSF 또는 혈액 샘플을 제공하는 단계, 이때 각 처리된 샘플은 하나의 대상체로부터 얻으며, 각각의 처리된 샘플은 중간 도메인 타우가 고갈되어 있고 MTBR 타우가 농축되어 있으며; 그리고 각 처리된 샘플에 대해, 서열 번호: 3의 아미노산 서열 (LQTAPVPMPDLK)을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 6의 아미노산 서열 (HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 7 (IGSLDNITHVPGGGNK)을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 8 (IGSLDNITHVPGGGN)을 포함하는 MTBR 타우 종, 또는 이의 조합을 정량하는 단계; 및 제2 샘플 및 제1 샘플에서 정량된 MTBR 타우 종들 간의 차이를 계산하는 단계를 포함하며, 이때 제2 샘플에서 정량된 MTBR 타우 종의 통계적으로 유의한 증가는 대상체의 알츠하이머 질환 진행을 나타낸다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명은 4R-타우병증을 구별하는 방법을 제공하며, 이 방법은 대상체로부터 얻은 처리된 CSF 또는 혈액 샘플을 제공하는 단계, 이때 CSF 또는 혈액 샘플은 중간 도메인 타우가 고갈되어 있고 MTBR 타우가 농축되어 있으며; 그리고, 처리된 샘플에서, (i) 서열 번호: 9의 아미노산 서열 (VQIVYKPVDLSK)을 포함하는 MTBR 타우 종, 및 (ii) 서열 번호: 7의 아미노산 서열 (IGSLDNITHVPGGGNK)을 포함하는 MTBR 타우 종 또는 서열 번호: 8의 아미노산 서열 (IGSLDNITHVPGGGN)을 포함하는 MTBR 타우 종을 정량하는 단계; 이때 (i) 및 (ii)로부터 정량된 MTBR 종들의 비율은 4R-타우병증을 알츠하이머 질환 및 건강한 상태와 구별한다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명은 4R-타우병증을 구별하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 대상체로부터 얻은 처리된 CSF 또는 혈액 샘플을 제공하는 단계, 이때 CSF 또는 혈액 샘플은 중간 도메인 타우가 고갈되어 있고 MTBR 타우가 농축되어 있으며; 그리고, 처리된 샘플에서, (i) 서열 번호: 9의 아미노산 서열 (VQIVYKPVDLSK)을 포함하는 MTBR 타우 종, 및 (ii) 서열 번호: 4의 아미노산 서열 (VQIINK)을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 5의 아미노산 서열 (LDLSNVQSK)을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 6의 아미노산 서열 (HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)을 포함하는 MTBR 타우 종, 또는 이의 조합을 정량하는 단계를 포함하며; 이때 (i) 및 (ii)로부터 정량된 MTBR 종들의 비율은 4R-타우병증을 알츠하이머 질환 및 건강한 상태와 구별한다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명은 4R-타우병증을 구별하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 대상체로부터 얻은 처리된 CSF 또는 혈액 샘플을 제공하는 단계, 이때 CSF 또는 혈액 샘플은 (a) N-말단 타우 및 중간 도메인 타우가 고갈되어 있고, (b) MTBR 타우가 농축되어 있으며; 그리고, 처리된 샘플에서, (i) 서열 번호: 2의 아미노산 서열 (IGSTENLK)을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 4의 아미노산 서열 (VQIINK)을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 5의 아미노산 서열 (LDLSNVQSK)을 포함하는 MTBR 타우 종, 또는 이의 조합, 및 (ii) 서열 번호: 6의 아미노산 서열 (HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 7의 아미노산 서열 (IGSLDNITHVPGGGNK)을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 8의 아미노산 서열 (IGSLDNITHVPGGGN)을 포함하는 MTBR 타우 종, 또는 이의 조합을 정량하는 단계를 포함하며, 이때 (i) 및 (ii)로부터 정량된 MTBR 종들의 비율은 4R-타우병증을 알츠하이머 질환 및 건강한 상태와 구별한다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명은 4R-타우병증을 구별하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 대상체로부터 얻은 처리된 CSF 또는 혈액 샘플을 제공하는 단계, 이때 CSF 또는 혈액 샘플은 (a) N-말단 타우 및 중간 도메인 타우가 고갈되어 있고, (b) MTBR 타우가 농축되어 있으며; 그리고, 처리된 샘플에서, (i) 서열 번호: 2의 아미노산 서열 (IGSTENLK)을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 4의 아미노산 서열 (VQIINK)을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 5의 아미노산 서열 (LDLSNVQSK)을 포함하는 MTBR 타우 종, 또는 이의 조합, 및 (ii) 서열 번호: 7의 아미노산 서열 (IGSLDNITHVPGGGNK)을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 8의 아미노산 서열 (IGSLDNITHVPGGGN)을 포함하는 MTBR 타우 종, 또는 이의 조합을 정량하는 단계를 포함하며, 이때 (i) 및 (ii)로부터 정량된 MTBR 종들의 비율은 4R-타우병증을 알츠하이머 질환 및 건강한 상태와 구별한다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명은 4R-타우병증을 구별하는 방법을 제공하며, 이 방법은 대상체로부터 얻은 처리된 CSF 또는 혈액 샘플을 제공하는 단계, 이때 CSF 또는 혈액 샘플은 (a) N-말단 타우 및 중간 도메인 타우가 고갈되어 있고, (b) MTBR 타우가 농축되어 있으며; 그리고, 처리된 샘플에서, (a) 서열 번호: 6의 아미노산 서열 (HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)을 포함하는 MTBR 타우 종, 및 (b) 서열 번호: 7의 아미노산 서열 (IGSLDNITHVPGGGNK)을 포함하는 MTBR 타우 종 또는 서열 번호: 8의 아미노산 서열 (IGSLDNITHVPGGGN)을 포함하는 MTBR 타우 종, 또는 이의 조합을 정량하는 단계; 이때 (a) 및 (b)로부터 정량된 MTBR 종들의 비율은 4R-타우병증을 기타 타우병증 및 건강한 상태와 구별한다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명은 3R-타우병증을 구별하는 방법을 제공하며, 이 방법은 대상체로부터 얻은 처리된 CSF 또는 혈액 샘플을 제공하는 단계, 이때 CSF 또는 혈액 샘플은 (a) N-말단 타우 및 중간 도메인 타우가 고갈되어 있고, (b) MTBR 타우가 농축되어 있으며; 그리고, 처리된 샘플에서, (a) 서열 번호: 9의 아미노산 서열 (VQIVYKPVDLSK)을 포함하는 MTBR 타우 종, 및 (b) 서열 번호: 2 (IGSTENLK), 서열 번호: 4 (VQIINK), 서열 번호: 5 (LDLSNVQSK), 서열 번호: 6 (HVPGGGSVQIVYKPVDLSK), 서열 번호: 7 (IGSLDNITHVPGGGNK), 서열 번호: 8 (IGSLDNITHVPGGGN)의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 또는 이의 조합을 정량하는 단계; 이때 (a) 및 (b)로부터 정량된 MTBR 종들의 비율은 3R-타우병증을 기타 타우병증 및 건강한 상태와 구별한다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명은 대상체에서 타우병증 관련 병리를 측정하는 방법을 제공하며, 이 방법은 대상체로부터 얻은 처리된 CSF 또는 혈액 샘플을 제공하는 단계, 이때 CSF 또는 혈액 샘플은 중간 도메인 타우가 고갈되어 있고 MTBR 타우가 농축되어 있으며; 및 처리된 샘플에서 서열 번호: 2의 아미노산 서열 (IGSTENLK)을 포함하는 MTBR 종, 서열 번호: 3의 아미노산 서열 (LQTAPVPMPDLK)을 포함하는 MTBR 종, 서열 번호: 4의 아미노산 서열 (VQIINK)을 포함하는 MTBR 종, 서열 번호: 5의 아미노산 서열 (LDLSNVQSK)을 포함하는 MTBR 종, 서열 번호: 6의 아미노산 서열 (HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)을 포함하는 MTBR 종, 서열 번호: 8의 아미노산 서열 (IGSLDNITHVPGGGN)을 포함하는 MTBR 종, 서열 번호: 9의 아미노산 서열 (VQIVYKPVDLSK)을 포함하는 MTBR 종 또는 이의 조합을 정량하는 단계를 포함하고, 이때 정량된 MTRB-타우 종들의 양, 또는 이들의 비율은 대상체의 뇌에서 타우병증 관련 병리를 나타낸다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명은 대상체 뇌의 타우 침착을 측정하는 방법을 제공하며, 이 방법은 대상체로부터 얻은 처리된 CSF 또는 혈액 샘플을 제공하는 단계, 이때 CSF 또는 혈액 샘플은 중간 도메인 타우가 고갈되어 있고 MTBR 타우가 농축되어 있으며; 및 처리된 샘플에서 서열 번호: 2의 아미노산 서열 (IGSTENLK)을 포함하는 MTBR 종, 서열 번호: 3의 아미노산 서열 (LQTAPVPMPDLK)을 포함하는 MTBR 종, 서열 번호: 4의 아미노산 서열 (VQIINK)을 포함하는 MTBR 종, 서열 번호: 5의 아미노산 서열 (LDLSNVQSK)을 포함하는 MTBR 종, 서열 번호: 6의 아미노산 서열 (HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)을 포함하는 MTBR 종, 서열 번호: 8의 아미노산 서열 (IGSLDNITHVPGGGN)을 포함하는 MTBR 종, 서열 번호: 9의 아미노산 서열 (VQIVYKPVDLSK)을 포함하는 MTBR 종 또는 이의 조합을 정량하는 단계를 포함하고, 이때 정량된 MTRB-타우 종들의 양, 또는 이들의 비율은 대상체의 뇌에서 타우 침착을 나타낸다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명은 대상체 뇌의 타우 침착을 측정하는 방법을 제공하며, 이 방법은 대상체로부터 얻은 처리된 CSF 또는 혈액 샘플을 제공하는 단계, 이때 CSF 또는 혈액 샘플은 중간 도메인 타우가 고갈되어 있고 MTBR 타우가 농축되어 있으며; 및 처리된 샘플에서 서열 번호: 2의 아미노산 서열 (IGSTENLK)을 포함하는 MTBR 종, 서열 번호: 4의 아미노산 서열 (VQIINK)을 포함하는 MTBR 종, 서열 번호: 5의 아미노산 서열 (LDLSNVQSK)을 포함하는 MTBR 종, 서열 번호: 6의 아미노산 서열 (HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)을 포함하는 MTBR 종, 서열 번호: 8의 아미노산 서열 (IGSLDNITHVPGGGN)을 포함하는 MTBR 종, 서열 번호: 9의 아미노산 서열 (VQIVYKPVDLSK)을 포함하는 MTBR 종 또는 이의 조합을 정량하는 단계를 포함하고, 이때 정량된 MTRB-타우 종들의 양, 또는 이들의 비율은 3R-타우병증 또는 4R-타우병증 (즉, 비AD 타우병증) 대상체의 뇌에서 타우 침착을 나타낸다.
다음의 특정 구체예는 생물학적 시료에서 타우를 측정하는 방법을 포함하는 방법에 관한 것이다. 이들 구체예 각각에서, 생물학적 샘플에서 타우를 측정하는 방법은 (a) 생물학적 샘플에서 N-말단 타우, 중간 도메인 타우, 또는 N-말단 타우 및 중간 도메인 타우를 친화도 고갈에 의해 감소시키고, 그리고 선택적으로 아밀로이드 베타를 친화도 고갈에 의해 감소시키는 단계, 이때 생물학적 샘플은 혈액 샘플 또는 CSF 샘플이고 생물학적 샘플은 선택적으로 동위원소 표지된 타우 내부 표준을 포함하고; (b) (i) 생물학적 샘플로부터 단백질 침전 및 침전된 단백질을 분리하여 추가 단백질을 제거하여 상청액을 얻은 다음, 상청액으로부터 고체상 추출에 의해 타우를 정제하는 단계, 또는 (ii) MTBR 타우를 친화도 정제함으로써, (i) 또는 (ii)에 의해 농축된 타우를 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 타우를 농축시키는 단계; (c) 농축된 타우를 프로테아제로 절단한 다음, 선택적으로, 생성된 절단 생성물을 고체상 추출에 의해 탈염시켜 타우의 단백질분해 펩타이드를 포함하는 샘플을 얻는 단계; 및 (d) 이러한 타우의 단백질분해 펩타이드를 포함하는 샘플로 액체 크로마토그래피 - 질량 분석법 (LC/MS)을 수행하여 타우의 적어도 하나의 단백질분해 펩타이드의 양을 검출 및 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 단계 (a) 내지 (d) 각각에 대한 추가 세부사항은 본원에 참고로 포함된 섹션 II에서 찾을 수 있다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명은 대상체에서 알츠하이머 질환(AD) 관련 병리를 측정하는 방법을 제공하며, 이 방법은 상기 방법에 따라 생물학적 샘플에서 타우를 측정하는 단계를 포함하고, 이때 측정되는 타우는 서열 번호: 3의 아미노산 서열 (LQTAPVPMPDLK)을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 6의 아미노산 서열 (HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 8의 아미노산 서열 (IGSLDNITHVPGGGN)을 포함하는 MTBR 타우 종, 또는 이의 조합이고, 이때 MTRB-타우 종들의 양은 대상체의 뇌에서 AD 관련 병리를 나타낸다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명은 대상체의 뇌에서 알츠하이머 질환(AD) 관련 타우 침착을 측정하는 방법을 제공하며, 이 방법은 상기 방법에 따라 생물학적 샘플에서 타우를 측정하는 단계를 포함하고, 이때 측정되는 타우는 서열 번호: 3의 아미노산 서열 (LQTAPVPMPDLK)을 포함하는 MTBR 타우 종이고, 이때 MTRB-타우 종들의 양은 대상체의 뇌에서 AD 관련 병리를 나타낸다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명은 대상체의 뇌에서 알츠하이머 질환(AD) 관련 타우 침착을 측정하는 방법을 제공하며, 이 방법은 상기 방법에 따라 생물학적 샘플에서 타우를 측정하는 단계를 포함하고, 이때 측정되는 타우는 서열 번호: 3의 아미노산 서열 (LQTAPVPMPDLK)을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 6의 아미노산 서열 (HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 7의 아미노산 서열 (IGSLDNITHVPGGGNK)을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 8의 아미노산 서열 (IGSLDNITHVPGGGN)을 포함하는 MTBR 타우 종, 또는 이의 조합이고, 이때 MTRB-타우 종들의 양은 대상체의 뇌에서 AD 관련 병리를 나타낸다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명은 대상체의 아밀로이드 상태를 결정하는 방법을 제공하며, 이 방법은 상기 방법에 따라 생물학적 샘플에서 타우를 측정하는 단계를 포함하고, 이때 측정되는 타우는 서열 번호: 6의 아미노산 서열 (HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)을 포함하는 MTBR 타우 종이고, MTRB-타우 종들의 양은 대상체의 뇌에서 AD 관련 아밀로이드 베타 침착을 나타내며 PIB-PET로 결정시 아밀로이드 양성을 예측한다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명은 알츠하이머 질환의 진단 방법을 제공하며, 이 방법은 상기 방법에 따라 생물학적 샘플에서 타우를 측정하는 단계, 이때 측정되는 타우는 서열 번호: 3의 아미노산 서열 (LQTAPVPMPDLK)을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 6의 아미노산 서열 (HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 7의 아미노산 서열 (IGSLDNITHVPGGGNK)을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 8의 아미노산 서열 (IGSLDNITHVPGGGN)을 포함하는 MTBR 타우 종, 또는 이의 조합이고; 및 정량된 MTBR 타우 종이 약 1.5σ 이상 상이한 경우 알츠하이머 질환을 진단하는 단계를 포함하고, 이때 σ는 타우병증의 임상 징후 또는 증상이 없고 PET 영상화 및/또는 CSF에서의 Aβ42/40 측정값으로 측정시 아밀로이드 음성인 대조군 집단에서 측정한 정규 분포로 정의되는 표준 편차이다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명은 대상체에서 알츠하이머 질환 (AD) 진행을 측정하는 방법을 제공하고, 이 방법은 상기 방법에 따라 생물학적 샘플에서 타우를 측정하는 단계, 이때 측정되는 타우는 서열 번호: 3의 아미노산 서열 (LQTAPVPMPDLK)을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 6의 아미노산 서열 (HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 7 (IGSLDNITHVPGGGNK)을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 8 (IGSLDNITHVPGGGN)을 포함하는 MTBR 타우 종, 또는 이의 조합이고; 및 제2 샘플 및 제1 샘플에서 정량된 MTBR 타우 종들 간의 차이를 계산하는 단계를 포함하며, 이때 제2 샘플에서 정량된 MTBR 타우 종의 통계적으로 유의한 증가는 대상체의 알츠하이머 질환 진행을 나타낸다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명은 4R-타우병증을 구별하는 방법을 제공하며, 이 방법은 상기 방법에 따라 생물학적 샘플에서 타우를 측정하는 단계를 포함하고, 이때 측정되는 타우는 (i) 서열 번호: 9의 아미노산 서열 (VQIVYKPVDLSK)을 포함하는 MTBR 타우 종, 및 (ii) 서열 번호: 7의 아미노산 서열 (IGSLDNITHVPGGGNK)을 포함하는 MTBR 타우 종 또는 서열 번호: 8의 아미노산 서열 (IGSLDNITHVPGGGN)을 포함하는 MTBR 타우 종이고; 이때 (i) 및 (ii)로부터 정량된 MTBR 종들의 비율은 4R-타우병증을 알츠하이머 질환 및 건강한 상태와 구별한다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명은 4R-타우병증을 구별하는 방법을 제공하며, 이 방법은 상기 방법에 따라 생물학적 샘플에서 타우를 측정하는 단계를 포함하고, 이때 측정되는 타우는 (i) 서열 번호: 9의 아미노산 서열 (VQIVYKPVDLSK)을 포함하는 MTBR 타우 종, 및 (ii) 서열 번호: 4의 아미노산 서열 (VQIINK)을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 5의 아미노산 서열 (LDLSNVQSK)을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 6의 아미노산 서열 (HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)을 포함하는 MTBR 타우 종, 또는 이의 조합이고; 이때 (i) 및 (ii)로부터 정량된 MTBR 종들의 비율은 4R-타우병증을 알츠하이머 질환 및 건강한 상태와 구별한다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명은 4R-타우병증을 구별하는 방법을 제공하며, 이 방법은 상기 방법에 따라 생물학적 샘플에서 타우를 측정하는 단계를 포함하고, 이때 측정되는 타우는 (i) 서열 번호: 2의 아미노산 서열 (IGSTENLK)을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 4의 아미노산 서열 (VQIINK)을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 5의 아미노산 서열 (LDLSNVQSK)을 포함하는 MTBR 타우 종, 또는 이의 조합, 및 (ii) 서열 번호: 6의 아미노산 서열 (HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 7의 아미노산 서열 (IGSLDNITHVPGGGNK)을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 8의 아미노산 서열 (IGSLDNITHVPGGGN)을 포함하는 MTBR 타우 종, 또는 이의 조합이고, 이때 (i) 및 (ii)로부터 정량된 MTBR 종들의 비율은 4R-타우병증을 알츠하이머 질환 및 건강한 상태와 구별한다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명은 4R-타우병증을 구별하는 방법을 제공하며, 이 방법은 상기 방법에 따라 생물학적 샘플에서 타우를 측정하는 단계를 포함하고, 이때 측정되는 타우는 (i) 서열 번호: 2의 아미노산 서열 (IGSTENLK)을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 4의 아미노산 서열 (VQIINK)을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 5의 아미노산 서열 (LDLSNVQSK)을 포함하는 MTBR 타우 종, 또는 이의 조합, 및 (ii) 서열 번호: 7의 아미노산 서열 (IGSLDNITHVPGGGNK)을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 8의 아미노산 서열 (IGSLDNITHVPGGGN)을 포함하는 MTBR 타우 종, 또는 이의 조합이고, 이때 (i) 및 (ii)로부터 정량된 MTBR 종들의 비율은 4R-타우병증을 알츠하이머 질환 및 건강한 상태와 구별한다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명은 4R-타우병증을 구별하는 방법을 제공하며, 이 방법은 상기 방법에 따라 생물학적 샘플에서 타우를 측정하는 단계를 포함하고, 이때 측정되는 타우는 (i) 서열 번호: 6의 아미노산 서열 (HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)을 포함하는 MTBR 타우 종, 및 (ii) 서열 번호: 7의 아미노산 서열 (IGSLDNITHVPGGGNK)을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 8의 아미노산 서열 (IGSLDNITHVPGGGN), 또는 이의 조합을 포함하는 MTBR 타우 종이고; 이때 (i) 및 (ii)로부터 정량된 MTBR 종들의 비율은 4R-타우병증을 알츠하이머 질환 및 건강한 상태와 구별한다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명은 대상체에서 타우병증 관련 병리를 측정하는 방법을 제공하며, 이 방법은 상기 방법에 따라 생물학적 샘플에서 타우를 측정하는 단계, 이때 CSF 또는 혈액 샘플은 중간 도메인 타우가 고갈되어 있고 MTBR 타우가 농축되어 있으며; 및 처리된 샘플에서 서열 번호: 2의 아미노산 서열 (IGSTENLK)을 포함하는 MTBR 종, 서열 번호: 3의 아미노산 서열 (LQTAPVPMPDLK)을 포함하는 MTBR 종, 서열 번호: 4의 아미노산 서열 (VQIINK)을 포함하는 MTBR 종, 서열 번호: 5의 아미노산 서열 (LDLSNVQSK)을 포함하는 MTBR 종, 서열 번호: 6의 아미노산 서열 (HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)을 포함하는 MTBR 종, 서열 번호: 8의 아미노산 서열 (IGSLDNITHVPGGGN)을 포함하는 MTBR 종, 서열 번호: 9의 아미노산 서열 (VQIVYKPVDLSK)을 포함하는 MTBR 종 또는 이의 조합을 정량하는 단계를 포함하고, 이때 정량된 MTRB-타우 종들의 양, 또는 이들의 비율은 대상체의 뇌에서 타우병증 관련 병리를 나타낸다.
특정 구체예에서, 본 발명은 대상체의 뇌에서 타우 침착을 측정하는 방법을 제공하며, 이 방법은 상기 방법에 따라 생물학적 샘플에서 타우를 측정하는 단계, 이때 CSF 또는 혈액 샘플은 중간 도메인 타우가 고갈되어 있고 MTBR 타우가 농축되어 있으며; 및 처리된 샘플에서 서열 번호: 2의 아미노산 서열 (IGSTENLK)을 포함하는 MTBR 종, 서열 번호: 3의 아미노산 서열 (LQTAPVPMPDLK)을 포함하는 MTBR 종, 서열 번호: 4의 아미노산 서열 (VQIINK)을 포함하는 MTBR 종, 서열 번호: 5의 아미노산 서열 (LDLSNVQSK)을 포함하는 MTBR 종, 서열 번호: 6의 아미노산 서열 (HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)을 포함하는 MTBR 종, 서열 번호: 8의 아미노산 서열 (IGSLDNITHVPGGGN)을 포함하는 MTBR 종, 서열 번호: 9의 아미노산 서열 (VQIVYKPVDLSK)을 포함하는 MTBR 종 또는 이의 조합을 정량하는 단계를 포함하고, 이때 정량된 MTRB-타우 종들의 양, 또는 이들의 비율은 대상체의 뇌에서 타우 침착을 나타낸다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 대상체의 치료 방법을 제공하며, 이 방법은 (a) 대상체로부터 얻은 처리된 CSF 또는 혈액 샘플을 제공하는 단계, 이때 CSF 또는 혈액 샘플은 (i) 중간 도메인 타우가 고갈되어 있고, (ii) MTBR 타우가 농축되어 있으며; (b) 처리된 샘플에서, 서열 번호: 2의 아미노산 서열 (IGSTENLK)을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 3의 아미노산 서열 (LQTAPVPMPDLK)을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 4의 아미노산 서열 (VQIINK)을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 5의 아미노산 서열 (LDLSNVQSK)을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 6의 아미노산 서열 (HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 7의 아미노산 서열 (IGSLDNITHVPGGGNK)을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 8의 아미노산 서열 (IGSLDNITHVPGGGN)을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 9의 아미노산 서열 (VQIVYKPVDLSK)을 포함하는 MTBR 타우 종, 또는 이의 조합을 정량하는 단계; 및 (c) 타우 병리를 변경하기 위해 대상체에게 치료제를 투여하는 단계를 포함하고, 이때 대상체의 처리된 CSF 또는 혈액 샘플은 약 1.5σ 이상 상이한 정량된 MTBR 타우 종, 또는 정량된 MTBR 타우 종의 비율을 가지며, 이때 σ는 타우병증의 임상 징후 또는 증상이 없고 PET 영상화 및/또는 CSF에서의 Aβ42/40 측정값으로 측정시 아밀로이드 음성인 대조군 집단에서 측정한 정규 분포로 정의되는 표준 편차이고, 이때 정량된 MTRB-타우 종의 양 또는 이들의 비율은 대상체 뇌의 타우 병리를 나타낸다. 일부 구체예에서, 타우 병리를 변경하기 위해 대상체에 치료제를 투여하면 정량된 MTBR 종의 양을 변경하거나 안정화시킨다. 일부 구체예에서 치료는 콜린에스테라제 억제제, N-메틸 D-아스파테이트(NMDA) 길항제, 항우울제(예컨대, 선택적 세로토닌 재흡수 억제제, 비정형 항우울제, 아미노케톤, 선택적 세로토닌 및 노르에피네프린 재흡수 억제제, 삼환성 항우울제 등), 감마-세크레타제 억제제, 베타-세크레타제 억제제, 항-Aβ 항체(이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체 포함), 항-타우 항체(이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체 포함), 항-TREM2 항체 (이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체 포함), TREM2 효능제, 줄기 세포, 식이 보충제(예컨대, 리튬 물, 리포산을 포함하는 오메가-3 지방산, 장쇄 트리글리세리드, 제니스테인, 레스베라트롤, 커큐민 및 포도씨 추출물 등), 세로토닌 수용체 6의 길항제, p38알파 MAPK 억제제, 재조합 과립구 대식세포 콜로니-자극 인자, 수동 면역요법, 활성 백신(예컨대, CAD106, AF20513 등), 타우 단백질 응집 억제제(예컨대, TRx0237, 메틸티오니뮴 클로라이드 등), 혈당 제어를 개선하기 위한 요법(예컨대, 인슐린, 엑세나타이드, 리라글루타이드 피오글리타존 등), 항염증제, 포스포디에스테라제 9A 억제제, 시그마-1 수용체 작용제, 키나제 억제제, 포스파타제 활성화제, 포스파타제 억제제, 안지오텐신 수용체 차단제, CB1 및/또는 CB2 엔도칸나비노이드 수용체 부분 작용제,
Figure pct00006
-2 아드레날린 수용체 작용제, 니코틴 아세틸콜린 수용체 작용제, 5-HT2A 역 작용제, 알파-2c 아드레날린 수용체 길항제, 5-HT 1A 및 1D 수용체 효능제, 글루타미닐-펩타이드 사이클로트랜스퍼라제 억제제, APP 생산의 선택적 억제제, 모노아민 산화효소 B 억제제, 글루타메이트 수용체 길항제, AMPA 수용체 효능제, 신경 성장인자 자극제, HMG-CoA 환원효소 억제제, 신경영양제, 무스카린성 M1 수용체 효능제, GABA 수용체 조절인자, PPAR-감마 작용제, 미세소관 단백질 조절인자, 칼슘 채널 차단제, 항고혈압제, 스타틴 및 이들의 임의의 조합을 포함하는 약학 조성물이다. 예시 구체예에서, 약학 조성물은 키나제 억제제를 포함할 수 있다. 적합한 키나제 억제제는 싸우전드-앤드-원 아미노산 키나제 (TAOK), CDK, GSK-3
Figure pct00007
, MARK, CDK5 또는 Fyn을 억제할 수 있다 다른 예시 구체예에서, 약학 조성물은 포스파타제 활성화제를 포함할 수있다. 비-제한적인 예로서, 포스파타제 활성화제는 단백질 포스파타제 2A의 활성을 증가시킬 수 있다. 일부 구체예에서, 치료제는 타우 인산화 패턴을 변경하거나, 타우 응집을 길항하거나, 또는 병리학적 타우 아이소폼 및/또는 응집체의 제거를 증가시키는 활성 약학 성분을 포함하지만 이에 제한되지 않는 타우 표적화 요법을 포함하는 제약 조성물이다. 일부 구체예에서, 치료제가 항-Aβ 항체, 항-타우 항체, 항-TREM2 항체, TREM2 작용제, 감마-세크레타제 억제제, 베타-세크레타제 억제제, 키나제 억제제, 포스파타제 활성화제, 백신 또는 타우 단백질 응집 억제제이다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 대상체의 치료 방법을 제공하며, 이 방법은 (a) 대상체로부터 얻은 처리된 CSF 또는 혈액 샘플을 제공하는 단계, 이때 CSF 또는 혈액 샘플은 (i) 중간 도메인 타우가 고갈되어 있고, (ii) MTBR 타우가 농축되어 있으며; (b) 처리된 샘플에서, 서열 번호: 3의 아미노산 서열 (LQTAPVPMPDLK)을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 6의 아미노산 서열 (HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 7의 아미노산 서열 (IGSLDNITHVPGGGNK)을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 8의 아미노산 서열 (IGSLDNITHVPGGGN)을 포함하는 MTBR 타우 종, 또는 이의 조합을 정량하는 단계; 및 (c) 타우 병리를 변경하기 위해 대상체에게 치료제를 투여하는 단계를 포함하고, 이때 대상체의 처리된 CSF 또는 혈액 샘플은 약 1.5σ 이상 상이한 정량된 MTBR 타우 종, 또는 정량된 MTBR 타우 종의 비율을 가지며, 이때 σ는 타우병증의 임상 징후 또는 증상이 없고 PET 영상화 및/또는 CSF에서의 Aβ42/40 측정값으로 측정시 아밀로이드 음성인 대조군 집단에서 측정한 정규 분포로 정의되는 표준 편차이고, 이때 정량된 MTRB-타우 종의 양 또는 이들의 비율은 대상체 뇌의 타우 병리를 나타낸다. 일부 구체예에서, 타우 병리를 변경하기 위해 대상체에 치료제를 투여하면 정량된 MTBR 종의 양을 변경하거나 안정화시킨다. 일부 구체예에서 치료는 콜린에스테라제 억제제, N-메틸 D-아스파테이트(NMDA) 길항제, 항우울제(예컨대, 선택적 세로토닌 재흡수 억제제, 비정형 항우울제, 아미노케톤, 선택적 세로토닌 및 노르에피네프린 재흡수 억제제, 삼환성 항우울제 등), 감마-세크레타제 억제제, 베타-세크레타제 억제제, 항-Aβ 항체(이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체 포함), 항-타우 항체(이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체 포함), 항-TREM2 항체 (이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체 포함), TREM2 효능제, 줄기 세포, 식이 보충제(예컨대, 리튬 물, 리포산을 포함하는 오메가-3 지방산, 장쇄 트리글리세리드, 제니스테인, 레스베라트롤, 커큐민 및 포도씨 추출물 등), 세로토닌 수용체 6의 길항제, p38알파 MAPK 억제제, 재조합 과립구 대식세포 콜로니-자극 인자, 수동 면역요법, 활성 백신(예컨대, CAD106, AF20513 등), 타우 단백질 응집 억제제(예컨대, TRx0237, 메틸티오니뮴 클로라이드 등), 혈당 제어를 개선하기 위한 요법(예컨대, 인슐린, 엑세나타이드, 리라글루타이드 피오글리타존 등), 항염증제, 포스포디에스테라제 9A 억제제, 시그마-1 수용체 작용제, 키나제 억제제, 포스파타제 활성화제, 포스파타제 억제제, 안지오텐신 수용체 차단제, CB1 및/또는 CB2 엔도칸나비노이드 수용체 부분 작용제,
Figure pct00008
-2 아드레날린 수용체 작용제, 니코틴 아세틸콜린 수용체 작용제, 5-HT2A 역 작용제, 알파-2c 아드레날린 수용체 길항제, 5-HT 1A 및 1D 수용체 효능제, 글루타미닐-펩타이드 사이클로트랜스퍼라제 억제제, APP 생산의 선택적 억제제, 모노아민 산화효소 B 억제제, 글루타메이트 수용체 길항제, AMPA 수용체 효능제, 신경 성장인자 자극제, HMG-CoA 환원효소 억제제, 신경영양제, 무스카린성 M1 수용체 효능제, GABA 수용체 조절인자, PPAR-감마 작용제, 미세소관 단백질 조절인자, 칼슘 채널 차단제, 항고혈압제, 스타틴 및 이들의 임의의 조합을 포함하는 약학 조성물이다. 예시 구체예에서, 약학 조성물은 키나제 억제제를 포함할 수 있다. 적합한 키나제 억제제는 싸우전드-앤드-원 아미노산 키나제 (TAOK), CDK, GSK-3
Figure pct00009
, MARK, CDK5 또는 Fyn을 억제할 수 있다 다른 예시 구체예에서, 약학 조성물은 포스파타제 활성화제를 포함할 수있다. 비-제한적인 예로서, 포스파타제 활성화제는 단백질 포스파타제 2A의 활성을 증가시킬 수 있다. 일부 구체예에서, 치료제는 타우 인산화 패턴을 변경하거나, 타우 응집을 길항하거나, 또는 병리학적 타우 아이소폼 및/또는 응집체의 제거를 증가시키는 활성 약학 성분을 포함하지만 이에 제한되지 않는 타우 표적화 요법을 포함하는 제약 조성물이다. 일부 구체예에서, 치료제가 항-Aβ 항체, 항-타우 항체, 항-TREM2 항체, TREM2 작용제, 감마-세크레타제 억제제, 베타-세크레타제 억제제, 키나제 억제제, 포스파타제 활성화제, 백신 또는 타우 단백질 응집 억제제이다.
