CN117355750A

CN117355750A - 检测阿尔茨海默病阶段和进展的csf tau物质的方法及其用途

Info

Publication number: CN117355750A
Application number: CN202280023459.6A
Authority: CN
Inventors: R·巴特曼; E·麦克德; N·巴特莱米; K·霍里; Y·李
Original assignee: University of Washington
Current assignee: University of Washington
Priority date: 2021-01-21
Filing date: 2022-01-21
Publication date: 2024-01-05

Abstract

本公开内容提供了定量和分析各种CSF tau物质的方法及其用于测量tau病变的病理学特征和/或临床症状的用途，包括确定到阿尔茨海默氏病所致痴呆的时间量、确定从痴呆发作起的时间、对阿尔茨海默氏病分期、指导治疗决策以及评价某些治疗干预的临床效力。

Description

检测阿尔茨海默病阶段和进展的CSF TAU物质的方法及其用途

对相关申请的交叉参考

本申请要求2021年1月21日提交的美国临时申请号63/140,230、2021年2月18日提交的美国临时申请号63/151,051、2021年4月28日提交的美国临时申请号63/170,185、2021年4月28日提交的美国临时申请号63/180,915、2021年5月12日提交的美国临时申请号63/187,697和2021年6月21日提交的美国临时申请号63/213,006的优先权，它们各自特此通过引用整体并入。

政府权利

本发明是在美国国立卫生研究院授予的AG046363和AG032438下在政府支持下完成。美国政府对本发明享有一定权利。

对序列表的参考

本申请含有已经经由EFS-Web以ASCII格式提交并且特此通过引用整体并入的序列表。创建于2022年1月20日的ASCII副本被命名为“715616_ST25.txt”，且大小为8,936字节。

技术领域

本公开内容涵盖用于定量和分析各种CSF tau物质的方法及其用于测量tau病变的病理学特征和/或临床症状的用途，所述tau病变包括原发性tau病变(例如MAPT、PSP、CBD)和继发性tau病变(例如由Aβ淀粉样变性引起的AD)。

本公开内容的背景

微管相关蛋白tau(MAPT或tau)在神经元的形态学和生理学中发挥着重要作用。Tau具有六种不同的全长蛋白同工型，并经历许多可能的翻译后修饰，包括乙酰化、糖基化和磷酸化。

tau蛋白作为不溶性聚集体在脑中的积累是阿尔茨海默氏病和被称为tau病变的其它神经变性疾病的标志之一。大脑皮质中的细胞内缠结是阿尔茨海默病(AD)的定义性病理学特征，并且与细胞外淀粉样蛋白-β(Aβ)斑块出现之后很久临床症状的发作相关，所述斑块在症状发作之前至多二十年就开始发展。Tau病理学似乎跨越脑区域进行传播，并通过特定病理性tau物质以朊病毒样方式在细胞间传送而散播，尽管这些物质(即单体物质、寡聚体物质和原纤维(fibril)物质)的性质和散播过程尚不确定。

在AD中，在脑脊液中可溶性的p-tau和未磷酸化的tau增加两倍。已经提出，这些变化反映了神经元死亡(神经变性)被动地将tau和NFT释放到CSF中的影响。但是，在具有显著NFT病理学和神经变性的其它tau病变(例如进行性核上性麻痹、额颞叶退化-tau)中，可溶性p-tau和总tau的CSF水平不会增加。这些观察结果表明Aβ可能触发导致AD的独特tau病变的过程，这一观点得到细胞和动物模型的支持。在于人类中存在淀粉样斑块的情况下，可溶性tau的活性产生的增加进一步支持了这一概念。

几项质谱法(MS)研究表明tau的微管结合区域(MTBR)在AD脑中以聚集体形式富集。此外，一系列低温电子显微术(冷冻-EM)研究证实，tau聚集体的核心结构由MTBR结构域的子片段组成，并且特定构象取决于tau病变。但是，这些研究使用死后脑组织，而关于生物样品诸如CSF中相应细胞外含有MTBR的tau物质的病理生理学知之甚少。

尽管tau构成了AD病理学的显著标志并且可以以聚集形式或可溶形式测量，但我们对这种关键神经元蛋白的翻译后修饰和同工型如何导致人类中NFT和神经变性的发展的理解仍然存在重要差距。例如，尚不清楚如果存在的话，tau在AD的临床前和临床阶段中发生什么病理生理学变化。因此，尚不清楚如果存在的话，tau在多大程度上可以被用于在AD相关症状发作之前对受试者进行分期并指导治疗决策。

概述

在一个方面，本公开内容涵盖用于测量受试者中到痴呆发作的时间的方法，所述测量通过(ai)在获得自所述受试者的血液样品或CSF样品中，测量在tau的残基T205处的磷酸化占据和测量MTBR-tau299/MTBR-tau354比率，以及任选地测量MTBR-tau212、在残基T217处的磷酸化占据、MTBR-tau243、MTBR-tau3R或其组合，或者(aii)在获得自所述受试者的血液样品或CSF样品中，测量在tau的残基T205处的磷酸化占据，测量在tau的残基T217处的磷酸化占据，以及测量MTBR-tau212；以及(b)使用(ai)或(aii)的度量来计算到痴呆发作的时间，其中到痴呆发作的时间是按年计到大于0的临床痴呆评级的时间。

在另一个方面，本公开内容涵盖用于在没有阿尔茨海默氏病的认知或行为症状的受试者中测量到痴呆发作的时间的方法，所述方法通常包括(a)加工来自所述受试者的血液样品或CSF样品以得到tau物质的第一群体和耗竭的样品，并然后加工所述耗竭的样品以得到tau物质的第二群体，其中所述tau物质的第一群体富集N-端tau和/或中间结构域tau，且其中富集的tau物质的第二群体富集MTBR-tau；(bi)在tau物质的第一群体中测量在tau的残基T205处的磷酸化占据和在tau物质的第二群体中测量MTBR-tau299/MTBR-tau354比率，以及任选地在tau物质的第二群体中测量MTBR-tau212，或

(bii)在tau物质的第一群体中测量在tau的残基T205处的磷酸化占据和测量在tau的残基T217处的磷酸化占据，以及在tau物质的第二群体中测量MTBR-tau212；和

(c)使用(bi)或(bii)的度量计算到痴呆发作的时间，其中到痴呆发作的时间是按年计到大于0的临床痴呆评级的时间。

在一些实施方案中，加工来自所述受试者的血液样品或CSF样品以得到富集的tau物质的第一群体和耗竭的样品包含使所述血液样品或所述CSF样品与特异性地结合至tau的N-端内的表位的表位结合剂接触，或使所述血液样品或所述CSF样品与特异性地结合至tau的中间结构域内的表位的表位结合剂接触，或使所述血液样品或所述CSF样品与特异性地结合至tau的N-端内的表位的第一表位结合剂接触并与特异性地结合至tau的中间结构域内的表位的第二表位结合剂接触，其中所述第一和第二表位结合剂依次或同时使用；任选地其中所述特异性地结合至tau的N-端内的表位的表位结合剂是HJ8.5或与HJ8.5特异性地结合相同表位的另一种表位结合剂，以及任选地其中所述特异性地结合至tau的中间结构域内的表位的表位结合剂是Tau1或与Tau1特异性地结合相同表位的另一种表位结合剂。

在一些实施方案中，加工所述耗竭的样品以得到富集的tau物质的第二群体包含执行化学萃取步骤以富集MTBR-tau物质，任选地其中所述化学萃取步骤包含混合酸以沉淀所述耗竭的样品的蛋白，任选地其中所述酸是高氯酸，且其中所述MTBR-tau物质在除去沉淀的蛋白以后在上清液中；或使所述耗竭的样品与特异性地结合至tau的MTBR内的至少一个表位的表位结合剂接触，任选地其中所述表位结合剂是在Vandermeeren等人，JAlzheimers Dis,2018,65:265-281中描述的77G7、RD3、RD4、UCB1017或PT76，或者在Roberts等人，Acta Neuropathol Commun,2020,8:13中描述的7G6，或者77G7、RD3、RD4、UCB1017、PT76或7G6的抗原结合片段，或者与77G7、RD3、RD4、UCB1017、PT76或7G6特异性地结合相同表位的其它表位结合剂。

在一些实施方案中，加工来自所述受试者的血液样品或CSF样品以得到富集的tau物质的第一群体和耗竭的样品包括使所述血液样品或所述CSF样品与特异性地结合至tau的N-端内的表位的表位结合剂接触，或使所述血液样品或所述CSF样品与特异性地结合至tau的中间结构域内的表位的表位结合剂接触，或使所述血液样品或所述CSF样品与特异性地结合至tau的N-端内的表位的第一表位结合剂接触并与特异性地结合至tau的中间结构域内的表位的第二表位结合剂接触，其中所述第一和第二表位结合剂依次或同时使用，任选地其中所述特异性地结合至tau的N-端内的表位的表位结合剂是HJ8.5或与HJ8.5特异性地结合相同表位的另一种表位结合剂，以及任选地其中所述特异性地结合至tau的中间结构域内的表位的表位结合剂是Tau1或与Tau1特异性地结合相同表位的另一种表位结合剂；以及加工所述耗竭的样品以得到富集的tau物质的第二群体包含执行化学萃取步骤以富集MTBR-tau物质，任选地其中所述化学萃取步骤包含混合酸以沉淀所述耗竭的样品的蛋白，任选地其中所述酸是高氯酸，且其中所述MTBR-tau物质在除去沉淀的蛋白以后在上清液中；或使所述耗竭的样品与特异性地结合至tau的MTBR内的至少一个表位的表位结合剂接触，任选地其中所述表位结合剂是在Vandermeeren等人，JAlzheimers Dis,2018,65:265-281中描述的77G7、RD3、RD4、UCB1017或PT76，或者在Roberts等人，ActaNeuropatholCommun,2020,8:13中描述的7G6，或者77G7、RD3、RD4、UCB1017、PT76或7G6的抗原结合片段，或者与77G7、RD3、RD4、UCB1017、PT76或7G6特异性地结合相同表位的其它表位结合剂。

在以上方面中的每一个中，所述受试者可以具有0的CDR。

在一些实施方案中，计算的到痴呆发作的时间的度量可以被用于将受试者的疾病进展分期，将受试者的脑病理学分期或为受试者选择治疗剂或诊断剂。

在仍然另一个方面，本公开内容提供了用于治疗没有阿尔茨海默氏病的认知或行为症状的受试者的方法，所述方法通过给所述受试者施用治疗剂或诊断剂，其中所述治疗剂减少Aβ产生、阻止或拮抗Aβ聚集或增加脑Aβ清除，任选地其中所述治疗剂是γ-分泌酶抑制剂、β-分泌酶抑制剂、被动免疫疗法(包括但不限于抗-Aβ抗体、抗-tau抗体或抗-ApoE抗体)或主动免疫疗法，或者其中所述治疗剂阻止或拮抗tau聚集、增加神经原纤维缠结清除、改变tau磷酸化模式，任选地其中所述治疗剂是tau蛋白聚集抑制剂、激酶抑制剂、磷酸酶活化剂、被动免疫疗法(包括但不限于抗-tau抗体)或主动免疫疗法。

在另一个方面，本公开内容提供了在具有阿尔茨海默氏病的认知或行为症状的受试者中测量从痴呆发作起的时间的方法，所述方法通过(ai)在获得自所述受试者的血液样品或CSF样品中，测量在tau的残基T205处的磷酸化占据和测量MTBR-tau299/MTBR-tau354比率，以及任选地测量MTBR-tau212、在残基T217处的磷酸化占据、MTBR-tau243、MTBR-tau3R或其组合，或者(aii)在获得自所述受试者的血液样品或CSF样品中，测量在tau的残基T205处的磷酸化占据，测量在tau的残基T217处的磷酸化占据，以及测量MTBR-tau212；和(b)使用(ai)或(aii)的度量来计算从痴呆发作起的时间，其中从痴呆发作起的时间是按年计从大于0的临床痴呆评级起的时间。

在又另一个方面，本公开内容提供了在具有阿尔茨海默氏病的认知或行为症状的受试者中测量从痴呆发作起的时间的方法，所述方法通过(a)加工来自所述受试者的血液样品或CSF样品以得到tau物质的第一群体和耗竭的样品，并然后加工所述耗竭的样品以得到tau物质的第二群体，其中所述tau物质的第一群体富集N-端tau和/或中间结构域tau，且其中富集的tau物质的第二群体富集MTBR-tau；(bi)在tau物质的第一群体中测量在tau的残基T205处的磷酸化占据和在tau物质的第二群体中测量MTBR-tau299/MTBR-tau354比率，以及任选地在tau物质的第二群体中测量MTBR-tau212，或(bii)在tau物质的第一群体中测量在tau的残基T205处的磷酸化占据和测量在tau的残基T217处的磷酸化占据，和在tau物质的第二群体中测量MTBR-tau212；和(c)使用(bi)或(bii)的度量计算从痴呆发作起的时间，其中从痴呆发作起的时间是按年计从大于0的临床痴呆评级起的时间。

在一些实施方案中，加工来自所述受试者的血液样品或CSF样品以得到富集的tau物质的第一群体和耗竭的样品包括使所述血液样品或所述CSF样品与特异性地结合至tau的N-端内的表位的表位结合剂接触，或使所述血液样品或所述CSF样品与特异性地结合至tau的中间结构域内的表位的表位结合剂接触，或使所述血液样品或所述CSF样品与特异性地结合至tau的N-端内的表位的第一表位结合剂接触并与特异性地结合至tau的中间结构域内的表位的第二表位结合剂接触，其中所述第一和第二表位结合剂依次或同时使用；任选地其中所述特异性地结合至tau的N-端内的表位的表位结合剂是HJ8.5或与HJ8.5特异性地结合相同表位的另一种表位结合剂，以及任选地其中所述特异性地结合至tau的中间结构域内的表位的表位结合剂是Tau1或与Tau1特异性地结合至相同的表位的另一种表位结合剂。

在一些实施方案中，加工所述耗竭的样品以得到富集的tau物质的第二群体包含

执行化学萃取步骤以富集MTBR-tau物质，

任选地其中所述化学萃取步骤包含混合酸以沉淀所述耗竭的样品的蛋白，任选地其中所述酸是高氯酸，且其中所述MTBR-tau物质在除去沉淀的蛋白以后在上清液中；或

使所述耗竭的样品与特异性地结合至tau的MTBR内的至少一个表位的表位结合剂接触，

任选地其中所述表位结合剂是在Vandermeeren等人，J Alzheimers Dis,2018,65:265-281中描述的77G7、RD3、RD4、UCB1017或PT76，或者在Roberts等人，ActaNeuropathol Commun,2020,8:13中描述的7G6，或者77G7、RD3、RD4、UCB1017、PT76或7G6的抗原结合片段，或者与77G7、RD3、RD4、UCB1017、PT76或7G6特异性地结合相同表位的其它表位结合剂。

权利要求18所述的方法，其中

加工来自所述受试者的血液样品或CSF样品以得到富集的tau物质的第一群体和耗竭的样品包含：

使所述血液样品或所述CSF样品与特异性地结合至tau的N-端内的表位的表位结合剂接触，或

使所述血液样品或所述CSF样品与特异性地结合至tau的中间结构域内的表位的表位结合剂接触，或

使所述血液样品或所述CSF样品与特异性地结合至tau的N-端内的表位的第一表位结合剂接触并与特异性地结合至tau的中间结构域内的表位的第二表位结合剂接触，其中所述第一和第二表位结合剂依次或同时使用，

任选地其中所述特异性地结合至tau的N-端内的表位的表位结合剂是HJ8.5或与HJ8.5特异性地结合相同表位的另一种表位结合剂，且任选地其中所述特异性地结合至tau的中间结构域内的表位的表位结合剂是Tau1或与Tau1特异性地结合相同表位的另一种表位结合剂；以及加工所述耗竭的样品以得到富集的tau物质的第二群体包含执行化学萃取步骤以富集MTBR-tau物质，任选地其中所述化学萃取步骤包含混合酸以沉淀所述耗竭的样品的蛋白，任选地其中所述酸是高氯酸，且其中所述MTBR-tau物质在除去沉淀的蛋白以后在上清液中；或使所述耗竭的样品与特异性地结合至tau的MTBR内的至少一个表位的表位结合剂接触，任选地其中所述表位结合剂是在Vandermeeren等人，J Alzheimers Dis,2018,65:265-281中描述的77G7、RD3、RD4、UCB1017或PT76，或者在Roberts等人，ActaNeuropathol Commun,2020,8:13中描述的7G6，或者77G7、RD3、RD4、UCB1017、PT76或7G6的抗原结合片段，或者与77G7、RD3、RD4、UCB1017、PT76或7G6特异性地结合相同表位的其它表位结合剂。

在一些实施方案中，使用计算的到痴呆发作的时间的度量来将受试者的疾病进展分期，将受试者的脑病理学分期，或者为受试者选择治疗剂或诊断剂。

因此，本公开内容提供了用于治疗没有阿尔茨海默氏病的认知或行为症状的受试者的方法，所述方法包含给所述受试者施用所述治疗剂或诊断剂。

在另一个方面，本公开内容提供了用于测量受试者中的认知变化的方法，所述方法包含(a)在获得自所述受试者的血液样品或CSF样品中测量在选自T111、T153、T181、T217和T231的tau的一个或多个残基处的磷酸化占据，和在获得自所述受试者的血液样品或CSF样品中测量MTBR-tau275、MTBR-tau299和MTBR-3R中的至少一个，以及任选地在获得自所述受试者的血液样品或CSF样品中测量总tau；和(b)使用(a)的度量来计算认知变化，其中所述认知变化相当于通过认知综合评分测量的认知变化，所述认知综合评分由以下组成：来自国际购物清单试验(International Shopping List Test)的延迟回忆评分、来自韦氏记忆量表修订版(WechslerMemory Scale-Revised)的逻辑记忆延迟回忆评分、来自韦氏成人智力量表修订版(WechslerAdult Intelligence Scale-Revised)的数字符号编码试验总分和MMSE总评分。

在一些实施方案中，将认知变化的度量用于评价治疗剂的有效性。

在下面更彻底地描述本公开内容的其它方面和迭代。

附图简要描述

申请文件含有至少一张被制成彩色的照片。带有彩色照片的本专利申请公布的副本将在请求并支付必要的费用后由专利局提供。

图1是最长的人tau同工型(2N4R)的示意图。鉴定了该同工型的N-端(N端)、中间结构域、MTBR和C-端(C端)，并且对于其它tau同工型(例如2N3R、1NR4、1N3R、0N4R和0N3R)，它们将以可预测的方式变化。

图2A是示出本公开内容的几种方法的示意图。在蓝色框中详述的方法(右-Tau-化学萃取方法)是一种方法。红色框(左-N-端Tau和中间结构域tau的IP)和蓝色框(右-Tau-化学萃取方法)的组合是另一种方法。

图2B是示出本公开内容的几种方法的示意图。在蓝色框中详述的方法(右Tau-化学萃取方法)是一种方法。红色框(左-N-端Tau和中间结构域tau的IP)和蓝色框(右-Tau-化学萃取方法)的组合是另一种方法。

图3是示出本公开内容的方法的示意图。

图4是示出本公开内容的方法的示意图。

图5是显示tau病理学在阿尔茨海默病的不同阶段演变的图解。在一组具有确定性阿尔茨海默病突变的参与者中测量四种不同的可溶性tau物质和不溶性tau，我们显示了在35年的过程中(x-轴)，tau相关变化显露出来(y-轴)，并且基于疾病阶段和其它可测量的生物标志物而有所不同。从原纤维状淀粉样蛋白病理学发展开始，在位置217(紫色)和181(蓝色)处的磷酸化开始增加。随着神经元功能障碍的增加(基于代谢变化)，在位置205(绿色)处的磷酸化开始与可溶性tau(橙色)一起增加。最后，随着神经变性的发作(基于脑萎缩和认知减退)，tau PET缠结(红色)开始发展，而217和181的磷酸化开始减少。总之，这凸显了在疾病过程中可溶性tau和聚集的tau的动态和分散模式以及与淀粉样蛋白病理学的密切相关性。

