JP2022544514A - Ｍｔｂｒタウアイソフォームを検出する方法およびその使用 - Google Patents

Ｍｔｂｒタウアイソフォームを検出する方法およびその使用 Download PDF

Info

Publication number
JP2022544514A
JP2022544514A JP2022508907A JP2022508907A JP2022544514A JP 2022544514 A JP2022544514 A JP 2022544514A JP 2022508907 A JP2022508907 A JP 2022508907A JP 2022508907 A JP2022508907 A JP 2022508907A JP 2022544514 A JP2022544514 A JP 2022544514A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
tau
seq
mtbr
species
amino acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2022508907A
Other languages
English (en)
Inventor
ベイトマン，ランドール
バルテルミー，ニコラ
ホリエ，カンタ
サトウ，チヒロ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Washington University in St Louis WUSTL
Original Assignee
Washington University in St Louis WUSTL
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Washington University in St Louis WUSTL filed Critical Washington University in St Louis WUSTL
Publication of JP2022544514A publication Critical patent/JP2022544514A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4711—Alzheimer's disease; Amyloid plaque core protein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/34—Purifying; Cleaning
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4709—Amyloid plaque core protein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G01N2800/2821—Alzheimer

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)

Abstract

Figure 2022544514000001
ここに開示する方法は、血液またはＣＳＦサンプルを、ＭＴＢＲタウ種および他のタウ種の定量に適するサンプルに変換する、処理工程の特有の組み合わせを用いる。本発明はまた診断、病期分類および／またはある疾患段階に適する処置の選択およびある処置レジメンの修飾のために、３Ｒ－および４Ｒ－タウオパチーの病理学的特徴および／または臨床症状を評価するための血液またはＣＳＦにおけるＭＴＢＲタウ種の使用も含む。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年８月１３日出願の米国仮出願６２／８８６,１６５、２０２０年２月６日出願の米国仮出願６２／９７０,９５０および２０２０年６月２６日出願の米国仮出願６３／０４４,８３６に基づく優先権を主張し、これら各々を全体として引用により本明細書に包含させる。
政府の権利
本発明は、アメリカ国立衛生研究所により承認されたＮＳ０９５７７３の政府支援の下になされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
配列表の言及
本出願は、ＥＦＳ－ＷｅｂによりASCII形式で提出されている配列表を含み、全体として引用により本明細書に包含させる。年月日に作成したASCIIコピーは、「665135_ST25.txt」なる名称であり、１４KBバイトサイズである。
分野
本発明は、血液またはＣＳＦ(cerebrospinal fluid)サンプルを、マススペクトロメトリー、免疫アッセイまたは当分野で知られる他のアッセイによりＭＴＢＲ(microtubule binding region)タウ種を定量するのに適するサンプルに変換する方法を包含する。本発明はまた診断、病期分類および／またはある疾患段階に適する処置の選択のための、３Ｒ－および４Ｒ－タウオパチーの病理学的特徴および／または臨床症状を測定するための血液またはＣＳＦにおけるＭＴＢＲタウ種の使用も含む。
背景
脳における不溶性凝集体としてのタウタンパク質の蓄積は、アルツハイマー病およびタウオパチーと称される他の神経変性疾患の特徴である。タウ病理は、脳領域を超えて伝播し、プリオン様方式で細胞から細胞への特異的病理学的タウ種の伝達により拡散すると考えられるが、これらの種(すなわち、モノマー、オリゴマーおよび原線維種)の性質および拡散プロセスは未知である(Frost et al., 2009; Goedert et at., 2010, 2017; Sanders et at., 2014; Wu et at., 2016; Mirbaha et al., 2018; Lasagna-Reeves et at., 2012)。タウは、完全長タンパク質で６種の異なるアイソフォームがある。さらに、タウは、１００を超える、リン酸化を含む翻訳後修飾部位を有し、加えて、複数短縮化部位を有する(Meredith et al., 2013; Sato et al., 2018; Barthelemy et al., 2019; Cicognola et al., 2019; Blennow et al., 2020)。故に、タウ拡散に関与する特異的病理学的タウ種の同定は、困難である。いくつかのマススペクトロメトリー(ＭＳ)試験で、タウの微小管結合領域(ＭＴＢＲ)がアルツハイマー病脳における凝集体中で富化されていることが示唆された(Taniguchi-Watanabe et al., 2016; Roberts et al., 2020)。さらに、一連の低温電子顕微鏡(Ｃｒｙｏ－ＥＭ)試験は、タウ凝集体のコア構造がＭＴＢＲドメインのサブセグメントからなり、特定の形態は、タウオパチーに依存することを示した(Fitzpatrick et al., 2017; Falcon et al., 2018, 2019; Zhang et al., 2020)。これらの発見は、ＭＴＢＲタウがタウ凝集に重要であることを強く示唆する。しかしながら、これらの試験は、死後の脳組織を使用した。生きているヒトで脳タウ凝集体のサロゲバイオマーカーとして役立ち得る、ＣＳＦおよび血液などの生物学的サンプルにおける対応する細胞外ＭＴＢＲ含有タウ種における病理的生理学はほとんど解明されていない。
ＣＳＦは、研究参加患者から、その来院時に腰部穿刺により定常的に得られる。先のＣＳＦタウバイオマーカー試験は、ＭＴＢＲタウがＣＳＦになく、Ｎ末端および中間ドメイン領域に集中していることを示した(Meredith et al., 2013; Sato et al., 2018)。Ｎ末端から中間ドメインを構成する種は、中間ドメインとＭＴＢＲドメインの間の短縮化後、ニューロンから細胞外空間に積極的に分泌されるように思われる(Sato et al., 2018)。ＭＴＢＲタウ種の検出は報告されたが(Barthelemy et al., 2016 b, a)、疾患との相関はまだ特徴づけられていない。最近、反復領域４(Ｒ４)内の残基３６８(タウ３６８)の切断を含むタウ種がＣＳＦで同定された(Blennow et al., 2020)。しかしながら、タウ３６８が、抗体により捕捉されない領域、短縮化および立体配座構造の変動を考慮すると、ＭＴＢＲタウ種の全体的プールを反映するか否か、不明である。
高解像度マススペクトロメトリー技術の進歩により、生物学的サンプル中の多数のタンパク質の存在量を測定する新しい方法が考案されている。装置およびデータ解析ソフトウェアの進歩にも関わらず、サンプル調製は、なお膨大な挑戦である。サンプル調製方法の選択は、観察される代謝物プロファイルおよびデータ品質に影響し、最終的に実施結果に影響し得る。特に、生物学的サンプルで存在量が少ないタンパク質およびペプチドでこれは当てはまる。この傘下に入るペプチドは、種々の疾患過程で様々に産生される完全長タンパク質の多くのタンパク分解性フラグメントを含む。
従って、当分野において、体液における、低存在量のＭＴＢＲタウ種を定量するためのサンプル処理方法の改善が必要とされたままである。
概要
本発明の種々の態様の中で、マススペクトロメトリーによりタウの相対的または絶対的濃度を測定するために、予め得た生物学的サンプルを処理する方法が提供される。
本発明のある態様は、生物学的サンプルにおけるタウを測定する方法であって、(ａ)血液サンプルまたはＣＳＦサンプルから選択される生物学的サンプルを準備し；(ｂ)タンパク質沈殿および沈殿タンパク質の分離により生物学的サンプルからタンパク質を除去して上清を得て；(ｃ)固相抽出によりタウを上清から精製し；(ｄ)プロテアーゼで精製タウを開裂し、次いで所望により得られた切断生成物を固相抽出により脱塩して、タウのタンパク分解ペプチドを含むサンプルを得て；そして(ｅ)タウのタンパク分解ペプチドを含むサンプルで液体クロマトグラフィー－マススペクトロメトリーを実施して、タウのタンパク分解ペプチドの少なくとも１種を検出しかつ濃度を測定することを含む、方法を含む。
本発明の他の態様は、生物学的サンプルにおけるタウを評価する方法であって、(ａ)血液サンプルまたはＣＳＦサンプルである生物学的サンプルにおいて、Ｎ末端タウ、中間ドメインタウまたはＮ末端タウおよび中間ドメインタウを親和性枯渇により減少させ；(ｂ)タンパク質沈殿および沈殿タンパク質の分離により生物学的サンプルからさらなるタンパク質を除去して上清を得て；(ｃ)固相抽出によりタウを上清から精製し；(ｄ)プロテアーゼで精製タウを開裂し、次いで所望により得られた切断生成物を固相抽出により脱塩して、タウのタンパク分解ペプチドを含むサンプルを得て；そして(ｅ)タウペプチドを含むサンプルで液体クロマトグラフィー－マススペクトロメトリーを実施して、タウのタンパク分解ペプチドの少なくとも１種を検出しかつ濃度を測定することを含む、方法を含む。
本発明の他の態様は、生物学的サンプルにおけるタウを測定する方法であって、(ａ)血液サンプルまたはＣＳＦサンプルである生物学的サンプルにおいて、Ｎ末端タウ、中間ドメインタウまたはＮ末端タウおよび中間ドメインタウを親和性枯渇により減少させ；(ｂ)ＭＴＢＲタウを親和性精製し；(ｃ)精製ＭＴＢＲタウをプロテアーゼで開裂し、次いで所望により得られた切断生成物を固相抽出により脱塩して、ＭＴＢＲタウのタンパク分解ペプチドを含むサンプルを得て；そして(ｄ)ＭＴＢＲタウのタンパク分解ペプチドを含むサンプルで液体クロマトグラフィー－マススペクトロメトリーを実施して、ＭＴＢＲタウのタンパク分解ペプチドの少なくとも１種を検出しかつ濃度を測定することを含む、方法を含む。
本発明の他の態様は、生物学的サンプルにおけるタウを測定する方法であって、(ａ)血液サンプルまたはＣＳＦサンプルである生物学的サンプルにおいて、Ｎ末端タウ、中間ドメインタウまたはＮ末端タウおよび中間ドメインタウを親和性枯渇により減少させ、ここで、親和性枯渇は、生物学的サンプルとタウ－４４１のアミノ酸１～２２１内(両端を含む)、好ましくはアミノ酸５０～２２１内(両端を含む)またはより好ましくはアミノ酸１０４～２２１内(両端を含む)のエピトープ(または他の完全長アイソフォームの同様に規定された領域内)と特異的に結合するエピトープ結合剤を接触させることを含み；(ｂ)ＭＴＢＲタウを親和性精製し、ここで、親和性精製は、工程(ａ)の生成物と、工程(ａ)のエピトープ結合剤により認識されるエピトープにＣ末端であるエピトープに結合するエピトープ結合剤を接触させることを含み；(ｃ)精製ＭＴＢＲタウをプロテアーゼで開裂し、次いで所望により得られた切断生成物を固相抽出により脱塩して、ＭＴＢＲタウのタンパク分解ペプチドを含むサンプルを得て；そして(ｄ)ＭＴＢＲタウのタンパク分解ペプチドを含むサンプルで液体クロマトグラフィー－マススペクトロメトリーを実施して、ＭＴＢＲタウのタンパク分解ペプチドの少なくとも１種を検出しかつ濃度を測定することを含む、方法を含む。ある実施態様において、工程(ｂ)のエピトープ結合剤は、タウ－４４１のアミノ酸２２１～４４１内(両端を含む)のエピトープ(または他の完全長アイソフォームの同様に規定された領域内)に特異的に結合する。ある実施態様において、工程(ｂ)のエピトープ結合剤は、タウ－４４１のアミノ酸２３５～４４１内(両端を含む)のエピトープ(または他の完全長アイソフォームの同様に規定された領域内)に特異的に結合する。ある実施態様において、工程(ｂ)のエピトープ結合剤は、タウ－４４１のアミノ酸２３５～３６８内(両端を含む)のエピトープ(または他の完全長アイソフォームの同様に規定された領域内)に特異的に結合する。ある実施態様において、工程(ｂ)のエピトープ結合剤は、タウ－４４１のアミノ酸２４４～３６８内(両端を含む)のエピトープ(または他の完全長アイソフォームの同様に規定された領域内)に特異的に結合する。ある実施態様において、工程(ｂ)のエピトープ結合剤は、タウ－４４１のアミノ酸２４４～２９９内(両端を含む)のエピトープ(または他の完全長アイソフォームの同様に規定された領域内)に特異的に結合する。
ここに開示する方法で使用される前、生物学的サンプルは、細胞デブリ除去、成分(例えば、プロテアーゼ阻害剤、同位体標識内部標準、界面活性剤、カオトロピック剤など)の添加および／または検体(例えば、Ａβペプチド、Ｎ末端タウ、中間ドメインタウなど)の枯渇により修飾されていた可能性がある。
ここに開示する方法は、特にＭＴＢＲタウの測定に適する。上記の具体的実施態様において、本発明の方法は、IGST(配列番号２)、VQII(配列番号４)、LQTA(配列番号３)、LDLS(配列番号５)、HVPG(配列番号６)、IGSL(配列番号７)およびVQIV(配列番号９)を含むが、これらに限定されない１以上のタウのトリプシン消化ペプチドの濃度の測定に使用し得る。ある例において、２以上のタウのトリプシン消化ペプチドの濃度を測定し、次いで２つの値の比を計算することが望ましいかもしれない。ここに開示するとおり、HVPG(配列番号６)対IGSL(配列番号７)、LQTA(配列番号３)対IGSL(配列番号７)、IGST(配列番号２)対IGSL(配列番号７)、VQII(配列番号４)対IGSL(配列番号７)、LDLS(配列番号５)対IGSL(配列番号７)、IGST(配列番号２)対HVPG(配列番号６)、VQII(配列番号４)対HVPG(配列番号６)、LDLS(配列番号５)対HVPG(配列番号６)およびVQIV(配列番号７)対LDLS(配列番号５)の比は、タウオパチー診断および処置決定の指針のための臨床上有意義な情報を提供し得る。なおさらなる例において、生物学的サンプルにおける１以上のさらなるタンパク質の存在／非存在の決定および／または１以上のさらなるタンパク質の濃度の測定が望ましいかもしれない。