실시예
다음 실시예는 본 발명의 다양한 반복을 설명한다. 다음 실시예에 개시된 기술들은 발명자에 의해 본 발명의 실시에서 잘 기능하는 것으로 발견된 기술들을 나타냄은, 당업자에게 자명하다. 그러나 당업자는, 본 출원의 개시내용에 비추어, 개시된 특정 구체예들에 많은 변화들을 줄 수 있으며 여전히 본 발명의 사상 및 범위에서 벗어나지 않는 가능성 있는 또는 유사한 결과를 얻을 수 있음을 이해하여야 한다. 따라서, 첨부된 도면에 기재되거나 도시된 모든 사항은 예시적인 것이며 제한적인 의미로 해석되어서는 안 된다.
실시예 1
Sato et al., 2018에 설명된 N-말단 타우 및 중간 도메인 타우(IP)에 대한 면역 침전 방법; 화학적 추출법(CX); 및 MTBR 타우를 농축시키기 위해 IP 및 CX 방법을 결합하는 가공법(PostIP-CX)과 같은 여러 샘플 처리 방법이 개발되었다. CX 및 PostIP-CX법은 MTBR 타우를 검출하고 정량하기 위해 특별히 개발되었다. 이러한 방법에 대한 개요는 도 2에 제공된다.
간단히 말해서, CSF(약 475μL)를 내부 표준으로서 15N Tau-441(2N4R) 균일 표지(100pg/μL 용액의 약 10μL, 또는 200pg/μL 용액의 약 5μL)를 포함하는 용액과 혼합했다. N-말단 타우 및 중간 도메인 타우 종들을 Tau1 및 HJ8.5 항체로 면역침전시킨 다음 이전에 설명한 바와 같이 (Sato et al., 2018) 처리 및 트립신 분해되었다.
CX법의 경우, CSF(약 475μL)를 내부 표준으로서 15N Tau-441(2N4R) 균일 표지(100pg/μL 용액의 약 10μL, 또는 200pg/μL 용액의 약 5μL)를 포함하는 용액과 혼합했다. 그런 다음, 화학적으로 타우를 추출했다. 매우 풍부한 CSF 단백질은 25 μL의 과염소산을 사용하여 침전되었다. 혼합 및 얼음 위에서 15분간 배양한 후, 혼합물을 4°C에서 20,000g으로 15분간 원심분리하고 상층액을 다음 단계에 따라 Oasis HLB 96-well μElution Plate(Waters)를 사용하여 추가로 정제했다. 플레이트를 300 μL의 메탄올로 한 번 세척하고 물 중의 0.1% FA 500 μL로 한 번 평형화하였다. 상청액을 Oasis HLB 96웰 μElution 플레이트에 추가하고 고체상에 흡착시켰다. 그 다음, 고체상을 물 중의 0.1 % FA 500 μL로 한 번 세척하였다. 용리 완충액(100μL; 물 중 35% 아세토니트릴 및 0.1% FA)을 추가하고, 용리액을 Speed-vac으로 건조시켰다. 건조된 샘플을 50mM TEABC 중의 트립신 용액(10ng/μL) 50μL로 용해시키고 37°C에서 20시간 동안 배양하였다.
PostIP-CX법의 경우, 면역침전 후 CSF(즉, 위에서 설명한 IP법 후에 남은 상청액)를 CX 방법에 설명된 대로 처리했다.
트립신 분해 후, 모든 샘플은 C18 TopTip에서 고체상 추출로 정제되었다. 이 정제 과정에서, 잔기 354-369(MTBR tau-354) 및 354-368(tau368)에 대한 AQUA 내부 표준 펩타이드 각 5fmol을 차등 정량화를 위해 스파이킹했다. 샘플을 용리하기 전에 물 중 3% 과산화수소 및 3% FA를 비드에 추가한 다음 4°C에서 밤새 배양하여 메티오닌을 함유하는 펩타이드를 산화시켰다. 용리액을 동결건조하고 물 중 2% 아세토니트릴 및 0.1% FA 27.5μL에 재현탁시킨 다음, PRM 모드에서 작동하는 Orbitrap Fusion Lumos Tribrid 또는 Orbitrap Tribrid Eclipse 질량 분석기(Thermo Scientific)에 연결된 nanoAcquity UPLC 시스템에서 MS 분석하였다.
도 3A에 도시된 바와 같이, CX 및 PostIP-CX법은 질량 분석에 의해 검출가능하고 정량할 수 있는 MTBR 타우를 포함하는 샘플을 생성하였다. IP법으로는 MTBR 타우의 정량화 가능한 신호를 얻지 못했다. 입증되지는 않았지만, MTBR 타우를 검출하고 정량하기 위한 유사한 민감도를 갖는 다른 방법을 사용할 수도 있다고 생각된다.
실시예 2
본 실시예에서, 후기 발병 알츠하이머 질환(LOAD100 및 LOAD60)이 있는 피험자의 두 임상 코호트에서 얻은 CSF 샘플을 분석했다. 이 분석에 사용된 샘플에 대한 임상 치매 등급(CDR) 점수 및 아밀로이드 상태가 표 1 및 2에 제공된다. SF 샘플(각각 약 500μl)을 PostIP-CX법으로 처리하고 실시예 1에 설명된 대로 질량 분석기로 평가했다. CSF로부터 면역침전된 CSF Aβ42 및 Aβ40은 이전에 기술된 바와 같이 질량 분석에 의해 측정되었다 (Patterson BW, 외, Ann Neurol 2015, 78: 439-453). pT217%는 이전에 기술된 바와 같이 질량 분석에 의해 측정되었다 (Barth
Figure pct00010
lemy, N.R., 외, Alz Res Therapy,　2020, 12:　26).
아밀로이드 상태를 결정하기 위해 PiB-PET SUVR 결과로부터 CSF Aβ42/40에 대한 컷오프 값을 계산하였다. PiB-PET SUVR에 대해 설정된 컷오프 >1.42(Ann Neurol 2016; 80:379-387)에 기초하 때, CSF Aβ42/40의 경우 (민감도% + 특이도%)는 0.1389에서 최대화되었다. 특히, pT217%는 설정된 컷오프에 의해 정의된 아밀로이드 상태와 우수한 상관관계를 보여주었고 단 하나의 이상치를 보였다 (도 4).
도 5-7에서 볼 수 있듯이 PostIP-CX 샘플에서 측정된 MTBR과 관련된 타우의 트립신 펩타이드는 아밀로이드 양성 대상에서 특히 증가했다. HVPG는 임상적으로 무증상 단계에서도 가장 유의하게 증가했다 (도 5-6). HVPG와 IGSL의 증가는 증상 발현 후에 포화된 반면, LQTA는 임상 발병 후에도 계속 증가했다 (도 7-8). LQTA의 농도는 타우에 대한 양전자방출단층촬영(PET)으로 측정한 타우 병리(Pearson r=0.84, n=35) 및 인지 테스트 척도와 가장 높은 상관관계를 보였다 (도 9-12). 상기 분석 중 일부의 경우, 아밀로이드 양성 CDR 1 및 CDR 2 샘플에 대한 데이터는 CDR>1로 결합되었고, 아밀로이드 음성 CDR 0.5 및 CDR 1에 대한 데이터는 CDR>0.5로 결합되었다. 통계 분석은 FDR을 5%로 설정한 Benjamini - Hochberg FDR 방법을 사용하여 다중 비교를 위해 조정된 일원 ANOVA에 의해 수행되었다.
중요한 것은 샘플 처리가 타우의 진단 유틸리티에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 예를 들어, MTBR 타우의 트립신 펩타이드 HVPG가 PostIP-CX 샘플의 전임상 단계에서 아밀로이드 음성 대상체와 아밀로이드 양성을 구별하는 반면, IP 샘플에서 중간 도메인 타우의 트립신 펩타이드 TPPS에서는 이러한 판별력이 관찰되지 않았다 (도 5). TPPS 트립신 펩타이드의 아미노산 서열은 TPPSSGEPPK (서열 번호: 10)이다. 샘플 처리는 또한 다양한 CSF 샘플 간의 MTBR 타우 양의 변화를 구별하는 능력에 상당한 영향을 미치는 것으로 나타났다. 예를 들어, 트립신 펩타이드 LQTA는 PostIP-CX 샘플에서는 증상 단계 이후 CSF 샘플에서 선형 증가를 나타내지만 IP 샘플에서는 그렇지 않은데 (도 13), 이는 PostIP-LQTA (중간 도메인-결여 MTBR tau-243)가 IP-LQTA 보다 아밀로이드 상태를 더 잘 구별함을 명확히 나타내는 것이다 (도 14).
위의 데이터는 AD 뇌 응집체에 농축된 MTBR 타우가 AD CSF에서도 증가함을 시사한다. 트립신 펩타이드 LQTA 및 HVPG는 각각 퍼지 코트의 일부이고 타우 필라멘트 응집의 시작점인 반면 IGSL은 코어 내부에 있다고 가정한다. 퍼지 코트와 같은 필라멘트 표면의 LQTA 펩타이드 위치는 항상 그것을 노출시켜 CSF로 방출될 가능성을 높인다. 응집에서 HVPG의 역할을 감안할 때 미성숙 필라멘트는 여전히 표면에서 HPVG를 노출시킬 수 있는 반면, 펩타이드는 성숙한 필라멘트의 코어에서 동원될 수 있다. 필라멘트 코어에서 IGSL의 위치는 초기 AD 단계에서도 예상될 수 있다.
기본 메커니즘에 관계없이 데이터는 CSF의 트립신 펩타이드 HVPG 및 LQTA가 각각 AD의 아밀로이드 상태 및 타우 병리를 요약하는 바이오마커로 사용될 수 있음을 시사한다. 특히, LQTA만이 타우-PET, 뿐만 아니라 아밀로이드 상태 및 인지 저하 측면에서 질환 진행에 따른 지속적인 증가를 보였으며, 이는 이 영역이 AD에서 타우 병리를 구별하는 열쇠임을 시사한다. 트립신 펩타이드 IGSL 및/또는 다른 바이오마커와 함께 이러한 펩타이드를 사용하면 대상의 질환 궤적을 결정할 때 판별력이 향상된다 (도 15-17). 또한, LQTA 및 기타 MTBR 타우 펩타이드는 다양한 타우병증을 구별하기 위한 바이오마커로 사용될 수 있다.
표 1: LOAD100 인구통계
Figure pct00011
표 2: LOAD60 인구통계
Figure pct00012
실시예 3
본 실시예에서는 알츠하이머 질환 바이오마커로서 MTBR 타우 종의 존재 및 잠재적 유용성에 대해 자세히 설명한다. 결과는 상당한 양의 중간 도메인-결여 MTBR 타우 - 즉, N-말단 및 중간 도메인 영역이 결여된 C-말단 단편을 생성하는 폴리펩타이드 서열 ("C-말단 스터브")의 중심 근처(예를 들어, tau-441의 아미노산 224 부근)에서 절단된 타우 종-가 CSF에 존재한다는 것을 보여준다. 더욱이, CSF MTBR 타우의 다른 영역들은 질환 진행의 병기를 결정하고 알츠하이머 질환 뇌 내부에서의 타우 응집과 상관관계가 있다. 이러한 발견은 뇌의 MTBR 타우와 CSF 사이의 관계에 대한 새로운 통찰력을 제공하고 알츠하이머 질환에 대한 유체 바이오마커로서 CSF 타우의 용도를 뒷받침한다.
재료 본 실시예의 실험에서는 두 개의 다른 인간 뇌 샘플 코호트 (발견 코호트 및 검증 코호트)가 사용되었다. 발견 코호트에는 알츠하이머 병리가 있는 참가자 2명과 병리가 없는 대조군 참가자 2명의 사후 냉동 뇌 조직 샘플이 포함되어 있으며, 이 샘플은 Washington University School of Medicine의 Knight ADRC Pathology Core에서 제공했다. 각 샘플은 아밀로이드 침착에 관하여 국립 노화연구소 및 알츠하이머 협회 (National Institute on Aging and Alzheimer's Association)에 따라 아밀로이드 병기 A3 (Thal 단계) 그리고 타우 응집에 관하여 Tau Braak 병기 VI, B3로 분류되었다. 각 참가자의 샘플은 소뇌, 상전두회, 전두엽, 측두엽, 후두엽, 시상, 편도체, 교뇌, 정수리 및 선조체를 포함한 6 내지 10개의 뇌 영역에서 수집되었다. 검증 코호트로서 20명의 참가자(CSF Aβ 42/40 비율 별로 아밀로이드 음성 8명 및 아밀로이드 양성 12명)로부터 얻은 두정엽의 추가 사후 동결 뇌 조직 샘플을 분석했다. 12명의 아밀로이드 양성 샘플들을 임상 치매 등급(CDR) 점수에 따라 임상 그룹으로 세분하고, 매우 경증 내지 중등도 알츠하이머 질환 (아밀로이드 양성, CDR=0.5 - 2, n=5) 또는 중증 알츠하이머 질환 (아밀로이드 양성, CDR=3, n=7)으로 분류하였다. 이러한 인간 연구는 워싱턴 대학 기관 검토 위원회(Washington University Institutional Review Board)의 승인을 받았다.