图6A和图6B显示，CSF MTBR-tau 299、MTBR-tau306和MTBR-tau 354在整个阿尔茨海默氏病连续谱(continuum)中表现出独特的特征，反映了缠结状态。图6A是4R和3Rtau的图解，显示了E2814结合区域。图6B显示了MTBR-tau299、MTBR-tau306和MTBR tau-354的浓度与症状发作的估计年数的相关性。红色点：有症状的突变携带者(MC)；橙色点：无症状MC；蓝色点：非携带者(NC)；“红色曲线”：MC的loess曲线；蓝色曲线：NC的loess曲线。

图7是跨越临床阿尔茨海默氏病阶段中MTBR-tau物质从脑tau聚集体分泌到CSF中的图示。在临床前AD阶段中，脑tau聚集体尚未成熟，因此三种MTBR-tau物质(MTBR-tau-243、MTBR-tau-299和MTBR-tau-354)以相同浓度分泌到CSF中。但是，随着tau聚集体随疾病进展而成熟并形成MTBR-tau-354的刚性核心(R4结构域)，在CSF中的MTBR-tau-354物质稳定化。MTBR-tau-299(R2至R3结构域)物质在后期症状阶段加入刚性核心结构，而MTBR-tau-243物质(在R1结构域的上游)保持暴露，使蛋白酶消化并释放到CSF中。最终，观察到在CSF中这三种物质的失衡，作为脑tau聚集体形成的反映。

图8A、图8B和图8C显示了pTau物质在分类淀粉样蛋白PET状态中的ROC和AUC。图8A显示了突变携带者的pT111、pT153、pS208和pT231。图8B显示了突变携带者和非携带者的pT111、pT153、pS208和pT231。图8C显示了组的曲线下面积和95％置信区间。

图9A、图9B和图9C显示了MTBR-tau物质在分类淀粉样蛋白PET状态中的ROC和AUC。图9A显示了突变携带者的MTBR-tau212、MTBR-tau243、MTBR-tau260和MTBR-tau275。图9B显示了突变携带者和非携带者的MTBR-tau212、MTBR-tau243、MTBR-tau260和MTBR-tau275。图9C显示了各组的曲线下面积和95％置信区间。

图10A、图10B和图10C显示了MTBR-tau物质在分类淀粉样蛋白PET状态中的ROC和AUC。图10A显示了突变携带者的MTBR-tau282、MTBR-tau299、MTBR-tau306和MTBR-tau354。图10B显示了突变携带者和非携带者的MTBR-tau282、MTBR-tau299、MTBR-tau306和MTBR-tau354。图10C显示了各组的曲线下面积和95％置信区间。

图11A、图11B和图11C显示了MTBR-tau物质在分类淀粉样蛋白PET状态中的ROC和AUC。图11A显示了突变携带者的MTBR-tau386、MTBR-tau396、MTBR-tau299/MTBR-tau354比率和MTBR-tau299/MTBR-tau282比率。图11B显示了突变携带者和非携带者的MTBR-tau386、MTBR-tau396、MTBR-tau299/MTBR-tau354比率和MTBR-tau299/MTBR-tau282。图11C显示了组的曲线下面积和95％置信区间。

图12A、图12B、图12C、图12D、图12E和图12F显示了突变携带者中pT111、pT153和pS208的框图。图12A显示了按PiB四分位数计的pT111/T111磷酸化比率增加的原始值(对于Q1，n＝47；对于Q2，n＝46；对于Q3，n＝46；和对于Q4，n＝47)。图12B显示了按PiB四分位数计的pT153/T153磷酸化比率增加的原始值(对于Q1，n＝47；对于Q2，n＝46；对于Q3，n＝46；和对于Q4，n＝47)。图12C显示了按PiB四分位数计的pS208/S208磷酸化比率增加的原始值(对于Q1，n＝47；对于Q2，n＝46；对于Q3，n＝46；和对于Q4，n＝47)。图12D显示了按PiB四分位数计的pT111/T111磷酸化比率增加的标准化值(对于Q1，n＝47；对于Q2，n＝46；对于Q3，n＝46；和对于Q4，n＝47)。图12E显示了按PiB四分位数计的pT153/T153磷酸化比率增加的标准化值(对于Q1，n＝47；对于Q2，n＝46；对于Q3，n＝46；和对于Q4，n＝47)。图12F显示了按PiB四分位数计的pS208/S208磷酸化比率增加的标准化值(对于Q1，n＝47；对于Q2，n＝46；对于Q3，n＝46；和对于Q4，n＝47)。P-值来自Wilcoxon秩和检验。

图13A、图13B、图13C、图13D、图13E、图13F、图13G、图13H、图13I、图13J、图13K、图13L、图13M、图13N、图13O、图13P、图13Q、图13R和图13S显示了各种tau物质的浓度与估计的到症状发作年数的相关性。图13A显示了pT111/T111；图13B显示了pT153/T153；图13C显示了pS208/S208；图13D显示了pT231/T231；图13E显示了pT153；图13F显示了pS208；图13G显示了pT231；图13H显示了pT231/T231；图13I显示了MTBR-tau212；图13J显示了MTBR-tau243；图13K显示了MTBR-tau260；图13L显示了MTBR-tau275；图13M显示了MTBR-tau282；图13N显示了MTBR-tau299；图13O显示了MTBR-tau3R；图13P显示了MTBR-tau354；图13Q显示了MTBR-tau386；图13R显示了MTBR-tau396；图13S显示了MTBR-tau299/MTBR-tau282；图13T显示了MTBR-tau299/MTBR-tau354比率。

图14A、图14B、图14C、图14D、图14E、图14F、图14G、图14H、图14I、图14J、图14K、图14L、图14M、图14N、图14O和图14P显示了通过DIAN EYO的pTau和MTBR的年度变化(从线性混合效应模型估计年度变化)。横截面数据的EYO截止值：pT111/T111为-19，pT153/T153为-22，pS208/S208为-22；变化率的EYO截止值：pT111/T111和pT153/T153为-25，pS208/S208的无截止值；所有纵向分析都基于log转换的pT111/T111和pS208/S208，以及平方根转化的pT153/T153。图14A显示了pT111/T111；图14B显示了pT153/T153；图14C显示了pS208/S208；图14D显示了pT231/T231；图14E显示了MTBR-tau212；图14F显示了MTBR-tau243；图14G显示了MTBR-tau260；图14H显示了MTBR-tau275；图14I显示了MTBR-tau282；图14J显示了MTBR-tau299；图14K显示了MTBR-tau3R；图14L显示了

MTBR-tau299/MTBR-tau282；图14M显示了

MTBR-tau299/MTBR-tau354；图14N显示了MTBR-tau354；图14O显示了MTBR-tau386；图13P显示了MTBR-tau396。

图15显示了基线生物标志物和认知综合的纵向变化率之间的相关性。

图16A、图16B、图16C、图16D、图16E、图16F、图16G、图16H、图16I、图16J、图16K、图16L、图16M、图16N、图16O和图16P显示了各种tau物质和总体认知之间的年度变化的相关性。图16A显示了pT111/T111；图16B显示了pT153/T153；图16C显示了pS208/S208；图16D显示了pT231/T231；图16E显示了MTBR-tau212；图16F显示了MTBR-tau243；图16G显示了MTBR-tau260；图16H显示了MTBR-tau275；图16I显示了MTBR-tau282；图16J显示了MTBR-tau299；图16K显示了MTBR-tau3R；图16L显示了MTBR-tau299/MTBR-tau282；图16M显示了MTBR-tau299/MTBR-tau354；图16N显示了MTBR-tau354；图16O显示了MTBR-tau386；图16P显示了MTBR-tau396。pT153/T153和MTBR 3R具有比其它tau物质更高的年度变化的相关性。

图17A和图17B显示了在基线时突变携带者(无症状的和有症状的)的各个tau磷酸化位点处的磷酸化占据的相关性和年度变化。图17A显示了pT111/T111、pT153/T153和pS208/208与pT217/217的相关性。图17B显示了pT111/T111、pT153/T153和pS208/208与pT205/205的相关性。

图18A、图18B、图18C、图18D、图18E、图18F、图18G、图18H、图18I、图18J和图18K显示了突变携带者(有症状的和无症状的)和非携带者的基线和年度变化率的相关性的热图。图18A显示了MC基线中相关性的热图。所有MTBR物质和总tau簇集在一起(几个小簇)；来自MTBR数据集的比率与其它tau物质而不是在MTBR中的tau物质一起簇集。pS202/S202不与任何其它tau物质相关联；TPPSS(指定总tau的区域)。图18B显示了使用所有MC的基线中相关性的热图。图18C显示了使用无症状MC的基线中相关性的热图。图18D显示了使用有症状MC的基线中相关性的热图。图18E显示了使用非携带者的基线中相关性的热图。图18F显示了其中颜色代表突变携带者的两种标志物的年度变化率之间的相关性的热图。图18G显示了其中颜色代表无症状突变携带者的两种标志物的年度变化率之间的相关性的热图。图18H显示了其中颜色代表有症状突变携带者的两种标志物的年度变化率之间的相关性的热图。图18I显示了其中颜色代表突变携带者的两种标志物的年度变化率之间的相关性绝对值的热图。图18J显示了其中颜色代表无症状突变携带者的两种标志物的年度变化率之间的相关性绝对值的热图。图18K显示了其中颜色代表有症状突变携带者的两种标志物的年度变化率之间的相关性的绝对值的热图。

图19A、图19B和图19C显示了在所有突变携带者、无症状突变携带者和有症状突变携带者中的DIAN EYO的预测。半偏R平方指示，如果在模型中包含VAR1，则模型R平方会增加x。平方半偏相关指示变量的重要性，因为它衡量R平方的增量值。半偏R平方总计不会为R平方，因为因变量的总变异也构成了由自变量之间的相关性引起的一部分。图19A显示了所有突变携带者中的pT205/T205、MTBR-tau212和MTBR-tau299/MTBR-tau354的DIAN EYO预测。图19B显示了无症状突变携带者中的pT205/T205、pT217/T217和MTBR-tau212的DIAN EYO预测。图19C显示了有症状突变携带者中的pT205/T205的DIAN EYO预测。

图20A和图20B显示了每5个EYO间隔的tau物质异常率。在NC中每种生物标志物的95％被用作将MC中每种生物标志物定义为正常和异常的阈值。图20A是显示每5个EYO间隔的tau物质异常率的表。图20B是显示每5个EYO间隔的tau物质异常率的折线图。

图21A显示了年度变化率的影响大小的对比(平均值相对于标准差的比率-MSR)。

图21B显示了年度变化率的影响大小的对比(平均值相对于标准差的比率-MSR)。aMC和基线EYO≥-25。

图22A和图22B显示了MTBR-tau299和MTBR-tau354变化在AD发作处出现拐点(CDR＝1)。图22A显示了MTBR-tau299。图22B显示了MTBR-tau534。

图23显示了MTBR-tau299/MTBR-tau354比率增强AD分期的辨别力。

图24A和图24B显示了CSF MTBR-299/354比率预测整个AD连续谱中的认知评分的性能。图24A显示了MTBR-299/354和CDR-SB。图24B显示了MTBR-299/354和MMSE。

图25显示了总结表MTBR-tau相对于认知评分。

图26A显示了MTBR-tau299/354比率和pT217％占据之间的相关性。

图26B显示了pT217％与E2814相关的MTBR-tau299/354良好相关，其概述了“早期阶段tau病理学”->pT217％可被用作E2814临床试验的替代效力标志物。

图27A是在图27B和图27C中定量和讨论的来自tau的胰蛋白酶肽的示意图(灰色条)。

图27B和图27C的图显示与对照脑提取物相比，包含MTBR tau-243、299和354的脑MTBRtau物质在聚集的阿尔茨海默氏病脑不溶性提取物中富集，确认了MTBRtau特异性地沉积在阿尔茨海默氏病脑中。所述图显示了来自(图18B)对照和阿尔茨海默氏病脑(n＝2，在发现队列中具有六至八个脑区域样品/组)和(图18C)来自对照(淀粉样蛋白阴性，n＝8)、非常轻度至中度阿尔茨海默氏病(AD)(淀粉样蛋白阳性，CDR＝0.5-2，n＝5)和重度AD脑(淀粉样蛋白阳性，CDR＝3，n＝7)的tau肽的富集特性(在验证队列中共n＝20)。将tau肽的相对丰度相对于中间结构域(残基181-190)肽进行定量，以进行内部归一化。与对照相比，含有微管结合区(MTBR)结构域的上游区域(残基243-254，MTBRtau-243)和重复区2(R2)至R3和R4(分别为残基299-317，MTBRtau-299，和残基354-369，MTBRtau-354)的物质在来自阿尔茨海默氏病脑的不溶性级分中高度富集，并且随疾病进展的临床阶段特异性富集，如通过CDR所测量的。MTBRtau-299和MTBRtau-354位于纤丝核心内部，而MTBRtau-243位于阿尔茨海默氏病聚集体的核心外部(Fitzpatrick等人，2017)。值得注意的是，残基195-209在阿尔茨海默氏病脑中减少，可能是由于高度磷酸化。将数据表示为箱线图，用Tukey方法描述中位数、四分位间距、最小值、最大值和离群值的单个点。统计检验的显著性：****p<0.001，***p<0.001，

**p<0.01，*p<0.05。

图28A是在实施例3中定量并在图19B和图19C中进一步讨论来自tau的胰蛋白酶肽(灰色条)以及抗体HJ8.5和Tau1的一般结合位点的示意图。

图28B是显示对照人CSF中的tau分布的图。通过聚焦N-端至中间结构域tau的Tau1/HJ8.5免疫沉淀对来自淀粉样蛋白阴性患者和CDR＝0患者(n＝30)的横截面队列的对照人CSF中的Tau肽进行定量。为了定量含有微管结合区(MTBR)和C-端区域的物质，对免疫沉淀后的CSF样品依次进行化学萃取和分析。使用Tau1/HJ8.5免疫沉淀方法(蓝色圆圈)，肽回收率在残基222以后急剧下降；因此，仅对N-端至中间结构域tau(残基6-23至243-254)肽通过该方法进行了定量(Sato等人，2018)。相比之下，免疫沉淀后的CSF的化学萃取方法(红色正方形)使得能够定量处于0.4-7ng/mL之间的浓度的整个tau区域包括MTBR至C-端区域。将数据表示为平均值。

图29A、图29B和图29C显示CSF MTBR-tau-243、299和354物质在整个阿尔茨海默氏病连续谱中表现出独特的特征，反映了缠结状态。图29A MTBR-tau-243，图29B MTBR-tau-299，和图29CMTBR-tau-354浓度。淀粉样蛋白阴性CDR＝0(n＝30)，淀粉样蛋白阳性CDR＝0(n＝18)，淀粉样蛋白阳性CDR＝0.5(n＝28)，淀粉样蛋白阳性CDR≥1(n＝12)，和淀粉样蛋白阴性CDR≥0.5(n＝12)。MTBR-tau-243在所有临床阶段随着AD进展而持续增加。MTBR-tau-299和354浓度类似地增加，直至非常轻度的AD阶段(淀粉样蛋白阳性和CDR＝0.5)，但随后在CDR≥1时饱和(MTBR-tau-299)或减少(MTBR-tau-354)。

****p<0.001，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。NS＝不显著。

图30A、图30B、图30C和图30D显示CSF MTBR-tau-243与包括p-tau217在内的所有tau物质中的tau PET测量的相关性最高，表明CSF MTBR-tau-243是概述tau病理学的最有希望的生物标志物。在tau PET(AV-1451)SUVR和在CSF中的图30A MTBR-tau-243、图30BMTBR-tau-299、图30C p-tau217浓度和图30D p-tau217磷酸化占据之间的相关性(对照n＝15和阿尔茨海默氏病(AD)n＝20，来自tau PET队列)。空心圆形：对照，实心正方形：AD。MTBR-tau-243显示与tau PET SUVR最显著的相关性(斯皮尔曼r＝0.7588，p<0.0001)，而MTBR-tau-299、p-tau217浓度和p-tau217磷酸化占据显示中等相关性(分别为斯皮尔曼r＝0.4584、0.5478和0.5555)，并且在高tau PET测量样品中观察到饱和。

图31显示了在Tau1/HJ8.1-IP之后通过化学萃取的MTBR-tau243相对于MTBR-tau212，其中对于MTBR-tau212，CX提供了阶段性增加，而E2814-IP没有。

图32显示了在Tau1/HJ8.1-IP之后通过化学萃取的MTBR-tau243相对于MTBR-tau212，其中对于MTBR-tau212，CX提供了阶段性增加，而E2814-IP没有。

详细描述

Tau蛋白在中枢神经系统中聚集成神经原纤维缠结是包括阿尔茨海默氏病(AD)在内的某些神经变性障碍的病因。尽管尚未完全了解tau不稳定的机制，但已经发现tau蛋白在tau聚集体中过度磷酸化。此外，tau的微管结合区(MTBR)已被认为在AD脑中的聚集体中富集。但是，对于整个AD进展过程中相应的细胞外pTau和含有MTBR的tau物质的病理生理学知之甚少。在血液和CSF中存在多种tau肽，但由于这些多肽的非常低的丰度，在这些生物样品中tau物质的检测和定量一直受到阻碍。

申请人已经发现，定量tau(例如在特定氨基酸残基处的磷酸化和/或MTBRtau)的某些方法可以被用于追踪AD从其临床前无症状阶段到有症状阶段的过程。鉴于tau同工型、翻译后修饰、丰度和溶解度的极大变异性，在AD相关症状发作之前使用tau物质对受试者分期并指导治疗决策一直是难以捉摸的。但是，申请人已经鉴定了定量tau物质的特定组合的方法，其对于鉴定从由AD引起的痴呆的发作到某些病理生理学变化的发展的年数是特别有用的。

本文公开的方法采用将生物样品转化为适合定量各种tau物质的样品的独特的加工步骤组合。例如，在本公开内容的一些方法中，加工步骤耗竭某些蛋白同时富集多种tau蛋白。在本公开内容的其它方法中，加工步骤耗竭某些蛋白同时富集多种MTBRtau蛋白。本文公开的某些方法特别适合于定量中间结构域非依赖性的MTBRtau物质。本文还描述了中间结构域非依赖性的MTBRtau物质和在某些氨基酸残基处的tau磷酸化测量tau病变的临床征象和症状、诊断tau病变和直接治疗tau病变的用途。下面更全面地描述本发明的这些和其它方面以及迭代。

I.定义

为了可以更容易地理解本发明，首先定义某些术语。除非另外定义，否则在本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明的实施方案所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。许多与本文描述的方法和材料相似、修改或等效的方法和材料无需过多实验即可用于本发明的实施方案的实践中，本文描述了优选的材料和方法。在描述和要求保护本发明的实施方案时，将根据以下阐述的定义使用以下术语。

如本文中使用的，术语“约”是指可以例如通过典型的测量技术和设备相对于任何可计量的变量而发生数值量的变化，所述变量包括但不限于质量、体积、时间、距离和量。此外，鉴于在现实世界中使用的固体和液体处理程序，存在某些非故意误差和变化，其可能通过被用于制造组合物或实施方法等的成分的制造、来源或纯度的差异而产生。术语“约”也涵盖这些变化，其可以为至高±5％，但也可以是±4％、3％、2％、1％等。无论是否被术语“约”修饰，权利要求包括所述量的等价物。

如本文中使用的，抗体是指如本领域所理解的完整抗体，即由两条重链和两条轻链组成，并且还指具有抗原结合区的任何抗体样分子，包括但不限于抗体片段诸如Fab’、Fab、F(ab’)2、单域抗体、Fv和单链Fv。术语抗体也指多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体和人源化抗体。用于制备和使用各种基于抗体的构建体和片段的技术是本领域众所周知的。用于制备和表征抗体的方法也是本领域众所周知的(参见例如Antibodies:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory,1988；通过引用整体并入本文)。

如本文中使用的，术语“适体”是指表示一种多核苷酸，通常是RNA或DNA，其在生化活性、分子识别或结合属性方面具有有用的生物活性。通常，适体具有分子活性，诸如与靶分子在特定表位(区域)处结合。通常认为，可以通过体外进化方法来合成和/或鉴定与多肽特异性结合的适体。用于制备和表征适体的手段，包括通过体外进化方法，是本领域众所周知的。参见例如US 7,939,313，通过引用整体并入本文。