本発明の他の態様は、対象におけるタウオパチー関連病理を測定する方法であって、血液サンプルまたはＣＳＦサンプルなどの対象から得た生物学的サンプルにおける１以上の中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ種の定量を含み、ここで、定量された中間ドメイン非依存的ＭＴＲＢタウ種の量またはそれらの比率が対象の脳におけるタウオパチー関連病理を表すものである、方法を提供する。タウオパチーは、３Ｒ－タウオパチー、混合型３Ｒ／４Ｒ－タウオパチーまたは４Ｒ－タウオパチーであり得る。疾患関連病理は、タウ沈着、タウ翻訳後修飾、脳および／または脳の動脈におけるアミロイドプラークまたは当分野で知られる他の病理学的特性であり得る。対象は、タウオパチーの臨床症状を有していても、有していなくてもよい。
本発明の他の態様は、対象におけるタウオパチーを診断する方法であって、血液サンプルまたはＣＳＦサンプルなどの対象から得た生物学的サンプルにおける１以上の中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ種の定量し、定量した中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ種が約１.５σ以上異なるときタウオパチーと診断することを含み、ここで、σは、タウオパチーの臨床徴候または症状を有さず、ＰＥＴ造影および／またはＣＳＦにおけるＡβ４２／４０測定で測定してアミロイド陰性である対照集団で測定した正規分布により規定される標準偏差である、方法を提供する。タウオパチーは、３Ｒ－タウオパチー、混合型３Ｒ／４Ｒ－タウオパチーまたは４Ｒ－タウオパチーであり得る。対象は、疾患の臨床症状を有していても、有していなくてもよい。
本発明の他の態様は、対象における疾患安定性を測定する方法であって、対象から得た第一生物学的サンプル、次いで同じ対象から得た第二生物学的サンプルにおける１以上の中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ種を定量し、ここで、第二生物学的サンプルは、第一生物学的サンプル後(例えば、数日、数週、数カ月または数年後)に得ており、サンプル間の定量したＭＴＢＲタウ種の差異を計算することを含み、ここで、第二サンプルにおける定量したＭＴＢＲタウ種の統計的に有意な増加は疾患進行を示し、第二サンプルにおける定量したＭＴＢＲタウ種の統計的に有意な減少は疾患改善を示し、そして変化なしは疾患安定を示すものである、方法を提供する。対象は、疾患の臨床症状を有していても、有していなくてもよい。
本発明の他の態様は、タウオパチーを有する対象を処置する方法であって、血液サンプルまたはＣＳＦサンプルなどの対象から得た生物学的サンプルにおける１以上の中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ種を定量し；そして疾患関連病理および／または臨床症状の測定値を改善するために対象に処置を施すことを含み、ここで、対象は、定量したＭＴＢＲタウ種が約１.５σ以上異なり、ここで、σは、タウオパチーの臨床徴候または症状を有さず、ＰＥＴ造影および／またはＣＳＦにおけるＡβ４２／４０測定により評価してアミロイド陰性である対照集団で測定した正規分布により規定される標準偏差である、方法を提供する。タウオパチーは、３Ｒ－タウオパチー、混合型３Ｒ／４Ｒ－タウオパチーまたは４Ｒ－タウオパチーであり得る。疾患関連病理の測定値は、ＭＴＢＲタウ種の量および／またはＰＥＴ造影により評価したタウ沈着、マススペクトロメトリーまたは他の適当な方法により評価したタウ翻訳後修飾、ＰＥＴ造影により評価した脳または脳の動脈におけるアミロイドプラーク、ＣＳＦにおけるＡβ４２／４０により測定したアミロイドプラークまたは当分野で知られる他の病理学的特徴であり得る。臨床症状は、臨床的に検証された装置(例えば、MMSE、CDR-SBなど)により評価した認知症または３Ｒ－、３Ｒ／４Ｒ－および４Ｒ－タウオパチーについて当分野で知られる他の臨床症状であり得る。
本発明のこれらおよび他の態様ならびにイテレーションを、下にさらに詳述する。
本出願は、カラーで提出した写真を少なくとも１枚含む。カラー写真を伴うこの特許出願公開のコピーは、請求および必要な費用の支払いにより、庁から提供される。
図１は、最長ヒトタウアイソフォーム(２Ｎ４Ｒ)の模式図を示す。このアイソフォームのＮ末端(Ｎ末端)、中間ドメイン、ＭＴＢＲおよびＣ末端(Ｃ末端)が特定され、他のタウアイソフォーム(例えば、２Ｎ３Ｒ、１ＮＲ４、１Ｎ３Ｒ、０Ｎ４Ｒおよび０Ｎ３Ｒ)について予測可能な方法で変化する。
図２Ａは、本発明のいくつかの方法を説明する模式図である。青色ボックス(右)内に詳述された方法は、一つの方法である。赤色ボックス(左)と青色ボックス(右)の組み合わせはその他の方法である。
図２Ｂは、本発明のいくつかの方法を説明する模式図である。青色ボックス(右)内に示された方法は、一つの方法である。赤色ボックス(左)と青色ボックス(右)の組み合わせはその他の方法である。
図３Ａは、ＣＳＦの一試験サンプルからタウペプチドを定量する能力について、３つのサンプル処理方法の効果を比較したグラフである。ＣＳＦの試験サンプルは一個体からではなく、ＣＳＦに関連する疾患状態は入手不可能あった。タウ－４４１ペプチドをｘ軸に、１４Ｎ／１５Ｎ比をｙ軸に示す。抗体ＨＪ８.５およびＴａｕ１により認識されるエピトープの相対的位置(各々「Ｙ」として示す)が示される。ＩＰ方法で処理したサンプルにおいて(緑色三角)、ＭＴＢＲ領域からのタウのトリプシン消化ペプチドは、検出可能ではあるものの、Ｎ末端～中間ドメインのタウのトリプシン消化ペプチドよりはるかに低いシグナルであり、ＡＤを含む慢性神経変性疾患および健常ボランティアからのヒトＣＳＦで定量不可能であった。対照的に、これらのペプチドは、ＣＸ方法(青色丸)またはPostIP-CX方法(赤色四角)で処理したサンプルで容易に検出できた。
図３Ｂは、サンプル処理が下流方法により検出されたタウタンパク質の集団にどのように影響し得るかを示す図である。ＩＰ方法において(緑色点線で囲む)、抗体(それぞれＨＪ８.５およびＴａｕ１により例示)により認識されるＮ末端および中間ドメインエピトープを有するタウ種は、免疫沈殿する。PostIP-CX方法において(赤色点線で囲む)、免疫沈殿および沈殿後に存在するタウ種は、免疫沈殿(「ＭＴＢＲ－Ｃ」図により例示)で使用した抗体により認識されるエピトープを有さず、またはエピトープは接近可能ではない(線形形態タウの図により例示)。免疫沈殿を予めすることなく行うＣＸ方法(青色点線で囲む)は、ＩＰ方法およびPostIP-CX方法に由来するタウ種を含むサンプルをもたらす。
図４は、ＬＯＡＤ１００およびＬＯＡＤ６０ ＣＳＦサンプルで評価したpT217％(ｘ軸)対Ａβ４２／４０濃度(ｙ軸)のグラフである。水平点線は、ＣＳＦ Ａβ４２／４０濃度により規定したアミロイド状態を画定する(ＣＳＦ Ａβ４２／４０＞０.１３８９＝アミロイド陽性およびＣＳＦ Ａβ４２／４０＜０.１３８９＝アミロイド陰性)。示されるとおり、ｐ２１７％は、このカットオフにより規定されたアミロイド状態と極めて良好に相関する。
図５は、実施例１に記載のＩＰ方法(ＩＰ＿TPPS、左側グラフ)または実施例１および２に記載のPostIP-CX方法(ＰｏｓｔｌＰ＿HVPG、右側グラフ)により処理されたＣＳＦサンプルにおける、マススペクトロメトリーにより定量した２種のタウのトリプシン消化ペプチド、TPPSおよびHVPGのグラフを示す。ＣＳＦサンプルは、ＣＤＲスコアおよびアミロイド状態により同定される。２グラフ間のグラフは、タウ－４４１におけるトリプシン消化ペプチドの相対的位置を示す。ＮＳ － 非有意。
図６Ａは、実施例１および２に記載のPostIP-CX方法により処理したＣＳＦサンプルにおけるタウのトリプシン消化ペプチド、HVPG対Ａβ４２／４０の量を示すグラフである。ＣＳＦサンプルをアミロイド状態により特定した － アミロイド陽性(赤色)またはアミロイド陰性(青色)。データは、実施例１および２に記載のPostIP-CX方法により処理したＣＳＦサンプルのHVPGの測定が、Ａβ４２／４０の観点でのアミロイド状態との強い相関により証明されるとおり、脳におけるアミロイド状態を再現することを示す。
図６Ｂは、実施例１および２に記載のPostIP-CX方法により処理したＣＳＦサンプルにおける、タウのトリプシン消化ペプチド、HVPG対pT217％の量を示すグラフである。ＣＳＦサンプルをアミロイド状態により特定した － アミロイド陽性(赤色)またはアミロイド陰性(青色)。データは、実施例１および２に記載のPostIP-CX方法により処理したＣＳＦサンプルのHVPGの測定が、pT217％の観点でのアミロイド状態との強い相関により証明されるとおり、脳におけるアミロイド状態を再現することを示す。
図７Ａ、図７Ｂおよび図７Ｃは、実施例１および２に記載のPostIP-CX方法により処理したＣＳＦサンプルにおける３種のタウのトリプシン消化ペプチド、LQTA(図７Ａ)、HVPG(図７Ｂ)およびIGSL(図７Ｃ)を示すグラフである。ＣＳＦサンプルを、ＣＤＲスコアおよびアミロイド状態によりグループ分けする。データは、LQTAが、症候性段階であっても、アミロイド陰性対象と比較して、アミロイド陽性対象で増加する；HVPGが、特に無症候性段階で、アミロイド陰性対象と比較して、アミロイド陽性対象で増加する；そして、IGSLが、アミロイド陰性対象と比較して、アミロイド陽性対象で増加し、症候性段階後に減少することを示す。
図８Ａ、図８Ｂおよび図８Ｃは、実施例１および２に記載のPostIP-CX方法により処理したＣＳＦサンプルにおける、３種のタウのトリプシン消化ペプチド、LQTA(図８Ａ)、HVPG(図８Ｂ)およびIGSL(図８Ｃ)の量をそれぞれ示すグラフである。個々の患者からの長期的サンプルを、記号により示すアミロイド状態と共に示す(ＣＤＲ０＝黒色丸、ＣＤＲ０.５＝青色三角、ＣＤＲ１＝赤色四角、ＣＤＲ２＝紫色逆三角)。対応ありｔ検定を、個々の参加者の１回目および２回目の来院結果に使用した。アミロイド陽性群は、各患者で方向の有意な変化を示した。タウ－ＰＥＴシグナルが高であり(＞２ SUVR)、ＣＤＲスコアがＣＤＲ１からＣＤＲ２に変わった参加者Ａ(赤色太線により示す)で観察された変化も注目に値した。この患者について、タウ病理進行により、LQTAは増加し(図８Ａ)、HVPGは減少し(図８Ｂ)、そしてIGSLは減少した(図８Ｃ)。
図９Ａ、図９Ｂおよび図９Ｃは、実施例１および２に記載のPostIP-CX方法により処理したＣＳＦサンプルにおける３種のタウのトリプシン消化ペプチドの量対サンプルを得た対象におけるCDR-SBスコアを示すグラフである。３種のタウのトリプシン消化ペプチドは、それぞれ、LQTA、HVPGおよびIGSLである。アミロイド陽性対象は青色丸であり、アミロイド陰性対象は赤色四角である。付随する統計解析により示されるとおり、LQTAのみがCDR-SBと有意に相関する。
図１０Ａ、図１０Ｂおよび図１０Ｃは、実施例１および２に記載のPostIP-CX方法により処理したＣＳＦサンプルにおける３種のタウのトリプシン消化ペプチドの量対サンプルを得た対象におけるミニメンタルステート試験(MMSE)スコアを示すグラフである。３種のタウのトリプシン消化ペプチドは、それぞれ、LQTA、HVPGおよびIGSLである。アミロイド陽性対象は青色丸であり、アミロイド陰性対象は赤色四角である。付随する統計解析により示されるとおり、LQTAのみがMMSEと有意に相関する。
図１１Ａ、図１１Ｂおよび図１１Ｃは、実施例１および２に記載のPostIP-CX方法により処理したＣＳＦサンプルにおける３種のタウのトリプシン消化ペプチドの量対サンプルを得た対象におけるタウ－ＰＥＴスコアを示すグラフである。３種のタウのトリプシン消化ペプチドは、それぞれ、LQTA、HVPGおよびIGSLである。アミロイド陽性対象は青色丸であり、アミロイド陰性対象は赤色四角である。付随する統計解析により示されるとおり、LQTAのみがタウ－ＰＥＴと有意に相関する。ＭＴＢＲタウの他のトリプシン消化ペプチドは有意に相関しなかった。
図１２Ａおよび図１２Ｂは、実施例１および２に記載のPostIP-CX方法により処理したＣＳＦサンプルにおけるタウのトリプシン消化ペプチド、LQTAの量対CDR-SB(図１２Ａ)およびMMSE(図１２Ｂ)を示すグラフである。データは、認知機能障害の２種の異なる測定により評価して、LQTAは認知機能と有意な相関を示した。
図１３Ａは、ＩＰ方法(ｘ軸)およびPostIP-CX方法(ｙ軸)により処理したサンプルにおけるタウのトリプシン消化ペプチド、LQTAの量を示すグラフである。アミロイド陽性対象を赤色記号で特定し、アミロイド陰性対象を青色記号で特定する。付随する統計解析により示されるとおり、「ＭＴＢＲ関連LQTA」(PostIP-CX方法で処理したサンプルで測定)のみが、アミロイド陽性群でアミロイド陰性群よりも増加した。
図１３Ｂおよび図１３Ｃは、それぞれ、実施例１および２に記載のPostIP-CX方法またはＩＰ方法で処理したＣＳＦサンプルにおけるタウのトリプシン消化ペプチド、LQTAの量を示すグラフである。ＣＳＦサンプルを、ＣＤＲスコアおよびアミロイド状態によりグループ分けする。データは、LQTA特異的特徴(すなわち、症候性段階後の直線的増加)が「ＭＴＢＲ関連ＬＴＱＡ」でのみ観察されたことを示す。データは、個々の結果(プロット)および平均(バー)として示す。統計試験における有意性：＊＊＊＊ｐ＜０.００１、＊＊＊ｐ＜０.００１、＊＊ｐ＜０.０１、＊ｐ＜０.０５。ＮＳ＝非有意。統計的差異を、ベンジャミン・ホッシュバーグ偽陽性率(ＦＤＲ)方法を使用する複数比較補正を伴う一元配置ANOVAで、ＦＤＲを５％で設定して評価した。
図１４は、アミロイド状態を決定するための、ＩＰ方法(青色(下部)線)またはPostIP-CX方法(赤色(上部)線)に従うマススペクトロメトリーにより測定した、タウのトリプシン消化ペプチド、LQTAの感受性および特異性を比較する受信者動作特性曲線(ＲＯＣ)を示すグラフである。曲線は、PostIP-LQTA(ＭＴＢＲ関連LQTA)がIP-LQTAよりもアミロイド状態を良好に識別することを示す。
図１５Ａおよび図１５Ｂは、IGSL対HVPG比が、識別力を押し上げることを示す。図１５Ａは、実施例１および２に記載するPostIP-CX方法により処理したＣＳＦサンプルにおける、比(IGSL／LQTA)として示す、タウのトリプシン消化ペプチド、IGSLおよびLQTAの量を示すグラフである。ＣＳＦサンプルを、ＣＤＲスコアおよびアミロイド状態によりグループ分けする。図１５Ｂは、IGSL／LQTA比とpT205％の相関を示すグラフである。pT205％を、先に記載のとおり測定した(Barthelemy, N.R., Li, Y, Joseph-Mathurin, N. et al. Nat Med 26, 398-407 (2020))。IGSL／LQTAは、pT205と極めて密接な相関を示し、これは、発症ＡＤ発症近くで調節される。
図１５Ｃおよび図１５Ｄは、IGSL対HVPG比が識別力を押し上げることを示す。図１５Ｃは、実施例１および２に記載するPostIP-CX方法により処理したＣＳＦサンプルにおける、比(IGSL／HVPG)として示すタウのトリプシン消化ペプチド、IGSLおよびHVPGの量を示すグラフである。ＣＳＦサンプルを、ＣＤＲスコアおよびアミロイド状態によりグループ分けする。図１５Ｄは、IGSL／LQTA比とpT217％の相関を示すグラフである。IGSL／HVPGはpT217と極めて密接な相関を示し、これは、アミロイド状態を再現する。