인간 CSF 샘플의 3가지 다른 코호트 -단면 코호트, 종단 코호트 및 Tau PET 코호트- 또한 본 실시예의 실험에 사용되었다 (표 3A 및 표 3B). 100명의 참가자의 CSF 샘플은 단면 코호트로서의 분석을 위해 아밀로이드 베타(Aβ) 안정 동위원소 표지 동역학(SILK) 연구(Patterson et al., 2015)에서 수집되었다. 이 코호트는 실시예 2에서 LOAD100 코호트라고도 한다. CSF 수집은 이전에 기술된 바와 같이 수행되었다 (Patterson 외, 2015). 간단히 말해서, CSF는 기준선에서 수집되었다. 다음으로, 참가자들은 10분에 걸쳐 류신 볼루스 주입을 받았다. 36시간 동안 시간 당 6mL의 CSF를 얻었다. 본 연구에서 30시간에 수집된 CSF 분취량을 타우 종의 MS 측정에 사용하였다. 아밀로이드 상태는 이전에 보고된 바와 같이 (Patterson et al., 2015) CSF Aβ 42/40 비율을 사용하여 정의되었다. 해당 컷오프 비율(0.1389)은 Pittsburgh 화합물 B(PiB) PET에 의해 결정된 아밀로이드 양성 예측의 정확도를 최대화했다. 아밀로이드 그룹은 표 3A에서 보는 바와 같이 CDR 점수에 따라 임상 그룹들로 세분되었다. 상기 단면 코호트에서 28명의 참가자(아밀로이드 양성 14명 및 아밀로이드 음성 14명)를 2 내지 9년 동안 추적관찰하여 CSF에서 타우 종의 종단 방향 궤적을 평가했다. CSF 샘플은 단면 코호트와 동일한 방식으로 수집 및 분석되었다. Tau PET 코호트에는 CSF 수집 시점으로부터 3년 이내에 타우 PET AV-1451 표준 섭취 계수율 (SUVR) 측정을 받은 35명의 참가자(20명의 아밀로이드 양성 및 15명의 아밀로이드 음성, 종단 코호트의 16명의 참가자 포함)가 포함되었다. PET 스캔은 이전에 기술된 바와 같이 수행되었으며 (Sato 외, 2018) SUVR에 대한 부분 체적 보정은 영역 확산 함수 기법을 사용하여 수행되었다 (Su 외, 2015). CSF 샘플은 그 외 다른 코호트들과 동일한 방식으로 수집 및 분석되었다.
표 3A - 단면 코호트
Figure pct00013
Figure pct00014
표 3B - 종단 및 Tau PET 코호트
Figure pct00015
Figure pct00016
MS에 의한 뇌 타우 분석: 동결된 뇌 조직 샘플을 -20°C의 저온 유지 장치를 사용하여 슬라이스하고 시험관에 수집했다. 조직(300 - 400mg)을 25mM 트리스-염산염(pH 7.4), 150mM 염화나트륨, 10mM 에틸렌디아민테트라아세트산, 10mM 에틸렌 글리콜 테트라아세트산, 포스파타제 억제제 칵테일 및 0.3 mg/μL의 뇌 조직 농도의 프로테아제 억제제를 포함하는 얼음처럼 차가운 완충액에서 초음파 처리했다. 균질액을 4°C, 11,000g에서 20분 동안 원심분리하여 정화했다. 상청액 (전체 뇌 추출물)을 새 시험관에 분취하여 넣고 사용시까지 -80 °C에서 보관하였다. 전뇌 추출물을 1% 사르코실과 함께 얼음 위에서 60분간 배양한 후, 100,000g, 4°C에서 60분간 초원심분리하여 불용성 펠렛을 얻었다. 불용성 펠릿을 200μL의 PBS로 재현탁시킨 후 초음파처리하고 이러한 불용성 현탁액을 사용시까지 -80°C에서 보관하였다.
가용성 타우 분석을 위해 전체 뇌 추출물의 타우 종을 Tau1 및 HJ8.5 항체로 면역침전시켰다. 면역침전된 가용성 타우 종은 이전에 기술된 바와 같이 (Sato 외, 2018) 처리 및 분해하였다.
불용성 타우 분석을 위해, 불용성 현탁액 (총 단백질 2.5 μg을 포함하는 10 - 20 μL)을 200 μL 용해 완충액 (7 M 우레아, 2 M 티오 우레아, 3% 3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판술포네이트, 1.5% n-옥틸 글루코시드, 100 mM 트리에틸 암모늄 바이카보네이트 (TEABC))와 혼합한 다음, 내부 표준으로서 15N Tau-441(2N4R) 균일 표지 (2 ng/μL, 프랑스 Lille University의 Guy Lippens 박사 제공)를 포함하는 용액 5 μL로 스파이킹하였다. 현탁액에 500mM 디티오트레이톨 5μL를 추가한 후 초음파 처리하였다. 생성된 용액을 15μL의 500mM 아이오도아세트아미드와 혼합하고 실온의 암실에서 30분 동안 배양하였다. 단백질분해는 이전에 보고된 바와 같은 (Roberts 외, 2020) 필터 보조 샘플 준비 방법을 사용하여 수행되었다. 간단히 말해서, 준비된 각각의 용액을 Nanosep 10K 필터 유닛(PALL)에 로딩하고 원심분리하였다. 필터 유닛의 샘플을 100mM TEABC 용액 중의 8M 요소로 세척한 후 고정된 단백질을 0.25μg의 엔도프로테이나제 Lys-C를 사용하여 37°C에서 60분 동안 필터에서 분해하였다. 그런 다음, 샘플을 37°C에서 밤새 0.4μg 트립신을 사용하여 추가로 분해하였다.
분해된 샘플(가용성 및 불용성 타우 종)을 원심분리로 수집한 다음 C18 TopTip(Glygen)으로 탈염시켰다. 이 정제 과정에서, 잔기 354-369(MTBR tau-354) 및 354-368(tau368)에 대한 AQUA 내부 표준 펩타이드 각 50 fmol을 차등 정량화를 위해 스파이킹했다. 샘플을 용리하기 전에 물 중 3% 과산화수소 및 3% 포름산 (FA)를 비드에 추가한 다음 4°C에서 밤새 배양하여 메티오닌을 함유하는 펩타이드를 산화시켰다. 용리액을 동결건조하고 물 중 2% 아세토니트릴 및 0.1% FA 27.5μL에 재현탁시킨 다음, 병렬 반응 모니터링 (PRM) 모드에서 작동하는 Orbitrap Fusion Tribrid 또는 Orbitrap Tribrid Eclipse 질량 분석기(Thermo Scientific)에 연결된 nanoAcquity UPLC 시스템(Waters)에서 MS 분석하였다.
가용성 및 불용성 타우 종에서 유래한 16개의 뇌 타우 펩타이드를 15N 또는 AQUA 내부 표준의 상응하는 동위원소 이성질체 신호와 비교하여 정량하였다(표 4). 중간 도메인 타우 펩타이드 (잔기 181-190)에 의해 각 펩타이드 양을 정규화함으로써 뇌 샘플 전반에 걸쳐 펩타이드-프로파일 비교를 수행하였다.
표 4
Figure pct00017
Figure pct00018
MS에 의한 CSF 타우 분석 : CSF (455 μL)를 내부 표준으로서 15N Tau-441(2N4R) 균일 표지 (100 pg/μL)를 포함하는 용액 10 μL와 혼합하였다. 주로 N-말단 내지 중간 도메인 영역으로 구성된 타우 종들은 Tau1 및 HJ8.5 항체로 면역침전되었다. 면역침전된 타우 종을 이전에 기술된 바와 같이 (Sato 외, 2018) 처리 및 분해하였다. 그 후, 20μL의 15N-타우 내부 표준(100pg/μL)을 면역침전 후 CSF에 스파이킹하였다. 이어서, 타우를 약간 변형하여 이전에 기술된 바와 같이 (Barth
Figure pct00019
lemy 외, 2016b) 화학적으로 추출하였다. 매우 풍부한 CSF 단백질은 25 μL의 과염소산을 사용하여 침전되었다. 혼합 및 얼음 위에서 15분간 배양한 후, 혼합물을 4°C에서 20,000g으로 15분간 원심분리하고 상층액을 다음 단계에 따라 Oasis HLB 96-well μElution Plate(Waters)를 사용하여 추가로 정제했다. 플레이트를 300 μL의 메탄올로 한 번 세척하고 물 중의 0.1% FA 500 μL로 한 번 평형화하였다. 상청액을 Oasis HLB 96웰 μElution 플레이트에 추가하고 고체상에 흡착시켰다. 그 다음, 고체상을 물 중의 0.1 % FA 500 μL로 한 번 세척하였다. 용리 완충액(100μL; 물 중 35% 아세토니트릴 및 0.1% FA)을 추가하고, 용리액을 Speed-vac으로 건조시켰다. 건조된 샘플을 50mM TEABC 중의 트립신 용액(10ng/μL) 50μL로 용해시키고 37°C에서 20시간 동안 배양하였다.
면역침전된 샘플 및 화학적으로 추출된 샘플 모두에 대한 배양 후, 각 트립신 분해물은 C18 TopTip에서 고체상 추출에 의해 정제되었다. 이 정제 과정에서, 잔기 354-369(MTBR tau-354) 및 354-368(tau368)에 대한 AQUA 내부 표준 펩타이드 각 5fmol을 차등 정량화를 위해 스파이킹했다. 샘플을 용리하기 전에 물 중 3% 과산화수소 및 3% FA를 비드에 추가한 다음 4°C에서 밤새 배양하여 메티오닌을 함유하는 펩타이드를 산화시켰다. 용리액을 동결건조하고 물 중 2% 아세토니트릴 및 0.1% FA 27.5μL에 재현탁시킨 다음, PRM 모드에서 작동하는 Orbitrap Fusion Lumos Tribrid 또는 Orbitrap Tribrid Eclipse 질량 분석기(Thermo Scientific)에 연결된 nanoAcquity UPLC 시스템에서 MS 분석하였다. 19개의 CSF 타우 펩타이드를 정량화하였다 (표 4). CSF 타우 분석의 개략적인 절차는 도 2A에 설명되어 있다.
통계적 분석 : 바이오마커 값의 차이는 달리 명시되지 않는 한 일원 ANOVA로 평가되었다. 양측 p<0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었으며 FDR이 5%로 설정된 Benjamini-Hochberg 거짓 발견율 (FDR) 방법을 사용하여 다중 비교에 대해 수정되었다 (Benjamini and Hochberg, 1995). Spearman 상관 관계를 사용하여 타우 바이오마커와 인지 테스트 측정 및 타우 PET SUVR 간의 연관성을 평가하였다.
결과 - 알츠하이머 질환 뇌에 존재하는 타우 종의 농축 프로파일링: 알츠하이머 질환 뇌의 타우 응집이 CSF의 타우 프로파일에 나타날 것이라는 가설을 세웠다. 따라서, 나중에 CSF 타우 프로파일과 비교하기 위해 알츠하이머 질환 및 대조군 뇌의 불용성 추출물의 타우 프로파일을 먼저 분석하였다(도 18B: 발견 코호트). 각각 R2와 R3 도메인 사이 및 R4 도메인 내에 위치한 잔기 299-317(MTBR tau-299) 및 354-369(MTBR tau-354)를 함유하는 종들은 알츠하이머 질환 뇌의 불용성 추출물에서 대조군에 비해 3-4배 더 많이 농축되어 있었던 것으로 결정되었다. 잔기 243-254(MTBR tau-243)를 함유하는 MTBR의 상류 영역은 또한 대조군에 비해 알츠하이머 질환 뇌에서 약 3배 더 큰 반면, 각각 R1 및 R2 도메인 내에 위치한 잔기 260-267 및 275-280을 포함하는 종들은 알츠하이머 질환과 대조군 조직 간에 차이가 없었다. 알츠하이머 질환 뇌에서 타우의 다른 영역들은 대조군에 비해 농축되어 있지 않았다. 특히, 중간 도메인 내에 잔기 195-209를 포함하는 종은 대조군에 비해 알츠하이머 질환 뇌에서 특히 더 낮았는데, 이는 불용성 타우 응집체의 잔기 199, 202, 205 및 208에서 발생하는 광범위한 과인산화의 결과일 가능성이 있다 (Malia 외, 2016). 참고로, 가용성 타우(전체 뇌 추출물)에서 확인된 MTBR 타우 종들에 대해서는 대조군과 알츠하이머 질환 사이에 어떠한 변화도 관찰되지 않았다 (도 23A). 이러한 결과는 대조군 (아밀로이드 음성, n=8), 매우 경증 내지 중등도 알츠하이머 질환 (아밀로이드 양성, CDR=0.5 - 2, n=5) 및 중증 알츠하이머 질환 (아밀로이드 양성, CDR=3, n=7) 참가자들의 뇌 샘플에서 재현되었으며 (도 18C 및 도 23B: 검증 코호트), 이는 MTBR tau-243, 299, 및 354 종들이 질환 진행 단계들 전반에 걸쳐 불용성 타우 응집체에 특이적으로 농축되어 있었음을 시사했다.
다음으로, 최근에 보고된 아스파라긴 엔도펩티다제 (Zhang et al., 2014; Blennow et al., 2020)에 의해 생성된 절단된 tau368(잔기 354-368) 종을 이와 쌍을 이루는 절단되지 않은 종인 MTBR tau-354와 대비하여 조사하고 뇌 불용성 추출물에서 이 두 가지 종 모두를 정량하였다 (도 24). tau368과 MTBR tau-354 사이의 높은 상관관계가 발견되었으며 (r=0.9783), 이는 상이한 뇌 병리 단계들에서 잔기 368에서의 절단이 동일한 비율로 발생함을 시사한다.
결과 - CSF에서 MTBR 타우의 정량화 : 알츠하이머 질환 뇌 응집체에서 MTBR 타우의 농축이 CSF의 가용성 타우 종의 수준과 관련이 있는지 여부를 결정하기 위해 CSF에서 MTBR 타우를 분석하는 방법이 개발되었다. 이 방법은 면역침전 후 (Tau1/HJ8.5) CSF에서의 타우 화학 추출을 이용한 다음, MS 분석한다 (도 2A). 이 방법은 MTBR 펩타이드를 정량하기에 충분한 회수율을 제공했다 (도 25). 화학적 추출 전 Tau1/HJ8.5 면역침전법에 의해 회수된 타우 펩타이드 풍부도는 잔기 222 이후에 극적으로 감소하였다 (Sato 외, 2018). 대조적으로, PostIP-CX법으로 정량된 MTBR 타우 종의 농도는 N-말단 내지 중간 도메인 영역에 비해 상대적으로 낮았지만 면역침전법에 의한 다른 타우 영역들과 여전히 비슷했다 (도 19). 정상 대조군 참가자의 CSF 농도(면역 침전 및 화학적 추출 방법의 합계 값으로 계산) 범위는 중간 도메인 종들 (잔기 151-155, 181-190, 195-209, 및 212-221)의 경우 8.2 - 32.0 ng/mL, MTBR 타우 종들 (잔기 243-254, 260-267, 275-280, 282-290, 299-317, 및 354-369)의 경우 0.4 - 3.7 ng/mL, 및 비-MTBR C-말단 타우 종들 (잔기 386-395 및 396-406)의 경우 6.5 - 5.1 ng/mL였다. C-말단을 포함하는 절단된 타우 종들의 CSF 농도 범위는 중간 도메인 (잔기 195-209 및 212-221)을 포함하는 경우와 유사한 범위에 있었으며, 이는 타우의 C-말단 쪽 또한 신경 세포에서 절단되어 N-말단 내지 중간 도메인 타우와 동일한 방식으로 세포외 분비됨을 시사한다 (Sato 외, 2018).
결과 - 알츠하이머 질환 단면 코호트에서 CSF MTBR 타우: 세포외 공간에 존재하는 MTBR 함유 종이 알츠하이머 질환 관련 변화를 반영하는지 결정하기 위해 다음과 같은 다양한 임상 단계의 아밀로이드 음성 및 아밀로이드 양성 참가자들로부터 얻은 단면 코호트에서 CSF를 분석했다: 아밀로이드 음성 CDR=0 (대조군, n=30), 아밀로이드 양성 CDR=0 (전임상 AD, n=18), 아밀로이드 양성 CDR=0.5 (매우 경증 AD, n=28), 아밀로이드 양성 CDR≥1 (경증-중등도 AD, n=12), 및 아밀로이드 음성 CDR≥0.5 (비AD 인지 장애, n=12).