术语“Aβ”是指源自被称为淀粉样蛋白前体蛋白(APP)的较大蛋白的羧基端区域的肽。编码APP的基因位于21号染色体上。存在可能具有毒性效应的多种形式的Aβ：Aβ肽的长度通常为37-43个氨基酸序列，但它们可以具有改变其整体大小的截断和修饰。它们可以在可溶性和不溶性隔室中以单体、寡聚体和聚集体形式存在于细胞内或细胞外，并且可以与其它蛋白或分子复合。Aβ的不利或毒性作用可归因于任何或所有上述形式，以及未具体描述的其它形式。例如，两种此类Aβ同工型包括Aβ40和Aβ42；其中Aβ42同工型特别是原纤维形成性或不溶性的并且与疾病状态相关。术语“Aβ”通常是指多个Aβ物质，而不区分单个Aβ物质。通过肽的大小来鉴定具体Aβ物质，例如Aβ42、Aβ40、Aβ38等。

如本文中使用的，术语“Aβ42/Aβ40值”意指获得自受试者的样品中Aβ42的量相较于同一样品中Aβ40的量的比率。

“Aβ淀粉样变性”被定义为在脑中的临床上异常的Aβ沉积。被确定具有Aβ淀粉样变性的受试者在本文中被称作“淀粉样蛋白阳性”，而确定不具有Aβ淀粉样变性的受试者在本文中被称作“淀粉样蛋白阴性”。在本领域中存在获接受的Aβ淀粉样变性指标。在本公开内容时，通过淀粉样蛋白成像(例如PiB PET、氟贝他吡(fluorbetapir)或本领域已知的其它成像方法)直接测量Aβ淀粉样变性，或通过减少的脑脊液(CSF)Aβ42或降低的CSF Aβ42/40比率间接测量Aβ淀粉样变性。具有>0.18的平均皮质结合潜力(MCBP)评分的[11C]PIB-PET成像是Aβ淀粉样变性的指标，通过免疫沉淀和质谱法(IP/MS))测量的约1ng/ml的脑脊液(CSF)Aβ42浓度也是如此。可替换地，可以使用使如通过PIB-PET确定的淀粉样蛋白阳性预测的准确性最大化的CSF Aβ42/40的截止比率。值，诸如这些值或本领域已知和/或在实施例中使用的其它值，可以单独使用或组合使用以在临床上确认Aβ淀粉样变性。参见例如Klunk W E等人.AnnNeurol 55(3)2004，Fagan A M等人.Ann Neurol,2006,59(3)，Patterson等人，Annals ofNeurology,2015,78(3):439-453，或Johnson等人，J.Nuc.Med.,2013,54(7):1011-1013，各自特此通过引用整体并入。具有Aβ淀粉样变性的受试者可能有症状，也可能没有症状，并且有症状的受试者可能满足也可能不满足与Aβ淀粉样变性相关的疾病的临床标准。与Aβ淀粉样变性相关的症状的非限制性实例可以包括受损的认知功能、改变的行为、异常的语言功能、情绪失调、癫痫发作(seizure)、痴呆和受损的神经系统结构或功能。与Aβ淀粉样变性相关的疾病包括但不限于阿尔茨海默氏病(AD)、脑淀粉样血管病(CAA)、路易小体痴呆和包涵体肌炎。具有Aβ淀粉样变性的受试者处于增加的进展与Aβ淀粉样变性相关的疾病的风险中。

“Aβ淀粉样变性的临床征象”是指本领域已知的Aβ沉积的度量。Aβ淀粉样变性的临床征象可以包括但不限于通过淀粉样蛋白成像(例如PiB PET、氟贝他吡或本领域已知的其它成像方法)或通过减少的脑脊液(CSF)Aβ42或Aβ42/40比率鉴定的Aβ沉积。参见例如KlunkWE等人.Ann Neurol 55(3)2004，和Fagan AM等人.AnnNeurol 59(3)2006，各自特此通过引用整体并入。Aβ淀粉样变性的临床征象还可以包括Aβ代谢的度量，特别是单独或与其它Aβ变体(例如Aβ37、Aβ38、Aβ39、Aβ40和/或总Aβ)的代谢度量相比的Aβ42代谢的度量，如美国专利系列号14/366,831、14/523,148和14/747,453中所述，各自特此通过引用整体并入。另外的方法描述于Albert等人.Alzheimer’s&Dementia 2007年第7卷，第170-179页；McKhann等人，Alzheimer’s&Dementia 2007年第7卷，第263-269页；和Sperling等人.Alzheimer’s&Dementia 2007年第7卷，第280-292页中，各自特此通过引用整体并入。重要的是，具有Aβ淀粉样变性的临床征象的受试者可能有也可能没有与Aβ沉积相关的症状。但是，具有Aβ淀粉样变性的临床征象的受试者处于增加的进展与Aβ淀粉样变性相关的疾病的风险中。

“淀粉样蛋白成像的候选者”是指已经被临床医师鉴定为可能在临床上需要淀粉样蛋白成像的个体的受试者。作为非限制性实例，淀粉样蛋白成像的候选者可以是具有一种或多种Aβ淀粉样变性的临床征象、一种或多种Aβ斑块相关的症状、一种或多种CAA相关的症状或其组合的受试者。临床医师可能为此类受试者推荐淀粉样蛋白成像以指导他或她的临床护理。作为另一个非限制性实例，淀粉样蛋白成像的候选者可以是与Aβ淀粉样变性相关的疾病的临床试验的潜在参与者(对照受试者或试验受试者)。

“Aβ斑块相关的症状”或“CAA相关的症状”分别是指由淀粉样蛋白斑块或CAA的形成造成或与其相关的任何症状，其由被称为淀粉样蛋白原纤维的规则有序的原纤维状聚集体组成。示例性的Aβ斑块相关的症状可以包括但不限于神经元变性、受损的认知功能、受损的记忆、改变的行为、情绪失调、癫痫发作、受损的神经系统结构或功能以及增加的阿尔茨海默氏病或CAA发展或恶化的风险。神经元变性可以包括神经元结构的变化(包括分子变化诸如有毒蛋白、蛋白聚集体等的细胞内积累，以及宏观水平的变化诸如轴突或树突的形状或长度的变化、髓鞘组成的变化、髓鞘的丧失等)、神经元功能的变化、神经元功能的丧失、神经元的死亡或它们的任何组合。受损的认知功能可以包括但不限于记忆、注意力、集中力、语言、抽象思维、创造力、执行功能、计划和组织方面的困难。改变的行为可以包括但不限于身体或言语攻击、冲动行为、减少的抑制、情感淡漠、减少的主动性、人格的改变、对乙醇、烟草或毒品的滥用以及其它成瘾相关的行为。情绪失调可以包括但不限于抑郁、焦虑、躁狂、易怒和情绪失控。癫痫发作可以包括但不限于全身性强直阵挛发作、复杂部分性发作和非癫痫性心因性癫痫发作。受损的神经系统结构或功能可以包括但不限于脑积水、帕金森症、睡眠障碍、精神病、平衡和协调损伤。这可包括运动损伤诸如单肢轻瘫、轻偏瘫、四肢轻瘫、共济失调、颤搐和震颤。这还可以包括感觉丧失或功能障碍，包括嗅觉、触觉、味觉、视觉和听觉。此外，这可以包括自主神经系统损伤诸如肠道和膀胱功能障碍、性功能障碍、血压和温度失调。最后，这可以包括可归因于下丘脑和垂体的功能障碍的激素损伤，诸如生长激素、促甲状腺激素、促黄体激素、促卵泡激素、促性腺素释放激素、催乳素以及许多其它激素和调节剂的缺乏和失调。

如本文中使用的，术语”受试者”是指哺乳动物，优选人。所述哺乳动物包括但不限于人类、灵长类动物、家畜、啮齿类动物和宠物。受试者可能正在等待医疗护理或治疗，可能正在接受医疗护理或治疗，或者可能已经接受了医疗护理或治疗。

如本文中使用的，术语“对照群体”、“正常群体”或来自“健康”受试者的样品表示一位受试者或一组受试者，其基于定性或定量试验结果，在临床上被确定不具有tau病变或Aβ淀粉样变性或与Aβ淀粉样变性相关的临床疾病(包括但不限于阿尔茨海默氏病)。“正常”受试者通常与待评价的个体为大致相同年龄，包括但不限于相同年龄的受试者和在5至10岁范围内的受试者。

如本文中使用的，术语“血液样品”是指源自血液、优选外周(或循环)血液的生物样品。血液样品可以是全血、血浆或血清，尽管血浆通常是优选的。

如本文中使用的，术语“同工型”是指由于编码蛋白的mRNA的可变剪接、蛋白的翻译后修饰、蛋白的蛋白水解性加工、遗传变异和体细胞重组而产生的相同蛋白变体的几种不同形式中的任一种。术语“同工型”和“变体”互换使用。

术语“tau”是指由基因MAPT(或其同系物)编码的多种同工型，以及在体内C端截短的、在体内N端截短的、在体内翻译后修饰或它们的任何组合的其物质。如本文中使用的，术语“tau”和“tau蛋白”和“tau物质”可以互换使用。在许多动物中，tau由基因MAPT编码，所述动物包括但不限于人类、非人灵长类动物、啮齿类动物、鱼、牛、青蛙、山羊和鸡。在基因未被鉴定为MAPT的动物中，可以通过本领域众所周知的方法鉴定同系物。

在人类中，存在六种由MAPT的外显子2、3和10的可变剪接产生的tau同工型。这些同工型的长度范围为352至441个氨基酸。外显子2和3各自在N端编码29个氨基酸的插入片段(称为N)，并且全长人tau同工型可能具有两个插入片段(2N)、一个插入片段(1N)或没有插入片段(0N)。所有全长人tau同工型还具有微管结合结构域(称为R)的三个重复。在C端包含外显子10导致包含由外显子10编码的第四个微管结合结构域。因此，全长人tau同工型可以由微管结合结构域的四个重复(包括外显子10：R1、R2、R3和R4)或微管结合结构域的三个重复(不包括外显子10：R1、R3和R4)构成。人tau可进行或不进行翻译后修饰。例如，本领域中已知，tau可以被磷酸化、泛素化、糖基化和糖化。人tau也可以在C端处、在N端处或者在C端和N端处在体内进行或不进行蛋白水解加工。因此，术语“人tau”涵盖2N3R、2N4R、1N3R、1N4R、0N3R和0N4R同工型，以及在体内C端截短的、在体内N端截短的、在体内翻译后修饰或它们的任何组合的其物质。编码tau的基因的可变剪接也类似地发生在其它动物中。

如本文中使用的，术语“tau-441”是指最长的人tau同工型(2N4R)，其长度为441个氨基酸。tau-441的氨基酸序列作为SEQ ID NO:1提供。在图1中鉴定了该同工型的N-端(N端)、中间结构域、MTBR和C-端(C端)。对于其它tau同工型(例如2N3R、1NR4、1N3R、0N4R和0N3R)，这些区域将以可预测的方式变化。因此，当相对于tau-441鉴定氨基酸位置时，熟练的技术人员将能够确定其它同工型的相应氨基酸位置。除非另外指出，否则在本公开内容中使用的氨基酸残基编号是基于tau-441(例如T217是在tau-441的位置217处的苏氨酸残基)。

如本文中使用的，术语“N-端tau”是指包含tau的N-端的两个或更多个氨基酸(例如tau-441的氨基酸1-103等)的一个tau蛋白或多个tau蛋白。

如本文中使用的，术语“中间结构域tau”是指包含tau的中间结构域的两个或更多个氨基酸(例如tau-441的氨基酸104-243等)的一个tau蛋白或多个tau蛋白。

如本文中使用的，术语“MTBRtau”是指包含tau的微管结合区(MTBR)的两个或更多个氨基酸(例如tau-441的氨基酸244-368等)的一个tau蛋白或多个tau蛋白。

如本文中使用的，术语“C-端tau”是指包含tau的C-端的两个或更多个氨基酸(例如tau-441的氨基酸369-441等)的一个tau蛋白或多个tau蛋白。

“tau的蛋白水解肽”是指通过体外蛋白水解裂解产生的tau蛋白的肽片段。“tau的胰蛋白酶肽”是指通过用胰蛋白酶体外切割产生的tau蛋白的肽片段。tau的胰蛋白酶肽在本文中可以通过它们的前四个氨基酸来指代。例如，“LQTA”(SEQ ID NO:3的前四个氨基酸)是指胰蛋白酶肽LQTAPVPMPDLK(SEQ ID NO:3)。通过其前四个氨基酸鉴定的其它胰蛋白酶肽的非限制性实例包括IGST(SEQ ID NO:2)、VQII(SEQ ID NO:4)、LDLS(SEQ ID NO:5)、HVPG(SEQ ID NO:6)、IGSL(SEQ ID NO:7)、VQIV(SEQ ID NO:9)和TPPS(SEQ ID NO:10)。

与脑中的tau沉积相关的疾病在本文中被称作“tau病变”。术语“tau沉积”包括所有形式的病理性tau沉积物，包括但不限于神经原纤维缠结、神经毡细丝(neuropilthread)和营养不良性神经突中的tau聚集体。本领域已知的tau病变包括但不限于进行性核上性麻痹(PSP)、拳击员痴呆、慢性创伤性脑病、与17号染色体相关的额颞痴呆和帕金森症、Lytico-Bodig病、关岛帕金森-痴呆复合征、缠结优势性痴呆、神经节细胞胶质瘤(ganglioglioma)和神经节细胞瘤(gangliocytoma)、脑膜血管瘤病、亚急性硬化性全脑炎、铅脑病、结节性硬化症、哈-斯二氏病、脂褐质沉积症、皮克病、皮质基底节变性(CBD)、嗜银性颗粒疾病(AGD)、额颞叶退化(FTLD)、阿尔茨海默氏病(AD)和额颞痴呆(FTD)。

根据在病理性tau沉积物中发现的tau异构体的优势对tau病变进行分类。具有主要由具有三个MTBR的tau组成的tau沉积物的那些tau病变被称作“3R-tau病变”。皮克病是3R-tau病变的非限制性实例。为清楚起见，一些3R-tau病变的病理性tau沉积物可能是3R和4Rtau同工型的混合物，其中3R同工型占优势。通常认为在阿尔茨海默氏病受试者的脑中的细胞内神经原纤维缠结(即tau沉积物)含有大约等量的3R和4R同工型两者。具有主要由具有四个MTBR的tau组成的tau沉积物的那些tau病变被称作“4R-tau病变”。PSP、CBD和AGD是4R-tau病变的非限制性实例，一些形式的FTLD也是如此。值得注意的是，在一些具有在遗传上证实的FTLD病例的受试者(诸如一些V334M和R406W突变携带者)脑中的病理性tau沉积物显示3R和4R同工型的混合物。

tau病变的临床征象可能是脑中tau的聚集体，包括但不限于神经原纤维缠结。用于检测和定量脑中tau聚集体的方法是本领域已知的(例如使用tau-特异性配体诸如THK5317、THK5351、AV1451、PBB3、MK-6240、RO-948、PI-2620、GTP1、PM-PBB3和JNJ64349311、JNJ-067)等的tau PET)。

如本文中使用的，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指由经过训练且有执照的专业人员向需要其的受试者提供医疗护理。医疗护理可以是诊断试验、治疗性处理和/或预防性或防止性措施。治疗性和预防性处理的目的是预防或减缓(减轻)不期望的生理学变化或疾病/障碍。治疗性或预防性处理的有益或期望的临床结果包括但不限于症状的缓解、疾病程度的减轻、疾病的稳定(即不恶化)状态、疾病进展的推迟或减慢、疾病状态的改善或缓和以及康复(无论是部分的还是完全的)，无论是可检测的还是不可检测的。“治疗”也可以意指与如果不接受治疗所预期的存活期相比延长的存活。需要治疗的那些包括已经患有疾病、病症或障碍的那些以及易于患有疾病、病症或障碍的那些或者其中待预防疾病、病症或障碍的那些。因此，需要治疗的受试者可能具有或没有疾病的任何症状或临床征象。

短语“tau疗法”统指被考虑用于或被用于处于进展tau病变的风险中的受试者或在临床上被诊断为具有tau病变的受试者的任何成像剂、治疗性治疗和/或预防性或防止性措施。成像剂的非限制性实例包括功能成像剂(例如氟脱氧葡萄糖等)和分子成像剂(例如匹兹堡化合物B、氟比他班、氟贝他吡(florbetapir)、氟美他酚、放射性标记的tau-特异性配体、放射性核素标记的抗体等)。治疗剂的非限制性实例包括胆碱酯酶抑制剂、N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)拮抗剂、抗抑郁药(例如选择性血清素重摄取抑制剂、非典型抗抑郁药、氨基酮、选择性血清素和去甲肾上腺素重摄取抑制剂、三环抗抑郁药等)、γ-分泌酶抑制剂、β-分泌酶抑制剂、抗-Aβ抗体(包括其抗原结合片段、变体或衍生物)、抗-tau抗体(包括其抗原结合片段、变体或衍生物)、干细胞、饮食补充物(例如锂水、含硫辛酸的ω-3脂肪酸、长链甘油三酯、染料木黄酮、白藜芦醇、姜黄素和葡萄籽提取物等)、血清素受体6的拮抗剂、p38αMAPK抑制剂、重组粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、被动免疫疗法、主动疫苗(例如CAD106、AF20513等)、tau蛋白聚集抑制剂(例如TRx0237、亚甲蓝氯化物(methylthionimiumchloride)等)、改善血糖控制的疗法(例如胰岛素、艾塞那肽、利拉鲁肽、吡格列酮等)、抗炎剂、磷酸二酯酶9A抑制剂、σ-1受体激动剂、激酶抑制剂、磷酸酶活化剂、磷酸酶抑制剂、血管紧张素受体阻滞剂、CB1和/或CB2内源性大麻素受体部分激动剂、β-2肾上腺素能受体激动剂、烟碱乙酰胆碱受体激动剂、5-HT2A反向激动剂、α-2c肾上腺素能受体拮抗剂、5-HT 1A和1D受体激动剂、谷氨酰胺酰肽环转移酶抑制剂、APP产生的选择性抑制剂、单胺氧化酶B抑制剂、谷氨酸受体拮抗剂、AMPA受体激动剂、神经生长因子刺激剂、HMG-CoA还原酶抑制剂、神经营养剂、毒蕈碱M1受体激动剂、GABA受体调节剂、PPAR-γ激动剂、微管蛋白调节剂、钙通道阻滞剂、抗高血压剂、他汀类和它们的任何组合。

“显著偏离平均值”是指比平均值(即来自正常受试者或正常群体的tau物质的平均水平)高或低至少1个标准差、优选至少1.3个标准差、更优选至少1.5个标准差或甚至更优选至少2个标准差的值。

短语“Aβ和tau疗法”统指被考虑用于或被用于处于进展Aβ淀粉样变性或AD的风险中的受试者、被诊断为具有Aβ淀粉样变性的受试者、被诊断为具有tau病变的受试者或被诊断为具有AD的受试者的任何成像剂或治疗剂。

II.测量tau的方法

本公开内容提供了通过质谱法测量生物样品中的tau的方法。一般而言，本公开内容的用于测量生物样品中tau的方法包含提供生物样品，通过耗竭一种或多种蛋白并然后纯化tau来加工所述生物样品，用蛋白酶切割所述纯化的tau，并然后任选地通过固相萃取将所得切割产物脱盐以得到包含tau的蛋白水解肽的样品，以及对包含tau的蛋白水解肽的样品进行液相色谱法-质谱法以检测和测量tau的至少一种蛋白水解肽的浓度(相对或绝对)。因此，在实践中，所公开的方法使用tau的至少一种蛋白水解肽来检测和测量在生物样品中存在的tau的量。

在一个实施例中，本公开内容的方法包含(a)提供选自血液样品或CSF样品的生物样品；(b)通过蛋白沉淀和分离沉淀的蛋白从所述生物样品中除去蛋白以得到上清液；(c)通过固相萃取从所述上清液中纯化tau；(d)用蛋白酶切割所述纯化的tau，并然后任选地通过固相萃取将所得切割产物脱盐以得到包含tau的蛋白水解肽的样品；和(e)用包含tau的蛋白水解肽的样品执行液相色谱法-质谱法以检测和测量tau的至少一种蛋白水解肽的浓度。