図１６は、タウ病理がアルツハイマー病の異なる相を通して進展することを示す、図である。確定的アルツハイマー病変異を有する参加者群における４種の異なる可溶性タウ種および不溶性タウの測定により、約４０年にわたる経過における(ｘ軸)、タウ関連変化を明らかにし(ｙ軸)、疾患段階および他の測定可能バイオマーカーに基づき、異なることを示した。原線維アミロイド病理の進展から開始して、２１７位(紫色)および１８１位(青色)でのリン酸化が増加し始める。ニューロン機能不全が増加するに連れ(代謝変化に基づく)、２０５位でのリン酸化(緑色)が可溶性タウ(橙色)と共に増加する。最後に、神経変性の発症に伴い(脳萎縮および認知低下に基づく)、Tau-PET濃縮体(赤色)が進展し始め、２１７位および１８１位のリン酸化は減少し始める。まとめると、これにより、疾患経過における可溶性および凝集タウの動的および分岐パターンおよびアミロイド病理との密接な相関が強調される。
図１７は、アルツハイマー病(ＡＤ)進行の間に、ＭＴＢＲタウの種々の領域の切断に対する接近性がどのように変わり得るかおよびなぜ配列番号３のアミノ酸配列(LQTAPVPMPDLK)を含むＭＴＢＲタウ種が、全ＡＤ段階にわたりタウ病理の良好なサロゲートであるかを示す理論的モデルの図である。発症前ＡＤ段階において、脳タウ凝集体は未成熟であり、プロテアーゼのより広範な接近を可能とする。ＭＴＢＲタウ２４３、ＭＴＢＲタウ２９９およびＭＴＢＲタウ３５４を含むＭＴＢＲタウ種は、ＣＳＦに分泌される。しかしながら、疾患進行に連れてタウ凝集体が成熟し、堅さを増していくコアを形成し、ＭＴＢＲタウ３５４、次いでＭＴＢＲタウ２９９へのプロテアーゼ接近は減少し、ＭＴＢＲタウ３５４、次いでＭＴＢＲタウ２９９を含むＭＴＢＲ種はＣＳＦで安定化される。しかしながら、ＭＴＢＲタウ２４３は、全疾患段階で暴露されたままであり、プロテアーゼ消化およびＣＳＦへの放出が可能である。ＣＳＦにおけるこれら３種の不均衡が、脳タウ凝集体形成の兆候として観察される。註：この図において、ＭＴＢＲタウ種間のサイズ差は描かれていない。
図１８Ａは、実施例３で定量し、図１８Ｂおよび図１８Ｃにさらに記載するタウ(灰色バー)からのトリプシン消化ペプチドの模式図である。
図１８Ｂおよび図１８Ｃは、対照脳抽出物と比較して、凝集アルツハイマー病脳不溶性抽出物でＭＴＢＲタウ２４３、２９９および３５４を含む脳ＭＴＢＲタウ種が富化され、ＭＴＢＲタウがアルツハイマー病脳で特異的に沈着されることを示す、グラフである。グラフは、(図１８Ｂ)対照およびアルツハイマー病脳(ｎ＝２で、発見コホートにおける６～８脳領域サンプル／群)および(図１８Ｃ)対照(アミロイド陰性、ｎ＝８)、極軽度乃至中程度アルツハイマー病(ＡＤ)(アミロイド陽性、ＣＤＲ＝０.５～２、ｎ＝５)および重度ＡＤ脳(アミロイド陽性、ＣＤＲ＝３、ｎ＝７)からのタウペプチドの富化プロファイルを示す(検証コホートで計ｎ＝２０)。タウペプチドの相対的存在量を、内部正規化のために中間ドメイン(残基１８１～１９０)ペプチドに対して定量した。微小管結合領域(ＭＴＢＲ)ドメインの上流領域(残基２４３～２５４、ＭＴＢＲタウ２４３)および反復領域２(Ｒ２)からＲ３およびＲ４(残基２９９～３１７それぞれ、ＭＴＢＲタウ２９９および３５４～３６９、ＭＴＢＲタウ３５４)を含む種は、ＣＤＲにより評価して、対照に比してアルツハイマー病脳の不溶性フラクションで高度に富化され、疾患進行の臨床病期までに特に富化された。ＭＴＢＲタウ２９９およびＭＴＢＲタウ３５４は線維コア内部に位置し、一方、ＭＴＢＲタウ２４３はアルツハイマー病凝集体コアの外部に位置する(Fitzpatrick et at., 2017)。注目すべきことには、残基１９５～２０９は、おそらく高度なリン酸化により、アルツハイマー病脳で減少する。データを、中央、四分位間間隔、最小、最高および外れ値の個々の点を示すテューキー法での箱ひげ図として表わす。統計試験における有意性：＊＊＊＊ｐ＜０.００１、＊＊＊ｐ＜０.００１、＊＊ｐ＜０.０１、＊ｐ＜０.０５。
図１９Ａは、実施例３で定量し、図１９Ｂおよび図１９Ｃにさらに記載するタウ(灰色バー)からのトリプシン消化ペプチドならびに抗体ＨＪ８.５およびＴａｕ１の一般的結合部位の模式図である。
図１９Ｂは、対照ヒトＣＳＦにおけるタウプロファイルを示すグラフである。アミロイド陰性およびＣＤＲ＝０患者の横断的コホート(ｎ＝３０)からの対照ヒトＣＳＦにおけるタウペプチドを、Ｎ末端～中間ドメインタウに焦点を絞ったＴａｕ１／ＦＩＪ８.５免疫沈殿により定量した。微小管結合領域(ＭＴＢＲ)およびＣ末端領域を含む種の定量のために、免疫沈殿後ＣＳＦサンプルを化学的に抽出し、連続して分析した。Ｔａｕ１／ＦＩＪ８.５免疫沈殿方法(青色丸)を使用して、ペプチド回収は、残基２２２後劇的に減少し、従って、Ｎ末端～中間ドメインタウ(残基６～２３から２４３～２５４)ペプチドのみをこの方法で定量した(Sato et at., 2018)。対照的に、免疫沈殿後ＣＳＦの化学抽出方法(赤色四角)は、０.４～７ng／mL濃度でＭＴＢＲからＣ末端領域を含む領域全体の定量を可能とする。データを平均として示す。
図２０Ａ、図２０Ｂおよび図２０Ｃは、横断的コホートからのPostlP-CX CSFにおける中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ２４３(図２０Ａ)、中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ２９９(図２０Ｂ)および中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ３５４(図２０Ｃ)の量を示すグラフである。中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ２４３、中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ２９９および中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ３５４は、アミロイドプラークおよび臨床的認知症段階に対して異なるプロファイルを示す。アミロイド陰性ＣＤＲ＝０(対照、ｎ＝３０)、アミロイド陽性ＣＤＲ＝０(発症前ＡＤ、ｎ＝１８)、アミロイド陽性ＣＤＲ＝０.５(極軽度ＡＤ、ｎ＝２８)、アミロイド陽性ＣＤＲ＞１(軽度～中程度ＡＤ、ｎ＝１２)およびアミロイド陰性ＣＤＲ＞０.５(非ＡＤ認知機能障害、ｎ＝１２)。中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ２４３は、全臨床病期をとおして、アルツハイマー病進行と共に増加し続ける。中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ２９９および中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ３５４濃度は、極軽度アルツハイマー病段階(アミロイド陽性およびＣＤＲ＝０.５)まで増加し続けるが、その後ＣＤＲ＞１で飽和(ＭＴＢＲタウ２９９)または減少(ＭＴＢＲタウ３５４)する。赤色または青色文字のｐ値は、それぞれ有意な増加または減少を示す。データは、個々の結果(プロット)および平均(バー)として示す。統計試験における有意性：＊＊＊＊ｐ＜０.００１、＊＊＊ｐ＜０.００１、＊＊ｐ＜０.０１、＊ｐ＜０.０５。ＮＳ＝非有意。
図２１Ａ、図２１Ｂおよび図２１Ｃは、アミロイド陰性(－)または陽性(＋)患者のＣＳＦにおける(図２１Ａ)中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ２４３、(図２１Ｂ)中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ２９９および(図２１Ｃ)中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ３５４の長期的変化率(ng／mL／年)を示すグラフを示す(長期的コホートから計ｎ＝２８)。アミロイド陽性群を、ＣＤＲ＝０～０(ｎ＝７)、ＣＤＲ＝０～０.５(ｎ＝２)、ＣＤＲ＝０～１(ｎ＝１)、ＣＤＲ＝０.５～０.５(ｎ＝２)、ＣＤＲ＝０.５～１(ｎ＝１)およびＣＤＲ＝１～２(ｎ＝１、参加者Ａ)を含む種々のＣＤＲ変化にさらに分ける。アミロイド陰性群の参加者は、有意な長期的変化を示さなかったが(平均値は０に近い)、アミロイド陽性群の大部分の参加者は、長期的にＭＴＢＲタウ濃度増加を示した。顕著なことに、アルツハイマー病臨床的発症後認知変化が最大に変化した(ＣＤＲ＝１～２)参加者Ａは、軽度ＡＤ(ＣＤＲ＝１)から中程度ＡＤ(ＣＤＲ＝２)進行のCSF ＭＴＢＲタウ２４３増加しか示さず、ＭＴＢＲタウ２９９および３５４は減少した。これらのデータは、ＣＳＦ中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ種が、アルツハイマー病臨床病期進行に伴い、長期的に増加することを示す。
図２２Ａ、図２２Ｂおよび図２２Ｃは、PostIP-CX CSFにおける(ｘ軸)Tau-PET(ＡＶ－１４５１)SUVRおよび(ｙ軸)中間ドメイン非依存的(図２２Ａ)ＭＴＢＲタウ－２４３、(図２２Ｂ)ＭＴＢＲタウ－２９９および(図２２Ｃ)ＭＴＢＲタウ－３５４濃度を示すグラフである(対照ｎ＝１５およびアルツハイマー病(ＡＤ)Tau-PETコホートからｎ＝２０)。白色丸：対照、黒色四角：ＡＤ。中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ２４３は、Tau-PET SUVRと最も有意な相関を示した(ｒ＝０.７５８８、ｐ＜０.０００１)。これらのデータは、配列番号３(LQTAPVPMPDLK)を含むＣＳＦ中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ種が、タウ富化体のTau-PET SUVR測定値と高度に相関し、一方他の中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ領域は、タウ富化体との相関が低いことを示す。
図２３Ａおよび図２３Ｂは、対照脳抽出物と比較して、アルツハイマー病脳可溶性抽出物で脳ＭＴＢＲタウ２４３、ＭＴＢＲタウ２９９およびＭＴＢＲタウ３５４が富化されていないことを示す、グラフである。図２３Ａは、対照およびアルツハイマー病脳からのタウペプチドの富化プロファイルを示し(ｎ＝２と発見コホートにおける８～１０脳領域サンプル／群)、図２３Ｂは、検証コホート(計ｎ＝２０)における対照(アミロイド陰性、ｎ＝８)、極軽度乃至中程度アルツハイマー病(ＡＤ)(アミロイド陽性、ＣＤＲ＝０.５～２、ｎ＝５)および重度ＡＤ脳(アミロイド陽性、ＣＤＲ＝３、ｎ＝７)からのタウペプチドの富化プロファイルを示す。タウペプチドの相対的ペプチド存在量を、内部正規化のために中間ドメイン(残基１８１～１９０)ペプチドに対して定量した。可溶性タウ種における微小管結合領域(ＭＴＢＲ)ドメイン含有タウ種で変化は観察されず、アルツハイマー病脳で増加した不溶性ＭＴＢＲタウ種と対照的であった(図１８)。データを、中央、四分位間間隔、最小、最高および外れ値の個々の点を示すテューキー法での箱ひげ図として表わす。統計試験における有意性：＊＊ｐ＜０.０１、＊ｐ＜０.０５。
図２４は、ＭＴＢＲタウ３５４が脳不溶性抽出物におけるタウ３６８と相関することを示すグラフであり、各種がタウ病理の進行により識別されないことを示唆する。対照およびアルツハイマー病患者からの脳不溶性抽出物におけるＭＴＢＲタウ３５４およびタウ３６８種のマススペクトロメトリー分析を、発見コホートサンプルを使用して実施した(計２３脳サンプル、アルツハイマー病＃１参加者から６脳領域、アルツハイマー病＃２参加者から８脳領域、対照＃１参加者から５脳領域、対照＃２参加者から４脳領域)。ＭＴＢＲタウ３５４(残基３５４～３６９)およびその切断形態、タウ３６８(残基３５４～３６８)は、脳不溶性抽出物で密接な相関を示した(スピアマンｒ＝０.９７８３)。
図２５Ａ、図２５Ｂ、図２５Ｃ、図２５Ｄ、図２５Ｅおよび図２５Ｆは、PostIP-CX方法による処理、続くマススペクトロメトリー(ＭＳ)分析後のヒトＣＳＦサンプルにおけるＭＴＢＲタウのトリプシン消化ペプチドの定量を示すグラフである。中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ２４３(図２５Ａ、図２５Ｄ)、中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ２９９(図２５Ｂ、図２５Ｅ)および中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ３５４(図２５Ｃ、図２５Ｆ)の抽出ＭＳクロマトグラムが示される。ヒトＣＳＦを、横断的コホートからのアミロイド陽性およびＣＤＲ＝０.５極軽度アルツハイマー病参加者から得た。図２５Ａ、図２５Ｂおよび図２５Ｃは、内因性トリプシン消化ペプチドからのピークを示し、一方図２５Ｄ、図２５Ｅおよび図２５Ｆは、内部標準(１５Ｎ標識タウ)からのピークを示す。Ｘ軸およびＹ軸は、それぞれ、各ピークの保持時間およびＭＳ強度を示す。
図２６Ａ、図２６Ｂ、図２６Ｃ、図２６Ｄ、図２６Ｅ、図２６Ｆ、図２６Ｇ、図２６Ｈ、図２６Ｉ、図２６Ｊおよび図２６Ｋは、ＩＰ方法によるサンプル処理、続くＭＳ分析後のヒトＣＳＦにおけるＮ末端タウおよび中間ドメインタウのトリプシン消化ペプチドの濃度を示すグラフである。Ｎ末端および中間ドメインＣＳＦタウ種は、極早期認知症と正常を識別するが、認知症段階と相関しない。横断的コホート内の群からのＣＳＦにおけるタウ種、残基(図２６Ａ)６～２３、(図２６Ｂ)２５～４４、(図２６Ｃ)４５～６７、(図２６Ｄ)６８～８７、(図２６Ｅ)８８～１２６、(図２６Ｆ)１５１～１５５、(図２６Ｇ)１８１～１９０、(図２６Ｈ)１９５～２０９、(図２６Ｉ)２１２～２２１、(図２６Ｊ)２２６～２３０および(図２６Ｋ)２４３～２５４濃度(残基ナンバリングはタウ４４１に基づく)。アミロイド陰性ＣＤＲ＝０(対照、ｎ＝２９)、アミロイド陽性ＣＤＲ＝０(発症前ＡＤ、ｎ＝１８)、アミロイド陽性ＣＤＲ＝０.５(極軽度ＡＤ、ｎ＝２７)、アミロイド陽性ＣＤＲ＞１(軽度～中程度ＡＤ、ｎ＝１２)およびアミロイド陰性ＣＤＲ＞０.５(非ＡＤ臨床的機能障害、ｎ＝１２)。これらタウ種を、Ｔａｕ１／ＦＩＪ８.５免疫沈殿方法(ＩＰ方法)を使用して単離した。赤色文字のｐ値は、有意を示す。データは、個々の結果(プロット)および平均(バー)として示す。統計試験における有意性：＊＊＊＊ｐ＜０.００１、＊＊＊ｐ＜０.００１、＊＊ｐ＜０.０１、＊ｐ＜０.０５。ＮＳ＝非有意。
図２７Ａ、図２７Ｂ、図２７Ｃ、図２７Ｄ、図２７Ｅ、図２７Ｆ、図２７Ｇおよび図２７Ｈは、PostIP-CX方法によるサンプル処理、続くＭＳ分析後の、ヒトＣＳＦにおけるＭＴＢＲタウのトリプシン消化ペプチドの濃度を示すグラフである。特有のアルツハイマー病アミロイドおよび臨床病期パターンは、ＣＳＦにおける中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ種に特異的である。中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ２４３のみが、さらに進行した臨床病期を識別する。横断的コホート内の参加者からの免疫沈殿後サンプルから化学抽出を使用して得たＣＳＦにおけるタウ種、残基(図２７Ａ)２４３～２５４(ＭＴＢＲタウ２４３)、(図２７Ｂ)２６０～２６７、(図２７Ｃ)２７５～２８０、(図２７Ｄ)２８２～２９０、(図２７Ｅ)２９９～３１７(ＭＴＢＲタウ２９９)、(図２７Ｆ)３５４～３６９(ＭＴＢＲタウ３５４)、(図２７Ｇ)３８６～３９５および(図２７Ｈ)３９６～４０６濃度(残基ナンバリングはタウ４４１に基づく)。アミロイド陰性ＣＤＲ＝０(対照、ｎ＝３０)、アミロイド陽性ＣＤＲ＝０(発症前ＡＤ、ｎ＝１８)、アミロイド陽性ＣＤＲ＝０.５(極軽度ＡＤ、ｎ＝２８)、アミロイド陽性ＣＤＲ＞１(軽度～中程度ＡＤ、ｎ＝１２)およびアミロイド陰性ＣＤＲ＞０.５(非ＡＤ臨床的機能障害、ｎ＝１２)。赤色または青色文字のｐ値は、それぞれ有意な増加または減少を示す。データは、個々の結果(プロット)および平均(バー)として示す。統計試験における有意性：＊＊＊＊ｐ＜０.００１、＊＊＊ｐ＜０.００１、＊＊ｐ＜０.０１、＊ｐ＜０.０５。ＮＳ＝非有意。