먼저, 알츠하이머 질환 뇌에 특이적으로 농축되어 있는 3가지 MTBR 타우 종들 (MTBR tau-243, MTBR tau-299 및 MTBR tau-354)의 CSF 수준을 조사했다 (도 20). 3가지 종들 모두 알츠하이머 질환 및 대조군 CSF 모두에 존재하였으며 그 수준은 대조군과 비교시 무증상 단계 (CDR=0)에서도 아밀로이드 양성 그룹에서 더 높았다 (MTBR tau-243 p=0.0170, MTBR tau-299 p=0.0002, 및 MTBR tau-354 p=0.0076). 놀랍게도, 이 종들은 임상 질환 발병 후 CSF에서 뚜렷한 특징을 보였다. MTBR tau-299 수준은 대조군에 비해 전임상 AD에서 204% 더 높았지만 매우 경증 AD (CDR=0.5)과 경증-중등도 AD (CDR≥1) 사이에서 포화되었던 반면 (p=0.2541), MTBR tau-354 수준은 증상 발병 후 수집된 샘플에서 유의하게 더 낮았다 (p=0.0345). 대조적으로, MTBR tau-243 수준은 증상 발병 후를 포함한 모든 질환 단계에서 점진적으로 더 높았다 (p=0.0025). 이러한 결과는 MTBR 타우 종 내에서 조차도 영역 특이도가 상이한 알츠하이머 질환 단계들을 구별할 수 있으며 MTBR tau-243이 우수한 알츠하이머 질환 단계 특이적 마커임을 시사한다.
다음으로 조사한 것은 CSF MTBR 타우 종이 그 외 영역들을 포함하는 타우 종과 비교할 때 알츠하이머 질환의 병기 결정에 향상된 민감도와 특이도를 제공하는지 여부였다. N-말단, 중간 도메인, MTBR 및 C-말단 도메인을 포함하는 여러 종들을 영역별 방법으로 정량화했다 (도 26, 도 27, 도 28). N-말단 및 중간 도메인 종은 면역침전법 (IP법) 및 면역침전 후 CSF에 대한 화학적 추출법 (PostIP-CX법)에 의해 정량된 반면, MTBR 내지 C-말단 종들은 면역침전 후 CSF에 대한 화학 추출법 (PostIP-CX법)에 의해서만 정량화되었는데, 이는 면역침전에 의해 정량화 가능한 신호를 얻을 수 없었기 때문이다. 면역침전법에 의해 정량된 N-말단 도메인을 포함하는 종들의 수준은 대조군과 무증상 단계(잔기 6-23 제외, p=0.0362) 또는 기타 인접 질환 단계 간에 차이가 없었다. 면역침전법에 의한 중간 도메인 종들의 수준은 대조군에서보다 무증상 아밀로이드 단계에서 유의하게 더 높았지만 (잔기 212-221 제외, p=0.0762) 효과 크기는 MTBR 타우 종에 비해 비교적 보통이었으며 (123% - 168% vs. 대조군) (예를 들어, MTBR tau-299 수준은 대조군보다 전임상 AD 단계에서 >200% 더 컸다) 이후의 질환 단계들 전반에 걸쳐 차이가 없었다. 추출 방법에 관계없이 MTBR tau-243, 299 및 354 종은 N-말단 내지 중간 도메인 종들 (잔기 6-23 내지 226-230, 도 28)과 비교하여 대조군과 질환 단계들 사이에 더 큰 차이를 보였다. MTBR 내지 C-말단 도메인들을 포함하는 다른 종들 (잔기 260-267, 275-280, 282-290, 386-395, 및 396-406)의 프로파일은 중간 도메인 종들과 유사하였으며 알츠하이머 질환 임상 치매의 단계에 특이적이지 않았다.
요약하면, 알츠하이머 질환 뇌에 농축되어 있는 MTBR을 포함하는 3가지 대표적인 종들 (MTBR tau-243, MTBR tau-299, 및 MTBR tau-354)은 (도 18) CSF에서 유사한 특성을 가졌으며, MTBR tau-243이 알츠하이머 질환 치매 단계에 대해 가장 큰 특이도를 나타내었다. 참고로, CSF에서 tau368 절단된 형태와 MTBR tau-354 비절단된 형태 사이에 높은 상관관계가 관찰되었다 (r=0.8382) (도 29). 알츠하이머 병의 임상 단계를 확실하게 구별할 수 있는 유일한 종은 MTBR tau-243이었다.
결과 - 알츠하이머 질환의 병기를 결정하는 특이적 바이오마커로서의 중간 도메인-결여 MTBR tau-243: 알츠하이머 질환 임상 치매 단계 전반에 걸쳐 점진적으로 더 높은 MTBR tau-243 종 수준은 이것이 질환 진행의 신뢰할 수 있는 예측인자가 될 수 있음을 시사한다. 다음으로 어떤 MTBR 타우 종 (MTBR tau-243, MTBR tau-299, 및 MTBR tau-354)이 CDR-박스 총점 (CDR-SB) 및 간이 정신 상태 검사 (MMSE)와 같은 인지 테스트 결과와 가장 높은 상관관계를 가지는지를 조사하였다. 아밀로이드 양성 그룹의 중간 도메인-결여 MTBR tau-243 종들이 CDR-SB 및 MMSE 모두와 높은 상관관계가 있는 것으로 밝혀졌다 (각각 r=0.5562, p<0.0001 및 r=-0.5433, p<0.0001) (도 30 및 도 31). 다른 종들의 수준은 인지 테스트와의 상관관계가 훨씬 더 낮거나 유의하지 않았으며 (표 5), 이는 CSF MTBR tau-243이 알츠하이머 질환의 임상 단계 그리고 무증상 단계 내지 진행 중인 임상 단계에 전반에 걸쳐 전반적인 질환 진행을 특이적으로 구별함을 시사한다.
표 5: 각 CSF 타우 종과 인지 측정 간의 상관관계: 중간 도메인-결여 MTBR tau-243(PostIP-CX법)은 다른 타우 종보다 인지 측정과 더 우수한 상관 관계를 나타낸다
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결과 - 알츠하이머 질환 종단 코호트의 CSF MTBR 타우: 단면 코호트에서 참가자의 하위 집합(n=28)을 2~9년 동안 추적관찰하여 CSF에서 MTBR 타우의 종단 궤적을 측정했다 (표 6). 알츠하이머 질환 뇌에 풍부한 MTBR 타우 종(MTBR tau-243, MTBR tau-299 및 MTBR tau-354)은 아밀로이드 양성 그룹에서 시간이 지남에 따라 유의하게 증가했으나 (1차와 2차 방문 사이의 양측 대응표본 t-검정으로 p<0.01) 아밀로이드 음성 그룹의 경우 MTBR tau-243을 제외하고 그렇지 않았다 (도 32). 아밀로이드 음성 그룹은 또한 MTBR tau-243의 약간의 종단 증가를 나타내었지만 아밀로이드 양성 그룹에서 관찰된 것보다 낮다 (아밀로이드 음성 및 양성 그룹 각각에서 차이 평균 = 0.4926 및 2.208).
도 21은 개별 참가자의 MTBR 타우 종 농도의 종단 변화율을 보여준다. 특히, 질환 발병 후 CDR이 가장 높은 한 참가자(참가자 A)(7년 만에 CDR=1에서 2로 변경)는 각 MTBR 타우 종에 대하여 특이적 궤적 프로파일을 보여주었다. MTBR tau-243은 경증 AD (CDR=1)로부터 중등도 AD (CDR=2)까지도 지속적으로 증가하였던 반면, MTBR tau-299 및 MTBR tau-354는 경증 AD 후 이 참가자의 CSF에서 감소를 보였다. 아밀로이드 양성 그룹의 다른 참가자들은 1차 방문시 전임상 AD 또는 매우 경증 AD (각각 CDR=0 또는 0.5)로 분류되었으며, 각 종 수준의 증가 추세는 대부분의 참가자에서 나타났으며 이는 단면 코호트의 결과를 뒷받침한다.
표 6
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Figure pct00023
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[00175] 결과 - 타우 PET 영상화와의 상관관계: 타우 PET 스캔으로 측정한 타우 병리학은 인지 저하 및 알츠하이머 질환의 임상 단계와 강한 상관관계가 있다 (Arriagada 외, 1992; Johnson 외, 2016; Ossenkoppele 외, 2016; Bejanin 외, 2017; Jack 외, 2018; Gordon 외, 2019). 다음으로 CSF의 MTBR 타우가 타우 PET에 의해 측정된 뇌 타우 병리와 상관관계가 있는지 여부를 조사하였다 (도 22). 중간 도메인-결여 MTBR tau-243은 tau PET SUVR과 유의한 상관관계가 있었으나 (r=0.7588, p<0.0001), MTBR tau-299와 MTBR tau-354는 상관관계가 훨씬 낮았다 (각각 r=0.4584, p=0.0056 및 r=0.4375, p=0.0086). 잔기 226-230을 포함하는 타우 종들 또한 타우 PET SUVR과 높은 상관관계를 보였으나 (r=0.6248, p<0.0001, 표 7), MTBR tau-243에서 관찰된 것보다는 낮았다. 이것은 CSF MTBR tau-243 및 주변 영역이 뇌에서 타우 응집의 대리 바이오마커일 수 있음을 시사한다. 뇌의 타우 병리를 구체적이고 정량적으로 추적하는 능력은 알츠하이머 질환 임상 연구에 매우 필요한 바이오마커이다.
표 7: 각 CSF 타우 종과 tau PET SUVR 간의 상관관계: 중간 도메인-결여 MTBR tau-243은 다른 타우 종보다 타우 병리와 더 우수한 상관관계를 나타낸다.
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논의 : 타우의 MTBR 영역은 주로 뇌 응집체에서 조사되었지만 CSF에서는 광범위하게 조사되지 않았다. 본 연구에서 CSF 타우를 분석하기 위해 민감하고 항체 독립적인 방법을 사용하여 인간 참가자의 CSF 샘플에서 타우의 MTBR 영역들의 존재 및 정량화를 나타내었다. 항체 의존성 분석법 (Meredith 외, 2013; Sato 외, 2018)을 활용한 과거 연구는 항체 특이성 또는 민감도를 포함한 분석 제한, 또는 CSF에서 MTBR 종들에 의해 채택된 가능한 입체구조를 회복하는 능력으로 인해 CSF 내 MTBR-포함 타우 종들을 검출하지 못했을 수 있다. 대안적으로, MTBR 타우는 다양한 프로테아제에 의해 절단되어 기존 면역분석 또는 면역침전 후 MS 분석에서 검출되지 않는 단편을 생성할 수 있다 (Gamblin 외, 2003; Cotman 외, 2005; Zhang 외, 2014; Zhao 외, 2016; Chen 외, 2018; Quinn 외, 2018). 본 연구에서, PostIP-CX법 이후 질량 분석법을 사용함으로써, 중간 도메인 타우 종들과 비교하여 MTBR 타우 종의 매우 놀라운 강력한 농도가 약 1% 내지 10%로 측정되었다 (도 19 및 도 2A).
현재까지 MTBR 타우가 세포외 타우 전파에 관여할 수 있는지 여부는 불분명한데, 이는 세포외 수준들이 너무 낮아 해당 병리를 씨딩하여 확산시킬 수 없다고 생각되었기 때문이다. CSF 내 MTBR의 화학량론에 대한 이러한 새로운 발견은 MTBR 함유 종이 병리학적 종으로서 세포외로 확산될 수 있다는 가설을 뒷받침한다. 이러한 측정은 또한 알츠하이머 질환에 대해 개발 중인 항-타우 약물의 잠재적인 표적에 정보를 제공하고, 알츠하이머 질환 환자의 CSF에서 MTBR 타우 종의 2~3배 증가로 나타난 바와 같이 표적의 정량적 측정을 제공한다. 그러나 한계는 병리학적 종들이 CSF가 아닌 간질액(ISF)에 존재할 수 있다는 것이다 (Colin 외, 2020). 일부 보고서에 따르면 CSF 타우가 주로 ISF에서 유래하고(Reiber, 2001) 알츠하이머 질환 환자의 인간 CSF가 형질전환 마우스 모델에서 타우 씨딩을 유도할 수 있다고 밝혀졌으나 (Skachokova 외, 2019), CSF에서 검출된 타우 종들이 인간 뇌에서 전파될 수 있는 병리학적 타우를 반영하는지 여부를 설명하기 위한 추가 연구가 필요하다.
이전 연구들은 알츠하이머 질환 뇌 타우 접종이 마우스 뇌에서 응집되면 심각한 타우 병리를 유도하였음을 보여주지만 (Guo 외, 2016; Narasimhan 외, 2017); 인간의 질환 진행과 관련이 있는, 세포외 공간 내의 병리학적 타우 종을 확인하는 보고는 없었다. 이를 통해 CSF MTBR 타우 종이 알츠하이머 질환에서 변화하는지 여부를 테스트하고 새로운 알츠하이머 질환 바이오마커로서의 적합성을 탐색했다. CSF MTBR 타우 수준은 알츠하이머 질환에서 증가하고 알츠하이머 질환 뇌 불용성 분획에 농축된 종들과 일치하는 것으로 밝혀졌다. CSF MTBR 타우가 알츠하이머 질환 임상 단계 및 타우 병리와 상관관계가 있다는 발견은 MTBR 타우가 알츠하이머 질환에서 타우 전파 기전과 관련이 있음을 시사하지만, 세포외 CSF MTBR 타우의 특성 (즉, 모노머, 올리고머, 또는 원섬유 종) 및 기원은 아직 알려져 있지 않다. CSF MTBR 타우는 뇌 응집체 또는 모노머 종을 활발하게 분비하는 뉴런에서 유래할 수 있으며, 이 문제를 해결하기 위한 향후 연구를 고안해야 한다.
흥미롭게도, CSF MTBR 타우 종의 변화 궤적은 MTBR의 다른 영역들 전반에 걸쳐 그리고 알츠하이머 병의 각 임상 단계에서 구별되는 것으로 밝혀졌다. 우리는 이러한 결과가 최근 Cryo-EM 발견에 의해 결정된 바와 같이 타우의 구조적 변화로 인한 것이라 가정한다. Cryo-EM 분석은 타우 응집체의 정렬된
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-쉬트 코어가 잔기 306에서 시작함을 시사한다 (Fitzpatrick 외, 2017). 그러므로, MTBR tau-354 (잔기 354-369 포함), MTBR tau-299 (잔기 299-317 포함) 및 MTBR tau-243 (잔기 243-254 포함)은 각각 필라멘트 코어의 내부 측면, 경계 및 외부 측면을 나타낸다. MTBR 타우-354 및 MTBR 타우-299 모두와 대조적으로, MTBR 타우-243 수준은 모든 질환 단계에 걸쳐 점진적으로 더 컸다. CSF 내 MTBR tau-243 및 인근 영역 (즉, 잔기 226-230)의 수준 또한 tau PET SUVR 거동과 높은 상관관계가 있으며 (도 22 및 표 7), 이는 MTBR tau-243 및 잠재적으로 인근 영역이 뇌 타우 응집체에 침착되고 세포외로도 분비된다는 가설을 뒷받침한다 (도 17).