在另一个实施例中，本公开内容的方法包含(a)通过亲合力耗竭在生物样品中减少N-端tau、中间结构域tau或N-端tau和中间结构域tau，其中所述生物样品是血液样品或CSF样品；(b)通过包含以下的方法富集在亲合力耗竭以后剩余可被称作N-端非依赖性的tau和/或中间结构域非依赖性的tau的tau：(i)通过蛋白沉淀和分离沉淀的蛋白从所述生物样品中除去另外的蛋白以得到上清液，并然后通过固相萃取从所述上清液中纯化tau，或(ii)亲合力纯化MTBRtau，由此通过(i)或(ii)产生富集的tau；(c)用蛋白酶切割所述富集的tau，并然后任选地通过固相萃取将所得切割产物脱盐以得到包含tau的蛋白水解肽的样品；和(d)用包含tau的蛋白水解肽的样品进行液相色谱法-质谱法(LC/MS)以检测和测量tau的至少一种蛋白水解肽的浓度。

在另一个实施例中，本公开内容的方法包含(a)通过亲合力耗竭在生物样品中减少N-端tau、中间结构域tau或N-端tau和中间结构域tau，其中所述生物样品是血液样品或CSF样品；(b)通过蛋白沉淀和分离沉淀的蛋白从所述亲合力耗竭的样品中除去另外的蛋白以得到上清液；(c)通过固相萃取从所述上清液中纯化tau；(d)用蛋白酶切割所述纯化的tau，并然后任选地通过固相萃取将所得切割产物脱盐以得到包含tau的蛋白水解肽的样品；和(e)用包含tau的蛋白水解肽的样品执行液相色谱法-质谱法以检测和测量tau的至少一种蛋白水解肽的浓度。

在另一个实施例中，本公开内容的方法包含(a)通过亲合力耗竭在生物样品中减少N-端tau、中间结构域tau或N-端tau和中间结构域tau，其中所述生物样品是血液样品或CSF样品；(b)从所述亲合力耗竭的样品中亲合力纯化MTBRtau；(c)用蛋白酶切割所述纯化的MTBRtau，并然后任选地通过固相萃取将所得切割产物脱盐以得到包含MTBRtau的蛋白水解肽的样品；和(d)用包含MTBR tau的蛋白水解肽的样品进行液相色谱法-质谱法以检测和测量MTBRtau的至少一种蛋白水解肽的浓度。

在另一个实施例中，本公开内容的方法包含(a)从生物样品中亲合力纯化MTBRtau，其中所述生物样品是血液样品或CSF样品；(b)用蛋白酶切割所述纯化的MTBRtau，并然后任选地通过固相萃取将所得切割产物脱盐以得到包含MTBRtau的蛋白水解肽的样品；和(c)用包含MTBRtau的蛋白水解肽的样品进行液相色谱法-质谱法以检测和测量MTBRtau的至少一种蛋白水解肽的浓度。

本公开内容进一步考虑在以上方法中的每一种中测量在tau的一个或多个残基处的磷酸化占据。磷酸化占据也被称作磷酸化的化学计量，是通过定量在tau的一个或多个残基处的磷酸化来测量的。使用残基T217进行说明，磷酸化占据通常被表达为pT217/T217，其中分子“pT217”是磷酸化的残基T217的量(相对或绝对)，并且分母“T217”是残基T217的量(相对或绝对)。当测量在tau的两个或更多个残基处的磷酸化时，所述方法可以进一步包含计算这些值之间的比率或另一种数学关系。在一些实施方案中，本文中的方法包含测量在一个或多个残基处的tau磷酸化，所述残基选自T111、S113、T181、S199、S202、S208、T153、T175、T205、S214、T217和T231。在一些实施方案中，本文中的方法包含测量在一个或多个残基处的tau磷酸化，所述残基选自T111、T181、S208、T153、T175、T205、S214、T217和T231。在一些实施方案中，本文中的方法包含测量在一个或多个残基处的tau磷酸化，所述残基选自T111、T153、T181、T205、S208、T217和T231。在一些实施方案中，本文中的方法包含测量在一个或多个残基处的tau磷酸化，所述残基选自T111、T153、T181、T205、T217和T231。在一些实施方案中，本文中的方法包含测量在一个或多个残基处的tau磷酸化，所述残基选自T111、T153、T181、T217和T231。在一些实施方案中，本文中的方法包含测量在一个或多个残基处的tau磷酸化，所述残基选自T111、T153、T181、T205、S208和T217。在一些实施方案中，本文中的方法包含测量在一个或多个残基处的tau磷酸化，所述残基选自T181、T205和T217。在一些实施方案中，本文中的方法包含测量在T205处的tau磷酸化。在一些实施方案中，本文中的方法包含测量在T205处和任选在一个或多个另外的残基处的tau磷酸化，所述另外的残基选自T111、T181、S208、T153、T175、S214、T217和T231。在一些实施方案中，本文中的方法包含测量在T205处和任选在一个或多个另外的残基处的tau磷酸化，所述另外残基选自T111、T153、T181、S208和T217。在一些实施方案中，本文中的方法包含测量在T205处和任选在一个或多个另外的残基处的tau磷酸化，所述另外残基选自T181和T217。

一般而言，使用任何包含tau的样品都可以测量在tau的一个或多个残基处的磷酸化占据。但是，氨基酸残基可能影响应使用哪种样品。例如，如果期望测量在T111处的tau磷酸化，并且将血液或CSF样品使用抗体Tau1或其它将C端结合到T111的亲合纯化试剂来亲合力耗竭中间结构域tau，则应当使用与所述亲合纯化试剂结合的tau来测量pT111/T111。在某些实施方案中，磷酸化占据的测量可以使用富集中间结构域tau(或富集N-端和中间结构域tau)的样品。

本公开内容不限于任何一种定量评估tau的位点特异性磷酸化的特定方法。合适的方法应当区分仅在单个氨基酸的磷酸化状态方面不同的tau同工型，区分在不同氨基酸处磷酸化的p-tau同工型，并定量独立于总tau中整体变化的在特定位点发生的磷酸化的变化。独立于总tau中整体变化的在特定位点发生的磷酸化化学计量的变化可以通过以下三种方案之一进行定量：1)磷酸化的肽异构体之间的相对对比，其可以被用于估计共享相同序列的每种磷酸化的肽的相对丰度；2)用来自tau蛋白的任意肽作为参考将磷酸化的肽归一化；和3)使用每种磷酸化和非磷酸化的肽的内部合成的标记的标准品进行绝对定量，其中将每种磷酸化的肽的绝对定量值用对来自tau蛋白的任何肽所得到的任何绝对定量值进行归一化。所有三种方法都使用内部归一化来对校每个位点的相对磷酸化变化。也可以使用本领域已知的其它方法。当使用内部合成的标记的标准品进行绝对定量时，优选在加工样品以富集可溶性tau之前将标记的标准品掺入样品中。

在示例性实施方案中，通过高分辨率质谱法测量tau的位点特异性磷酸化。质谱仪的合适类型是本领域已知的。这些包括但不限于四极杆、飞行时间、离子阱和Orbitrap，以及将不同类型的质量分析仪组合到一种架构中的混合质谱仪(例如来自ThermoFisherScientific的Orbitrap Fusion^TM Tribrid^TM质谱仪)。在MS分析之前通常将Tau蛋白水解消化。合适的蛋白酶包括但不限于胰蛋白酶、Lys-N、Lys-C和Arg-N。当使用亲合纯化/耗竭来生产tau样品时，消化可能会在从固定化配体上洗脱tau以后或在tau与固定化配体结合时发生。亲合纯化/耗竭在第II(c)部分中有详细描述。在一个或多个净化步骤之后，可以通过与高分辨率质谱仪接合的液相色谱系统来分离消化的tau肽。可以通过常规实验来优化色谱系统以产生期望的LC-MS模式。可施用广泛的LC-MS技术来定量分析位点特异性的tau磷酸化。非限制性实例包括选择的反应监测、平行反应监测、选择的离子监测和数据非依赖性采集。如上所述，位点特异性的tau磷酸化的所有定量评估都应考虑总tau整体变化。在示例性实施方案中，使用在实施例中概述的质谱方案。

本公开内容进一步考虑在以上方法中的每一种中测量总tau。Tau可以在可溶性和不溶性隔室中以单体和聚集体形式以有序或无序结构存在于细胞内或细胞外，并且可以与其它蛋白或分子复合。因此，生物样品的来源(例如脑组织、CSF、血液等)和生物样品的任何下游加工将影响在给定样品中的tau同工型的总数。可以通过质谱法进行总tau测量。可替换地，可以通过免疫测定或其它定量tau浓度的方法来测量总tau。在具体实施方案中，可以通过质谱法通过定量TPSL(SEQ ID NO:18的前四个氨基酸)胰蛋白酶肽(即TPSLPTPPTR(SEQIDNO:18))或TPPS(SEQ ID NO:10的前四个氨基酸)胰蛋白酶肽(即TPPSSGEPPK(SEQ ID NO:10))来测量总tau。在某些实施方案中，总tau的测量可以使用富集中间结构域tau(或富集N-端和中间结构域tau)的样品。

在仍然进一步的实施方案中，本公开内容考虑在以上方法中的每一种中确定在生物样品中一种或多种蛋白的存在/不存在和/或测量生物样品中的一种或多种另外的蛋白的浓度。在一些实施方案中，所述一种或多种蛋白可以是在纯化tau之前从生物样品中耗竭的蛋白。例如，在某些实施方案中，N-端tau和/或中间结构域tau物质可以与通过本文公开的方法定量的tau物质(例如MTBRtau、C-端tau)分开地进行鉴定和/或定量。可替换地或另外，可以通过平行加工生物样品的一部分，通过在用于本文公开的方法中之前从生物样品中耗竭感兴趣的蛋白，或通过在本文公开的样品加工步骤期间从生物样品中耗竭感兴趣的蛋白，来鉴定和/或定量Aβ、ApoE或任何其它感兴趣的蛋白。

在下面更详细地描述了生物样品、合适的内标以及耗竭一种或多种蛋白、纯化tau、用蛋白酶切割纯化的tau以及质谱法的步骤。

(a)生物样品

合适的生物样品包括获得自受试者的血液样品或脑脊液(CSF)样品。在一些实施方案中，所述受试者是人。人受试者可以正在等待医疗护理或治疗，可以处于医疗护理或治疗下，或者可以已经接受医疗护理或治疗。在各种实施方案中，人受试者可以是健康的受试者、处于发展神经变性疾病的风险中的受试者、具有神经变性疾病的征象和/或症状的受试者或者诊断出神经变性疾病的受试者。在其它实施方案中，所述神经变性疾病可以是tau病变。在具体实施例中，所述tau病变可以是阿尔茨海默氏病(AD)、进行性核上性麻痹(PSP)、皮质基底节变性(CBD)或额颞叶退化(FTLD)。在其它实施方案中，所述受试者是实验动物。在进一步的实施方案中，所述受试者是被遗传工程改造成表达人tau和任选的一种或多种另外的人蛋白(例如人Aβ、人ApoE等)的实验动物。

CSF可以已经通过用或不用留置CSF导管的腰椎穿刺术获得。可以合并从受试者同时收集的多个血液或CSF样品。血液可以已经通过用或不用静脉内导管的静脉穿刺术或通过指尖采血(或其等效方式)收集。一旦收集，就可以将血液或CSF样品根据本领域已知的方法进行加工(例如离心以除去全细胞和细胞碎片；使用被设计为在分析试验之前稳定和保存样品的添加剂等)。血液或CSF样品可以立即使用，或可以被冷冻并无限期保存。在用于本文公开的方法之前，如果需要或期望的话，生物样品还可以已被修改，以包括蛋白酶抑制剂、同位素标记的内标、(一种或多种)去污剂和(一种或多种)离液剂，和/或耗竭其它分析物(例如蛋白、肽、代谢物)。

所用样品的大小可以并且将会根据样品类型、样品获得自其的受试者的健康状况以及待分析的分析物(除了tau之外)而变化。CSF样品体积可以是约0.01mL至约5mL，或约0.05mL至约5mL。在具体实施例中，样品的大小可以是约0.05mL至约1mL CSF。血浆样品体积可以是约0.01mL至约20mL。

(b)同位素标记的内部tau标准品

同位素标记的tau可以被用作内标，以解释在整个样品加工过程中的变异性，并任选地以计算绝对浓度。通常，在重要的样品加工之前添加同位素标记的内部tau标准品，并且如果需要的话，可以添加超过一次。参见例如在图2-4中描述的方法。

本文描述了多种同位素标记的内部tau标准品。它们都具有掺入至少一个氨基酸残基中的重同位素标记。可以使用一种或多种全长同工型。可替换地或另外，如本领域已知的，也可以使用具有翻译后修饰的tau同工型和/或tau的肽片段。一般而言，所掺入的标记的氨基酸残基应当增加肽的质量而不影响其化学特性，并且由同位素标记的存在引起的质量偏移必须足以允许质谱方法将内标(IS)与内源性tau分析物信号区分开来。如本文证实的，合适的重同位素标记包括但不限于²H、¹³C和¹⁵N。通常，约1-10ng的内标经常为足够的。

(c)耗竭一种或多种蛋白

本公开内容的方法包含其中从样品中耗竭一种或多种蛋白的步骤。术语“耗竭”意指在量或数目方面减少。因此，耗竭蛋白的样品可以具有可测量地低于原始样品中的量的任何量的该蛋白，包括零量的该蛋白。

通过特异性地靶向一种或多种蛋白的方法，例如通过亲合力耗竭、固相萃取或本领域已知的其它方法，可以从样品中耗竭(一种或多种)蛋白。一种蛋白或多种蛋白的靶向耗竭可以被用于期望对该蛋白进行下游分析的情况(例如鉴定、定量、翻译后修饰的分析等)。例如，可以在用合适的表位结合剂亲合力耗竭Aβ以后通过本领域已知的方法来鉴定和定量Aβ肽。作为另一个非限制性实例，可以在亲合力耗竭ApoE并鉴定ApoE同工型以后通过本领域已知的方法来确定载脂蛋白E(ApoE)状态。靶向耗竭也可以被用于分离其它蛋白用于后续分析，包括但不限于载脂蛋白J、突触核蛋白、可溶性淀粉样蛋白前体蛋白、α-2巨球蛋白、S100B、髓磷脂碱蛋白、白介素、TNF、TREM-2、TDP-43、YKL-40、VILIP-1、NFL、朊病毒蛋白、pNFH和DJ-1。本文还使用某些tau蛋白的靶向耗竭来富集其它tau蛋白和/或消除在质谱分析共同发现的蛋白。例如，在本公开内容的某些实施方案中，在进一步加工样品以用于通过质谱分析之前，从样品中耗竭N-端tau蛋白和/或中间结构域tau蛋白。耗竭的tau蛋白的下游分析可能发生或不发生，但是本公开内容的方法考虑了两种选项。

在一些实施方案中，靶向耗竭可以通过亲合力耗竭来发生。亲合力耗竭是指凭借其与分子的特异性结合特性从样品中耗竭感兴趣的蛋白的方法。通常，所述分子是附着至诸如珠子、树脂、组织培养板等固体支持物上的配体(被称作固定化配体)。配体向固体支持物的固定化也可以在配体-蛋白相互作用发生后发生。合适的配体包括抗体、适体和其它表位结合剂。所述分子还可以是选择性地吸收感兴趣的蛋白的聚合物或其它材料。作为非限制性实例，被脂肪氧乙基化醇取代的聚羟基亚甲基(例如PHM-L LIPOSORB，Sigma Aldrich)可以被用于从血清中选择性地吸收脂蛋白(包括ApoE)。可以组合两种或更多种亲合力耗竭剂以依次或同时耗竭多种蛋白。

在一些实施方案中，本公开内容的方法包含使用至少一种表位结合剂从样品亲中合力耗竭一种或多种蛋白，所述表位结合剂特异性地结合至tau-441的氨基酸1至243(包括端值)内(或在0N或1N同工型的类似定义的区域内)的表位。在各种实施方案中，可以使用一种、两种、三种或更多种表位结合剂。当使用两种或更多种表位结合剂时，可以依次或同时使用它们。

在一些实施方案中，本公开内容的方法包含使用特异性地结合至tau的N-端(例如tau-441的氨基酸1至103，包括端值)内的表位的表位结合剂和特异性地结合至tau的中间结构域(例如tau-441的氨基酸104至243，包括端值)内的表位的表位结合剂，从样品中亲合力耗竭一种或多种蛋白。可以依次或同时使用所述表位结合剂。

在一些实施方案中，本公开内容的方法包含使用特异性地结合至tau-441的氨基酸1至35(包括端值)内的表位的表位结合剂和特异性地结合至tau-441的氨基酸104至243(包括端值)内(或在0N或1N同工型的类似定义的区域内)的表位的表位结合剂，从样品中亲合力耗竭一种或多种蛋白。可以依次或同时使用所述表位结合剂。

在一些实施方案中，本公开内容的方法包含使用特异性地结合至tau-441的氨基酸1至103(包括端值)内(或在0N或1N同工型的类似定义的区域内)的表位的表位结合剂；特异性地结合至tau-441的氨基酸104至243(包括端值)内(或在0N或1N同工型的类似定义的区域内)的表位的表位结合剂；和特异性地结合淀粉样蛋白β的表位的表位结合剂，从样品中亲合力耗竭一种或多种蛋白。可以依次或同时使用所述表位结合剂。

在一些实施方案中，本公开内容的方法包含使用特异性地结合至tau-441的氨基酸1至35(包括端值)内(或在0N或1N同工型的类似定义的区域内)的表位的表位结合剂；特异性地结合至tau-441的氨基酸104至243(包括端值)内(或在0N或1N同工型的类似定义的区域内)的表位的表位结合剂；和特异性地结合淀粉样蛋白β的表位的表位结合剂，从样品中亲合力耗竭一种或多种蛋白。可以依次或同时使用所述表位结合剂。

在一些实施方案中，本公开内容的方法包含使用特异性地结合至tau-441的氨基酸1至103(包括端值)内(或在0N或1N同工型的类似定义的区域内)的表位的表位结合剂；和特异性地结合淀粉样蛋白β的表位的表位结合剂，从样品中亲合力耗竭一种或多种蛋白。可以依次或同时使用所述表位结合剂。

在一些实施方案中，本公开内容的方法包含使用特异性地结合至tau-441的氨基酸1至35(包括端值)内(或在0N或1N同工型的类似定义的区域内)的表位的表位结合剂；和特异性地结合淀粉样蛋白β的表位的表位结合剂，从样品中亲合力耗竭一种或多种蛋白。可以依次或同时使用所述表位结合剂。

在一些实施方案中，本公开内容的方法包含使用特异性地结合至tau-441的氨基酸104至243(包括端值)内(或在0N或1N同工型的类似定义的区域内)的表位的表位结合剂；和特异性地结合淀粉样蛋白β的表位的表位结合剂，从样品中亲合力耗竭一种或多种蛋白。可以依次或同时使用所述表位结合剂。

在以上实施方案中的每一个中，所述表位结合剂可以包含抗体或适体。在一些实施方案中，特异性地结合淀粉样蛋白β的表位结合剂是HJ5.1，或是与HJ5.1结合相同表位和/或竞争性地抑制HJ5.1的表位结合剂。在一些实施方案中，特异性地结合至tau-441的氨基酸1至103(包括端值)内的表位的表位结合剂是HJ8.5，或是与HJ8.5结合相同表位和/或竞争性地抑制HJ8.5的表位结合剂。在一些实施方案中，特异性地结合至tau-441的氨基酸104至221(包括端值)内的表位的表位结合剂是Tau1，或是与Tau1结合相同表位和/或竞争性地抑制Tau1的表位结合剂。用于鉴定抗体特异性地结合的表位的方法以及评价两种抗体之间的竞争性抑制的测定法是本领域已知的。

可替换地，通过更通用的方法，例如通过超滤或用酸、有机溶剂或盐沉淀蛋白，可以从样品中耗竭(一种或多种)蛋白。一般而言，这些方法被用于可靠地减少高丰度和高分子量蛋白，这反过来富集低分子量和/或低丰度蛋白和肽(例如tau、Aβ等)。