図２８Ａ、図２８Ｂ、図２８Ｃ、図２８Ｄ、図２８Ｅ、図２８Ｆ、図２８Ｇ、図２８Ｈ、図２８Ｉおよび図２８Ｊは、PostIP-CX方法によるサンプル処理、続くＭＳ分析後の、ヒトＣＳＦにおけるＮ末端タウおよび中間ドメインタウのトリプシン消化ペプチドの濃度を示すグラフである。Ｎ末端および中間ドメインＣＳＦタウ種は、精製方法に関わらず、認知症段階と相関しない(図２６も参照)。横断的コホート内の群からのＣＳＦにおけるタウ種、残基(図２８Ａ)６～２３、(図２８Ｂ)２５～４４、(図２８Ｃ)４５～６７、(図２８Ｄ)６８～８７、(図２８Ｅ)８８～１２６、(図２８Ｆ)１５１～１５５、(図２８Ｇ)１８１～１９０、(図２８Ｈ)１９５～２０９、(図２８Ｉ)２１２～２２１および(図２８Ｊ)２２６～２３０濃度。アミロイド陰性ＣＤＲ＝０(対照、ｎ＝２９)、アミロイド陽性ＣＤＲ＝０(発症前ＡＤ、ｎ＝１８)、アミロイド陽性ＣＤＲ＝０.５(極軽度ＡＤ、ｎ＝２７)、アミロイド陽性ＣＤＲ＞１(軽度～中程度ＡＤ、ｎ＝１２)およびアミロイド陰性ＣＤＲ＞０.５(非ＡＤ臨床的機能障害、ｎ＝１２)。これらタウ種を、Ｔａｕ１／ＦＩＪ８.５免疫沈殿方法、続いて免疫沈殿後ＣＳＦの化学抽出(PostIP-CX)を使用して単離した。免疫沈殿方法および免疫沈殿後ＣＳＦの化学抽出方法からの濃度の合計を、Ｎ末端～中間ドメインタウ種について示す(総濃度として)。赤色文字のｐ値は、統計的有意を示す。データは、個々の結果(プロット)および平均(バー)として示す。統計試験における有意性：＊＊＊＊ｐ＜０.００１、＊＊＊ｐ＜０.００１、＊＊ｐ＜０.０１、＊ｐ＜０.０５。ＮＳ＝非有意。
図２８Ｋは、残基２４３～２５４を含むタウ種の総濃度を示すグラフである(ＩＰ方法およびPostIP-CX方法からの総和濃度)。
図２９は、ＣＳＦにおいて中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ３５４が中間ドメイン非依存的タウ３６８と相関することを示す、グラフである。ＣＳＦを、実施例３に一般的に記載するとおり、PostIP-CX方法により処理した。中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ３５４(残基３５４～３６９)およびその切断形態、タウ３６８(残基３５４～３６８)は、密接な相関を示す(スピアマンｒ＝０.８３８２)。結果を横断的コホートサンプルから得た(全臨床病期を含むｎ＝１００)。
図３０Ａ、図３０Ｂおよび図３０Ｃは、ＣＳＦ中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ２４３が臨床的認知症等級 － ボックス総和(CDR-SB)と高度に依存し、一方中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ２９９および中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ３５４はしないことを示す、グラフである。ＣＳＦにおける(図３０Ａ)中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ２４３、(図３０Ｂ)中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ２９９および(図３０Ｃ)中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ３５４濃度とのCDR-SB相関。アミロイド陽性群からのＣＳＦにおける中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ２４３は、CDR-SBとの高度の相関を示した(ｒ＝０.５５６２、ｐ＜０.０００１)。結果を横断的コホートサンプルから得た(アミロイド陰性ｎ＝４２およびアミロイド陽性ｎ＝５８)。
図３１Ａ、図３１Ｂおよび図３１Ｃは、ＣＳＦ中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ２４３が、中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ２９９および中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ３５４よりもミニメンタルステート試験(MMSE)と高度に相関することを示す、グラフである。ＣＳＦにおける(図３１Ａ)中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ２４３、(図３１Ｂ)中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ２９９および(図３１Ｃ)中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ３５４濃度とのMMSE相関。アミロイド陽性群からのＣＳＦにおける中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ２４３は、MMSEと高度の相関を示した(ｒ＝０.５４３３、ｐ＜０.０００１)。結果を横断的コホートサンプルから得た(アミロイド陰性ｎ＝４２およびアミロイド陽性ｎ＝５８)。
図３２Ａ、図３２Ｂおよび図３２Ｃは、アルツハイマー病臨床病期進行に伴う、ＣＳＦ中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ２４３、中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ２９９、中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ３５４の長期的増加を示す、グラフである。アミロイド陰性(－)または陽性(＋)患者におけるＣＳＦの中間ドメイン非依存的(図３２Ａ)ＭＴＢＲタウ２４３、(図３２Ｂ)ＭＴＢＲタウ２９９および(図３２Ｃ)ＭＴＢＲタウ３５４タウ濃度の長期的変化が示される。黒色丸：ＣＤＲ＝０、青色三角：ＣＤＲ＝０.５、赤色四角：ＣＤＲ＝１、紫色逆三角：ＣＤＲ＝２。ＣＤＲ軌道が安定した(または減少している)参加者を点線で示す。１回目と２回目の来院の間にＣＤＲが増加した参加者を実線で示す。アミロイド陽性群における赤色太線は、アルツハイマー病発症後認知変化が最大であった(ＣＤＲ＝１～２)特定の参加者(参加者Ａ)の長期的軌道を示し、CSF ＭＴＢＲタウ２４３が軽度ＡＤ(ＣＤＲ＝１)から中程度ＡＤ(ＣＤＲ＝２)でも増加することが示唆される。統計的有意性を、１回目および２回目の来院について対応ありｔ検定により評価した(アミロイド陰性ｎ＝１４およびアミロイド陽性ｎ＝１４)。＊＊ｐ＜０.０１。ＮＳ＝非有意。
図３３は、本発明の方法を示す模式図である。
図３４Ａ、図３４Ｂおよび図３４Ｃは、PostIP-CX方法(上部)対PostIP-CX方法(下部)で処理したＣＳＦサンプルにおいて測定した、トリプシン消化ペプチドLQTA(図３４Ａ)、HVPG(図３４Ｂ)およびIGSL(図３４Ｃ)の量を示す、グラフである。
図３５Ａは、PostIP-IP方法(ｙ軸)対PostIP-CX方法(ｘ軸)で処理したサンプルで測定したトリプシン消化ペプチドLQTA(左)、IGST(中央)およびVQII(右)の量を示すグラフである。グラフ上部の画は、タウ４４１における各トリプシン消化ペプチドの相対的位置を示す。両軸とも絶対的濃度を示す(ng／mL)。
図３５Ｂは、PostIP-IP方法(ｙ軸)対PostIP-CX方法(ｘ軸)で処理したサンプルで測定したトリプシン消化ペプチドLDLS(左)、HVPG(中央)およびIGSL(右)の量を示す、グラフである。グラフ上部の画は、タウ４４１における各トリプシン消化ペプチドの相対的位置を示す。両軸とも絶対的濃度を示す(ng／mL)。
図３６Ａは、PostIP-IP方法(ｙ軸)対PostIP-CX方法(ｘ軸)で処理したサンプルで測定したトリプシン消化ペプチドLQTA(左)、IGST(中央)およびVQII(右)の量を示す、グラフである。グラフ上部の画は、タウ４４１における各トリプシン消化ペプチドの相対的位置を示す。両軸とも絶対的濃度を示す(ng／mL)。対照対象から得たサンプルは青色丸であり；認知機能障害のないアミロイド陽性対象(ＣＤＲ＜０.５)から得たサンプルは赤色四角であり；そして認知機能障害を有するアミロイド陽性対象(ＣＤＲ＞０.５)から得たサンプルは、黒色三角である。
図３６Ｂは、PostIP-IP方法(ｙ軸)対PostIP-CX方法(ｘ軸)で処理したサンプルで測定したトリプシン消化ペプチドLDLS(左)、HVPG(中央)およびIGSL(右)の量を示す、グラフである。グラフ上部の画は、タウ４４１における各トリプシン消化ペプチドの相対的位置を示す。両軸とも絶対的濃度を示す(ng／mL)。対照対象から得たサンプルは青色丸であり；認知機能障害のないアミロイド陽性対象(ＣＤＲ＜０.５)から得たサンプルは赤色四角であり；そして認知機能障害を有するアミロイド陽性対象(ＣＤＲ＞０.５)から得たサンプルは、黒色三角である。
図３７Ａは、種々の完全長タウアイソフォームの図である。数種のタウのトリプシン消化ペプチドの相対的位置を示す(例えば、LQTA、IGST、VQII、LDLS、HVPG、IGSL、VQIV)。各「Ｙ」は、Ｎ末端(左)および中間ドメイン(中央)およびＭＴＢＲ(右)領域に特異的に結合する抗体を表す。タウ４４１のアミノ酸２２４であるタウの主切断部位を、点線として示す。
図３７Ｂは、実施例１に記載のＩＰ方法によるサンプル処理後のLC-MSにより決定した、対照対象(左、青色丸)および非ＡＤタウオパチーを有する対象(右、緑色丸)から得たサンプルにおける、トリプシン消化ペプチドVQIVおよびLDLSの量を、比として表わすグラフである。ｎｓ 非有意；テューキーの多重比較検定。
図３７Ｃは、実施例４に記載するPostIP-IP方法によるサンプル処理後のLC-MSにより決定した、対照対象(左、青色丸)および非ＡＤタウオパチーを有する対象(右、緑色丸)から得たサンプルにおける、トリプシン消化ペプチドVQIVおよびLDLSの量を、比として表わすグラフである。
図３８は、実施例４に記載するPostIP-IP方法によるサンプル処理後のLC-MSにより決定した、対照対象(青色丸)および非ＡＤタウオパチーを有する対象(緑色三角)から得たサンプルにおける、トリプシン消化ペプチドVQIV(ｘ軸)およびLDLS(ｙ軸)の量を示す、グラフである。＊＊＊＊ ｐ＜０.０００１；テューキーの多重比較検定。
図３９は、実施例４に記載するPostIP-IP方法によるサンプル処理後のLC-MSにより決定した、対照対象(左、青色丸)、ＡＤを有する対象(中央、赤色丸)および非ＡＤタウオパチーを有する対象(右、緑色丸)から得たサンプルにおける、トリプシン消化ペプチドVQIVおよびLDLSの量を、比として表わすグラフである。ｎｓ 非有意；＊＊＊＊ ｐ＜０.０００１；テューキーの多重比較検定。
図４０Ａ、図４０Ｂ、図４０Ｃ、図４０Ｄ、図４０Ｅおよび図４０Ｆは、実施例４に記載するPostIP-IP方法によるサンプル処理後のLC-MSにより決定した、対照対象(青色丸)、ＡＤを有する対象(赤色四角)および非ＡＤタウオパチーを有する対象(緑色三角)から得たサンプルにおける、タウのトリプシン消化ペプチドの比較を示す、グラフである。タウのトリプシン消化ペプチドは、図４０ＡではIGST(ｘ軸)およびVQII(ｙ軸)、図４０ＢではLDLS(ｘ軸)およびVQII(ｙ軸)、図４０ＣではIGSL(ｘ軸)およびHVPG(ｙ軸)、図４０ＥではIGST(ｘ軸)およびHPVG(ｙ軸)、図４０ＥではVQII(ｘ軸)およびHPVG(ｙ軸)ならびに図４０ＦではIGST(ｘ軸)およびHPVG(ｙ軸)である。両軸とも絶対的濃度を示す(ng／mL)。
図４１は、実施例４に記載するPostIP-IP方法によるサンプル処理後のLC-MSにより決定した、非ＡＤタウオパチーを有する対象から得たサンプルにおける、タウのトリプシン消化ペプチドIGST対HVPG(上部左)、VQII対HVPG(上部右)およびLDLS対HVPG(下部)の量の比較を示すグラフである。右側のキー凡例は、各対象の非ＡＤタウオパチー診断を示す。両軸とも絶対的濃度を示す(ng／mL)。
図４２Ａ、図４２Ｂおよび図４２Ｃは、実施例４に記載するPostIP-IP方法によるサンプル処理後のLC-MSにより決定した、対照対象(青色丸)、ＡＤを有する対象(赤色四角)および非ＡＤタウオパチーを有する対象(緑色三角)から得たサンプルにおける、タウのトリプシン消化ペプチドIGST対IGSL(図４２Ａ)、VQII対IGSL(図４２Ｂ)およびLDLS対IGSL(図４２Ｃ)の量の比較を示す、グラフである。両軸とも絶対的濃度を示す(ng／mL)。
図４３Ａは、タウのＭＴＢＲ領域の図である。トリプシン消化ペプチドIGST、VQII、LDLS、HVPGおよびIGSLの相対的位置を、抗体７７Ｇ７が特異的に結合するエピトープの相対的位置として示す。
図４３Ｂ、図４３Ｃ、図４３Ｄおよび図４３Ｅは、実施例４に記載するPostIP-IP方法によるサンプル処理後のLC-MSにより決定した、非ＡＤ対象(左バー)、ＡＤを有する対象(右バー)から得たサンプルにおける、タウのトリプシン消化ペプチドIGSL／IGST(図４３Ｂ)、IGSL／VQII(図４３Ｃ)、IGSL／LDLS(図４３Ｄ)およびIGSL／HVPG(図４３Ｅ)の比を示す、グラフである。非ＡＤ対象について、青色はＰＳＰを有する対象を示し、緑色はＦＴＤを有する対象を示し、赤色はＣＢＤを有する対象を示し、紫色は連続的ＰＳＰ－ＣＢＤを有する対象を示す。統計的有意は、対応のないｔ検定とウェルチ補正により決定した。
図４４Ａ、図４４Ｂ、図４４Ｃ、図４４Ｄおよび図４４Ｅは、実施例４に記載するPostIP-IP方法によるサンプル処理後のLC-MSにより決定して、非ＡＤ対象(青色)およびＡＤを有する対象(赤色)から得たサンプルにおける、タウのトリプシン消化ペプチドIGSL対IGST(図４４Ａ)、IGSL対VQII(図４４Ｂ)、IGSL対LDLS(図４４Ｃ)、VQII対IGST(図４４Ｄ)、VQII対LDLS(図４４Ｅ)、IGSL対HVPG(図４３Ｅ)の量の比較を示す、グラフである。図４４Ａ、図４４Ｂおよび図４４Ｃにおいて、非ＡＤ対象は散布図を示し、一方、図４４Ｄ、図４４Ｅおよび図４４Ｆにおいて、ＡＤおよび非ＡＤは同一の相関を示した。
図４５は、ＡＤおよび非ＡＤタウオパチーを有する対象からのＣＳＦにおいて測定した種々のタウのトリプシン消化ペプチドの相関を示す。ボックスで協調したデータは、ＡＤおよび非ＡＤタウオパチーを識別する分岐点を示唆する。
図４６は、ＣＳＦタウがどのように非ＡＤタウオパチーを機別するかの仮説を示す図である。記載するとおり、ＣＳＦにおいて、非ＡＤタウオパチーは、脳タウ沈着の兆候として、ＡＤより含まれる(１)Ｒ１－Ｒ２が少ないおよび(２)Ｒ３－Ｒ４が多い。
図４７は、脳不溶性タウの種々のトリプシン消化ペプチドの量を示すグラフである。
図４８Ａ、図４８Ｂ、図４８Ｃおよび図４８Ｄは、実施例４に記載するPostIP-IP方法によるサンプル処理後のLC-MSにより決定した、対照対象(左バー)、ＡＤを有する対象(中央バー)および非ＡＤ対象(右バー)から得たサンプルにおけるタウのトリプシン消化ペプチドIGSL／IGST(図４８Ａ)、IGSL／VQII(図４８Ｂ)、IGSL／LDLS(図４８Ｃ)およびIGSL／HVPG(図４８Ｄ)の比を示すグラフである。非ＡＤ対象について、黒色三角は、遺伝的に確認されたP301L FTLD(４Ｒ－タウオパチー)を有する対象を示し、黒色四角は、遺伝的に確認されたR406W FTLD(３Ｒ／４Ｒ ｍｉｘ)を有する対象を示す。