MTBR 타우가 알츠하이머 질환 병리 및 임상 진행 단계와 높은 상관관계가 있다는 발견은 타우병증을 치료하기 위한 치료적 항타우 약물의 유망한 표적에 대한 중요한 통찰력을 제공한다. 예를 들어, MTBR의 상류 영역 (잔기 235-250)의 에피토프를 인식하는 새로운 타우 항체는 세포 기반 분석에서 알츠하이머 질환 및 진행성 핵상 마비 뇌로부터의 타우 씨딩을 완화하는 중요하고 선택적인 능력을 보여주었다 (Courade 외, 2018). 이러한 발견은 MTBR의 상류 영역이 세포외, 병리학적 타우와 관련될 수 있음을 시사한다. 이것은 인간 알츠하이머 질환 뇌 추출물을 주사한 형질전환 쥐의 말단 뇌 영역으로의 타우 병리의 전파를 완화시킨 항체에 의해 뒷받침된다 (Albert 외, 2019). MTBR의 상류 영역(잔기 249-258)의 에피토프를 인식하는 또 다른 새로운 타우 항체는 인간 알츠하이머 질환 뇌 추출물을 씨딩한 세포- 및 생체내 형질전환 마우스 모델에서 타우 병리 유도를 감소시킴을 보여주었다 (Vandermeeren 외, 2018). MTBR tau-299 및 MTBR tau-354 종을 표적으로 하는 항체는 또한 P301L 타우 또는 알츠하이머 질환 뇌 추출물의 씨딩에 의해 유도된 타우 병리를 완화시켰으며 (Weisov
Figure pct00028
외, 2019; Roberts 외, 2020), 이는 MTBR의 특정 영역을 포함하는 종들이 타우병증에서 타우 병리를 확산시키는 원인이 된다는 가설을 뒷받침한다.
요약하면, CSF의 MTBR 타우 종은 C-말단 단편으로 존재하고 알츠하이머 질환에서 특이적으로 증가함이 발견되었으며, 이는 알츠하이머 질환 뇌 응집체에서 나타나는 농축을 반영하는 것이다. 이러한 연구 결과는 특정 MTBR-함유 종들 (MTBR tau-299 및 MTBR tau-243)이 알츠하이머 질환에서 아밀로이드 및 타우 병리를 측정하는 유망한 CSF 바이오마커임을 시사한다. 특히, 중간 도메인-결여 MTBR tau-243은 알츠하이머 질환에서의 질환 진행 및 타우 병리와 유사하였으며 타우 병리의 바이오마커 및 새로운 항타우 항체 요법의 표적으로 활용될 수 있다.
실시예 4
"PostIP-IP"라고 하는 또 다른 샘플 처리 방법을 개발하였으며 실시예 1 및 2에 설명된 PostIP-CX법과 비교하였다. PostIP-IP법의 예시적인 작업 흐름을 도 33에 제공한다.
실시예 2에 기재된 LOAD100 코호트로부터 얻은 CSF 샘플을 PostIP-CX법(실시예 1) 또는 PostIP-IP법(본 실시예)에 의해 처리한 다음, 실시예 2에 일반적으로 기재된 바와 같이 LC-MS에 의해 분석하였다.
도 34A에서 보는 바와 같이, 트립신 펩타이드 LQTA는 2개의 샘플 사이에서 상이한 프로파일을 나타내었다. 예를 들어, 임상 발병 후에도, PostIP-CX법으로 처리한 샘플들에서 측정한 LQTA 양의 지속적인 증가는 PostIP-IP법으로 처리한 샘플들에서는 관찰되지 않았다. 대조적으로, 트립신 펩타이드 HVPG 및 IGSL은 PostIP-CX 및 PostIP-IP법으로 처리된 샘플들 간에 유사한 프로파일을 보여준다 (도 34B 및 도 34C). 또 다른 트립신 펩타이드에 관한 추가 분석은 LQTA와 IGST 펩타이드 사이의 아미노산 서열 내 R1에서 중요한 절단 이벤트가 발생할 수 있음을 시사한다 (도 35A).
LQTA의 하류 (즉, C-말단)에 있는 모든 트립신 펩타이드의 풍부도는 샘플 처리 방법들 간 우수한 상관관계를 보였으나 (R2 값에 기초, 도 35 참조), 트립신 펩타이드 HVPG와 IGSL 사이에 R2 값이 현저한 감소가 있었다. 이를 추가로 연구하기 위해 샘플을 CDR 점수별로 - 보다 구체적으로, 인지 장애가 있는 대상체 (CI, CDR>0.5) 및 인지 장애가 없는 대상체 (CDR<0.5)- 그룹화하였다. 도 36B에서 보는 바와 같이, HVPG 및 IGSL 트립신 펩타이드의 경우, 인지 장애가 있는 대상체만이 PostIP-CX vs. PostIP-IP법에 의해 처리된 샘플 사이에 낮은 상관관계를 나타내었다. 이는 HVPG 및 IGSL 트립신 펩타이드를 포함하는 타우 영역들을 응집체 내부로 동원시켜 CSF 및 기타 생물학적 유체에서 이들 펩타이드를 포함하는 타우 종들의 양을 변화시키는, 뇌에서의 타우-응집 발생을 반영할 수 있다.
종합하면, 이들 데이터는 샘플 처리 방법의 선택이 CSF 및 기타 생물학적 유체에서, CNS에서의 타우 병리를 요약하는 MTBR 타우 종들을 검출하는 능력에 영향을 미친다는 것을 나타낸다.
실시예 5
본 실시예에서, 대상체의 3개 임상 코호트들의 CSF 샘플을 IP법(실시예 1) 및 PostIP-IP법(실시예 4)에 의해 처리하고 실시예 3에 일반적으로 기재된 질량 분석법으로 평가하였다. 샘플은 대조군 대상체 (n=93), AD가 있는 아밀로이드 양성 대상체 (n=41), 비AD 타우병증 대상체 (n=87)에서 얻었다. 비AD 타우병증 대상체는 임상적으로 CBD 또는 CBD/PSP (n=20), FTD (n=29), FTLD (R406W n=7, P301L n=3), PSP (n=18), 및 미정의된 비AD 치매 (n=3)로 진단받았다. 3R 및 4R 아이소폼에 특이적인 트립신 펩타이드가 특히 관심 대상이었다. Ovod 외, Alzheimers Dement J. Alzheimers Assoc, 2017, 13:841-849에 일반적으로 기재된 질량 분석법으로 CSF Aβ42/40을 측정하였다. 아밀로이드 상태는 0.085의 컷오프 값을 사용하여 정의되었다 (즉, 아밀로이드 양성 > 0.085, 아밀로이드 음성 < 0.085). pT217%는 이전에 기술된 질량 분석법으로 측정되었다.
도 37에서 보는 바와 같이, 샘플에서 트립신 펩타이드 VQIV/LDLS 비율은 PostIP-IP법으로 처리된 샘플들에서 비AD 타우병증을 대조군과 구별하지만 (도 37C) IP법 처리시에는 그렇지 않다 (도 37B). PostIP-IP법으로 처리된 샘플에 대한 추가 분석은 대조군 대상체에 비해 비AD 타우병증 대상체의 CSF에서 LDLS의 풍부도가 더 낮음을 나타낸다 (도 38).
비AD 타우병증 대상체로부터 얻은 PostIP-IP 처리된 샘플에서 VQIV/LDLS 비율의 증가가 측정되었으나, AD가 있는 대상체 또는 대조군 대상체로부터 얻은 샘플에서는 그렇지 않았다 (도 39). PostIP-IP 샘플 처리 후 또 다른 트립신 펩타이드들을 분석한 결과, AD 대상체 또는 대조군 대상체와 비교하여 비AD 타우병증 대상체에서 R1-R2 트립신 펩타이드들 (예를 들어, IGST, VQII, LDLS, 등)과 이후 R2-R3 트립신 펩타이드들 (예를 들어, HVPG, 등) 간의 낮은 상관관계가 확인되었다 (도 40, 표 8). 비 AD 타우병증과 비교하여 PSP, CBD 및 FTD가 있는 특정 대상체들은 이상치였다 (도 41). HPVG를 제외하고 트립신 펩타이드 IGSL과 비교시 유사한 결과를 얻었다 (도 42).
종합하면, 이들 데이터는 PostIP-IP 샘플 처리 후에 측정된 CSF 타우 프로파일이 뇌 타우 응집 상태를 반영할 수 있음을 시사한다. 예를 들어, 4R-타우병증은 VQII 트립신 펩타이드를 포함하는 뇌 불용성 타우 농축 R2 영역을 포함하고, 4R-타우병증 대상체의 일부 CSF 샘플은 트립신 펩타이드 IGST, VQII 및 LDLS의 양이 HVPG 또는 IGSL에 비해 감소되었음을 보여주었다. 이는 AD 대상체에서는 관찰되지 않았다. 이러한 데이터를 고려할 때 4R-타우병증을 구별하는 방법은 MTBR 타우의 R2 영역을 농축하는 데 중점을 두어야 한다.
표 8
Figure pct00029
실시예 6
본 실시예에서, 비AD 타우병증을 포함하는 대상체의 단일 임상 코호트로부터 얻은 CSF 및 뇌 샘플에 대한 추가 분석은 비AD 타우병증 대상체로부터 얻은 CSF 샘플을 AD 대상체로부터 얻은 CSF 샘플과 구별하기 위한 중간 도메인-결여 MTBR 타우의 유용성에 관한 추가 증거를 제공하였다. 이 코호트의 대상체에는 AD 대상체(n=28), 임상적으로 CBD 또는 CBD/PSP를 진단받은 대상체(n=20), 임상적으로 FTD를 진단받은 대상체(n=22) 및 임상적으로 PSP를 진단받은 대상체(n=11)가 포함되었다. 이들 대상체로부터 수득된 CSF 샘플을 실시예 4에 일반적으로 기재된 PostIP-IP법으로 처리하고 실시예 3에 일반적으로 기재된 질량 분석법으로 평가하였다. 뇌 불용성 타우를 실시예 3에 기재된 바와 같이 평가하였다.
실시예 5에서 언급한 바와 같이, CSF의 PostIP-IP 샘플 처리 후 트립신 펩타이드 분석 결과 비AD 타우병증 대상체에서 R1 및 초기 R2 트립신 펩타이드 (예를 들어, IGST, VQII, LDLS, 등) 및 후기 R2, R3 및/또는 R4 트립신 펩타이드 (예를 들어, IGSL, 등) 사이의 낮은 상관관계가 확인되었다 (도 43, 도 44, 및 도 45). CSF에서 비 AD 타우병증의 타우 종들은 AD의 타우 종들 보다 (1) 더 적은 R1 및 R2 및 (2) 더 많은 R3 및 R4를 포함하며, 이는 뇌 타우 침착을 반영하는 것이라는 가설을 세웠다 (도 46). 이 가설을 테스트하기 위해 뇌 불용성 타우를 분석했다. 도 47에서 보는 바와 같이, 트립신 펩타이드 VQII는 4R-타우병증의 뇌 타우 응집체에 농축되어 있다. 트립신 펩타이드 HVPG 및 IGSL도 뇌 타우 응집체에 농축되어 있으나 AD에 비해 적다. 이들 데이터는 비AD 타우병증을 AD와 구별하는 방법으로서 R3 또는 R4에 대한 R1 또는 R2의 비율 사용을 추가로 뒷받침한다.
이후 분석을 유전적으로 확인된 FTLD 사례에서 얻은 CSF 샘플 (R406W, n=7; P301L, n=3), 대조군 대상체에서 얻은 CSF 샘플 (n=44), 및 AD 대상체의 또 다른 CSF 샘플 (n=41)을 포함하는 것으로 확장시켰다. 이들 대상체로부터 수득된 CSF 샘플을 실시예 4에 일반적으로 기재된 PostIP-IP법으로 처리하고 실시예 3에 일반적으로 기재된 질량 분석법으로 평가하였다. CSF의 PostIP-IP 샘플 처리 후 트립신 펩타이드 분석 결과 비AD 타우병증 대상체에서 R1 및 초기 R2 트립신 펩타이드 (예를 들어, IGST, VQII, LDLS, 등) 및 후기 R2, R3 및/또는 R4 트립신 펩타이드 (예를 들어, IGSL, 등) 사이의 낮은 상관관계가 다시 한 번 확인되었다 (도 48 및 도 49). 이들 데이터에 의해 비AD 타우병증을 AD와 구별하는 방법으로서 R3 또는 R4에 대한 R1 또는 R2의 양의 비율 사용이 검증되었으며 또한 대조군 대상체와 비AD 타우병증을 구별하는 능력이 입증되었다. 특히, 유전적으로 확인된 FTLD 사례에서 얻은 CSF 샘플을 사용하면 이러한 분석은 더욱 엄격해진다.
SEQUENCE LISTING <110> Washington University BATEMAN, Randall BARTHELEMY, Nicolas HORIE, Kanta SATO, Chihiro <120> METHODS TO DETECT MTBR TAU ISOFORMS AND USE THEREOF <130> 047563-665135 <150> 62/886,165 <151> 2019-08-13 <150> 62/970,950 <151> 2020-02-06 <150> 63/044,836 <151> 2020-06-26 <160> 21 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 441 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly 1 5 10 15 Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His 20 25 30 Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu 35 40 45 Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser 50 55 60 Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val 65 70 75 80 Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala Ala Gln Pro His Thr Glu 85 90 95 Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro 100 105 110 Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met Val 115 120 125 Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys Gly 130 135 140 Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro 145 150 155 160 Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro 165 170 175 Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly 180 185 190 Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser 195 200 205 Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys 210 215 220 Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys 225 230 235 240 Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val 245 250 255 Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly 260 265 270 Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln 275 280 285 Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly 290 295 300 Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser 305 310 315 320 Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln 325 330 335 Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser 340 345 350 Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn 355 360 365 Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala 370 375 380 Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser 385 390 395 400 Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser 405 410 415 Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val 420 425 430 Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu 435 440 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 2 Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys 1 5 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 3 Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys 1 5 10 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 4 Val Gln Ile Ile Asn Lys 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 5 Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln Ser Lys 1 5 <210> 6 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 6 His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp 1 5 10 15 Leu Ser Lys <210> 7 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 7 Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn Lys 1 5 10 15 <210> 8 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 8 Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn 1 5 10 15 <210> 9 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 9 Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys 1 5 10 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 10 Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys 1 5 10 <210> 11 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 11 Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly Thr Tyr Gly Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg <210> 12 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 12 Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp 1 5 10 15 Ala Gly Leu Lys 20 <210> 13 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 13 Glu Ser Pro Leu Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly 1 5 10 15 Ser Glu Thr Ser Asp Ala Lys 20 <210> 14 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 14 Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val Asp Glu Gly 1 5 10 15 Ala Pro Gly Lys 20 <210> 15 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 15 Gln Ala Ala Ala Gln Pro His Thr Glu Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala 1 5 10 15 Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala 20 25 30 Gly His Val Thr Gln Ala Arg 35 <210> 16 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 16 Ile Ala Thr Pro Arg 1 5 <210> 17 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 17 Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg 1 5 10 15 <210> 18 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Claims (75)

  1. 다음 단계를 포함하는, 생물학적 샘플에서 타우를 측정하는 방법:
    (a) 혈액 샘플 또는 CSF 샘플에서 서택된 생물학적 샘풀을 제공하는 단계, 이때 생물학적 샘플은 (i) 선택적으로 동위원소 표지된 타우 내부 표준을 포함하고, 그리고 (ii) 선택적으로 아밀로이드 베타, N-말단 타우, 중간 도메인 타우, 또는 이의 조합이 고갈되어 있으며;
    (b) 단백질 침전 및 침전된 단백질 분리에 의해 생물학적 샘플로부터 단백질을 제거하여, 상청액을 얻는 단계;
    (c) 상청액으로부터 타우를 고체상 추출로 정제하는 단계;
    (d) 정제된 타우를 프로테아제로 절단한 다음, 생성된 절단 생성물을 고체상 추출에 의해 선택적으로 탈염시켜 타우의 단백질분해 펩타이드를 포함하는 샘플을 얻는 단계; 및
    타우의 단백질분해 펩타이드를 포함하는 샘플로 액체 크로마토그래피 - 질량 분석법을 수행하여 타우의 적어도 하나의 단백질분해 펩타이드의 양을 검출하고 측정하는 단계.