在一些实施方案中，可以通过沉淀从样品中耗竭蛋白。简而言之，沉淀包含向样品中加入沉淀剂并彻底混合，将所述样品与沉淀剂一起温育以沉淀蛋白，并通过离心或过滤分离沉淀的蛋白。然后可以将所得上清液用于下游应用中。所需试剂的量可以通过本领域已知的方法通过实验确定。合适的沉淀剂包括高氯酸、三氯乙酸、乙腈、甲醇等。在示例性实施方案中，通过酸沉淀从样品中耗竭蛋白。在进一步的实施方案中，通过使用高氯酸的酸沉淀从样品中耗竭蛋白。

作为非限制性实例，可以通过使用高氯酸的酸沉淀从样品中耗竭蛋白。除非另外指出，否则如本文中使用的“高氯酸”是指70％高氯酸。在一些实施方案中，以约1％v/v至约15％v/v的终浓度加入高氯酸。在其它实施方案中，以约1％v/v至约10％v/v的终浓度加入高氯酸。在其它实施方案中，以约1％v/v至约5％v/v的终浓度加入高氯酸。在其它实施方案中，以约3％v/v至约15％v/v的终浓度加入高氯酸。在其它实施方案中，以约3％v/v至约10％v/v的终浓度加入高氯酸。在其它实施方案中，以约3％v/v至约5％v/v的终浓度加入高氯酸。在其它实施方案中，以3.5％v/v至约15％v/v、3.5％v/v至约10％v/v或3.5％v/v至约5％v/v的终浓度加入高氯酸。在其它实施方案中，以约3.5％v/v的终浓度加入高氯酸。在加入高氯酸以后，将样品充分混合(例如通过涡旋混合器)并保持在低温下，通常持续约10分钟或更长时间，以促进沉淀。例如，可以将样品保持约10分钟至约60分钟，约20分钟至约60分钟，或约30分钟至约60分钟。在其它实施例中，可以将样品保持约15分钟至约45分钟，或约30分钟至约45分钟。在其它实施例中，可以将样品保持约15分钟至约30分钟，或约20分钟至约40分钟。在其它实施例中，将样品保持约30分钟。然后将样品在低温下离心以使沉淀的蛋白形成团块，并将包含可溶性tau的上清液(即酸可溶性级分)转移至新容器中。如上文中所使用的，“低温”是指10℃或更低的温度。例如，低温可以是约1℃、约2℃、约3℃、约4℃、约5℃、约6℃、约7℃、约8℃、约9℃或约10℃。在一些实施方案中，较窄的温度范围可以是优选的，例如约3℃至约5℃，或甚至约4℃。在某些实施方案中，可以通过将样品置于冰上来实现低温。

可以组合来自上述方案中的一个或两个的两种或更多种方法以依次或同时耗竭多种蛋白。例如，可以选择性地耗竭(靶向耗竭)一种或多种蛋白，然后耗竭高丰度/分子量蛋白。可替换地，可以首先耗竭高丰度/分子量蛋白，然后靶向耗竭一种或多种蛋白。在仍然另一个替代方案中，可以首先耗竭高丰度/分子量蛋白，然后进行一种或多种蛋白的第一轮靶向耗竭，并然后进行与在第一轮中靶向的蛋白不同的一种或多种蛋白的第二轮靶向耗竭。其它迭代对于熟练的技术人员来说将是显而易见的。

(d)纯化tau

本文公开的方法的另一个步骤包含纯化tau，特别是MTBR tau。在一些实施例中，所述MTBRtau是N-端非依赖性的和/或中间结构域非依赖性的MTBRtau。纯化的tau可以是部分纯化的或完全纯化的。

在一些实施方案中，本公开内容的方法包含通过固相萃取来纯化tau。通过固相萃取来纯化tau包含：使包含tau的样品与包含吸附tau的吸附剂的固相接触，一个或多个洗涤步骤，以及从所述吸附剂洗脱tau。合适的吸附剂包括反相吸附剂。合适的反相吸附剂是本领域已知的，并且包括但不限于烷基键合的二氧化硅、芳基键合的二氧化硅、苯乙烯/二乙烯基苯材料、N-乙烯基吡咯烷酮/二乙烯基苯材料。在示例性实施方案中，所述反相材料是包含N-乙烯基吡咯烷酮和二乙烯基苯的聚合物或包含苯乙烯和二乙烯基苯的聚合物。在示例性实施方案中，吸附剂是Oasis HLB(Waters)。在与包含tau的上清液接触之前，通常按照制造商的说明书或如本领域已知地对吸附剂进行预调理(例如用水可混溶性有机溶剂，并然后用包含流动相的缓冲液)。此外，可以任选地酸化上清液，因为一些反相材料比其它材料更强烈地保留离子化的分析物。优选在流动相中和对于洗脱使用挥发性组分，因为它们促进样品干燥。在示例性实施方案中，洗涤步骤可以包含使用包含约0.05％v/v三氟乙酸(TFA)至约1％v/v TFA的液相或其等效物。在一些实施例中，所述洗涤可以用包含约0.05％v/v至约0.5％v/v TFA或约0.05％v/v至约0.1％v/v TFA的液相。在一些实施例中，所述洗涤可以用包含约0.1％v/v至约1.0％v/v TFA或约0.1％v/v至约0.5％v/v TFA的液相。然后将结合的tau用包含约20％v/v至约50％v/v乙腈(ACN)的液相或其等效物洗脱。在一些实施例中，可以用包含约20％v/v至约40％v/v ACN或约20％v/v至约30％v/v ACN的液相洗脱tau。在一些实施例中，可以用包含约30％v/v至约50％v/v ACN或约30％v/v至约40％v/vACN的液相洗脱tau。可以通过本领域已知的方法(例如真空干燥(例如speed-vac)、冷冻干燥、在氮气流下蒸发等)来干燥洗脱液。

在一些实施方案中，本公开内容的方法包含通过亲合纯化来纯化MTBR tau。亲合纯化是指利用感兴趣的蛋白对分子的特异性结合特性来富集感兴趣的蛋白的方法。通常，所述分子是附着至诸如珠子、树脂、组织培养板等固体支持物的配体(被称作固定化配体)。配体向固体支持物的固定化也可以在配体-蛋白相互作用发生后发生。合适的配体包括抗体、适体和其它表位结合剂。通过亲合纯化来纯化MTBR tau包含使包含tau的样品与合适的固定化配体接触，一个或多个洗涤步骤，以及从固定化配体洗脱MTBRtau。

在一些实施方案中，本公开内容的方法包含使用至少一种表位结合剂通过亲合纯化来纯化MTBRtau，所述表位结合剂特异性地结合至tau-441的氨基酸235至368(包括端值)内或在tau-441的氨基酸244至368(包括端值)内(或在其它全长同工型的类似定义的区域内)的表位。在各种实施方案中，可以使用一种、两种、三种或更多种表位结合剂。当使用两种或更多种表位结合剂时，可以依次或同时使用它们。合适的表位结合剂的非限制性实例包括在Vandermeeren等人，JAlzheimers Dis,2018,65:265-281中描述的抗体77G7、RD3、RD4、UCB1017和PT76，和在Roberts等人，ActaNeuropathol Commun,2020,8:13中描述的抗体E2814和7G6，以及与那些抗体特异性地结合相同表位的其它表位结合剂。在其它实施方案中，本公开内容的方法包含使用以下表位结合剂通过亲合纯化来纯化MTBRtau：特异性地结合至MTBRtau的R1内的表位的表位结合剂，特异性地结合至MTBRtau的R2内的表位的表位结合剂，特异性地结合至MTBRtau的R3内的表位的表位结合剂，特异性地结合至MTBRtau的R4内的表位的表位结合剂，特异性地结合3Rtau独有的表位的表位结合剂，特异性地结合4Rtau独有的表位的表位结合剂，特异性地结合跨MTBRtau的R1和R2的表位的表位结合剂，特异性地结合跨MTBR tau的R2和R3的表位的表位结合剂，特异性地结合跨MTBRtau的R3和R4的表位的表位结合剂，或它们的任何组合。在具体实施例中，本公开内容的方法包含使用表位结合剂通过亲合纯化来纯化MTBR tau，所述表位结合剂特异性地结合至包含tau-441的氨基酸316至355(或其它全长同工型的相同区域)的表位。在各种实施方案中，可以使用一种、两种、三种或更多种表位结合剂。当使用两种或更多种表位结合剂时，可以依次或同时使用它们。

在以上实施方案中的每一个中，所述表位结合剂可以包含抗体或适体。在一些实施方案中，特异性地结合至MTBRtau的R3和R4内的表位的表位结合剂是77G7或是与77G7结合相同表位和/或竞争性地抑制77G7(BioLegend)的表位结合剂。在一些实施方案中，特异性地结合3R tau独有的表位的表位结合剂是RD3(de Silva等人，Neuropathology andApplied Neurobiology,2003,29:288-302)，或是与RD3结合相同表位和/或竞争性地抑制RD3的表位结合剂。在一些实施方案中，特异性地结合4R tau独有的表位的表位结合剂是RD4(de Silva等人，Neuropathology and Applied Neurobiology,2003,29:288-302)，或是与RD4结合相同表位和/或竞争性地抑制RD4的表位结合剂。

(e)用蛋白酶切割纯化的tau

本文中公开的方法的另一个步骤包含用蛋白酶切割纯化的tau。用蛋白酶切割纯化的tau包含在适合消化tau的条件下使包含纯化的tau的样品与蛋白酶接触。当使用亲合纯化时，可以在从固定化配体洗脱tau以后或在tau结合时发生消化。合适的蛋白酶包括但不限于胰蛋白酶、Lys-N、Lys-C和Arg-N。在优选的实施方案中，所述蛋白酶是胰蛋白酶。所得切割产物是包含tau的蛋白水解肽的组合物。当所述蛋白酶是胰蛋白酶时，所得切割产物包含tau的胰蛋白酶肽。在蛋白水解性裂解以后，通常通过固相萃取将所得切割产物脱盐。

(f)LC-MS

本文中公开的方法的另一个步骤包含用包含tau的蛋白水解肽的样品执行液相色谱法-质谱法(LC-MS)以检测和测量tau的至少一种蛋白水解肽的浓度。因此，在实践中，所公开的方法使用tau的一种或多种蛋白水解肽以检测和测量在生物样品中存在的tau蛋白的量。

在胰蛋白酶是蛋白酶的实施方案中，指示MTBR tau的存在的tau的蛋白水解肽包括但不限于在表A中列出的肽。当使用替代的酶进行消化时，得到的蛋白水解肽可能略有不同，但可以由本领域普通技术人员容易地确定。不希望受理论约束，据信相同类型的两个生物样品之间胰蛋白酶肽的量的变化反映了构成那些生物样品的MTBR tau物质的差异。如在本文中公开的，MTBR tau的某些蛋白水解肽的量以及MTBR tau的某些蛋白水解肽的比率可以提供临床上有意义的信息以指导治疗决策。因此，允许检测和定量MTBR tau的胰蛋白酶肽的方法具有在许多神经变性疾病的诊断和治疗中的实用性。

表A：指示MTBR tau的存在的tau的胰蛋白酶肽

胰蛋白酶肽名称	氨基酸序列	SEQ ID NO:
			IGST	IGSTENLK	2
LQTA	LQTAPVPMPDLK	3
			VQII	VQIINK	4
LDLS	LDLSNVQSK	5
			HVPG	HVPGGGSVQIVYKPVDLSK	6
IGSL	IGSLDNITHVPGGGNK	7
			tau368	IGSLDNITHVPGGGN	8
VQIV	VQIVYKPVDLSK	9

tau的蛋白水解肽可以通过与高分辨率质谱仪结合的液相色谱系统来分离。合适的LC-MS系统可以包含<1.0mm ID柱和使用小于约100μl/min的流速。在优选的实施方案中，使用纳米流LC-MS系统(例如约50-100μm ID柱和<1μL/min、优选约100-800nL/min、更优选约200-600nL/min的流速)。在示例性实施方案中，LC-MS系统可以包含0.05mM ID柱并使用约400nL/min的流速。

如本领域已知的，可使用串联质谱法来改善分辨率，或者可以改进技术以用单个质量分析仪实现串联质谱法的分辨率。合适类型的质谱仪是本领域已知的。这些包括但不限于四极杆、飞行时间、离子阱和Orbitrap以及将不同类型的质量分析仪组合到一种架构中的混合质谱仪(例如Orbitrap Fusion^TM Tribrid^TM质谱仪、Orbitrap Fusion^TM Lumos^TM质谱仪、Orbitrap Tribrid^TM Eclipse^TM质谱仪、Q Exactive质谱仪，每种均来自ThermoFisher Scientific)。在示例性实施方案中，LC-MS系统可以包含选自以下的质谱仪：Orbitrap Fusion^TM Tribrid^TM质谱仪、Orbitrap Fusion^TM Lumos^TM质谱仪、OrbitrapTribrid^TM Eclipse^TM质谱仪或在四极杆处具有类似或改进的离子聚焦和离子透明度的质谱仪。可以通过优化在分析前收集的离子的数目(例如使用轨道阱的AGC设置)和/或注射时间来开发合适的质谱方案。在示例性实施方案中，使用在实施例中概述的质谱方案。

III.将受试者分期

在一个方面，本公开内容提供了用于在没有阿尔茨海默氏病的认知或行为症状的受试者中测量到痴呆发作的时间的方法，所述方法包含(a_i)在获得自所述受试者的血液样品或CSF样品中，测量在tau的残基T205处的磷酸化占据和测量MTBR-tau299/MTBR-tau354比率，和任选地测量MTBR-tau212、在残基T217处的磷酸化占据、MTBR-tau243和/或MTBR-tau3R，或(a_ii)在获得自所述受试者的血液样品或CSF样品中，测量在tau的残基T205处的磷酸化占据，测量在tau的残基T217处的磷酸化占据，和测量MTBR-tau212；和(b)使用(ai)或(aii)的度量来计算到痴呆发作的时间，其中到痴呆发作的时间是按年计到大于0的临床痴呆评级(CDR)的时间。在示例性实施方案中，没有阿尔茨海默氏病的认知或行为症状的受试者具有0的CDR。

在另一个方面，本公开内容提供了用于在没有阿尔茨海默氏病的认知或行为症状的受试者中测量到痴呆发作的时间的方法，所述方法包含(a)加工来自所述受试者的血液样品或CSF样品以得到tau物质的第一群体和耗竭的样品，并然后加工所述耗竭的样品以得到tau物质的第二群体，其中所述tau物质的第一群体富集N-端tau和/或中间结构域tau，且其中富集的tau物质的第二群体富集MTBR-tau；(b_i)在tau物质的第一群体中测量在tau的残基T205处的磷酸化占据和在tau物质的第二群体中测量MTBR-tau299/MTBR-tau354比率，和任选地在tau物质的第二群体中测量MTBR-tau212，或(b_ii)在tau物质的第一群体中测量在tau的残基T205处的磷酸化占据和测量在tau的残基T217处的磷酸化占据，和在tau物质的第二群体中测量MTBR-tau212；和(c)使用(bi)或(bii)的度量计算到痴呆发作的时间，其中到痴呆发作的时间是按年计到大于0的临床痴呆评级的时间。在示例性实施方案中，具有阿尔茨海默氏病的认知或行为症状的受试者具有大于0、大于或等于0.5或大于或等于1的CDR。作为非限制性实例，具有阿尔茨海默氏病的认知或行为症状的受试者可以具有0.5、1、1.5或2的CDR。

在另一个方面，本公开内容提供了在具有阿尔茨海默氏病的认知或行为症状的受试者中测量从痴呆发作起的时间的方法，所述方法包含(a_i)在获得自所述受试者的血液样品或CSF样品中，测量在tau的残基T205处的磷酸化占据和测量MTBR-tau299/MTBR-tau354比率，和任选地测量MTBR-tau212、在残基T217处的磷酸化占据、MTBR-tau243和/或MTBR-tau3R，或(a_ii)在获得自所述受试者的血液样品或CSF样品中，测量在tau的残基T205处的磷酸化占据，测量在tau的残基T217处的磷酸化占据，和测量MTBR-tau212；和(b)使用(ai)或(aii)的度量来计算从痴呆发作起的时间，其中从痴呆发作起的时间是按年计从大于0的临床痴呆评级起的时间。

在另一个方面，本公开内容提供了用于在具有阿尔茨海默氏病的认知或行为症状的受试者中测量从痴呆发作起的时间的方法，所述方法包含(a)加工来自所述受试者的血液样品或CSF样品以得到tau物质的第一群体和耗竭的样品，并然后加工所述耗竭的样品以得到tau物质的第二群体，其中所述tau物质的第一群体富集N-端tau和/或中间结构域tau，且其中富集的tau物质的第二群体富集MTBR-tau；(b_i)在tau物质的第一群体中测量在tau的残基T205处的磷酸化占据和在tau物质的第二群体中测量MTBR-tau299/MTBR-tau354比率，和任选地在tau物质的第二群体中测量MTBR-tau212，或(b_ii)在tau物质的第一群体中测量在tau的残基T205处的磷酸化占据和测量在tau的残基T217处的磷酸化占据，和在tau物质的第二群体中测量MTBR-tau212；和(c)使用(bi)或(bii)的度量计算从痴呆发作起的时间，其中从痴呆发作起的时间是按年计从大于0的临床痴呆评级起的时间。

在另一个方面，本公开内容提供了在具有阿尔茨海默氏病的认知或行为症状的受试者中测量从痴呆发作起的时间的方法，所述方法包含(a_i)在获得自所述受试者的血液样品或CSF样品中，测量在tau的残基T205处的磷酸化占据和测量MTBR-tau(例如，MTBR-tau299)的变化率，和任选地测量MTBR-tau212；和(b)使用(ai)或(aii)的度量来计算从痴呆发作起的时间，其中从痴呆发作起的时间是按年计从大于0的临床痴呆评级起的时间。

在另一个方面，本公开内容提供了用于测量受试者中的认知变化的方法，所述方法包含(a)在获得自所述受试者的血液样品或CSF样品中测量在选自T111、T153、T181、T217和T231的tau的一个或多个残基处的磷酸化占据，和在获得自所述受试者的血液样品或CSF样品中测量MTBR-tau275、MTBR-tau299和MTBR-tau3R(MTBR-tau306)中的至少一种，和任选地在获得自所述受试者的血液样品或CSF样品中测量总tau；和(b)使用(a)的度量来计算认知变化。

在上述实施方案中的一些中，计算到痴呆发作的时间包括确定(一种或多种)所测量的tau物质水平显著偏离没有脑淀粉样蛋白斑块的对照群体中的平均值的量，如通过PET成像和/或CSF中的Aβ42/40度量所测量的。“显著偏离平均值”是指比平均值高或低至少1个标准差、优选至少1.3个标准差、更优选至少1.5个标准差或甚至更优选至少2个标准差的值(即分别为1σ、1.3σ、1.5σ或1.5σ,其中σ是通过在没有脑淀粉样蛋白斑块的对照群体中测量的正态分布所定义的标准差，如通过PET成像和/或CSF中的Aβ42/40度量所测量的)。除了使用阈值(例如比平均值高或低至少1个标准差)之外，在一些实施方案中，比平均值高或低的变化程度或随时间的变化率可以被用来计算受试者中到痴呆发作的时间。

生物样品可以获得自可能是或不是无症状的受试者。“无症状的受试者”是指没有表现出AD的任何征象或症状的受试者。但是，受试者可能表现出AD的征象或症状(例如记忆丧失、乱放东西、情绪或行为的改变等)，但没有表现出足以用于临床诊断轻度认知损伤或痴呆的认知或功能损伤。在进一步的实施方案中，受试者可以携带已知造成显性遗传性阿尔茨海默氏病的基因突变之一。在替代实施方案中，受试者可能不携带已知造成显性遗传性阿尔茨海默氏病的基因突变。没有特定家族联系的阿尔茨海默氏病被称为散发性阿尔茨海默氏病。

本公开内容的另一个方面涵盖诊断受试者的阿尔茨海默氏病的阶段的方法。在各种实施方案中，“AD的阶段”可以被定义为自AD引起的痴呆发作以来已经过去的时间量(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月等)。尽管存在AD的临床诊断标准，但在临床环境中常见的是给定的受试者的症状发作时间未知，或者痴呆或AD的诊断存在疑问。因此，本领域需要客观地诊断受试者的AD的阶段的试验。