図４９Ａ、図４９Ｂ、図４９Ｃ、図４９Ｄ、図４９Ｅおよび図４９Ｆは、実施例４に記載するPostIP-IP方法によるサンプル処理後のLC-MSにより決定した、対照対象(青色)、ＡＤを有する対象(赤色)および非ＡＤ対象(緑色)からのＣＳＦサンプルにおける、タウのトリプシン消化ペプチドIGSL対IGST(図４９Ａ)、IGSL対VQII(図４９Ｂ)、IGSL対LDLS(図４９Ｃ)、VQII対IGST(図４９Ｄ)、VQII対LDLS(図４９Ｅ)、IGSL対HVPG(図４３Ｆ)の量の比較を示す、グラフである。図４９Ａ、図４９Ｂおよび図４９Ｃにおいて、非ＡＤ対象は散布図を示し、一方、図４９Ｄ、図４９Ｅおよび図４９Ｆにおいて、対照、ＡＤおよび非ＡＤは同一の相関を示した。
詳細な記載
ＭＴＢＲタウは、血液およびＣＳＦにおいて複数のペプチドとして存在する。これら生物学的サンプル中のＭＴＢＲタウの検出および定量は、これらのポリペプチドがごく少量であるため、妨げられている。ここに開示する方法は、生物学的サンプルを、ＭＴＢＲタウおよび他のタウ種の定量に適するサンプルに変換する処理工程の特有の組み合わせを用いる。例えば、本発明のある方法において、処理工程はあるタンパク質を枯渇させ、同時に複数のタウタンパク質を富化する。本発明の他の方法において、処理工程はあるタンパク質を枯渇させ、同時に複数のＭＴＢＲタウタンパク質を富化する。ここに開示するある方法は、特に中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ種の定量に適する。タウオパチーの臨床徴候および症状評価、タウオパチー診断およびタウオパチー処置指示のための、中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ種の使用も記載される。本発明のこれらおよび他の態様およびイテレーションは、下により徹底的に記載する。
Ｉ. 定義
本発明がより容易に理解され得るように、まず一部用語を定義する。異る定義がされていない限り、ここで使用する全ての技術的および科学的用語は、本発明の実施態様が属する分野の当業者に共通して理解されるのと同じ意味を有する。ここに記載するものに類似する、改変されたまたは等価な多くの方法および材料を、過度の実験なく本発明の実施態様の実施に使用でき、好ましい材料および方法がここに記載される。本発明の実施態様の記載および請求に際し、次の用語を、以下のように定義し、使用する。
ここで使用する用語「約」は、質量、体積、時間、距離および量を含むが、これらに限定されないあらゆる数量的変動に関して、例えば、一般的測定技術および装置で生じ得る、数量の変動を含める表現である。さらに、現実に使用されているある固体および液体の操作方法を仮定するとき、一定の不注意による誤りならびに組成物の製造または方法の実施に使用される成分の製造、供給源または純度の差よる変動の可能性がある。用語「約」はまた、最大±５％であり得て、±４％、３％、２％、１％などでもあり得る、これらの変動を含む。用語「約」による修飾の有無にかかわらず、特許請求の範囲は、数量の均等値を含む。
ここで使用する抗体は、当分野で理解される完全、すなわち、２個の重鎖および２個の軽鎖からなる抗体をいい、また、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ(ａｂ’)２、単一ドメイン抗体、Ｆｖおよび一本鎖Ｆｖなどの抗体フラグメントを含むが、これらに限定されない、抗原結合領域を有するあらゆる抗体様分子もいう。用語抗体はまた、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体もいう。種々の抗体ベースの構築物およびフラグメントを製造および使用するための技術は、当分野で周知である。抗体の製造および特徴づけの手段も、当分野で周知である(例えばAntibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988参照；引用によりその全体として本明細書に包含させる)。
ここで使用する用語「アプタマー」は、生化学的活性、分子認識または結合属性の観点で、有用な生物学的活性を有するポリヌクレオチド、一般にＲＮＡまたはＤＮＡをいう。通常、アプタマーは、特異的エピトープ(領域)で標的分子に結合するなどの分子活性を有する。ポリペプチドへの結合に特異的であるアプタマーを、インビトロ進化方法により合成および／または同定し得ることは一般に認識される。インビトロ進化方法によるものを含むアプタマーの製造および特徴づけの手段は、当分野で周知である。例えば、引用によりその全体として本明細書に包含させるＵＳ７,９３９,３１３参照。
用語「Ａβ」は、アミロイド前駆体タンパク質(ＡＰＰ)と称される大型タンパク質のカルボキシ末端における領域に由来するペプチドをいう。ＡＰＰをコードする遺伝子は染色体２１に位置する。毒性効果を有し得る、多数のＡβ形態がある：Ａβペプチドは、一般に３７～４３アミノ酸配列長であるが、全体的サイズを変化させる短縮化および修飾を有し得る。細胞内または細胞外で、モノマー、オリゴマーおよび凝集形態で可溶性および不溶性区画に見られ得て、他のタンパク質または分子と複合体化し得る。Ａβの有害または毒性効果は、上記形態の何れかまたは全てならびに特には記載していないその他に起因し得る。例えば、２つのこのようなＡβアイソフォームはＡβ４０およびＡβ４２を含み、Ａｐ４２アイソフォームは特に線維素生成性または不溶性であり、疾患状態と関連する。用語「Ａβ」は、一般に個々のＡβ種を区別することなく、複数のＡβ種をいう。特異的Ａβ種は、ペプチドサイズ、例えば、Ａβ４２、Ａβ４０、Ａβ３８などにより同定される。
ここで使用する用語「Ａβ４２／Ａβ４０値」は、対象から得たサンプルにおけるＡβ４２の量と同サンプルにおけるＡβ４０の量を比較した比をいう。
「Ａβアミロイド症」は、脳における臨床的に異常なＡβ沈着として定義される。Ａβアミロイド症を有するとして決定される対象は、ここでは「アミロイド陽性」といい、一方Ａβアミロイド症を有しないとして決定される対象は、ここでは、「アミロイド陰性」という。当分野において認識されたＡβアミロイド症の指標がある。本発明の時点で、Ａβアミロイド症は、アミロイド造影(例えば、ＰｉＢ ＰＥＴ、フロルベタピルまたは当分野で知られる他の造影方法)により直接測定または脳脊髄液(ＣＳＦ)Ａβ４２減少またはＣＳＦ Ａβ４２／４０比減少により間接的に測定される。平均皮質結合能(ＭＣＢＰ)スコア＞０.１８の[１１Ｃ]PIB-PET造影は、Ａβアミロイド症の指標であり、免疫沈降およびマススペクトロメトリー(ＩＰ／ＭＳ)により測定された脳脊髄液(ＣＳＦ)Ａβ４２濃度約１ng／mlと同様である。あるいは、PIB-PETにより決定されたアミロイド陽性予測の精度を最大化するＣＳＦ Ａβ４２／４０のカットオフ比を使用できる。これらのまたは当分野で知られるその他および／または実施例で使用される値を単独で、または組み合わせて、Ａβアミロイド症の臨床的確認に使用し得る。例えば、各々、引用によりその全体として本明細書に包含させる、Klunk W E et al. Ann Neurol 55(3) 2004, Fagan A M et al. Ann Neurol, 2006, 59(3), Patterson et. al, Annals of Neurology, 2015, 78(3): 439-453またはJohnson et al., J. Nuc. Med., 2013, 54(7): 1011-1013参照。Ａβアミロイド症を有する対象は、症状があってもなくてもよく、症候性対象は、Ａβアミロイド症に関連する疾患の臨床的基準を満たしていても、いなくてもよい。Ａβアミロイド症と関連する症状の非限定的例は、認知機能障害、行動変化、異常言語機能、感情調節不全、発作、認知症および神経系構造または機能障害を含み得る。Ａβアミロイド症と関連する疾患は、アルツハイマー病(ＡＤ)、脳アミロイド血管障害(ＣＡＡ)、レヴィー小体認知症および封入体筋炎を含むが、これらに限定されない。Ａβアミロイド症を有する対象は、Ａβアミロイド症と関連する疾患発症のリスクが増加している。
「Ａβアミロイド症の臨床徴候」は、当分野で知られる、Ａβ沈着の測定をいう。Ａβアミロイド症の臨床徴候は、アミロイド造影(例えばＰｉＢ ＰＥＴ、フロルベタピルまたは当分野で知られる他の造影方法)または脳脊髄液(ＣＳＦ)Ａβ４２またはＡβ４２／４０比減少により同定されたＡβ沈着を含み得るが、これに限定されない。例えば、引用により全体として本明細書に包含させる、Klunk WE et al. Ann Neurol 55(3) 2004, and Fagan AM et al. Ann Neurol 59(3) 2006参照。Ａβアミロイド症の臨床徴候は、各々引用によりその全体として本明細書に包含させる米国特許出願１４／３６６,８３１、１４／５２３,１４８および１４／７４７,４５３に記載の、Ａβの代謝の測定、特にＡβ４２代謝単独の測定または他のＡβバリアント(例えばＡβ３７、Ａβ３８、Ａβ３９、Ａβ４０および／または総Ａβ)の代謝と比較した測定も含み得る。さらなる方法は、各々引用によりその全体として本明細書に包含させる、Albert et al. Alzheimer's & Dementia 2007 Vol. 7, pp. 170-179; McKhann et al., Alzheimer's & Dementia 2007 Vol. 7, pp. 263-269;およびSperling et al. Alzheimer's & Dementia 2007 Vol. 7, pp. 280-292に記載される。重要なことに、Ａβアミロイド症の臨床徴候を有する対象は、Ａβ沈着と関連する症状を有しても、有していなくてもよい。それでも、Ａβアミロイド症の臨床徴候を有する対象は、Ａβアミロイド症と関連する疾患発症のリスクが増加している。
「アミロイド造影の候補」は、アミロイド造影が臨床的に正当であり得る個体として医師により同定されている対象をいう。非限定的例として、アミロイド造影の候補は、１以上のＡβアミロイド症の臨床徴候、１以上のＡβプラーク関連症状、１以上のＣＡＡ関連症状またはこれらの組み合わせを有する対象であり得る。医師は、このような対象に対するアミロイド造影を推奨し、臨床ケアを指示し得る。他の非限定的例として、アミロイド造影の候補は、Ａβアミロイド症と関連する疾患についての潜在的治験参加者(対照対象または試験対象)であり得る。
「Ａβプラーク関連症状」または「ＣＡＡ関連症状」は、アミロイド原線維と称される規則的に配列された原線維凝集体からなる、それぞれ、アミロイドプラークまたはＣＡＡの形成により引き起こされるまたはそれと関連するあらゆる症状をいう。Ａβプラーク関連症状の例は、ニューロン変性、認知機能障害、記憶障害、行動変化、感情調節不全、発作、神経系構造または機能障害およびアルツハイマー病またはＣＡＡ発症もしくは悪化のリスク増加を含み得るが、これらに限定されない。ニューロン変性は、ニューロン構造変化(毒性タンパク質、タンパク質凝集体など細胞内蓄積などの分子変化および軸索または樹状突起の形または長さの変化などのマクロレベル変化、髄鞘組成変化、髄鞘喪失などを含む)、ニューロン機能変化、ニューロン機能喪失、ニューロン死またはこれらの何れかの組み合わせを含み得る。認知機能障害は、記憶、注意、集中、言語、抽象的思考、創造性、実行機能、計画および秩序の困難を含み得るが、これらに限定されない。行動変化は、乱暴な動作および言葉、衝動性、抑制減少、無関心、着手減少、人格変化、アルコール、タバコまたは薬物濫用および他の耽溺関連行動を含み得るが、これらに限定されない。感情調節不全は、うつ病、不安、躁病、易怒性および感情失禁を含み得るが、これらに限定されない。発作は、全身性強直性間代性発作、複雑部分発作および非てんかん性、心因性発作を含み得るが、これらに限定されない。神経系構造または機能障害は、水頭症、パーキンソン病、睡眠障害、精神病、平衡および協調の機能障害を含み得るが、これらに限定されない。これは、単不全麻痺、片側不全麻痺、四肢不全麻痺、運動失調、バリズムおよび振戦などの運動機能障害を含み得る。これはまた嗅覚、触知、味覚、視覚および聴覚感覚を含む、感覚消失または機能不全も含み得る。さらに、これは、腸および膀胱機能不全、性機能不全、血圧および体温調節不全などの自律神経系機能障害を含み得る。最後に、これは、成長ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン、ゴナドトロピン放出ホルモン、プロラクチンおよび多数の他のホルモンおよびモジュレーターの欠如および調節不全などの視床下部および下垂体の機能不全に起因するホルモン機能障害を含み得る。
ここで使用する用語「対象」は、哺乳動物、好ましくはヒトをいう。哺乳動物は、ヒト、霊長類、家畜、齧歯類およびペットを含むが、これらに限定されない。対象は、医療または処置を待っているかもしれない、医療または処置下にあるかもしれないまたは医療または処置を受けているかもしれない。
ここで使用する用語「対照集団」、「正常集団」または「健常」対象からのサンプルは、定性的または定量的試験結果に基づき、タウオパチーまたはＡβアミロイド症または臨床的Ａβアミロイド症と関連する疾患(アルツハイマー病を含むが、これに限定されない)を有しないことが臨床的に決定された対象または対象群をいう。
ここで使用する用語「血液サンプル」は、血液、好ましくは末梢(または循環)血液に由来する生物学的サンプルをいう。血液サンプルは、全血、血漿または血清であってよいが、血漿が一般に好ましい。
ここで使用する用語「アイソフォーム」は、タンパク質をコードするｍＲＮＡの選択的スプライシング、タンパク質の翻訳後修飾、タンパク質のタンパク分解性処理、遺伝的変異および体細胞組み換えに起因する同じタンパク質バリアントの数種の異なる形態の何れかをいう。用語「アイソフォーム」および「バリアント」は相互交換可能に使用される。
用語「タウ」は、遺伝子MAPT(またはそのホモログ)によりコードされる、複数のアイソフォームおよびインビボでＣ末端切断、インビボでＮ末端切断、インビボで翻訳後修飾またはこれらの何れかの組み合わせを受けているその種をいう。ここで使用する用語「タウ」および「タウタンパク質」および「タウ種」は、相互交換可能に使用され得る。ヒト、非ヒト霊長類、齧歯類、魚類、ウシ、カエル、ヤギおよびニワトリを含むが、これらに限定されない多くの動物において、タウは遺伝子MAPTによりコードされる。遺伝子がMAPTとして同定されていない動物について、ホモログを、当分野で周知の方法により同定し得る。
ヒトにおいて、MAPTのエクソン２、３および１０の選択的スプライシングにより産生される、タウの６種のアイソフォームがある。これらのアイソフォームは、３５２～４４１アミノ酸長の範囲である。エクソン２および３は、各々Ｎ末端(Ｎと称する)に２９アミノ酸インサートをコードし、完全長ヒトタウアイソフォームは両インサート(２Ｎ)、１インサート(１Ｎ)を有するかまたはインサートを有しない(０Ｎ)ことがある。全完全長ヒトタウアイソフォームはまた微小管結合ドメインの３反復(Ｒと称する)も有する。Ｃ末端へのエクソン１０の挿入は、エクソン１０によりコードされる４番目の微小管結合ドメインの挿入に至る。故に、完全長ヒトタウアイソフォームは、微小管結合ドメインの４反復(エクソン１０はＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４を含む)または微小管結合ドメインの３反復(エクソン１０はＲ１、Ｒ３およびＲ４を含む)。ヒトタウは、翻訳後修飾されていても、されていなくてもよい。例えば、タウがリン酸化、ユビキチン化、グリコシル化および糖化され得ることは、当分野で知られる。ヒトタウはまたＣ末端、Ｎ末端またはＣ末端およびＮ末端でインビボでタンパク分解処理され得るまたはされ得ない。従って、用語「ヒトタウ」は、２Ｎ３Ｒ、２Ｎ４Ｒ、１Ｎ３Ｒ、１Ｎ４Ｒ、０Ｎ３Ｒおよび０Ｎ４ＲアイソフォームならびにインビボでＣ末端切断、インビボでＮ末端切断、インビボで翻訳後修飾またはこれらの何れかの組み合わせを受けているその種を含む。タウをコードする遺伝子の選択的スプライシングは、他の動物で同様に起こる。