  2. 청구항 1에 있어서, 생물학적 샘플은 아밀로이드 베타, N-말단 타우, 중간 도메인 타우, 또는 이의 조합이 고갈되어 있음을 특징으로 하는, 방법.
  3. 청구항 2에 있어서, (i) 생물학적 샘플은 아밀로이드 베타, N-말단 타우, 및 중간 도메인 타우가 고갈되어 있거나, (ii) 생물학적 샘플은 N-말단 타우 및 중간 도메인 타우가 고갈되어 있거나, 또는 (iii) 생물학적 샘플은 중간 도메인 타우가 고갈되어 있음을 특징으로 하는, 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 단계 (c)의 고체상은 타우를 흡착하는 역상 흡착제를 포함함을 특징으로 하는, 방법.
  5. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서:
    단계 (b)는 생물학적 샘플의 단백질을 침전시키기 위한 산을 혼합하는 단계를 포함하고, 선택적으로 이때 산은 과염소산이고; 및/또는
    단계 (e)에서, 액체 크로마토그래피 - 질량 분석법은 나노-LC/MS 시스템에 의해 수행됨을 특징으로 하는, 방법.
  6. 다음 단계를 포함하는, 생물학적 샘플에서 타우를 측정하는 방법:
    (a) 생물학적 샘플에서 친화도 고갈에 의해 N-말단 타우, 중간 도메인 타우, 또는 N-말단 타우와 중간 도메인 타우를 감소시키는 단계, 그리고 선택적으로 친화도 고갈에 의해 아밀로이드 베타를 감소시키는 단계, 이때 생물학적 샘플은 혈액 샘플 또는 CSF 샘플이고 생물학적 샘플은 선택적으로 동위원소 표지된 타우 내부 표준을 포함하고;
    (b) (i) 단백질 침전 및 침전된 단백질의 분리에 의해 생물학적 샘플로부터 추가 단백질을 제거하여 상청액을 얻은 다음, 이러한 상청액으로부터 고체상 추출에 의해 타우를 정제하는 단계, 또는 (ii) MTBR 타우를 친화도 정제하는 단계를 포함하는 방법으로 MTBR 타우를 농축시켜, (i) 또는 (ii)에 의해 농축된 MTBR 타우를 생성하는 단계;
    (c) 농축된 MTBR 타우를 프로테아제로 절단한 다음, 생성된 절단 생성물을 고체상 추출에 의해 선택적으로 탈염시켜 타우의 단백질분해 펩타이드를 포함하는 샘플을 얻는 단계; 및
    타우의 단백질분해 펩타이드를 포함하는 샘플의 액체 크로마토그래피 - 질량 분석법(LC/MS)을 수행하여 타우의 적어도 하나의 단백질분해 펩타이드의 양을 검출하고 측정하는 단계.
  7. 청구항 6에 있어서, 단계 (a)는 (i) N-말단 타우, 중간 도메인 타우, 또는 N-말단 타우와 중간 도메인 타우, 및 (ii) 아밀로이드 베타를 감소시키는 단계를 포함함을 특징으로 하는, 방법.
  8. 청구항 6에 있어서, 생물학적 샘플은 인간 타우를 포함하고 단계 (a)는 다음 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는, 방법:
    tau-441의 아미노산 1 - 243 내부 (이들 아미노산 포함)의 에피토프에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 에피토프 결합제와 생물학적 샘플을 접촉시키는 단계; 또는
    tau-441의 아미노산 1 - 103 내부 (이들 아미노산 포함)의 에피토프에 특이적으로 결합하는 제1 에피토프 결합제, 및 tau-441의 아미노산 104 - 243 내부 (이들 아미노산 포함)의 에피토프에 특이적으로 결합하는 제2 에피토프 결합제와 생물학적 샘플을 접촉시키는 단계; 또는
    tau-441의 아미노산 1 - 103 내부 (이들 아미노산 포함)의 에피토프에 특이적으로 결합하는 제1 에피토프 결합제, tau-441의 아미노산 104 - 243 내부 (이들 아미노산 포함)의 에피토프에 특이적으로 결합하는 제2 에피토프 결합제; 및 아밀로이드 베타의 에피토프에 특이적으로 결합하는 제3 에피토프 결합제와 생물학적 샘플을 접촉시키는 단계; 또는
    tau-441의 아미노산 1 - 103 내부 (이들 아미노산 포함)의 에피토프에 특이적으로 결합하는 제1 에피토프 결합제, 및 아밀로이드 베타의 에피토프에 특이적으로 결합하는 제2 에피토프 결합제와 생물학적 샘플을 접촉시키는 단계; 또는
    tau-441의 아미노산 104 - 243 내부 (이들 아미노산 포함)의 에피토프에 특이적으로 결합하는 제1 에피토프 결합제; 및 아밀로이드 베타의 에피토프에 특이적으로 결합하는 제3 에피토프 결합제와 생물학적 샘플을 접촉시키는 단계.
  9. 청구항 8에 있어서, 아밀로이드 베타에 특이적으로 결합하는 에피토프 결합제는 HJ5.1임을 특징으로 하는, 방법.
  10. 청구항 8에 있어서, tau-441의 아미노산 1 - 103 내부 (이들 아미노산 포함)의 에피토프에 특이적으로 결합하는 에피토프 결합제는 HJ8.5임을 특징으로 하는, 방법.
  11. 청구항 8에 있어서, tau-441의 아미노산 104 - 243 내부 (이들 아미노산 포함)의 에피토프에 특이적으로 결합하는 에피토프 결합제는 Tau1임을 특징으로 하는, 방법.
  12. 청구항 6 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 고체상 추출은 타우를 흡착하는 역상 흡착제를 포함함을 특징으로 하는, 방법.
  13. 청구항 6 내지 11 중 어느 한 항에 있어서,
    MTBR 타우를 농축시키는 방법은 단계 (b)(i)을 포함하고 이때 단백질 침전은 생물학적 샘플의 단백질을 침전시키기 위한 산을 혼합하는 단계를 포함하고, 선택적으로 이때 산은 과염소산이고; 및/또는
    단계 (e)에서, 액체 크로마토그래피 - 질량 분석법은 나노-LC/MS 시스템에 의해 수행됨을 특징으로 하는, 방법.
  14. 청구항 13에 있어서, 단계 (b) 및 (c)에서 수행되는 고체상 추출은 타우를 흡착하는 역상 흡착제를 포함함을 특징으로 하는, 방법.
  15. 청구항 8 내지 11 중 어느 한 항에 있어서,
    MTBR 타우를 농축시키는 방법은 단계 (b)(ii)를 포함하고 이때 MTBR 타우를 친화도 정제하는 단계는 단계 (a)의 생성물을 단계 (a)의 에피토프에 대해 C-말단에 있는 에피토프에 특이적으로 결합하는 에피토프 결합제와 접촉시키는 단계를 포함하고; 및/또는
    단계 (e)에서, 액체 크로마토그래피 - 질량 분석법은 나노-LC/MS 시스템에 의해 수행됨을 특징으로 하는, 방법.
  16. 청구항 15에 있어서, 단계 (b)의 에피토프 결합제는 다음의 에피토프에 특이적으로 결합함을 특징으로 하는, 방법:
    tau-441의 아미노산 221 내지 441 (이들 아미노산 포함) 내부, 또는
    tau-441의 아미노산 235 내지 441 (이들 아미노산 포함) 내부, 또는
    tau-441의 아미노산 235 내지 368 (이들 아미노산 포함) 내부, 또는
    tau-441의 아미노산 244 내지 368 (이들 아미노산 포함) 내부, 또는
    tau-441의 아미노산 244 내지 299 (이들 아미노산 포함) 내부.
  17. 청구항 16에 있어서, 에피토프 결합제는 77G7, RD3, RD4, UCB0107, PT76, E2814 및 7G6으로 구성된 그룹에서 선택된 항체임을 특징으로 하는, 방법.
  18. 청구항 15, 16 또는 17에 있어서, 단계 (c)에서 수행되는 고체상 추출은 타우를 흡착하는 역상 흡착제를 포함함을 특징으로 하는, 방법.
  19. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 프로테아제는 트립신임을 특징으로 하는, 방법.
  20. 청구항 19에 있어서, 단계 (d)는 타우의 적어도 하나의 단백질분해 펩타이드의 양을 검출 및 측정하는 단계를 포함하고, 이때 타우의 단백질분해 펩타이드는 서열 번호: 2, 서열 번호: 4, 서열 번호: 3, 서열 번호: 5, 서열 번호: 6, 서열 번호: 7, 및 서열 번호: 9에서 선택된 아미노산 서열을 가짐을 특징으로 하는, 방법.
  21. 청구항 19에 있어서, 단계 (d)는 타우의 적어도 2가지 단백질분해 펩타이드의 농도를 검출 및 측정하는 단계를 포함하고, 이때 타우의 이러한 2가지 단백질분해 펩타이드는 서열 번호: 2, 서열 번호: 4, 서열 번호: 3, 서열 번호: 5, 서열 번호: 6, 서열 번호: 7, 서열 번호: 8, 및 서열 번호: 9에서 선택된 아미노산 서열을 가짐을 특징으로 하는, 방법.
  22. 청구항 21에 있어서, 타우의 적어도 2가지 단백질분해 펩타이드는 서열 번호: 6 및 서열 번호: 7, 서열 번호: 6 및 서열 번호: 8, 서열 번호: 3 및 서열 번호: 6, 서열 번호: 3 및 서열 번호: 7, 서열 번호: 3 및 서열 번호: 8, 서열 번호: 2 및 서열 번호: 7, 서열 번호: 2 및 서열 번호: 8, 서열 번호: 4 및 서열 번호: 7, 서열 번호: 4 및 서열 번호: 8, 서열 번호: 5 및 서열 번호: 7, 서열 번호: 5 및 서열 번호: 8, 서열 번호: 2 및 서열 번호: 6, 서열 번호: 4 및 서열 번호: 6, 서열 번호: 5 및 서열 번호: 6, 또는 서열 번호: 9 및 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 가짐을 특징으로 하는, 방법.
  23. 청구항 6 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 프로테아제는 트립신임을 특징으로 하는, 방법.
  24. 청구항 23에 있어서, 단계 (d)는 MTBR 타우의 적어도 하나의 단백질분해 펩타이드의 농도를 검출 및 측정하는 단계를 포함하고, 이때 타우의 단백질분해 펩타이드는 서열 번호: 2, 서열 번호: 4, 서열 번호: 3, 서열 번호: 5, 서열 번호: 6, 서열 번호: 7, 서열 번호: 8, 및 서열 번호: 9에서 선택된 아미노산 서열을 가짐을 특징으로 하는, 방법.
  25. 청구항 23에 있어서, 단계 (d)는 MTBR 타우의 적어도 2가지 단백질분해 펩타이드의 농도를 검출 및 측정하는 단계를 포함하고, 이때 타우의 이러한 2가지 단백질분해 펩타이드는 서열 번호: 2, 서열 번호: 4, 서열 번호: 3, 서열 번호: 5, 서열 번호: 6, 서열 번호: 7, 서열 번호: 8, 및 서열 번호: 9에서 선택된 아미노산 서열을 가짐을 특징으로 하는, 방법.
  26. 청구항 25에 있어서, MTBR 타우의 적어도 2가지 단백질분해 펩타이드는 서열 번호: 6 및 서열 번호: 7, 서열 번호: 6 및 서열 번호: 8, 서열 번호: 3 및 서열 번호: 6, 서열 번호: 3 및 서열 번호: 7, 서열 번호: 3 및 서열 번호: 8, 서열 번호: 2 및 서열 번호: 7, 서열 번호: 2 및 서열 번호: 8, 서열 번호: 4 및 서열 번호: 7, 서열 번호: 4 및 서열 번호: 8, 서열 번호: 5 및 서열 번호: 7, 서열 번호: 5 및 서열 번호: 8, 서열 번호: 2 및 서열 번호: 6, 서열 번호: 4 및 서열 번호: 6, 서열 번호: 5 및 서열 번호: 6, 또는 서열 번호: 9 및 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 가짐을 특징으로 하는, 방법.
  27. 청구항 12에 있어서, 프로테아제는 트립신임을 특징으로 하는, 방법.
  28. 청구항 13에 있어서, 프로테아제는 트립신임을 특징으로 하는, 방법.
  29. 청구항 15에 있어서, 프로테아제는 트립신임을 특징으로 하는, 방법.
  30. 청구항 27, 28, 또는 29에 있어서, 단계 (d)는 MTBR 타우의 적어도 하나의 단백질분해 펩타이드의 농도를 검출 및 측정하는 단계를 포함하고, 이때 타우의 단백질분해 펩타이드는 서열 번호: 2, 서열 번호: 4, 서열 번호: 3, 서열 번호: 5, 서열 번호: 6, 서열 번호: 7, 서열 번호: 8, 및 서열 번호: 9에서 선택된 아미노산 서열을 가짐을 특징으로 하는, 방법.
  31. 청구항 27, 28, 또는 29에 있어서, 단계 (d)는 MTBR 타우의 적어도 2가지 단백질분해 펩타이드의 농도를 검출 및 측정하는 단계를 포함하고, 이때 타우의 이러한 단백질분해 펩타이드는 서열 번호: 2, 서열 번호: 4, 서열 번호: 3, 서열 번호: 5, 서열 번호: 6, 서열 번호: 7, 서열 번호: 8, 및 서열 번호: 9에서 선택된 아미노산 서열을 가짐을 특징으로 하는, 방법.
  32. 청구항 31에 있어서, MTBR 타우의 적어도 2가지 단백질분해 펩타이드는 서열 번호: 6 및 서열 번호: 7, 서열 번호: 6 및 서열 번호: 8, 서열 번호: 3 및 서열 번호: 7, 서열 번호: 3 및 서열 번호: 8, 서열 번호: 2 및 서열 번호: 7, 서열 번호: 2 및 서열 번호: 8, 서열 번호: 4 및 서열 번호: 7, 서열 번호: 4 및 서열 번호: 8, 서열 번호: 5 및 서열 번호: 7, 서열 번호: 5 및 서열 번호: 8, 서열 번호: 2 및 서열 번호: 6, 서열 번호: 4 및 서열 번호: 6, 서열 번호: 5 및 서열 번호: 6, 또는 서열 번호: 9 및 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 가짐을 특징으로 하는, 방법.
  33. 청구항 6 내지 32 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 단계 (a)의 생물학적 샘플로부터 제거된 N-말단 타우, 중간 도메인 타우, 또는 아밀로이드 베타의 농도를 검출 및 측정하는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는, 방법.
  34. 다음 단계를 포함하는, 대상체에서 알츠하이머 질환 (AD) 관련 병리를 측정하는 방법:
    대상체로부터 얻은 처리된 CSF 또는 혈액 샘플을 제공하는 단계, 이때 CSF 또는 혈액 샘플은 중간 도메인 타우가 고갈되어 있고 MTBR 타우가 농축되어 있으며; 및
    처리된 샘플에서, 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 또는 이의 조합을 정량하는 단계, 이때 정량된 MTRB-타우 종들의 양 또는 이의 비율은 대상체 뇌의 AD 관련 병리를 나타냄.
  35. 청구항 6 내지 18 중 어느 한 항의 방법에 따라 CSF 또는 혈액 샘플 내 타우를 측정하는 단계를 포함하는, 대상체에서 알츠하이머 질환 (AD) 관련 병리를 측정하는 방법으로서,
    이때 측정된 타우는 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 또는 이의 조합이고, 이때 정량된 MTRB-타우 종들의 양 또는 이의 비율은 대상체 뇌의 AD 관련 병리를 나타내는, 방법.
  36. 청구항 34 또는 35에 있어서, AD 관련 병리는 대상체 뇌에서의 타우 침착임을 특징으로 하는, 방법.