可替换地或除了使用位点特异性的tau磷酸化、MTBR-tau物质的度量和任选的总tau的度量之外，在以上实施方案中的任一个中，可以使用从(一种或多种)测量的磷酸化水平和/或MTBR-tau水平计算的比率，或从(一种或多种)测量的磷酸化水平和/或MTBR-tau水平和总tau计算的比率。在实施例中详细介绍了这两种方案。还可以使用除比率之外的数学运算。例如，实施例在各种统计模型(例如线性回归、LME曲线、LOESS曲线等)中结合其它已知的生物标志物(例如APOEε4状态、年龄、性别、认知试验评分、功能试验评分等)使用位点特异性的tau磷酸化值和/或MTBR-tau值。度量的选择和数学运算的选择可以被优化以最大化该方法的特异性。例如，可以通过在ROC曲线下的面积来评价诊断准确性，并且在一些实施方案中，将0.7或更大的ROC AUC值设置为阈值(例如0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95等)。

常规上通过淀粉样蛋白-正电子发射断层摄影术(PET)来测量人类中的脑淀粉样蛋白斑块。例如，皮质Aβ-斑块的¹¹C-匹兹堡化合物B(PiB)PET成像通常被用于检测Aβ-斑块病理。皮质PiB-PET的标准摄取值比率(SUVR)可靠地鉴定显著皮质Aβ-斑块，并被用于将受试者分类为PIB阳性的(SUVR≥1.25)或阴性的(SUVR<1.25)。因此，在上述实施方案中，如通过PET成像测量的没有脑淀粉样蛋白斑块的对照群体可指具有皮质PiB-PET SUVR<1.25的受试者群体。PiB结合的其它值(例如平均皮质结合潜力)或除皮质区域之外的感兴趣区域的分析也可以被用于将受试者分类为PIB阳性的或阴性的。也可以使用其它PET成像剂。

如通过CSF中的Aβ42/40度量所测量的没有脑淀粉样蛋白斑块的对照群体可指当通过质谱法测量时具有<0.12的Aβ42/40度量的受试者群体，如Patterson等人，AnnalsofNeurology,2015中所述。

图5和6说明了分离的tau样品中tau磷酸化和MTBR-tau水平与到AD所致痴呆发作的年数相关的动态模式。图20显示了每5个EYO间隔的各种tau物质异常率。显著偏离平均值的在T217处的磷酸化水平首次发生在AD所致痴呆发作之前约21年。R2中MTBR-tau299的变化发生在发作之前约22年，接近p-tau217占据的变化的首次检测。R4中MTBR-tau354的增加在临床阶段后期达到饱和，可能是由于沉积成脑缠结。值得注意的是，概括tau病理生理学的MTBR-tau299/354的比率与pT217占据高度相关(即在AD所致痴呆发作之前约21年)。MTBR-tau3R的变化率在AD所致痴呆发作之前约20年开始增加，并且与AD进展高度相关。MTBR-tau243的变化率在AD所致痴呆发作之前约15年开始增加。MTBR-tau212水平的变化与AD进展高度相关。显著偏离平均值的在T205处的磷酸化水平首次发生在AD所致痴呆发作之前约13年。

在一个实施例中，本公开内容的方法包含提供获得自受试者的生物样品和(ai)在获得自所述受试者的血液样品或CSF样品中，测量在tau的残基T205处的磷酸化占据和测量MTBR-tau299/MTBR-tau354比率，和任选地测量MTBR-tau212、在残基T217处的磷酸化占据、MTBR-tau243和/或MTBR-tau3R，或(aii)在获得自所述受试者的血液样品或CSF样品中，测量在tau的残基T205处的磷酸化占据，测量在tau的残基T217处的磷酸化占据，和测量MTBR-tau212；(b)使用(ai)或(aii)的度量计算到痴呆发作的时间，其中到痴呆发作的时间是按年计到大于0的临床痴呆评级的时间；和(c)当在T217处的tau磷酸化和/或MTBR-tau299/MTBR-tau354比率在平均值以上约1.5σ或更多且在T205处的tau磷酸化是在平均值以上小于约1.5σ时，将所述受试者确定为从AD所致痴呆发作起约10至约25年或约10至约20年，其中σ是通过在没有脑淀粉样蛋白斑块的对照群体中测量的(如通过PET成像和/或在CSF中的Aβ42/40度量测量的)在T217和T205处的tau磷酸化、MTBR-tau299/MTBR-tau354比率和MTBR-tau212的正态分布所定义的标准差。在各种实施方案中，在T217处的tau磷酸化和/或MTBR-tau299/MTBR-tau354比率可以是在对照群体的平均值以上约1.3σ、约1.35σ、约1.4σ、约1.45σ、约1.5σ、约1.6σ、约1.7σ、约1.8σ、约1.9σ、约2σ或大于2σ。在其它实施方案中，在T217处的tau磷酸化和/或MTBR-tau299/MTBR-tau354比率可以是在对照群体的平均值以上约1.85σ、约1.9σ、约1.95σ、约2σ、约2.1σ、约2.2σ、约2.3σ、约2.4σ、约2.5σ或大于2.5σ。在以上实施方案中的每一个中，在T205处的tau磷酸化可以是在对照群体的平均值处或者在对照群体的平均值以上小于约1.3σ、约1.35σ、约1.4σ、约1.45σ、约1.5σ、约1.51σ、约1.55σ、约1.6σ、约1.7σ、约1.8σ、约1.9σ、约2.0σ。可替换地，在T205处的tau磷酸化可以是在对照群体的平均值以上约2.0σ、约2.05σ、约2.1σ、约2.2σ、约2.3σ、约2.4σ、约2.5σ或小于2.5σ。在进一步的实施例中，在T217处的tau磷酸化和/或MTBR-tau299/MTBR-tau354比率在对照群体的平均值以上约2σ或更多，且在T205处的tau磷酸化可以在对照群体的平均值以上小于约2σ或更小。除了使用阈值(例如比平均值高或低至少1个标准差)以外，在一些实施方案中，绝对值比平均值高或低的变化程度或随时间的变化率可以被用于对受试者进行分类。在仍然进一步的实施方案中，测量的在T205和/或T217处的tau磷酸化水平和MTBR-tau299/MTBR-tau354比率值和/或MTBR-tau212值可以被用于各种数学运算中以与各自本身相比改善预测能力。例如，可以从测量的磷酸化水平计算(一种或多种)比率。还可以使用除比率之外的数学运算。

在另一个实施例中，本公开内容的方法包含(a)提供获得自受试者的第一和第二生物样品，其中“第一”和“第二”是指收集样品的顺序，并如上面讨论地测量tau物质；(b)计算在所测量的每个残基处的位点特异性磷酸化的变化以及MTBR-tau299/MTBR-tau354比率值和任选的MTBR-tau212值的变化；和(c)当磷酸化水平T217和/或MTBR-tau299/MTBR-tau354比率降低或保持相同并且在T205处的磷酸化水平升高时，诊断受试者的AD的阶段。第一和第二分离的tau样品可以相隔数天、数周或数月进行收集。通常，对于两个样品，在(a)(i)、(a)(ii)或(a)(iii)中所述的特定位点处的tau磷酸化也将为约1.5σ或以上，以及其中σ是通过在没有脑淀粉样蛋白斑块的对照群体中测量的(通过PET成像和/或在CSF中的Aβ42/40度量测量的)在T217和T205、T181和T205或者T181、T205和T217处的tau磷酸化的正态分布所定义的标准差。在仍然进一步的实施方案中，测量的在特定位点处的tau磷酸化水平和在(a)(i)、(a)(ii)中所述的MTBR-tau物质值可以被用于各种数学运算中以与各自本身相比改善预测能力。例如，可以从测量的磷酸化水平计算(一种或多种)比率。还可以使用除比率之外的数学运算。

用于测量tau磷酸化和MTBR-tau的方法描述于第II部分中，并且其通过引用并入本部分。但是，熟练的技术人员将理解，绝对值可以根据方案和被用于绝对定量的内标的来源/规格而变化。

在以上的一些实施方案中，加工来自所述受试者的血液样品或CSF样品以得到富集的tau物质的第一群体和耗竭的样品可以包含使所述血液样品或所述CSF样品与特异性地结合至tau的N-端内的表位的表位结合剂接触，或使所述血液样品或所述CSF样品与特异性地结合至tau的中间结构域内的表位的表位结合剂接触，或使所述血液样品或所述CSF样品与特异性地结合至tau的N-端内的表位的第一表位结合剂接触并与特异性地结合至tau的中间结构域内的表位的第二表位结合剂接触。可以依次或组合使用所述第一和第二表位结合剂。在一些实施例中，特异性地结合至tau的N-端内的表位的表位结合剂是HJ8.5或与HJ8.5特异性地结合相同表位的另一种表位结合剂。在一些实施例中，特异性地结合至tau的中间结构域内的表位的表位结合剂是Tau1或与Tau1特异性地结合相同表位的另一种表位结合剂。

在以上的其它实施方案中，加工所述耗竭的样品以得到富集的tau物质的第二群体可以包含执行化学萃取步骤以富集MTBR-tau物质。在某些实施方案中，所述化学萃取步骤可以包含混合酸以沉淀所述耗竭的样品的蛋白，任选地其中所述酸是高氯酸，且其中所述MTBR-tau物质在除去沉淀的蛋白以后在上清液中。可替换地，加工所述耗竭的样品以得到富集的tau物质的第二群体可以包含使所述耗竭的样品与特异性地结合至tau的MTBR内的至少一个表位的表位结合剂接触。在某些实施方案中，所述表位结合剂可以是在Vandermeeren等人，JAlzheimers Dis,2018,65:265-281中描述的77G7、RD3、RD4、UCB1017或PT76，或者在Roberts等人，ActaNeuropathol Commun,2020,8:13中描述的E2814或7G6，或者77G7、RD3、RD4、UCB1017、PT76、E2814或7G6的抗原结合片段，或者与77G7、RD3、RD4、UCB1017、PT76、E2814或7G6特异性地结合相同表位的其它表位结合剂。

在以上仍然其它的实施方案中，加工来自所述受试者的血液样品或CSF样品以得到富集的tau物质的第一群体和耗竭的样品可以包含使所述血液样品或所述CSF样品与特异性地结合至tau的N-端内的表位的表位结合剂接触，或使所述血液样品或所述CSF样品与特异性地结合至tau的中间结构域内的表位的表位结合剂接触，或使所述血液样品或所述CSF样品与特异性地结合至tau的N-端内的表位的第一表位结合剂接触并与特异性地结合至tau的中间结构域内的表位的第二表位结合剂接触；并且加工所述耗竭的样品以得到富集的tau物质的第二群体包含执行化学萃取步骤以富集MTBR-tau物质或使所述耗竭的样品与特异性地结合至tau的MTBR内的至少一个表位的表位结合剂接触。可以依次或组合使用所述第一和第二表位结合剂。在某些实施例中，特异性地结合至tau的N-端内的表位的表位结合剂是HJ8.5与HJ8.5或特异性地结合相同表位的另一种表位结合剂；并且特异性地结合至tau的中间结构域内的表位的表位结合剂是Tau1或与Tau1特异性地结合相同表位的另一种表位结合剂。所述化学萃取步骤可以包含混合酸以沉淀所述耗竭的样品的蛋白，任选地其中所述酸是高氯酸，且其中所述MTBR-tau物质在除去沉淀的蛋白以后在上清液中。特异性地结合至tau的MTBR内的至少一个表位的表位结合剂可以是在Vandermeeren等人，JAlzheimers Dis,2018,65:265-281中描述的77G7、RD3、RD4、UCB1017或PT76，或者在Roberts等人，Acta Neuropathol Commun,2020,8:13中描述的E2814或7G6，或者77G7、RD3、RD4、UCB1017、PT76、E2814或7G6的抗原结合片段，或者与77G7、RD3、RD4、UCB1017、PT76、E2814或7G6特异性地结合相同表位的其它表位结合剂。

IV.治疗方法

本公开内容也涵盖本文描述的到痴呆发作的时间的度量的以下用途：将受试者的疾病进展分期；将受试者的脑病理学分期；为受试者选择诊断剂；和为受试者选择适合受试者的疾病阶段和根本疾病病理学的一种治疗剂或一类治疗剂。因此，本公开内容的另一个方面是用于治疗受试者的方法，所述方法包含给所述受试者施用根据所述受试者到痴呆发作的时间的度量而为所述受试者选择的所述治疗剂或诊断剂。

如本文中使用的，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指由经过训练且有执照的专业人员向需要其的受试者提供医疗护理。医疗护理可以是诊断试验、治疗性处理和/或预防性或防止性措施。治疗性和预防性处理的目的是预防或减缓(减轻)不期望的生理学变化或疾病/障碍。治疗性或预防性处理的有益或期望的临床结果包括但不限于症状的缓解、疾病程度的减轻、疾病的稳定(即不恶化)状态、疾病进展的推迟或减慢、疾病状态的改善或缓和以及康复(无论是部分的还是完全的)，无论是可检测的还是不可检测的。“治疗”也可以意指与如果不接受治疗所预期的存活期相比延长的存活。需要治疗的那些包括已经患有疾病、病症或障碍的那些以及易于患有疾病、病症或障碍的那些或者其中待预防疾病、病症或障碍的那些。在一些实施方案中，接受治疗的受试者是无症状的。如本文中使用的，“无症状的受试者”是指不表现出AD的任何征象或症状的受试者。在其它实施方案中，受试者可能表现出AD的征象或症状(例如记忆丧失、乱放东西、情绪或行为改变等)，但没有表现出足以在临床上诊断由阿尔茨海默氏病所致的痴呆的认知或功能损伤。有症状的或无症状的受试者可能具有Aβ淀粉样变性；但是，对Aβ淀粉样变性的事先知晓并不是治疗的必要条件。在仍然进一步的实施方案中，受试者可以被诊断为具有AD。在前述实施方案中的任一个中，受试者可以携带已知造成显性遗传性阿尔茨海默氏病的基因突变之一。在替代实施方案中，受试者可能不携带已知造成显性遗传性阿尔茨海默氏病的基因突变。

在一个实施方案中，如上所述的用于治疗受试者的方法可以包含提供获得自受试者的生物样品和(ai)在获得自所述受试者的血液样品或CSF样品中，测量在tau的残基T205处的磷酸化占据和测量MTBR-tau299/MTBR-tau354比率，和任选地测量MTBR-tau212、在残基T217处的磷酸化占据、MTBR-tau243和/或MTBR-tau3R，或(aii)测量在tau的残基T205处的磷酸化占据，测量在tau的残基T217处的磷酸化占据，和测量MTBR-tau212；和(b)当(一种或多种)测量的水平显著偏离在没有脑淀粉样蛋白斑块的对照群体中的平均值(如通过PET成像和/或在CSF中的Aβ42/40度量测量的)时，将药物组合物施用给所述受试者。

在另一个实施方案中，如上所述的用于治疗受试者的方法可以包含(a)提供获得自受试者的第一和第二生物样品，并在每个样品中测量(ai)在获得自所述受试者的血液样品或CSF样品中，测量在tau的残基T205处的磷酸化占据和测量MTBR-tau299/MTBR-tau354比率，和任选地测量MTBR-tau212、在残基T217处的磷酸化占据、MTBR-tau243和/或MTBR-tau3R，或(aii)测量在tau的残基T205处的磷酸化占据，测量在tau的残基T217处的磷酸化占据，和测量MTBR-tau212；(b)使用(ai)或(aii)的度量或度量的变化计算到痴呆发作的时间，其中到痴呆发作的时间是按年计到大于0的临床痴呆评级的时间；和(c)当计算的度量或(一种或多种)变化显著偏离在没有脑淀粉样蛋白斑块的对照群体中的平均值(通过PET成像和/或在CSF中的Aβ42/40度量测量的)时，将药物组合物施用给所述受试者。“显著偏离平均值”是指比平均值高或低至少1个标准差、优选至少1.3个标准差、更优选至少1.5个标准差或甚至更优选至少2个标准差的值(即分别为1σ、1.3σ、1.5σ或1.5σ,其中σ是通过在没有脑淀粉样蛋白斑块的对照群体中测量的正态分布所定义的标准差，如通过PET成像和/或CSF中的Aβ42/40度量所测量的)。除了使用阈值(例如比平均值高或低至少1个标准差)之外，在一些实施方案中，比平均值高或低的变化程度可以被用作治疗受试者的标准。

可替换地或除了使用位点特异性的tau磷酸化、MTBR-tau物质的度量之外，在以上实施方案中的任一个中，可以使用从(一种或多种)测量的水平计算的比率。还可以使用除比率之外的数学运算。例如，实施例在各种统计模型(例如线性回归、LME曲线、LOESS曲线等)中结合其它已知的生物标志物(例如APOEε4状态、年龄、性别、认知试验评分、功能试验评分等)使用位点特异性的tau磷酸化值。

被考虑用于或被用于处于进展Aβ淀粉样变性或AD的风险中的受试者、被诊断为具有Aβ淀粉样变性的受试者、被诊断为具有tau病变的受试者或被诊断为具有AD的受试者的许多成像剂和治疗剂靶向特定病理生理学变化。例如，Aβ靶向疗法通常被设计为减少Aβ产生、拮抗Aβ聚集或增加脑Aβ清除；tau靶向疗法通常被设计为改变tau磷酸化模式、拮抗tau聚集或增加NFT清除；多种疗法被设计为减少CNS炎症或脑胰岛素抗性；等。这些不同药剂的效力可以通过向通过本文公开的方法分期的受试者施用所述药剂来改善。

在示例性实施方案中，被考虑用于或被用于处于进展Aβ淀粉样变性或AD的风险中的受试者、被诊断为具有Aβ淀粉样变性的受试者、被诊断为具有tau病变的受试者或被诊断为具有AD的受试者的成像剂和治疗剂(共同地在本文中被称作“Aβ和tau疗法”)的效力可以通过以下来改善：将所述Aβ或tau疗法施用给具有在T205和/或T217处的某种tau磷酸化水平和/或MTBR-tau299/MTBR-tau354比率的受试者，和任选地测量MTBR-tau212和/或MTBR-tau3R和/或MTBR-243，如通过本文中公开的方法所测量的以及在图和实施例中所示的。

例如，在到痴呆发作的时间度量是约20年、约25年或约30年或更久的实施方案中，合适的治疗剂可以是防止病理性淀粉样蛋白沉积(即淀粉样蛋白沉积大于对受试者的年龄所预见的沉积)的一级预防性治疗。非限制性实例包括减少Aβ产生、阻止或拮抗Aβ聚集或增加脑Aβ清除的治疗剂，包括但不限于γ-分泌酶抑制剂、β-分泌酶抑制剂、被动免疫疗法(包括但不限于抗-Aβ抗体、抗-tau抗体或抗-ApoE抗体)、主动免疫疗法。

在到痴呆发作的时间的度量是约25年至约15年或约20年至约15年的实施方案中，合适的治疗剂可以是防止进一步的病理性淀粉样蛋白-β沉积或减少受试者现有的淀粉样蛋白-β斑块负荷的二级预防性治疗。非限制性实例包括减少Aβ产生、阻止或拮抗Aβ聚集或增加脑Aβ清除的治疗剂，包括但不限于γ-分泌酶抑制剂、β-分泌酶抑制剂和被动免疫疗法(包括但不限于抗-Aβ抗体、抗-tau抗体或抗-ApoE抗体)。

在到痴呆发作的时间的度量是约15年或更少的实施方案中，除了防止进一步的病理性淀粉样蛋白-β沉积或减少受试者现有的淀粉样蛋白-β斑块负荷的治疗之外，合适的治疗剂可以是预防或拮抗tau聚集或靶向神经原纤维缠结的二级预防治疗。非限制性实例包括预防或拮抗tau聚集或靶向神经原纤维缠结的治疗剂，包括tau蛋白聚集抑制剂、激酶抑制剂、磷酸酶活化剂、被动免疫疗法(包括但不限于抗-tau抗体)。