ここで使用する用語「タウ－４４１」は、４４１アミノ酸長である最長ヒトタウアイソフォーム(２Ｎ４Ｒをいう。タウ４４１のアミノ酸配列は、配列番号１として提供される。Ｎ末端(N term)、中間ドメイン、ＭＴＢＲおよびＣ末端(C term)は、このアイソフォームについて図１に示される。これらの領域は、他のタウアイソフォーム(例えば、２Ｎ３Ｒ、１ＮＲ４、１Ｎ３Ｒ、０Ｎ４Ｒおよび０Ｎ３Ｒ)について、予測可能な方法でかわる。従って、アミノ酸位置がタウ４４１に対して特定されるとき、当業者は、他のアイソフォームの対応するアミノ酸位置を決定できる。
ここで使用する用語「Ｎ末端タウ」は、タウのＮ末端の２以上のアミノ酸(例えば、タウ４４１のアミノ酸１～１０３など)を含む、１個のタウタンパク質または複数のタウタンパク質をいう。
ここで使用する用語「中間ドメインタウ」は、タウの中間ドメインの２以上のアミノ酸(例えば、タウ４４１のアミノ酸１０４～２４３など)を含む、１個のタウタンパク質または複数のタウタンパク質をいう。
ここで使用する用語「ＭＴＢＲタウ」は、タウの微小管結合領域(ＭＴＢＲ)の２以上のアミノ酸(例えば、タウ４４１のアミノ酸２４４～３６８など)を含む、１個のタウタンパク質または複数のタウタンパク質をいう。
ここで使用する用語「Ｃ末端タウ」は、タウのＣ末端の２以上のアミノ酸(例えば、タウ４４１のアミノ酸３６９～４４１など)を含む、１個のタウタンパク質または複数のタウタンパク質をいう。
「タウのタンパク分解ペプチド」は、インビトロタンパク分解性切断により産生されたタウタンパク質のペプチドフラグメントをいう。「タウのトリプシン消化ペプチド」は、トリプシンでのインビトロ切断により産生された、タウタンパク質のペプチドフラグメントをいう。タウのトリプシン消化ペプチドは、ここでは、その最初の４アミノ酸により示され得る。例えば、「LQTA」は、トリプシン消化ペプチドLQTAPVPMPDLK(配列番号３)をいう。最初の４アミノ酸により同定される他のトリプシン消化ペプチドの非限定的例は、IGST(配列番号２)、VQII(配列番号４)、LDLS(配列番号５)、HVPG(配列番号６)、IGSL(配列番号７)、VQIV(配列番号９)およびTPPS(配列番号１０)を含む。
脳におけるタウ沈着と関連する疾患は、ここでは、「タウオパチー」と称する。用語「タウ沈着」は、変性神経突起における神経原線維濃縮体、神経絨毛糸およびタウ凝集体を含むが、これらに限定されない病理学的タウ沈着物の全形態を含む。当分野で知られるタウオパチーは、進行性核上性麻痺(ＰＳＰ)、拳闘家痴呆、慢性外傷性脳症、染色体１７に関連する前頭側頭骨性認知症およびパーキンソン病、リティコ・ボディグ病、グアムのパーキンソン認知症複合、神経原線維変化型認知症、神経節膠腫および神経節細胞腫、髄膜血管腫症、亜急性硬化性全脳炎、鉛脳症、結節性硬化症、ハラーホルデン・スパッツ病、リポフスチン沈着症、ピック病、大脳皮質基底核変性症(ＣＢＤ)、嗜銀顆粒病(ＡＧＤ)、前頭側頭葉変性(FTLD)、アルツハイマー病(ＡＤ)および前頭側頭骨性認知症(ＦＴＤ)を含むが、これらに限定されない。
タウオパチーは、病理学的タウ沈着物に見られるタウアイソフォームの優性により分類される。主に３個のＭＴＢＲを有するタウからなるタウ沈着物のタウオパチーは、「３Ｒ－タウオパチー」と称される。ピック病は、３Ｒ－タウオパチーの非限定的例である。明確にするために、一部３Ｒ－タウオパチーの病理学的タウ沈着物は、３Ｒアイソフォーム優性で３Ｒおよび４Ｒタウアイソフォームの混合であり得る。アルツハイマー病を有する対象の脳における細胞内神経原線維富化体(すなわちタウ沈着物)は、一般に３Ｒおよび４Ｒアイソフォーム両者をほぼ等量で含むと考えられる。主に４個のＭＴＢＲを有するタウからなるタウ沈着物のタウオパチーは、「４Ｒ－タウオパチー」と称される。ＰＳＰ、ＣＢＤおよびＡＧＤは４Ｒ－タウオパチーの非限定的例であり、FTLDの一部形態もそうである。顕著なことに、一部Ｖ３３４ＭおよびＲ４０６Ｗ変異キャリアなどの遺伝的に確認されたFTLD症例を有する一部対象の脳における病理学的タウ沈着物は、３Ｒと４Ｒアイソフォームの混合を示す。
タウオパチーの臨床徴候は、神経原線維濃縮体を含むが、これに限定されない、脳におけるタウの凝集体であり得る。脳におけるタウ凝集体を検出および定量する方法は、当分野で知られる(例えば、[18F]THK5317、[18F]THK5351、[18F]AV1451、[11C]PBB3、[18F]MK-6240、[18F]RO-948、[18F]PI-2620、[18F]GTP1、[18F]PM-PBB3および[18F]JNJ64349311、[18F]JNJ-067などのタウ特異的リガンドを使用するTau-PETなど)。
ここで使用する用語「処置」または「処置する」は、それを必要とする対象への、訓練され、免許を受けた専門家による医療の提供をいう。医療は、診断試験、治療処置および／または予防的または防止的手段であり得る。治療および予防処置の目的は、望ましくない生理学的変化または疾患／障害の予防または減速(低減)である。治療または予防処置の有益なまたは所望の臨床的結果は、検出可能であっても、検出可能でなくても、症状軽減、疾患の程度低減、疾患状態安定化(すなわち、悪化しない)、疾患進行緩徐化または減速、疾患状態改善または緩和および寛解(部分的であれ合計であれ)を含むが、これらに限定されない。「処置」は、処置を受けないときの余命と比較した生存延長も意味し得る。処置を必要とするものは、既に疾患、状態または障害を有するものならびに疾患、状態または障害を有する素因にあるものまたは疾患、状態または障害を予防すべきものを含む。従って、処置を必要とする対象は、疾患の何らかの症状または臨床徴候を有していても、有していなくてもよい。
用語「タウ治療」は、集合的に、タウオパチーを発症するリスクのある対象または臨床的にタウオパチーを有すると診断された対象について意図される、または使用される、あらゆる造影剤、治療処置および／または予防的または防止的手段をいう。造影剤の非限定的例は、機能的造影剤(例えばフルオロデオキシグルコースなど)および分子造影剤(例えば、ピッツバーグ化合物Ｂ、フロルベタベン、フロルベタピル、フルテメタモル、放射標識タウ特異的リガンド、放射性核種標識抗体など)を含む。治療剤の非限定的例は、コリンエステラーゼ阻害剤、Ｎ－メチルＤ－アスパルテート(ＮＭＤＡ)アンタゴニスト、抗うつ剤(例えば、選択的セロトニン再取り込み阻害剤、非定型抗うつ剤、アミノケトン、選択的セロトニンおよびノルエピネフリン再取り込み阻害剤、三環式抗うつ剤など)、ガンマ－セクレターゼ阻害剤、ベータ－セクレターゼ阻害剤、抗Ａβ抗体(その抗原結合フラグメント、バリアントまたは誘導体を含む)、抗タウ抗体(その抗原結合フラグメント、バリアントまたは誘導体を含む)、幹細胞、栄養補助食品(例えばリチウム水、リポ酸を有するオメガ－３脂肪酸、長鎖トリグリセリド、ゲニステイン、レスベラトロール、クルクミンおよびグレープシード抽出物など)、セロトニン受容体６アンタゴニスト、ｐ３８アルファＭＡＰＫ阻害剤、組み換え顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、受動的免疫療法、活性ワクチン(例えばＣＡＤ１０６、ＡＦ２０５１３など)、タウタンパク質凝集阻害剤(例えばＴＲｘ０２３７、塩化メチルチオニニウムなど)、血糖管理を改善するための治療(例えば、インスリン、エキセナチド、リラグルチド、ピオグリタゾンなど)、抗炎症剤、ホスホジエステラーゼ９Ａ阻害剤、シグマ－１受容体アゴニスト、キナーゼ阻害剤、ホスファターゼアクティベーター、ホスファターゼ阻害剤、アンギオテンシン受容体ブロッカー、ＣＢ１および／またはＣＢ２エンドカンナビノイド受容体部分アゴニスト、ｂ－２アドレナリン受容体アゴニスト、ニコチンアセチルコリン受容体アゴニスト、５－ＨＴ２Ａ逆アゴニスト、アルファ－２ｃアドレナリン受容体アンタゴニスト、５－ＨＴ１Ａおよび１Ｄ受容体アゴニスト、グルタミニル－ペプチドシクロトランスフェラーゼ阻害剤、ＡＰＰ生成選択的阻害剤、モノアミンオキシダーゼＢ阻害剤、グルタミン酸受容体アンタゴニスト、ＡＭＰＡ受容体アゴニスト、神経増殖因子刺激因子、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ阻害剤、神経栄養剤、ムスカリンＭ１受容体アゴニスト、ＧＡＢＡ受容体モジュレーター、ＰＰＡＲ－ガンマアゴニスト、微小管タンパク質モジュレーター、カルシウムチャネルブロッカー、抗高血圧剤、スタチンおよびこれらの何れかの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
II. タウ測定方法
本発明は、マススペクトロメトリーによる生物学的サンプルにおけるタウ測定方法を提供する。一般的に言うと、生物学的サンプルにおける本発明のタウ測定方法は、生物学的サンプルを準備し、１以上のタンパク質を枯渇させ、次いでタウを精製することにより生物学的サンプルを処理し、プロテアーゼで精製タウを開裂し、次いで所望により得られた切断生成物を固相抽出により脱塩して、タウのタンパク分解ペプチドを含むサンプルを得て、タウのタンパク分解ペプチドを含むサンプルで液体クロマトグラフィー－マススペクトロメトリーを実施して、タウのタンパク分解ペプチドの少なくとも１種を検出し、濃度(相対的または絶対的)を測定することを含む。故に、実際には、開示する方法は、生物学的サンプルに存在するタウを検出し、かつ量を測定するためにタウのタンパク分解ペプチドの少なくとも１種を使用する。
一例において、本発明の方法は、(ａ)血液サンプルまたはＣＳＦサンプルから選択される生物学的サンプルを準備し；(ｂ)タンパク質沈殿により生物学的サンプルからタンパク質を除去し、沈降タンパク質を分離して、上清を得て；(ｃ)固相抽出によりタウを上清から精製し；(ｄ)プロテアーゼで精製タウを開裂し、次いで所望により得られた切断生成物を固相抽出により脱塩して、タウのタンパク分解ペプチドを含むサンプルを得て；そして(ｅ)タウのタンパク分解ペプチドを含むサンプルで液体クロマトグラフィー－マススペクトロメトリーを実施して、タウのタンパク分解ペプチドの少なくとも１種を検出しかつ濃度を測定することを含む。
他の例において、本発明の方法は、(ａ)血液サンプルまたはＣＳＦサンプルである生物学的サンプルにおいて、Ｎ末端タウ、中間ドメインタウまたはＮ末端タウおよび中間ドメインタウを親和性枯渇により減少させ；(ｂ)(ｉ)タンパク質沈殿および沈殿タンパク質の分離により生物学的サンプルからさらなるタンパク質を除去して上清を得て、次いで固相抽出によりタウを上清から精製するまたは(ii)ＭＴＢＲタウを親和性精製し、それにより(ｉ)または(ii)富化タウを産生することを含む方法により、Ｎ末端非依存的タウおよび／または中間ドメイン非依存的タウと称し得る、親和性枯渇後残存するタウを富化し；(ｃ)富化タウをプロテアーゼで開裂し、次いで所望により固相抽出により得られた切断生成物を脱塩して、タウのタンパク分解ペプチドを含むサンプルを得て；そして(ｄ)タウのタンパク分解ペプチドを含むサンプルで液体クロマトグラフィー－マススペクトロメトリー(ＬＣ／ＭＳ)を実施して、タウのタンパク分解ペプチドの少なくとも１種を検出し、かつ濃度を測定することを含む。
他の例において、本開示の方法は、(ａ)血液サンプルまたはＣＳＦサンプルである生物学的サンプルにおいて、Ｎ末端タウ、中間ドメインタウまたはＮ末端タウおよび中間ドメインタウを親和性枯渇により減少させ；(ｂ)タンパク質沈殿および沈降タンパク質の分離により生物学的サンプルからさらなるタンパク質を除去して上清を得て；(ｃ)固相抽出によりタウを上清から精製し；(ｄ)プロテアーゼで精製タウを開裂し、次いで所望により得られた切断生成物を固相抽出により脱塩して、タウのタンパク分解ペプチドを含むサンプルを得て；そして(ｅ)タウのタンパク分解ペプチドを含むサンプルで液体クロマトグラフィー－マススペクトロメトリーを実施して、タウのタンパク分解ペプチドの少なくとも１種を検出し、かつ濃度を測定することを含む。
他の例において、本発明の方法は、(ａ)血液サンプルまたはＣＳＦサンプルである生物学的サンプルにおいて、Ｎ末端タウ、中間ドメインタウまたはＮ末端タウおよび中間ドメインタウを親和性枯渇により減少させ；(ｂ)ＭＴＢＲタウを親和性精製し；(ｃ)精製ＭＴＢＲタウをプロテアーゼで開裂し、次いで所望により得られた切断生成物を固相抽出により脱塩して、ＭＴＢＲタウのタンパク分解ペプチドを含むサンプルを得て；そして(ｄ)ＭＴＢＲタウのタンパク分解ペプチドを含むサンプルで液体クロマトグラフィー－マススペクトロメトリーを実施して、ＭＴＢＲタウのタンパク分解ペプチドの少なくとも１種を検出しかつ濃度を測定することを含む。
他の例において、本発明の方法は、(ａ)血液サンプルまたはＣＳＦサンプルである生物学的サンプルからＭＴＢＲタウを親和性精製し；(ｂ)精製ＭＴＢＲタウをプロテアーゼで開裂し、次いで所望により得られた切断生成物を固相抽出により脱塩して、ＭＴＢＲタウのタンパク分解ペプチドを含むサンプルを得て；そして(ｃ)ＭＴＢＲタウのタンパク分解ペプチドを含むサンプルで液体クロマトグラフィー－マススペクトロメトリーを実施して、ＭＴＢＲタウのタンパク分解ペプチドの少なくとも１種を検出しかつ濃度を測定することを含む。
本発明は、さらに上記方法の何れにおいても、生物学的サンプルにおける１以上のタンパク質の存在／非存在の決定および／または生物学的サンプルにおける１以上のさらなるタンパク質の濃度測定を意図する。ある実施態様において、１以上のタンパク質は、タウ精製前に生物学的サンプルから枯渇させたタンパク質であり得る。例えば、ある実施態様において、Ｎ末端タウおよび／または中間ドメインタウ種を、ここに開示する定量により、タウ種(例えば、ＭＴＢＲタウ、Ｃ末端タウ)と別に同定および／または定量し得る。これとは別にまたはこれに加えて、Ａβ、ＡｐｏＥまたは何れかの興味ある他のタンパク質を、平行して生物学的サンプルの一部の処理により、ここに開示する方法で利用する前に生物学的サンプルから興味あるタンパク質を枯渇させることによりまたはここに開示するサンプル処理工程中に生物学的サンプルから興味あるタンパク質を枯渇させることにより、同定および／または定量し得る。
生物学的サンプル、適当な内部標準および１以上のタンパク質の枯渇、タウ精製、プロテアーゼでの精製タウの開裂およびマススペクトロメトリーの工程を、下にさらに詳述する。
生物学的サンプル
適当な生物学的サンプルは、対象から得た血液サンプルまたは脳脊髄液(ＣＳＦ)サンプルを含む。ある実施態様において、対象はヒトである。ヒト対象は、医療または処置を待っているかもしれない、医療または処置下にあるかもしれないまたは医療または処置を受けているかもしれない。種々の実施態様において、ヒト対象は、健常対象、神経変性疾患を発症するリスクのある対象、神経変性疾患の徴候および／または症状を有する対象または神経変性疾患を有すると診断された対象であり得る。さらなる実施態様において、神経変性疾患はタウオパチーであり得る。具体例として、タウオパチーはアルツハイマー病(ＡＤ)、進行性核上性麻痺(ＰＳＰ)、大脳皮質基底核変性症(ＣＢＤ)または前頭側頭葉変性症(ＦＴＬＤ)であり得る。他の実施態様において、対象は実験動物である。さらなる実施態様において、対象はヒトタウおよび所望により１以上のさらなるヒトタンパク質(例えば、ヒトＡβ、ヒトＡｐｏＥなど)を発現するよう遺伝子操作された実験動物である。