  37. 청구항 34 또는 35에 있어서, AD 관련 병리는 대상체 뇌 또는 뇌 동맥에서의 아밀로이드 베타 침착임을 특징으로 하는, 방법.
  38. 다음 단계를 포함하는, 대상체 뇌에서 알츠하이머 질환 (AD) 관련 타우 침착을 측정하는 방법:
    대상체로부터 얻은 처리된 CSF 또는 혈액 샘플을 제공하는 단계, 이때 처리된 CSF 또는 혈액 샘플은 중간 도메인 타우가 고갈되어 있고 MTBR 타우가 농축되어 있으며; 및
    처리된 CSF 또는 혈액 샘플에서 서열 번호: 3의 아미노산 서열 (LQTAPVPMPDLK)을 포함하는 MTBR 타우 종을 정량하는 단계를 포함하며, 이때 정량된 MTRB-타우 종들의 양은 대상체의 뇌에서 AD 관련 타우 침착을 나타냄.
  39. 청구항 6 내지 18 중 어느 한 항의 방법에 따라 CSF 또는 혈액 샘플 내 타우를 측정하는 단계를 포함하는, 대상체 뇌에서 알츠하이머 질환 (AD) 관련 타우 침착을 측정하는 방법으로서,
    이때 측정되는 타우는 서열 번호: 3의 아미노산 서열 (LQTAPVPMPDLK)을 포함하는 MTBR 타우 종이고, 이때 측정되는 MTRB-타우 종들의 양은 대상체의 뇌에서 AD 관련 병리를 나타내는, 방법.
  40. 다음 단계를 포함하는, 대상체 뇌에서 알츠하이머 질환 (AD) 관련 타우 침착을 측정하는 방법:
    대상체로부터 얻은 처리된 CSF 또는 혈액 샘플을 제공하는 단계, 이때 CSF 또는 혈액 샘플은 중간 도메인 타우가 고갈되어 있고 MTBR 타우가 농축되어 있으며; 및
    처리된 샘플에서, 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 또는 이의 조합을 정량하는 단계, 이때 정량된 MTRB-타우 종들의 양 또는 이의 비율은 대상체 뇌의 AD 관련 타우 침착을 나타냄.
  41. 청구항 6 내지 18 중 어느 한 항의 방법에 따라 CSF 또는 혈액 샘플 내 타우를 측정하는 단계를 포함하는, 대상체 뇌에서 알츠하이머 질환 (AD) 관련 타우 침착을 측정하는 방법으로서,
    이때 측정된 타우는 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 또는 이의 조합이고, 그리고 이때 정량된 MTRB-타우 종들의 양 또는 이의 비율은 대상체 뇌의 AD 관련 병리를 나타내는, 방법.
  42. 다음 단계를 포함하는, 알츠하이머 질환 진단 방법:
    대상체로부터 얻은 처리된 CSF 또는 혈액 샘플을 제공하는 단계, 이때 CSF 또는 혈액 샘플은 중간 도메인 타우가 고갈되어 있고 MTBR 타우가 농축되어 있으며; 및
    처리된 샘플에서, 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 또는 이의 조합을 정량하는 단계; 및
    정량된 MTBR 타우 종이 약 1.5σ 이상 상이한 경우 알츠하이머 질환을 진단하는 단계, 이때 σ는 PET 영상화 및/또는 Aβ42/40 측정으로 측정시 아밀로이드 음성인 대조군 집단에서 측정한 정규 분포로 정의되는 표준 편차임.
  43. 다음 단계를 포함하는, 알츠하이머 질환 진단 방법:
    청구항 6 내지 18 중 어느 한 항에 따라 CSF 또는 혈액 샘플 내 타우를 측정하는 단계, 이때 측정되는 타우는 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 또는 이의 조합이고; 및
    정량된 MTBR 타우 종이 약 1.5σ 이상 상이한 경우 알츠하이머 질환을 진단하는 단계, 이때 σ는 PET 영상화 및/또는 Aβ42/40 측정으로 측정시 아밀로이드 음성인 대조군 집단에서 측정한 정규 분포로 정의되는 표준 편차임.
  44. 다음 단계를 포함하는, 대상체에서 알츠하이머 질환 (AD) 진행을 측정하는 방법:
    처리된 제1 CSF 또는 혈액 샘플 및 처리된 제2 CSF 또는 혈액 샘플을 제공하는 단계, 이때 각 처리된 샘플은 단일 대상체로부터 얻으며, 그리고 각 처리된 샘플은 중간 도메인 타우가 고갈되어 있고 MTBR 타우가 농축되어 있으며; 및
    처리된 각 샘플에 대하여, 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 또는 이의 조합을 정량하는 단계; 및
    제2 샘플 및 제1 샘플에서 정량된 MTBR 타우 종들 간의 차이를 계산하는 단계, 이때 제2 샘플에서 정량된 MTBR 타우 종의 통계적으로 유의한 증가는 대상체의 알츠하이머 질환 진행을 나타냄.
  45. 다음 단계를 포함하는, 대상체에서 알츠하이머 질환 (AD) 진행을 측정하는 방법:
    청구항 6 내지 18 중 어느 한 항에 따라 제1 및 제2 CSF 또는 혈액 샘플 내 타우를 측정하는 단계, 이때 측정되는 타우는 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 또는 이의 조합이고; 및
    제2 샘플 및 제1 샘플에서 정량된 MTBR 타우 종들 간의 차이를 계산하는 단계, 이때 제2 샘플에서 정량된 MTBR 타우 종의 통계적으로 유의한 증가는 대상체의 알츠하이머 질환 진행을 나타냄.
  46. 청구항 38 내지 45 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 아밀로이드 음성임을 특징으로 하는, 방법.
  47. 청구항 46에 있어서, 대상체는 치매가 없음을 특징으로 하는, 방법.
  48. 청구항 46에 있어서, 대상체는 치매가 있음을 특징으로 하는, 방법.
  49. 청구항 38 내지 45 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 아밀로이드 양성임을 특징으로 하는, 방법.
  50. 청구항 49에 있어서, 대상체는 치매가 없음을 특징으로 하는, 방법.
  51. 청구항 49에 있어서, 대상체는 치매가 있음을 특징으로 하는, 방법.
  52. 청구항 46 또는 청구항 49에 있어서, 대상체는 0.5 내지 1.0의 CDR 점수를 가짐을 특징으로 하는, 방법.
  53. 청구항 46 또는 청구항 49에 있어서, 대상체는 > 1.0 내지 2.0의 CDR 점수 (중등도 AD)를 가짐을 특징으로 하는, 방법.
  54. 청구항 46 또는 청구항 49에 있어서, 대상체는 > 2.0의 CDR 점수를 가짐을 특징으로 하는, 방법.
  55. 청구항 38 내지 54 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 생물학적 또는 CSF 샘플에서 아밀로이드 베타를 정량하는 단계, N-말단 타우를 정량하는 단계, 중간 도메인 타우를 정량하는 단계, 타우의 번역후 변형을 정량하는 단계, 또는 ApoE 아이소폼을 확인하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  56. 다음 단계를 포함하는, 대상체의 뇌에서 타우 병리를 측정하는 방법:
    대상체로부터 얻은 처리된 CSF 또는 혈액 샘플을 제공하는 단계, 이때 CSF 또는 혈액 샘플은 중간 도메인 타우가 고갈되어 있고 MTBR 타우가 농축되어 있으며; 및
    처리된 샘플에서, 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 또는 이의 조합을 정량하는 단계, 이때 정량된 MTRB-타우 종들의 양 또는 이의 비율은 대상체 뇌의 타우 병리를 나타냄.
  57. 청구항 6 내지 18 중 어느 한 항의 방법에 따라 CSF 또는 혈액 샘플 내 타우를 측정하는 단계를 포함하는, 대상체 뇌에서 타우 병리를 측정하는 방법으로서, 이때 측정되는 타우는, 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 또는 이의 조합인, 방법.
  58. 다음 단계를 포함하는, 4R-타우병증의 구별 방법:
    대상체로부터 얻은 처리된 CSF 또는 혈액 샘플을 제공하는 단계, 이때 CSF 또는 혈액 샘플은 중간 도메인 타우가 고갈되어 있고 MTBR 타우가 농축되어 있으며; 및
    처리된 샘플에서, (a) 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 및 (b) 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 또는 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종을 정량하는 단계;
    이때 (b)로부터 정량된 MTBR 종에 대한 (a)로부터 정량된 MTBR 종의 비율이 4R-타우병증을 구별함.
  59. 청구항 6 내지 17 중 어느 한 항의 방법에 따라 생물학적 샘플에서 타우를 측정하는 단계를 포함하는, 4R-타우병증의 구별 방법으로서, 이때 측정되는 타우는 (a) 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 및 (b) 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 또는 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종이고;
    이때 (b)로부터 정량된 MTBR 종에 대한 (a)로부터 정량된 MTBR 종의 비율이 4R-타우병증을 구별하는, 방법.
  60. 다음 단계를 포함하는, 3R-타우병증 또는 4R-타우병증을 알츠하이머 질환과 구별하는 방법:
    대상체로부터 얻은 처리된 CSF 또는 혈액 샘플을 제공하는 단계, 이때 CSF 또는 혈액 샘플은 (a) 중간 도메인 타우가 고갈되어 있고, 그리고 (b) MTBR 타우가 농축되어 있으며; 및
    처리된 샘플에서, (a) 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 및 (b) 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 또는 이의 조합, 및 (b) 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 또는 이의 조합을 정량하는 단계;
    이때 (b)로부터 정량된 MTBR 종에 대한 (a)로부터 정량된 MTBR 종의 비율이 3R-타우병증 또는 4R-타우병증을 알츠하이머 질환과 구별함.
  61. 청구항 6 내지 18 중 어느 한 항의 방법에 따라 생물학적 샘플에서 타우를 측정하는 단계를 포함하는, 3R-타우병증 또는 4R-타우병증을 알츠하이머 질환과 구별하는 방법으로서, 이때 측정되는 타우는 (a) 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 또는 이의 조합, 및 (b) 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 또는 이의 조합이고,
    이때 (b)로부터 정량된 MTBR 종에 대한 (a)로부터 정량된 MTBR 종의 비율이 3R-타우병증 또는 4R-타우병증을 알츠하이머 질환과 구별하는, 방법.
  62. 다음 단계를 포함하는, 4R-타우병증의 진단 방법:
    청구항 6 내지 18 중 어느 한 항의 방법에 따라 CSF 또는 혈액 샘플에서 타우를 측정하는 단계, 이때 측정되는 타우는 (a) 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 또는 이의 조합, 및 (b) 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 또는 이의 조합이고,
    정량된 MTBR 타우 종이 약 1.5σ 이상 상이한 경우 4R-타우병증을 진단하는 단계, 이때 σ는 타우병증의 임상 징후나 증상이 없고 CSF에서 PET 영상화 및/또는 Aβ42/40 측정으로 측정 시 아밀로이드 음성인 대조군에서 측정한 정규 분포로 정의된 표준 편차임.
  63. 청구항 56 내지 62 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 치매가 없음을 특징으로 하는, 방법.
  64. 청구항 63에 있어서, 4R-타우병증은 피질기저 변성, 전두측두엽 변성, 전두측두엽 치매 또는 진행성 핵상 마비임을 특징으로 하는, 방법.
  65. 청구항 56 내지 62 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 치매가 있음을 특징으로 하는, 방법.
  66. 청구항 65에 있어서, 4R-타우병증은 피질기저 변성, 전두측두엽 변성, 전두측두엽 치매 또는 진행성 핵상 마비임을 특징으로 하는, 방법.
  67. 다음 단계를 포함하는, 치료를 필요로 하는 대상체의 치료 방법:
    대상체로부터 얻은 처리된 CSF 또는 혈액 샘플을 제공하는 단계, 이때 CSF 또는 혈액 샘플은 (a) 중간 도메인 타우가 고갈되어 있고, 그리고 (b) MTBR 타우가 농축되어 있으며;
    처리된 샘플에서, 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 MTBR 타우 종, 또는 이의 조합을 정량하는 단계; 및
    타우 병리를 변경하기 위해 대상체에게 치료제를 투여하는 단계를 포함하고, 이때 대상체의 처리된 CSF 또는 혈액 샘플은 약 1.5σ 이상 상이한 정량된 MTBR 타우 종, 또는 정량된 MTBR 타우 종의 비율을 가지며, 이때 σ는 타우병증의 임상 징후 또는 증상이 없고 PET 영상화 및/또는 CSF에서의 Aβ42/40 측정값으로 측정시 아밀로이드 음성인 대조군 집단에서 측정한 정규 분포로 정의되는 표준 편차이고, 이때 정량된 MTRB-타우 종의 양 또는 이들의 비율은 대상체 뇌의 타우 병리를 나타냄.
  68. 청구항 67에 있어서, 치료제는 정량된 MTBR 종들의 양을 변경 또는 안정화시킴을 특징으로 하는, 방법.
  69. 청구항 67 또는 68에 있어서, 치료제는 콜린에스테라제 억제제, N-메틸 D-아스파테이트(NMDA) 길항제, 항우울제, 감마-세크레타제 억제제, 베타-세크레타제 억제제, 항-Aβ 항체, 항-타우 항체, 항-TREM2 항체, TREM2 효능제, 줄기 세포, 식이 보충제, 세로토닌 수용체 6의 길항제, p38알파 MAPK 억제제, 재조합 과립구 대식세포 집락 자극 인자, 수동 면역 요법, 활성 백신, 타우 단백질 응집 억제제, 혈당 조절을 개선하기 위한 요법, 항염증제, 포스포디에스테라제 9A 억제제, 시그마-1 수용체 효능제, 키나제 억제제, 포스파타제 활성화제, 포스파타제 억제제, 안지오텐신 수용체 차단제, CB1 및/또는 CB2 엔도칸나비노이드 수용체 부분 효능제,
    Figure pct00030
    -2 아드레날린 수용체 효능제, 니코틴 아세틸콜린 수용체 효능제, 5-HT2A 역 효능제, 알파-2c 아드레날린 수용체 길항제, 5-HT 1A 및 1D 수용체 작용제, 글루타미닐-펩타이드 사이클로트랜스퍼라제 억제제, APP 생성의 선택적 억제제, 모노아민 산화효소 B 억제제, 글루타메이트 수용체 길항제, AMPA 수용체 작용제, 신경 성장 인자 자극제, HMG-CoA 환원효소 억제제, 신경영양제, 무스카린성 M1 수용체 효능제, GABA 수용체 조절제, PPAR-감마 효능제, 미세소관 단백질 조절제, 칼슘 채널 차단제, 항고혈압제, 및 스타틴으로 구성된 그룹에서 선택됨을 특징으로 하는, 방법.
  70. 청구항 69에 있어서, 치료제는 항-Aβ 항체, 항-타우 항체, 항-TREM2 항체, TREM2 효능제, 감마-세크레타제 억제제, 베타-세크레타제 억제제, 키나제 억제제, 포스파타제 활성화제, 백신, 및 타우 단백질 응집 억제제로 구성된 그룹에서 선택됨을 특징으로 하는, 방법.
  71. 청구항 70에 있어서, 키나제 억제제는 싸우전드-앤드-원 아미노산 키나제 (a thousand-and-one amino acid kinase, TAOK), CDK, GSK-3
    Figure pct00031
    , MARK, CDK5, 또는 Fyn의 억제제임을 특징으로 하는, 방법.
  72. 청구항 70에 있어서, 포스파타제 활성화제는 단백질 포스파타제 2A의 활성을 증가시킴을 특징으로 하는, 방법.
  73. 청구항 70에 있어서, 백신은 CAD106 또는 AF20513임을 특징으로 하는, 방법.
  74. 청구항 70에 있어서, 타우 단백질 응집 억제제는 TRx0237 또는 메틸티오니뮴 클로라이드임을 특징으로 하는, 방법.
  75. 청구항 70에 있어서, 항-Aβ 항체는 아두카누맙임을 특징으로 하는, 방법.
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