抗-Aβ抗体的非限制性实例包括苏兰珠单抗(solanezumab)(LY2062430；EliLilly)、阿杜那单抗(BI-IB037；Biogen)、克瑞组单抗(crenezumab)(MABT102A、RG7412，Genentech和Roche)、更汀芦单抗(RO4909832、RG14502；Roche)、巴匹组单抗(bapinezumab)(Janssen和Pfizer)、BAN2401(Eisai)、LY3002813(Lilly)、RO7126209(Roche)、AAB-003和GK933776。

抗-tau抗体的非限制性实例包括西瑞奈单抗(AC Immune和Genentech)、ABBV-8E12(Abbvie)、BIIB092(Biogen)、BIIB076(Biogen)、LY3303560(Lilly)、RO7105705(Roche/Genentech)、JNJ-63733657(Janssen)、Lu AF87908(Lundbeck)。

抗-ApoE抗体的非限制性实例包括HJ6.3、HAE-4(WUSTL，Denali Therapeutics)。

治疗剂的非限制性实例也包括胆碱酯酶抑制剂、N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)拮抗剂、抗抑郁药(例如选择性血清素重摄取抑制剂、非典型抗抑郁药、氨基酮、选择性血清素和去甲肾上腺素重摄取抑制剂、三环抗抑郁药等)、γ-分泌酶抑制剂、β-分泌酶抑制剂、抗-Aβ抗体(包括其抗原结合片段、变体或衍生物)、抗-tau抗体(包括其抗原结合片段、变体或衍生物)、抗-TREM2抗体(包括其抗原结合片段、变体或衍生物)、TREM2激动剂、干细胞、饮食补充物(例如锂水、含硫辛酸的ω-3脂肪酸、长链甘油三酯、染料木黄酮、白藜芦醇、姜黄素和葡萄籽提取物等)、血清素受体6的拮抗剂、p38αMAPK抑制剂、重组粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、被动免疫疗法、主动疫苗(例如CAD106、AF20513等)、tau蛋白聚集抑制剂(例如TRx0237、亚甲蓝氯化物等)、改善血糖控制的治疗(例如胰岛素、艾塞那肽、利拉鲁肽、吡格列酮等)、抗炎剂、磷酸二酯酶9A抑制剂、σ-1受体激动剂、激酶抑制剂、磷酸酶活化剂、磷酸酶抑制剂、血管紧张素受体阻滞剂、CB1和/或CB2内源性大麻素受体部分激动剂、β-2肾上腺素能受体激动剂、烟碱乙酰胆碱受体激动剂、5-HT2A反向激动剂、α-2c肾上腺素能受体拮抗剂、5-HT 1A和1D受体激动剂、谷氨酰胺酰肽环转移酶抑制剂、APP产生的选择性抑制剂、单胺氧化酶B抑制剂、谷氨酸受体拮抗剂、AMPA受体激动剂、神经生长因子刺激剂、HMG-CoA还原酶抑制剂、神经营养剂、毒蕈碱M1受体激动剂、GABA受体调节剂、PPAR-γ激动剂、微管蛋白调节剂、钙通道阻滞剂、抗高血压剂、他汀类药物和它们的任何组合。在示例性实施方案中，药物组合物可以包含激酶抑制剂。合适的激酶抑制剂可以抑制一千零一氨基酸激酶(TAOK)、CDK、GSK-3β、MARK、CDK5或Fyn。在另一个示例性实施方案中，药物组合物可以包含磷酸酶活化剂。作为非限制性实例，磷酸酶活化剂可以增加蛋白磷酸酶2A的活性。在一些实施方案中，所述治疗是包含tau靶向疗法的药物组合物，所述疗法包括但不限于改变tau磷酸化模式、拮抗tau聚集或增加病理性tau同工型和/或聚集体的清除的活性药物成分。在一些实施方案中，所述治疗是抗-Aβ抗体、抗-tau抗体、抗-TREM2抗体、TREM2激动剂、γ-分泌酶抑制剂、β-分泌酶抑制剂、激酶抑制剂、磷酸酶活化剂、疫苗或tau蛋白聚集抑制剂。

治疗剂类别的非限制性实例和具体实例也呈现在下表中。

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例如，当在T217处的tau磷酸化和MTBR-tau299/MTBR-tau354比率值是在对照群体的平均值以上约1.5σ或更多并且在T205处的tau磷酸化是在对照群体的平均值附近或在对照群体的平均值以上小于约1.5σ或更多时，优选的治疗剂可以包括被设计为预防受试者变成淀粉样蛋白阳性的那些(例如被设计为减少Aβ产生、拮抗Aβ聚集等的淀粉样蛋白靶向疗法)。作为另一个实例，当在T217处的tau磷酸化和MTBR-tau299/MTBR-tau354比率值是在对照群体的平均值以上约1.5σ或更多并且在T205处的tau磷酸化是在对照群体的平均值以上约1.5σ或更多时，优选的治疗剂可以包括被设计为阻止淀粉样蛋白沉积增加或者减少受试者的现有斑块负荷的那些。作为另一个实例，当在T217处的tau磷酸化和MTBR-tau299/MTBR-tau354比率值和T205是在对照群体的平均值以上约1.5σ或更多时，优选的治疗剂可以包括被设计为阻止淀粉样蛋白沉积增加、减少受试者的现有斑块负荷、阻止tau聚集或者靶向NFT的那些。作为另一个实例，当在T217处的tau磷酸化、和MTBR-tau299/MTBR-tau354比率值和T205是在对照群体的平均值以上约1.5σ或更多，并且在T217处的tau磷酸化和MTBR-tau299/MTBR-tau354比率值走平或下降，并且总tau和/或在T205处的tau磷酸化增加时，优选的治疗剂可以包括被设计为阻止淀粉样蛋白沉积增加、减少受试者的现有斑块负荷、阻止tau聚集或靶向NFT的那些，以及对具有AD的受试者有特异性的那些。本文公开的细节可以类似地被用于施用针对其它靶标(例如CNS炎症、ApoE等)设计的治疗剂，包括但不限于在前述段落中鉴定的那些。

实施例

以下实施例说明了本发明的各种迭代。本领域技术人员应该理解，在随后的实施例中公开的技术代表发明人发现的在本发明的实践中发挥良好作用的技术。但是，本领域技术人员鉴于本公开内容应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对所公开的具体实施方案做出改变并且仍然获得类似或相似的结果。因此，在附图中阐述或示出的所有内容将被解释为示例性的而非限制性含义的。

实施例1

开发了几种样品加工方法：在Sato等人，2018中描述的N-端tau和中间结构域tau的免疫沉淀方法(IP)；化学萃取方法(CX)；以及将IP和CX方法组合以富集MTBRtau的方法(IP后-CX)。专门开发了CX和IP后-CX方法用于检测和定量MTBRtau。在图2中提供了这些方法的概述。

简而言之，将CSF(约475μL)与作为内标的含有¹⁵NTau-441(2N4R)均匀标记(大约10μL的100pg/μL溶液，或大约5μL的200pg/μL溶液)的溶液混合。将N-端tau和中间结构域tau物质用Tau1和HJ8.5抗体进行免疫沉淀，并然后如前所述进行加工和胰蛋白酶消化(Sato等人，2018)。

对于CX方法，将CSF(约475μL)与作为内标的含有¹⁵NTau-441(2N4R)均匀标记(大约10μL的100pg/μL溶液，或大约5μL的200pg/μL溶液)的溶液混合。然后，化学萃取tau。使用25μL的高氯酸沉淀高度丰富的CSF蛋白。在混合并在冰上温育15分钟以后，将混合物在4℃下以20,000g离心15分钟，并根据以下步骤使用Oasis HLB 96-孔μElution板(Waters)进一步纯化上清液。将所述板用300μL的甲醇洗涤一次并用500μL的0.1％FA水溶液平衡一次。将上清液加入Oasis HLB 96-孔μElution板中并吸附至固相。然后，将固相用500μL的0.1％FA水溶液洗涤一次。加入洗脱缓冲液(100μL；35％乙腈和0.1％FA水溶液)，并将洗脱液通过Speed-vac干燥。将干燥的样品用50μL在50mM TEABC中的胰蛋白酶溶液(10ng/μL)溶解并在37℃温育20小时。

对于IP后-CX方法，如在CX方法中所述处理免疫沉淀后的CSF(即在上述IP方法以后剩余的上清液)。

在胰蛋白酶消化后，通过在C18 TopTip上的固相萃取纯化所有样品。在此纯化过程中，掺入各5fmol的残基354-369(MTBRtau-354)和354-368(tau368)的AQUA内标肽用于差异定量。在洗脱样品之前，将3％过氧化氢和3％FA水溶液加入珠子中，随后在4℃下温育过夜以氧化含有甲硫氨酸的肽。将洗脱液冷冻干燥并重新悬浮于27.5μL的2％乙腈和0.1％FA水溶液中，然后在与以PRM模式运行的Orbitrap Fusion Lumos Tribrid或OrbitrapTribrid Eclipse质谱仪(Thermo Scientific)偶联的nanoAcquity UPLC系统上进行MS分析。

CX和IP后-CX方法产生的样品包含通过质谱法可检测的和可定量的MTBRtau。通过IP方法未获得MTBRtau的可定量信号。尽管没有证明，但据信也可以使用具有相似灵敏度的替代方法来检测和定量MTBRtau。

实施例2

通过MS进行CSFtau分析：将CSF(455μL)与10μL作为内标的含有¹⁵N Tau-441(2N4R)均匀标记(100pg/μL)的溶液混合。将主要由N-端至中间结构域区域组成的tau物质用Tau1和HJ8.5抗体进行免疫沉淀。将免疫沉淀的tau物质如前所述进行加工和消化(Sato等人，2018)。随后，将20μL的¹⁵N-tau内标(100pg/μL)掺入免疫沉淀后的CSF中。然后，如先前报道(Barthélemy等人，2016b)伴随一些修改，对tau进行化学萃取。使用25μL的高氯酸沉淀高度丰富的CSF蛋白。在混合并在冰上温育15分钟以后，将混合物在4℃下以20,000g离心15分钟，并根据以下步骤使用Oasis HLB 96-孔μElution板(Waters)进一步纯化上清液。将所述板用300μL的甲醇洗涤一次，并用500μL的0.1％FA水溶液平衡一次。将上清液加入OasisHLB 96-孔μElution板中并吸附至固相。然后，将固相用500μL的0.1％FA水溶液洗涤一次。加入洗脱缓冲液(100μL；35％乙腈和0.1％FA水溶液)，并将洗脱液通过Speed-vac干燥。将干燥的样品用50μL在50mM TEABC中的胰蛋白酶溶液(10ng/μL)溶解，并在37℃温育20小时。

在将免疫沉淀的和化学萃取的样品温育以后，通过在C18 TopTip上的固相萃取纯化每种胰蛋白酶消化物。在此纯化过程中，掺入各5fmol的残基354-369(MTBR tau-354)和354-368(tau368)的AQUA内标肽用于差异定量。在洗脱样品之前，将3％过氧化氢和3％FA水溶液加入珠子中，随后在4℃下温育过夜以氧化含有甲硫氨酸的肽。将洗脱液冷冻干燥并重新悬浮于27.5μL的2％乙腈和0.1％FA水溶液中，然后在与以PRM模式运行的OrbitrapFusion Lumos Tribrid或Orbitrap Tribrid Eclipse质谱仪(Thermo Scientific)偶联的nanoAcquity UPLC系统上进行MS分析。对19种CSF tau肽进行了定量(表1)。CSF tau分析的示意性程序描述于图2A中。

统计分析：除非另外指出，否则用单因素方差分析评估生物标志物值的差异。两侧p<0.05被认为是统计上显著的，并使用Benjamini-Hochberg错误发现率(FDR)方法以FDR设置在5％进行多重比较校正(Benjamini和Hochberg，1995)。将斯皮尔曼相关性用于评估tau生物标志物与认知试验测量和tau PET SUVR之间的关联。

表1

实施例3

开发了另一种样品加工方法，其被称作“IP后-IP”，并将其与在实施例1和2中描述的IP后-CX方法进行比较。在图3和图4中提供了IP后-IP方法的示例性工作流程。

将从在实施例2中描述的LOAD100队列获得的CSF样品通过IP后-CX方法(实施例1)或IP后-IP方法(本实施例)进行加工，并然后通过LC-MS进行分析，如在实施例2中一般描述的。

实施例4

用于鉴定和定量来自血浆和脑脊液(CSF)的越来越多的可溶性tau物质的方法的进步为更好地理解tau相关病理学在阿尔茨海默病(AD)中的作用提供了机会。最近在显性遗传性和散发性AD方面的工作已经证实了，在tau蛋白的特定位置处的过度磷酸化、N-端片段和微管结合区(MTBR)与AD级联的不同方面有关。但是，需要评价由不同的可溶性tau物质提供的潜在独特信息。显性遗传AD网络(DIAN)研究提供了探索多种可溶性tau物质与疾病进展以及淀粉样蛋白和神经变性的多种生物标志物之间的关系的机会。

在该实施例中，从参与DIAN的227名突变携带者(MC)(152名无症状MC、77名有症状的MC)和141名非携带者中定量超过12种CSF磷酸化的tau(p-tau)物质和截短的MTBR物质。使用具有逐步选择的线性回归，评价了用于预测估计的到症状发作的年数(EYO)的p-tau和MTBR物质的最佳组合。使用相关性热图和层次聚类检查了tau/p-tau物质和其它生物标志物之间基线水平和纵向变化率的关联模式。

DIAN是国际性、多中心的个体(突变携带者和非携带者；无症状和有症状)登记，所述个体是其父母在APP、PSEN1或PSEN2基因中具有已知的AD致病突变的生物学成年子女，其中使用标准工具在进入时以及此后纵向地以统一的方式对个体进行评价。所述标准工具包括：(1)统一数据集(UDS)的临床和认知测验组系(battery)以及另外的神经心理学和人格测量；(2)阿尔茨海默氏病神经成像计划(ADNI)结构(磁共振成像或MRI)、功能(18氟脱氧葡萄糖正电子发射断层摄影术或FDG PET)和淀粉样蛋白成像(匹兹堡化合物-B或PIB)PET方案；(3)根据ADNI方案，收集生物流体(血液；CSF)用于DNA分析和AD的推定生物标志物的测定，以及(4)对进入尸体剖检的个体的脑组织的统一组织病理学检查。在DIAN中，有症状的个体是具有大于0的临床痴呆评级(CDR>0)的个体。临床痴呆评级是众所周知的被用于定量痴呆症状的严重程度的量表。在DIAN中的症状风险由EYO定义。这里的EYO被定义为父母诊断痴呆的年龄减去参与者当前的年龄。对于在基线时有症状的参与者(如由CDR>0评估的)，从每次临床评估时的年龄减去在实际症状发作时报告的年龄，以定义EYO。

磷酸化-tau检测和定量：样品加工

从80名参与者的队列中汇集人CSF，包括淀粉样蛋白阴性且认知正常的(CDR＝0)对照(n＝47，年龄60+)和淀粉样蛋白阳性且CDR>0的AD患者(n＝33，年龄60+)。从对照组和AD组分别产生5个和7个500μL CSF等分试样汇集物。在初次收集时，将CSF以1,000×g离心沉降10分钟以除去细胞碎片，并立即在-80℃冷冻。在实验过程中添加蛋白酶抑制剂混合液。如之前所述伴随一些修改，对Tau进行免疫沉淀和脱盐(Sato等人，2018)。简而言之，将CNBr活化的Sepharose珠子(GE Healthcare 17-0430-01)以每克珠子3mg抗体的浓度分别与抗体Tau1和HJ8.5交联。给样品掺入AQUA肽(ThermoFisher Scientific)，达到每微升样品中每个感兴趣的序列10fmol磷酸化的tau和100fmol未磷酸化的tau的量。使用这些内标计算Tau和p-tau浓度。将可溶性tau在去污剂(1％NP-40)、离液试剂(5mM胍)和蛋白酶抑制剂(Roche完全蛋白酶抑制剂混合液)中进行免疫沉淀。将与sepharose珠子缀合的抗-Tau1和HJ8.5抗体分别在灭活的sepharose珠子中稀释10倍和5倍，并将30μL的50％抗体珠子浆液与溶液一起在室温下旋转90分钟。将珠子在25mM三乙基碳酸氢铵缓冲液(TEABC,Fluka17902)中洗涤三次。将结合的tau在37℃下用400ng MS级胰蛋白酶(Promega,V5111)在珠子上消化16小时。将消化物加载到TopTip C18(Glygen,TT2C18.96)上，按照制造商的说明书进行脱盐和洗脱。将洗脱的肽通过真空离心(CentriVap Concentrator Labconco)干燥，并重新悬浮于25μL的2％乙腈和0.1％甲酸在MS级水中的溶液中。

将人血液以与以上基本相同的方式加工，但可以使用更大量的血液(例如约500μL至约10mL)。

另外的细节可在PCT/US2019/030725中找到，其公开内容通过引用并入本文。

MTBR-tau检测和定量：样品加工

为了检测和定量MTBRtau物质，如图4所示处理CSF。使用Tau1和HJ8.5的免疫沉淀如上文大体所述。E2814是抗-tau抗体(Eisai)。参见例如Roberts等人，Acta NeuropatholCommun,2020,8(1):13。如上文大体所述进行使用TopTip C18的胰蛋白酶消化和脱盐。将人血液以基本上相同的方式加工，但是可以使用更大量的血液(例如约0.5mL至约10mL)。

磷酸化-tau和MTBR tau检测和定量：质谱法

将肽重悬浮液的5μL等分试样注入nano-Acquity LC中进行MS分析。nano-AcquityLC(Waters Corporation,Milford,MA，美国)配有HSS T375μm×100μm,1.8μm柱，并使用溶液A和B的梯度的0.5μL/min流速来分离肽。溶液A由在MS级水中的0.1％甲酸组成，而溶液B由在乙腈中的0.1％甲酸组成。将肽在28分钟内用2％-20％的溶液B的梯度从柱上洗脱，然后用20％-40％溶液B洗脱另外13分钟，然后在另外3分钟内升至85％溶液B以清洁柱。Orbitrap Fusion Lumos配备有NanosprayFlex电喷雾离子源(Thermo FisherScientific,San Jose,CA，美国)。从10μm SilicaTip发射器(New Objective,Woburn,MA，美国)喷入离子源中的肽离子在四极杆中被靶向和分离。这些通过HCD片段化，并且离子碎片在Orbitrap中进行检测(分辨率30,000或60,000，质量范围150-1,200m/z)。在HSS T3300μm×100μm、1.8mm柱上以4μl/min的流速进行亲水肽(SSRcalc<9，全部不含亮氨酸)监测用于肽图谱分析，使用2％-12％溶液B梯度进行洗脱，并在30mm SilicaTip发射器上操作喷雾。

下面是一些MS转换的列表。肽被列在左栏中。命名法“K.IATPR.G”指示胰蛋白酶肽是IATPR(SEQ ID NO:16)。在“K.IATPR.G”中的“.”被软件程序用来标记切割位点。

结果

对于所有突变携带者(MC)，对于预测EYO，tau生物标志物的最佳组合是在T205处的磷酸化占据(pT205/T205)、MTBR-tau299/MTBR-tau354比率和MTBR-tau212(r²＝0.6)。对于无症状MC，pT205/T205、pT217/T217和MTBR-tau212是最佳组合(r²＝0.47)，并且对于有症状的MC，单独的pT205/T205最具预测性的(r²＝0.12)。基线磷酸化占据(pT217/T217、pT181/T181、pT153/T153、pT111/T111、pT205/T205、pS208/S208)和两种MTBR比率(MTBR-tau299/MTBR-tau354、MTBR-tau299/MTBR-tau282)与淀粉样蛋白病理学(PiB PET、CSF Aβ42/Aβ40比率)簇集在一起，而MTBR-tau与总tau和神经元损伤/神经炎症生物标志物(YKL40、NGRN、VILIP1、SNAP25)更相关。pT153/T153的年度变化与PiB PET(-0.43)和CSF Aβ42/Aβ40(0.67)的年度变化具有最高相关性；而pT217/T217、pT181/T181、总tau、pT153/T153、MTBR-3R、pT111/T111、pT231/T231、MTBR-tau275和MTBR-tau299的年度变化与认知综合的年度变化高度相关(r>0.5)。