ＣＳＦは、留置ＣＳＦカテーテルを用いるまたは用いない腰部穿刺により得ることができる。対象から同時に集めた複数の血液またはＣＳＦサンプルを貯留し得る。血液は、静脈カテーテルを用いまたは用いない静脈穿刺または指腹採血(またはその同等手技)で集められていてよい。集められたら、血液またはＣＳＦサンプルを、当分野で知られる方法に従い処理し得る(例えば、全細胞および細胞破片を除去するための遠心分離；分析試験前に検体を安定化および保存するために用意された添加剤の使用など)。血液またはＣＳＦサンプルはすぐに使用してよくまたは凍結し、無限に保存してよい。ここに開示する方法で使用する前に、生物学的サンプルを、必要または所望であれば、プロテアーゼ阻害剤、同位体標識内部標準、界面活性剤およびカオトロピック剤の添加および／または他の成分(例えばタンパク質ペプチド、代謝物)の枯渇のために、処理してもよい。
使用するサンプルサイズは、サンプルタイプ、サンプルを得た対象の健康状態および分析すべき検体(タウに加えて)に依存して変わり得る。ＣＳＦサンプル体積は、約０.０１mL～約５mLまたは約０.０５mL～約５mLであり得る。具体例において、サンプルサイズは、約０.０５mL～約１mL ＣＳＦであり得る。血漿サンプル体積は、約０.０１mL～約２０mLであり得る。
(ｂ)同位体標識、内部タウ標準
同位体標識タウを、サンプル処理中の変動の説明および所望により絶対的濃度の計算のための内部標準として使用し得る。一般に、同位体標識、内部タウ標準を、有意ななサンプル処理の前に加え、必要であれば１回以上加えてよい。例えば、図２および図３３に記載する方法参照。
複数の同位体標識内部タウ標準をここに記載する。全て、少なくとも１個のアミノ酸残基に重同位体標識が取り込まれている。１以上の完全長アイソフォームが使用され得る。これとは別にまたはこれに加えて、翻訳後修飾されたタウアイソフォームおよび／またはタウのペプチドフラグメントも、当分野で知られるとおり、使用し得る。一般的に、取り込まれた標識アミノ酸残基は、化学的性質に影響することなく、ペプチドの質量を増加し、同位体標識の存在に起因する質量シフトは、マススペクトロメトリー方法で内部標準(ＩＳ)と内因性タウ検体シグナルの識別が可能となるのに十分でなければならない。ここに示すとおり、適当な重同位体標識は、２Ｈ、１３Ｃおよび１５Ｎを含むが、これらに限定されない。一般に、約１～１０ngの内部標準が十分である。
(ｃ)１以上のタンパク質の枯渇
本発明の方法は、サンプルから１以上のタンパク質を枯渇させる工程を含む。用語「枯渇」は、量的または数的減少を意味する。従って、タンパク質を枯渇させたサンプルは、タンパク質の量が、元のサンプルの量より測定可能に少ない何れかの量のタンパク質を有し得る。
タンパク質は、１以上のタンパク質を特に標的とする方法、例えば親和性枯渇、固相抽出または当分野で知られる他の方法により、サンプルから枯渇され得る。１つのタンパク質または複数タンパク質の標的枯渇は、そのタンパク質の下流分析が所望である状況で、使用し得る(例えば、翻訳後修飾の同定、定量、分析など)。例えば、Ａβペプチドを、適当なエピトープ結合剤とのＡβの親和性枯渇後に、当分野で知られる方法により同定および定量し得る。他の非限定的例として、アポリポタンパク質Ｅ(ＡｐｏＥ)状態を、ＡｐｏＥの親和性枯渇およびＡｐｏＥアイソフォームの同定後、当分野で知られる方法により決定し得る。標的枯渇は、アポリポタンパク質Ｊ、シヌクレイン、可溶性アミロイド前駆体タンパク質、アルファ－２マクログロブリン、Ｓ１００Ｂ、ミエリン塩基性タンパク質、インターロイキン、ＴＮＦ、ＴＲＥＭ－２、ＴＤＰ－４３、ＹＫＬ－４０、ＶＩＬＩＰ－１、ＮＦＬ、プリオンタンパク質、ｐＮＦＨおよびＤＪ－１を含むが、これらに限定されない他のタンパク質のその後の分析のための単離にも使用し得る。あるタウタンパク質の標的枯渇も、他のタウタンパク質の富化および／またはマススペクトロメトリー分析を妨害するタンパク質の除去のために、ここで使用する。例えば、本発明のある実施態様において、Ｎ末端タウタンパク質および／または中間ドメインタウタンパク質を、マススペクトロメトリーによる分析のためのさらなるサンプル処理前にサンプルから枯渇させる。枯渇タウタンパク質の下流分析をやってもやらなくてもよいが、両選択肢は、本発明の方法において考慮される。
ある実施態様において、標的枯渇を親和性枯渇により実施し得る。親和性枯渇は、分子への特異的結合性を利用して、サンプルから興味あるタンパク質を枯渇させる方法をいう。一般に、分子は、ビーズ、樹脂、組織培養プレートなどの固体支持体に結合したリガンド(固定化リガンドと称する)である。固体支持体へのリガンドの固定化は、リガンド－タンパク質相互作用が生じた後にも生じ得る。適当なリガンドは、抗体、アプタマーおよび他のエピトープ結合剤を含む。分子は、ポリマーまたは興味あるタンパク質を選択的に吸収する他の材料でもあり得る。非限定的例として、脂肪オキシエチル化アルコール置換ポリヒドロキシメチレン(例えば、PHM-L LIPOSORB、Sigma Aldrich)を、血清からリポタンパク質(ＡｐｏＥを含む)を選択的に吸収し得る。２以上の親和性枯渇剤を組み合わせて、複数タンパク質を連続的にまたは同時に枯渇させ得る。
ある実施態様において、本発明の方法は、タウ－４４１のアミノ酸１～２４３(両端を含む)内のエピトープ(または０Ｎもしくは１Ｎアイソフォームの同様に規定された領域内)に特異的に結合する、少なくとも１個のエピトープ結合剤を使用して、サンプルから１以上のタンパク質を親和性枯渇させることを含む。種々の実施態様において、１個、２個、３個またはそれ以上のエピトープ結合剤が使用され得る。２以上のエピトープ結合剤を使用するとき、連続的にまたは同時に使用し得る。
ある実施態様において、本発明の方法は、タウのＮ末端(例えば、タウ４４１のアミノ酸１～１０３(両端を含む))内のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤およびタウの中間ドメイン(例えば、タウ４４１のアミノ酸１０４～２４３(両端を含む))内のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤を使用して、サンプルから１以上のタンパク質を親和性枯渇させることを含む。エピトープ結合剤は、連続的にまたは同時に使用し得る。
ある実施態様において、本発明の方法は、タウ４４１(両端を含む)のエピトープアミノ酸１～３５内に特異的に結合するエピトープ結合剤およびタウ４４１のエピトープアミノ酸１０４～２４３内(両端を含む)(または０Ｎもしくは１Ｎアイソフォームの同様に規定された領域内)に特異的に結合するエピトープ結合剤を使用して、サンプルから１以上のタンパク質を親和性枯渇させることを含む。エピトープ結合剤は、連続的にまたは同時に使用し得る。
ある実施態様において、本発明の方法は、タウ４４１のエピトープアミノ酸１～１０３内(両端を含む)(または０Ｎもしくは１Ｎアイソフォームの同様に規定された領域内)に特異的に結合するエピトープ結合剤；タウ４４１のエピトープアミノ酸１０４～２４３内(両端を含む)(または０Ｎもしくは１Ｎアイソフォームの同様に規定された領域内)に特異的に結合するエピトープ結合剤；およびアミロイドベータエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤を使用して、サンプルから１以上のタンパク質を親和性枯渇させることを含む。エピトープ結合剤は、連続的にまたは同時に使用し得る。
ある実施態様において、本発明の方法は、タウ４４１(両端を含む)のエピトープアミノ酸１～３５内に特異的に結合するエピトープ結合剤(または０Ｎもしくは１Ｎアイソフォームの同様に規定された領域内)；タウ４４１のエピトープアミノ酸１０４～２４３内(両端を含む)(または０Ｎもしくは１Ｎアイソフォームの同様に規定された領域内)に特異的に結合するエピトープ結合剤；およびアミロイドベータエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤を使用して、サンプルから１以上のタンパク質を親和性枯渇させることを含む。エピトープ結合剤は、連続的にまたは同時に使用し得る。
ある実施態様において、本発明の方法は、タウ４４１のエピトープアミノ酸１～１０３内(両端を含む)(または０Ｎもしくは１Ｎアイソフォームの同様に規定された領域内)に特異的に結合するエピトープ結合剤；およびアミロイドベータエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤を使用して、サンプルから１以上のタンパク質を親和性枯渇させることを含む。エピトープ結合剤は、連続的にまたは同時に使用し得る。
ある実施態様において、本発明の方法は、タウ４４１(両端を含む)のエピトープアミノ酸１～３５内に特異的に結合するエピトープ結合剤(または０Ｎもしくは１Ｎアイソフォームの同様に規定された領域内)；およびアミロイドベータエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤を使用して、サンプルから１以上のタンパク質を親和性枯渇させることを含む。エピトープ結合剤は、連続的にまたは同時に使用し得る。
ある実施態様において、本発明の方法は、タウ４４１のエピトープアミノ酸１０４～２４３内(両端を含む)(または０Ｎもしくは１Ｎアイソフォームの同様に規定された領域内)に特異的に結合するエピトープ結合剤；およびアミロイドベータエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤を使用して、サンプルから１以上のタンパク質を親和性枯渇させることを含む。エピトープ結合剤は、連続的にまたは同時に使用し得る。
上記実施態様の何れにおいても、エピトープ結合剤は、抗体またはアプタマーを含み得る。ある実施態様において、アミロイドベータに特異的に結合するエピトープ結合剤は、ＨＪ５.１またはＨＪ５.１と同じエピトープに結合するおよび／またはＨＪ５.１を競合的に阻害するエピトープ結合剤である。ある実施態様において、タウ４４１のエピトープアミノ酸１～１０３内(両端を含む)に特異的に結合するエピトープ結合剤は、ＨＪ８.５またはＨＪ８.５と同じエピトープに結合するおよび／またはＨＪ８.５を競合的に阻害するエピトープ結合剤である。ある実施態様において、タウ４４１のエピトープアミノ酸１０４～２２１内(両端を含む)に特異的に結合するエピトープ結合剤は、Ｔａｕ１またはＴａｕ１と同じエピトープに結合するおよび／またはＴａｕ１を競合的に阻害するエピトープ結合剤である。抗体が特異的に結合するエピトープを同定する方法および２抗体間の競合的阻害を評価するアッセイは、当分野で知られる。
あるいは、タンパク質は、より一般的な方法、例えば限外濾過または酸、有機溶媒もしくは塩でのタンパク質沈殿によりサンプルから枯渇され得る。一般的に言うと、これらの方法の使用は、高存在量および高分子量タンパク質を確実に減少し、次いで、これが低分子量および／または少量のタンパク質およびペプチド(例えば、タウ、Ａβなど)を富化する。
ある実施態様において、タンパク質を、沈殿によりサンプルから枯渇させ得る。すなわち、沈殿は、沈殿剤をサンプルに加え、徹底的に混合し、サンプルと沈殿剤をインキュベトとして、タンパク質を沈殿させ、遠心分離または濾過により沈殿タンパク質を分離することを含む。次いで、得られた上清を下流適用に使用し得る。必要な薬剤の量は、当分野で知られる方法により実験的に決定され得る。適当な沈殿剤は、過塩素酸、トリクロロ酢酸、アセトニトリル、メタノールなどを含む。例示的実施態様において、タンパク質を、酸沈殿によりサンプルから枯渇させる。さらなる実施態様において、タンパク質を、を、過塩素酸を使用する酸沈殿によりサンプルから枯渇させる。
非限定的例として、タンパク質を、過塩素酸を使用する酸沈殿によりサンプルから枯渇させ得る。ここで使用する「過塩素酸」は、特に断らない限り７０％過塩素酸をいう。ある実施態様において、過塩素酸を最終濃度約１％ｖ／ｖ～約１５％ｖ／ｖまで加える。他の実施態様において、過塩素酸を最終濃度約１％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖまで加える。他の実施態様において、過塩素酸を最終濃度約１％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖまで加える。他の実施態様において、過塩素酸を最終濃度約３％ｖ／ｖ～約１５％ｖ／ｖまで加える。他の実施態様において、過塩素酸を最終濃度約３％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖまで加える。他の実施態様において、過塩素酸を最終濃度約３％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖまで加える。他の実施態様において、過塩素酸を最終濃度３.５％ｖ／ｖ～約１５％ｖ／ｖ、３.５％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖまたは３.５％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖまで加える。他の実施態様において、過塩素酸を最終濃度約３.５％ｖ／ｖまで加える。過塩素酸添加後、サンプルを良く混合し(例えば、ボルテックスミキサーにより)、一般に約１０分間以上、低温に維持して、沈殿を促進する。例えば、サンプルを、約１０分間～約６０分間、約２０分間～約６０分間または約３０分間～約６０分間維持し得る。他の例において、サンプルを約１５分間～約４５分間または約３０分間～約４５分間維持し得る。他の例において、サンプルを約１５分間～約３０分間または約２０分間～約４０分間維持し得る。他の例において、サンプルを約３０分間維持する。次いで、サンプルを低温で遠心分離して、沈殿タンパク質をペレット化し、可溶性タウを含む上清(すなわち、酸可溶性フラクション)を新しい容器に移す。上記で使用する、「低温」は、１０℃以下の温度をいう。例えば、低温は、約１℃、約２℃、約３℃、約４℃、約５℃、約６℃、約７℃、約８℃、約９℃または約１０℃であり得る。ある実施態様において、狭い温度範囲、例えば、約３℃～約５℃または約４℃が好ましい。ある実施態様において、サンプルを氷に乗せることにより、低温を達成し得る。
上記アプローチの一方または両方からの２以上の方法を組み合わせて、複数のタンパク質を連続的にまたは同時に枯渇させ得る。例えば、１以上のタンパク質を選択的に枯渇(標的枯渇)させ、続いて高存在量／分子量タンパク質を枯渇させ得る。あるいは、高存在量／分子量タンパク質をまず枯渇させ、続いて１以上のタンパク質を標的枯渇させ得る。なおさらに他の選択肢において、高存在量／分子量タンパク質をまず枯渇させ、１以上のタンパク質の第一ラウンドの標的枯渇、次いで第一ラウンドの標的と異なる１以上のタンパク質の第二ラウンドの標的枯渇が続き得る。他のイテレーションは、当業者には容易に明らかである。
(ｄ)タウ精製
ここに開示する方法の他の工程は、タウ、特にＭＴＢＲタウの精製を含む。ある例において、ＭＴＢＲタウは、Ｎ末端非依存的および／または中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウである。タウの精製は、部分精製でも完全精製でもよい。