这项工作进一步强调了随着AD进展过程而发生的可溶性tau相关变化的多样性。重要的是，这项研究表明，tau相关病理变化的演变存在不同的阶段，其追踪疾病进展和特定的非tau生物标志物变化。这些发现既帮助理解tau在AD中的作用，也帮助理解治疗试验的结果。这些发现也可在AD的诊断、预后和治疗中具有实用性。作为非限制性实例，这些发现可以被用于确定受试者是否应该接受另外的诊断试验和/或选择适当的(一种或多种)试验(例如基于淀粉样蛋白的PET、基于tau的PET等)。作为另一个非限制性实例，这些发现可以被用于为受试者选择一种治疗剂或一类治疗剂，其为针对受试者的疾病阶段和根本疾病病理学(如通过tau生物标志物测量的)定制的。

表2:通过aMC、sMC和NC的pTau

值是平均值±sd

由于数据倾斜，P值基于Kruskal-Wallis单因素方差分析

表3：pTau物质在对MC的PiB PET状态(阳性或阴性)进行分类时的AUC

表4:pTau物质在对MC的认知状态(CDR＝0或CDR>0)进行分类时的AUC

实施例5

背景：脑tau聚集是阿尔茨海默氏病(AD)的病理学标志，并且tau微管结合区(MTBR)是AD tau缠结的核心。近年来，在R1中的tau残基243-254(MTBR-tau243)、在R2中的tau残基299-317(MTBR-tau299)和在R4中的tau残基354-369(MTBR-tau354)被鉴定为在散发性AD脑缠结中特异性富集。在CSF中相应的可溶性MTBR物质增加，与临床进展和通过tau-PET测量的tau病理学高度相关。由于最近在人AD中发现了细胞外MTBR-tau，因此MTBR-tau已经成为靶向该区域的抗体的高度优先目标。在这项研究中，我们试图确定这些MTBR-tau变化何时发生以及与DIAN中的临床、认知和生物标志物变化的相关性。

方法：开发了高精度方法来定量CSF中的十二种tau物质。为了分析MTBR-tau，我们使用抗-MTBR抗体E2814进行了免疫沉淀，E2814是针对R2和R4的双表位以及潜在的tau药物。我们分析了参与DIAN观察队列的227名突变携带者(MC)(152名无症状，77名有症状)和141名非携带者的CSF。

结果：CSF MTBR-tau在MC中特异性增加，并在不同时间变化。在R2中MTBR-tau299的变化发生在-22的估计的到症状发作的年数(EYO)，这接近p-tau217占据的变化的首次检测(EYO-21)。在R4中MTBR-tau354的增加在临床阶段晚期饱和，可能是由于沉积成脑缠结。值得注意的是，概括tau病理生理学的MTBR-tau299/354比率与p-tau217占据(一种早期淀粉样蛋白标志物)高度相关，在特别是无症状MC中(r＝0.82)，这表明MTBR-tau和p-tau217为评估在tau-PET阴性群体中抗-MTBR疗法的生物标志物。

结论：我们鉴定了tau缠结(MTBR物质)的可溶性测量，其在症状发作之前许多年发生变化并在有症状阶段一直持续，表明可以使用抗-MTBR-tau抗体诸如E2814来实施早期干预。最后，我们利用这些结果在DIAN试验单元(DIAN-TU)E2814药物臂中设计了tau下一代平台，以靶向无症状和有症状携带者的独立队列中的可溶性MTBR-tau。在散发性AD和DIAD中，CSF“E2814相关的”MTBR在AD中尤其增加。在整个AD连续谱中E2814-相关的MTBR-tau谱在sAD和DIAD之间看起来相似。在sAD以及DIAD的早期阶段(临床前阶段)增加(-20EYO)。E2814-相关的MTBR的水平在AD发作以后降低(CDR>1，EYO>0)。对于MTBR-260(晚期-R1)、270(早期R2)、282(中期-R2)和299(R2-R3)，E2814相关的MTBR-tau水平与CX水平密切相关。对于MTBR-243(R1上游)和354(R4)，E2814相关的MTBR-tau水平与CX水平相关性较低，这可能是由于MTBR的切割和募集到脑中的tau聚集中。E2814-IP研究揭示了在CSF MTBR-tau中存在多个切割位点，例如254(R1上游)～260(早期R1)和354(R4)～386(C-端)。纵向评估揭示了MTBR-tau299和354的特定轨迹，它们在AD发作之前增加，而它们在AD发作之后减少(->脑tau聚集体的反映)。在考虑MTBR-299/354的比率的情况下，在CSF中的“E2814-相关的MTBR-tau”可以预测AD中的认知测量。在考虑MTBR-299/354的比率的情况下，在CSF中的“E2814-相关的MTBR-tau”仅概括在“早期阶段AD”的tau病理学(tau-PET)。

序列表

<110> 华盛顿大学(Washington University)

BATEMAN, Randall

<120> 检测阿尔茨海默病阶段和进展的CSF TAU物质的方法及其用途

<130> 047563-715616

<150> 63/140,230

<151> 2021-01-21

<150> 63/151,051

<151> 2021-02-18

<150> 63/170,185

<151> 2021-04-02

<150> 63/180,915

<151> 2021-04-28

<150> 63/187,697

<151> 2021-05-12

<150> 63/213,006

<151> 2021-06-21

<160> 21

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 441

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly

1 5 10 15

Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His

20 25 30

Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu

35 40 45

Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser

50 55 60

Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val

65 70 75 80

Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala Ala Gln Pro His Thr Glu

85 90 95

Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro

100 105 110

Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met Val

115 120 125

Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys Gly

130 135 140

Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro

145 150 155 160

Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro

165 170 175

Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly

180 185 190

Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser

195 200 205

Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys

210 215 220

Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys

225 230 235 240

Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val

245 250 255

Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly

260 265 270

Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln

275 280 285

Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly

290 295 300

Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser

305 310 315 320

Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln

325 330 335

Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser

340 345 350

Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn

355 360 365

Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala

370 375 380

Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser

385 390 395 400

Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser

405 410 415

Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val

420 425 430

Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu

435 440

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 2

Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys

1 5

<210> 3

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 3

Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys

1 5 10

<210> 4

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 4

Val Gln Ile Ile Asn Lys

1 5

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 5

Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln Ser Lys

1 5

<210> 6

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 6

His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp

1 5 10 15

Leu Ser Lys

<210> 7

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 7

Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn Lys

1 5 10 15

<210> 8

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 8

Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn

1 5 10 15

<210> 9

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 9

Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys

1 5 10

<210> 10

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 10

Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys

1 5 10

<210> 11

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 11

Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly Thr Tyr Gly Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg

<210> 12

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 12

Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp

1 5 10 15

Ala Gly Leu Lys

20

<210> 13

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 13

Glu Ser Pro Leu Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly

1 5 10 15

Ser Glu Thr Ser Asp Ala Lys

20

<210> 14

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 14

Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val Asp Glu Gly

1 5 10 15

Ala Pro Gly Lys

20

<210> 15

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 15

Gln Ala Ala Ala Gln Pro His Thr Glu Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala

1 5 10 15

Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala

20 25 30

Gly His Val Thr Gln Ala Arg

35

<210> 16

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 16

Ile Ala Thr Pro Arg

1 5

<210> 17

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 17

Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg

1 5 10 15

<210> 18

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 18

Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg

1 5 10

<210> 19

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 19

Val Ala Val Val Arg

1 5

<210> 20

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 20

Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys

1 5 10

<210> 21

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 21

Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg

1 5 10

Claims

1.用于在没有阿尔茨海默氏病的认知或行为症状的受试者中测量到痴呆发作的时间的方法，所述方法包含

(a_i)在获得自所述受试者的血液样品或CSF样品中，测量在tau的残基T205处的磷酸化占据和测量

MTBR-tau299/MTBR-tau354比率，和任选地测量MTBR-tau212、在残基T217处的磷酸化占据、MTBR-tau243、MTBR-tau3R或其组合，或

(a_ii)在获得自所述受试者的血液样品或CSF样品中，测量在tau的残基T205处的磷酸化占据，测量在tau的残基T217处的磷酸化占据，和测量MTBR-tau212；和

(b)使用(ai)或(aii)的度量来计算到痴呆发作的时间，其中到痴呆发作的时间是按年计到大于0的临床痴呆评级的时间。

2.用于在没有阿尔茨海默氏病的认知或行为症状的受试者中测量到痴呆发作的时间的方法，所述方法包含

(a)加工来自所述受试者的血液样品或CSF样品以得到tau物质的第一群体和耗竭的样品，并然后加工所述耗竭的样品以得到tau物质的第二群体，

其中所述tau物质的第一群体富集N-端tau和/或中间结构域tau，且

其中所述富集的tau物质的第二群体富集MTBR-tau；

(b_i)在所述tau物质的第一群体中测量在tau的残基T205处的磷酸化占据和在所述tau物质的第二群体中测量

MTBR-tau299/MTBR-tau354比率，和任选地在所述tau物质的第二群体中测量MTBR-tau212，或

(b_ii)在所述tau物质的第一群体中测量在tau的残基T205处的磷酸化占据和测量在tau的残基T217处的磷酸化占据，和在所述tau物质的第二群体中测量MTBR-tau212；和

3.权利要求2所述的方法，其中加工来自所述受试者的血液样品或CSF样品以得到富集的tau物质的第一群体和耗竭的样品包含

使所述血液样品或所述CSF样品与特异性地结合至所述tau的N-端内的表位的表位结合剂接触，或

使所述血液样品或所述CSF样品与特异性地结合至所述tau的中间结构域内的表位的表位结合剂接触，或

使所述血液样品或所述CSF样品与特异性地结合至所述tau的N-端内的表位的第一表位结合剂接触并与特异性地结合至所述tau的中间结构域内的表位的第二表位结合剂接触，其中所述第一和第二表位结合剂依次或同时使用；

任选地其中所述特异性地结合至所述tau的N-端内的表位的表位结合剂是HJ8.5或与HJ8.5特异性地结合相同的表位的另一种表位结合剂，且任选地其中所述特异性地结合至所述tau的中间结构域内的表位的表位结合剂是Tau1

或与Tau1特异性地结合相同的表位的另一种表位结合剂。

4.权利要求2所述的方法，其中加工所述耗竭的样品以得到富集的tau物质的第二群体包含

执行化学萃取步骤以富集MTBR-tau物质，

任选地其中所述化学萃取步骤包含混合酸以沉淀所述耗

竭的样品的蛋白，任选地其中所述酸是高氯酸，且其中所述MTBR-tau物质在除去沉淀的蛋白以后在上清液中；或

使所述耗竭的样品与特异性地结合至所述tau的MTBR内的至少一个表位的表位结合剂接触，

任选地其中所述表位结合剂是在Vandermeeren等人，J

Alzheimers Dis,2018,65:265-281中描述的77G7、RD3、

RD4、UCB1017或PT76，或者在Roberts等人，Acta

Neuropathol Commun,2020,8:13中描述的7G6，或者

77G7、RD3、RD4、UCB1017、PT76或7G6的抗原结合片段，或者与77G7、RD3、RD4、UCB1017、PT76或7G6特异性地结合相同表位的其它表位结合剂。

5.权利要求2所述的方法，其中

加工来自所述受试者的血液样品或CSF样品以得到富集的tau物质的第一群体和耗竭的样品包含

使所述血液样品或所述CSF样品与特异性地结合至所述tau的N-端内的表位的第一表位结合剂接触并与特异性地结合至所述tau的中间结构域内的表位的第二表位结合剂接触，其中所述第一和第二表位结合剂依次或同时使用，

或与Tau1特异性地结合相同的表位的另一种表位结合剂；且

加工所述耗竭的样品以得到富集的tau物质的第二群体包含

执行化学萃取步骤以富集MTBR-tau物质，

任选地其中所述化学萃取步骤包含混合酸以沉淀所述耗

任选地其中所述表位结合剂是在Vandermeeren等人，J

Alzheimers Dis,2018,65:265-281中描述的77G7、RD3、

RD4、UCB1017或PT76，或者在Roberts等人，Acta

Neuropathol Commun,2020,8:13中描述的7G6，或者

6.权利要求1至5中的任一项所述的方法，其中所述受试者具有0的CDR。

7.权利要求1至6中的任一项所述的到痴呆发作的时间的度量用于将受试者的疾病进展分期的用途。

8.权利要求1至6中的任一项所述的到痴呆发作的时间的度量用于将受试者的脑病理学分期的用途。

9.权利要求1至6中的任一项所述的到痴呆发作的时间的度量用于为受试者选择治疗剂或诊断剂的用途。

10.用于治疗没有阿尔茨海默氏病的认知或行为症状的受试者的方法，所述方法包含给所述受试者施用权利要求9所述的治疗剂或诊断剂。

11.权利要求9所述的用途或权利要求10所述的方法，其中所述诊断剂是tau PET示踪剂，任选地其中所述tau PET示踪剂选自flortaucipir(Lilly)、MK-6240(Cerveau)、PI-2620(Life Molecular Imaging)、RO-948(Roche)、GPT1(Genentech)、JNJ-067(Janssen)、JNJ-64349311(Janssen)、APN-1607、SNFT-1(Tokohu University)、PM-PBB3、AV1451、THK5351和THK5317。

12.权利要求9所述的用途或权利要求10所述的方法，其中所述诊断剂是AβPET示踪剂，任选地其中所述AβPET示踪剂选自FDDNP、AV-45、GE067、BAY94-9172、PI、GDF、NaF、p5+14、氟贝他吡、氟比他班和氟美他酚。

13.权利要求9所述的用途或权利要求10所述的方法，其中所述治疗剂减少Aβ产生，阻止或拮抗Aβ聚集，或增加脑Aβ清除，任选地其中所述治疗剂是γ-分泌酶抑制剂、β-分泌酶抑制剂、被动免疫疗法(包括但不限于抗-Aβ抗体、抗-tau抗体或抗-ApoE抗体)或主动免疫疗法。

14.权利要求9所述的用途或权利要求10所述的方法，其中所述治疗剂阻止或拮抗tau聚集，增加神经原纤维缠结清除，改变tau磷酸化模式，任选地其中所述治疗剂是tau蛋白聚集抑制剂、激酶抑制剂、磷酸酶活化剂、被动免疫疗法(包括但不限于抗-tau抗体)或主动免疫疗法。

15.权利要求9所述的用途或权利要求10所述的方法，其中所述治疗剂是γ分泌酶抑制剂或β-分泌酶抑制剂。

16.权利要求9所述的用途或权利要求10所述的方法，其中所述治疗剂是抗-Aβ抗体、抗-tau抗体或抗-ApoE抗体。

17.用于在具有阿尔茨海默氏病的认知或行为症状的受试者中测量从痴呆发作起的时间的方法，所述方法包含

(b)使用(ai)或(aii)的度量来计算从痴呆发作起的时间，其中从痴呆发作起的时间是按年计从大于0的临床痴呆评级起的时间。

18.用于在具有阿尔茨海默氏病的认知或行为症状的受试者中测量从痴呆发作起的时间的方法，所述方法包含

其中所述富集的tau物质的第二群体富集MTBR-tau；

(c)使用(bi)或(bii)的度量计算从痴呆发作起的时间，其中从痴呆发作起的时间是按年计从大于0的临床痴呆评级起的时间。

19.权利要求18所述的方法，其中加工来自所述受试者的血液样品或CSF样品以得到富集的tau物质的第一群体和耗竭的样品包含

或与Tau1特异性地结合相同的表位的另一种表位结合剂。

20.权利要求18所述的方法，其中加工所述耗竭的样品以得到富集的tau物质的第二群体包含

执行化学萃取步骤以富集MTBR-tau物质，

任选地其中所述化学萃取步骤包含混合酸以沉淀所述耗

任选地其中所述表位结合剂是在Vandermeeren等人，J

Alzheimers Dis,2018,65:265-281中描述的77G7、RD3、

RD4、UCB1017或PT76，或者在Roberts等人，Acta

Neuropathol Commun,2020,8:13中描述的7G6，或者

21.权利要求18所述的方法，其中

或与Tau1特异性地结合相同的表位的另一种表位结合剂；和

加工所述耗竭的样品以得到富集的tau物质的第二群体包含

执行化学萃取步骤以富集MTBR-tau物质，

任选地其中所述化学萃取步骤包含混合酸以沉淀所述耗

任选地其中所述表位结合剂是在Vandermeeren等人，J

Alzheimers Dis,2018,65:265-281中描述的77G7、RD3、

RD4、UCB1017或PT76，或者在Roberts等人，Acta

Neuropathol Commun,2020,8:13中描述的7G6，或者

22.权利要求17至21中的任一项所述的方法，其中所述受试者具有大于或等于0.5的CDR、大于或等于1的CDR或者大于或等于2的CDR。

23.权利要求17至22中的任一项所述的到痴呆发作的时间的度量用于将受试者的疾病进展分期的用途。

24.权利要求17至22中的任一项所述的到痴呆发作的时间的度量用于将受试者的脑病理学分期的用途。

25.权利要求17至22中的任一项所述的到痴呆发作的时间的度量用于为受试者选择治疗剂或诊断剂的用途。

26.用于治疗没有阿尔茨海默氏病的认知或行为症状的受试者的方法，所述方法包含给所述受试者施用权利要求25所述的治疗剂或诊断剂。

27.权利要求25所述的用途或权利要求26所述的方法，其中所述诊断剂是tau PET示踪剂，任选地其中所述tau PET示踪剂选自flortaucipir(Lilly)、MK-6240(Cerveau)、PI-2620(Life Molecular Imaging)、RO-948(Roche)、GPT1(Genentech)、JNJ-067(Janssen)、JNJ-64349311(Janssen)、APN-1607、SNFT-1(Tokohu University)、PM-PBB3、AV1451、THK5351和THK5317。

28.权利要求25所述的用途或权利要求26所述的方法，其中所述诊断剂是AβPET示踪剂，任选地其中所述AβPET示踪剂选自。

29.权利要求25所述的用途或权利要求26所述的方法，其中所述治疗剂减少Aβ产生，阻止或拮抗Aβ聚集，或增加脑Aβ清除，任选地其中所述治疗剂是γ-分泌酶抑制剂、β-分泌酶抑制剂、被动免疫疗法(包括但不限于抗-Aβ抗体、抗-tau抗体或抗-ApoE抗体)或主动免疫疗法。

30.权利要求25所述的用途或权利要求26所述的方法，其中所述治疗剂阻止或拮抗tau聚集，增加神经原纤维缠结清除，改变tau磷酸化模式，任选地其中所述治疗剂是tau蛋白聚集抑制剂、激酶抑制剂、磷酸酶活化剂、被动免疫疗法(包括但不限于抗-tau抗体)或主动免疫疗法。

31.权利要求25所述的用途或权利要求26所述的方法，其中所述治疗剂是γ分泌酶抑制剂或β-分泌酶抑制剂。

32.权利要求25所述的用途或权利要求26所述的方法，其中所述治疗剂是抗-Aβ抗体、抗-tau抗体或抗-ApoE抗体。

33.权利要求25所述的用途或权利要求26所述的方法，其中所述治疗剂是抗-Aβ抗体、抗-tau抗体或抗-ApoE抗体。

34.权利要求25所述的用途或权利要求26所述的方法，其中所述治疗剂是胆碱酯酶抑制剂、NMDA受体拮抗剂或抗炎剂。

35.用于测量受试者中的认知变化的方法，所述方法包含

(a)在获得自所述受试者的血液样品或CSF样品中测量在选自T111、T153、T181、T217和T231的tau的一个或多个残基处的磷酸化占据，和

在获得所述受试者的血液样品或CSF样品中测量

MTBR-tau275、MTBR-tau299和MTBR-3R中的至少一个，和

任选地在获得自所述受试者的血液样品或CSF样品中测量总tau；和

(b)使用(a)的度量来计算认知变化。

36.权利要求35所述的方法，其中所述认知变化相当于通过认知综合评分测量的认知变化，所述认知综合评分由以下组成：来自国际购物清单试验的延迟回忆评分、来自韦氏记忆量表修订版的逻辑记忆延迟回忆评分、来自韦氏成人智力量表修订版的数字符号编码试验总分和MMSE总评分。

37.权利要求34或权利要求35所述的方法，其中所述受试者具有0的CDR。

38.权利要求35或权利要求35所述的方法，其中所述受试者具有大于或等于0.5的CDR。

39.权利要求34至38中的任一项所述的认知变化的度量用于评价治疗剂有效性的用途。