ある実施態様において、本発明の方法は、固相抽出によるタウの精製を含む。固相抽出によるタウの精製は、タウを含むサンプルと、タウを吸着する吸着剤を含む固相の接触、１以上の洗浄工程および吸着剤からのタウの溶出を含む。適当な吸着剤は、逆相吸着剤を含む。適当な逆相吸着剤は当分野で知られ、アルキル結合シリカ、アリール結合シリカ、スチレン／ジビニルベンゼン材、Ｎ－ビニルピロリドン／ジビニルベンゼン材を含むが、これらに限定されない。例示的実施態様において、逆相材料は、Ｎ－ビニルピロリドンおよびジビニルベンゼンを含むポリマーまたはスチレンおよびジビニルベンゼンを含むポリマーである。例示的実施態様において、吸着剤は、Oasis HLB(Waters)である。タウを含む上清との接触前、吸着剤を、一般に、製造者の指示に従いまたは当分野で知られるとおり、プレコンディショニングする(例えば、水混和性有機溶媒、次いで移動相含有緩衝液で)。さらに、上清を、ある逆相材料が、イオン化検体をその他のものより強く保持するために、所望により酸性化し得る。移動相においておよび溶出のために揮発成分を使用することが、サンプル乾燥が促進されるため、好ましい。例示的実施態様において、洗浄工程は、約０.０５％ｖ／ｖ トリフルオロ酢酸(ＴＦＡ)～約１％ｖ／ｖ ＴＦＡまたはその等価物を含む液体相の使用を含み得る。ある例において、洗浄は、約０.０５％ｖ／ｖ～約０.５％ｖ／ｖ ＴＦＡまたは約０.０５％ｖ／ｖ～約０.１％ｖ／ｖ ＴＦＡを含む液体相を用い得る。ある例において、洗浄は、約０.１％ｖ／ｖ～約１.０％ｖ／ｖ ＴＦＡまたは約０.１％ｖ／ｖ～約０.５％ｖ／ｖ ＴＦＡを含む液体相を用い得る。次いで、結合タウを、約２０％ｖ／ｖ～約５０％ｖ／ｖアセトニトリル(ＡＣＮ)またはその等価物を含む液体相で溶出する。ある例において、タウを、約２０％ｖ／ｖ～約４０％ｖ／ｖ ＡＣＮまたは約２０％ｖ／ｖ～約３０％ｖ／ｖ ＡＣＮを含む液体相で溶出し得る。ある例において、タウを、約３０％ｖ／ｖ～約５０％ｖ／ｖ ＡＣＮまたは約３０％ｖ／ｖ～約４０％ｖ／ｖ ＡＣＮを含む液体相で溶出し得る。溶離液を、当分野で知られる方法で乾燥させ得る(例えば、真空乾燥(例えば、Speed-vac)、凍結乾燥、窒素流下の蒸発など)。
ある実施態様において、本発明の方法は、親和性精製によるＭＴＢＲタウの精製を含む。親和性精製は、ある分子への特異的結合性により興味あるタンパク質を富化する方法である。一般に、分子は、ビーズ、樹脂、組織培養プレートなどの固体支持体に結合するリガンドで(固定化リガンドと称する)ある。固体支持体へのリガンドの固定化は、リガンド－タンパク質相互作用が生じた後にも生じ得る。適当なリガンドは、抗体、アプタマーおよび他のエピトープ結合剤を含む。親和性精製によるＭＴＢＲタウの精製は、タウを含むサンプルと適当な固定化リガンドの接触、１以上の洗浄工程および固定化リガンドからのＭＴＢＲタウの溶出を含む。
ある実施態様において、本発明の方法は、タウ４４１のエピトープアミノ酸２３５～３６８内(両端を含む)またはタウ４４１のアミノ酸２４４～３６８内(両端を含む)(または他の完全長アイソフォームの同様に規定された領域内)に特異的に結合する少なくとも１個のエピトープ結合剤を使用する親和性精製によるＭＴＢＲタウの精製を含む。種々の実施態様において、１個、２個、３個またはそれ以上のエピトープ結合剤が使用され得る。２以上のエピトープ結合剤を使用するとき、連続的にまたは同時に使用し得る。適当なエピトープ結合剤の非限定的例は、Vandermeeren et al., J Alzheimers Dis, 2018, 65:265-281に記載される抗体７７Ｇ７、ＲＤ３、ＲＤ４、ＵＣＢ１０１７およびＰＴ７６ならびにRoberts et al., Acta Neuropathol Commun, 2020, 8: 13に記載される抗体Ｅ２８１４および７Ｇ６ならびにこれら抗体と同じエピトープに特異的に結合する他のエピトープ結合剤を含む。さらなる実施態様において、本発明の方法は、ＭＴＢＲタウのＲ１内のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤、ＭＴＢＲタウのＲ２内のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤、ＭＴＢＲタウのＲ３内のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤、ＭＴＢＲタウのＲ４内のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤、３Ｒタウに特有のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤、４Ｒタウに特有のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤、ＭＴＢＲタウのＲ１およびＲ２に伸びるエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤、ＭＴＢＲタウのＲ２およびＲ３に伸びるエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤、ＭＴＢＲタウのＲ３およびＲ４に伸びるエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤またはこれらの何れかの組み合わせを使用する親和性精製による、ＭＴＢＲタウの精製を含む。具体例において、本発明の方法は、タウ４４１のアミノ酸３１６～３５５(または他の完全長アイソフォームの同じ領域)を含むエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤を使用する親和性精製による、ＭＴＢＲタウの精製を含む。種々の実施態様において、１個、２個、３個またはそれ以上のエピトープ結合剤が使用され得る。２以上のエピトープ結合剤を使用するとき、連続的にまたは同時に使用し得る。
上記実施態様の何れにおいても、エピトープ結合剤は、抗体またはアプタマーを含み得る。ある実施態様において、ＭＴＢＲタウのＲ３およびＲ４内のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤は７７Ｇ７または７７Ｇ７と同じエピトープに結合するおよび／または７７Ｇ７(BioLegend)を競合的に阻害するエピトープ結合剤である。ある実施態様において、３Ｒタウに特有のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤はＲＤ３(de Silva et al., Neuropathology and Applied Neurobiology, 2003, 29: 288-302)またはＲＤ３と同じエピトープに結合するおよび／またはＲＤ３を競合的に阻害するエピトープ結合剤である。ある実施態様において、４Ｒタウに特有のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤はＲＤ４(de Silva et al., Neuropathology and Applied Neurobiology, 2003, 29: 288-302)またはＲＤ４と同じエピトープに結合するおよび／またはＲＤ４を競合的に阻害するエピトープ結合剤である。
(ｅ)プロテアーゼでの精製タウの開裂
ここに開示する方法の他の工程は、プロテアーゼでの精製タウの開裂を含む。プロテアーゼでの精製タウの開裂は、精製タウを含むサンプルとプロテアーゼを、タウの消化に適する条件下で接触させることを含む。親和性精製を使用するとき、消化は、固定化リガンドからのタウ溶出後にまたはタウが結合している間に行ってよい。適当なプロテアーゼは、トリプシン、Ｌｙｓ－Ｎ、Ｌｙｓ－ＣおよびＡｒｇ－Ｎを含むが、これらに限定されない。好ましい実施態様において、プロテアーゼはトリプシンである。得られた切断生成物は、タウのタンパク分解ペプチドを含む組成物である。プロテアーゼがトリプシンであるとき、得られた切断生成物はタウのトリプシン消化ペプチドを含む。タンパク分解性切断後、得られた切断生成物は、一般に固相抽出により脱塩される。
(ｆ)LC-MS
ここに開示する方法の他の工程は、タウのタンパク分解ペプチドの少なくとも１種を検出し、かつ濃度を測定するためのタウを含むサンプルのタンパク分解ペプチドで液体クロマトグラフィー－マススペクトロメトリー(LC-MS)を実施することを含む。故に、実際には、開示する方法は、生物学的サンプルに存在するタウタンパク質の検出および量の測定のための１以上のタウのタンパク分解ペプチドの使用を含む。
トリプシンがプロテアーゼである実施態様において、ＭＴＢＲタウの存在を示すタウのタンパク分解ペプチドは、表Ａに挙げたペプチドを含むが、これらに限定されない。消化のために別の酵素を使用するとき、得られたタンパク分解ペプチドは、わずかに異なるかもしれないが、当業者には容易に決定できる。理論に拘束されることを望まないが、２つの同じタイプの生物学的サンプル間のトリプシン消化ペプチドの量の変動は、これら生物学的サンプルを構成するＭＴＢＲタウ種の差異を反映すると考えられる。ここに開示するとおり、ＭＴＢＲタウの特定のタンパク分解ペプチドの量およびＭＴＢＲタウの特定のタンパク分解ペプチドの比は、処置決定の指針となる臨床上有意義な情報を提供する。故に、ＭＴＢＲタウのトリプシン消化ペプチドの検出および定量を可能とする方法は、多くの神経変性疾患の診断および処置に有用である。
Figure 2022544514000002
タウのタンパク分解ペプチドは、高解像度マススペクトロメーターに適合した液体クロマトグラフィー系で分離できる。適当なLC-MS系は、＜１.０mm ＩＤカラムおよび約１００μl／分未満の流速の使用を含み得る。好ましい実施態様において、ナノフローLC-MS系が使用される(例えば、約５０～１００μm ＩＤカラムおよび流速＜１μL／分、好ましくは約１００～８００nL／分、より好ましくは約２００～６００nL／分)。例示的実施態様において、LC-MS系は、０.０５mM ＩＤカラムおよび流速約４００nL／分の使用を含み得る。
当分野で知られるとおりタンデムマススペクトロメトリーを使用して解像度を改善できまたは単一質量アナライザーを用いるタンデムマススペクトロメトリーの解像度を達成するためのテクノロジーを改善し得る。適当なタイプのマススペクトロメーターは、当分野で知られる。これらは、四重極、飛行時間型、イオントラップおよびOrbitrapならびに種々のタイプの質量アナライザーを一つの構造に合わせたハイブリッドマススペクトロメーター(例えば、各々ThermoFisher ScientificのOrbitrap FusionTM TribridTMマススペクトロメーターまたはOrbitrap FusionTM LumosTMマススペクトロメーター、Orbitrap TribridTM EclipseTMマススペクトロメーター、Q Exactiveマススペクトロメーター)を含むが、これらに限定されない。例示的実施態様において、LC-MS系は、Orbitrap FusionTM TribridTMマススペクトロメーター、Orbitrap FusionTM LumosTMマススペクトロメーター、Orbitrap TribridTM EclipseTMマススペクトロメーターまたは四重極と類似のまたは改善されたイオン集束およびイオン透過率を有するマススペクトロメーターから選択されるマススペクトロメーターを含み得る。適当なマススペクトロメトリープロトコールを、分析前に集めたイオンの数(例えばまたはバイトラップを使用するＡＧＣ設定)および／または注入時間を最適化することにより展開され得る。例示的実施態様において、実施例に概説したマススペクトロメトリープロトコールが使用される。
III. ＭＴＢＲタウ測定の使用
本発明はまた診断、病期分類、ある疾患段階に適する処置の選択およびある処置レジメン修飾(例えば、用量変更、異なる薬物または処置モダリティへの切り替えなど)のためのタウオパチーの病理学的特徴および／または臨床症状のバイオマーカーとしての、血液またはＣＳＦにおけるＭＴＢＲタウ種、特に中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ種の測定の使用を含む。病理学的特性は、タウ病理の態様(例えば、タウ沈着の量、翻訳後修飾の存在／非存在、翻訳後修飾の量など)であり得る。タウ沈着とは別にまたはそれに加えて、病理学的特性は、タウ非依存的であり得る。例えば、タウオパチーがアルツハイマー病であるとき、脳または脳の動脈におけるアミロイドベータ(Ａβ)沈着である。臨床症状は、臨床的に検証された装置(例えば、MMSE、CDR-SBなど)またはタウオパチーと関連する何らかの他の臨床症状により評価して、認知症であり得る。３Ｒ－および４Ｒ－タウオパチーとして当分野で知られる他の病理学的特徴および臨床症状のバイオマーカーとして、血液またはＣＳＦにおけるＭＴＢＲタウ種、特に中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ種の評価もまた意図される。有利に、中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ種を含むが、これに限定されないＭＴＢＲタウ種は、疾患状態と健常状態を識別するだけでなく、種々のタウオパチー間も識別する。
従って、ある態様において、本発明は、対象におけるタウオパチー関連病理を評価するであって、血液サンプルまたはＣＳＦサンプルなどの対象から得た生物学的サンプルにおける１以上のＭＴＢＲタウ種を定量することを含み、ここで、定量したＭＴＲＢタウ種の量が対象の脳におけるタウオパチー関連病理を表すものである、方法を提供する。タウオパチーは、３Ｒ－タウオパチー、混合型３Ｒ／４Ｒ－タウオパチーまたは４Ｒ－タウオパチーであり得る。疾患関連病理は、タウ沈着、タウ翻訳後修飾、脳および／または脳の動脈におけるアミロイドプラークまたは当分野で知られる他の病理学的特性であり得る。対象は、タウオパチーの臨床症状を有していても、有していなくてもよい。好ましい実施態様において、少なくとも１個のＭＴＢＲタウ種定量は中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ種である。さらなる実施態様において、２以上のＭＴＢＲタウ種定量は中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ種である。なおさらなる実施態様において、各ＭＴＢＲタウ種定量は中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ種である。
他の態様において、本発明は、対象におけるタウオパチーを診断する方法であって、血液サンプルまたはＣＳＦサンプルなどの対象から得た生物学的サンプルにおける１以上のＭＴＢＲタウ種を定量し、定量したＭＴＢＲタウ種が約１.５σ以上であるときタウオパチーと診断することを含み、ここで、σは、タウオパチーの臨床徴候または症状を有さず、ＰＥＴ造影および／またはＣＳＦにおけるＡβ４２／４０測定で評価してアミロイド陰性である対照集団で測定した正規分布により規定される標準偏差である、方法を提供する。タウオパチーは、３Ｒ－タウオパチー、混合型３Ｒ／４Ｒ－タウオパチーまたは４Ｒ－タウオパチーであり得る。対象は、疾患の臨床症状を有していても、有していなくてもよい。好ましい実施態様において、少なくとも１個のＭＴＢＲタウ種定量は中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ種である。さらなる実施態様において、２以上のＭＴＢＲタウ種定量は中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ種である。なおさらなる実施態様において、各ＭＴＢＲタウ種定量は中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ種である。
他の態様において、本発明は、対象におけるタウオパチー疾患の安定性を測定する方法であって、対象から得た第一生物学的サンプル、次いで後の時点(例えば、数日、数週、数カ月または数年後)で同じ対象から得た第二生物学的サンプルにおける１以上のＭＴＢＲタウ種を定量し、サンプル間の定量したＭＴＢＲタウ種の差異を計算することを含み、ここで、第二サンプルにおける定量したＭＴＢＲタウ種の統計的に有意な増加は疾患進行を示し、第二サンプルにおける定量したＭＴＢＲタウ種の統計的に有意な減少は疾患改善を示し、そして変化なしは疾患安定を示すものである、方法を提供する。タウオパチーは、３Ｒ－タウオパチー、混合型３Ｒ／４Ｒ－タウオパチーまたは４Ｒ－タウオパチーであり得る。対象は、疾患の臨床症状を有していても、有していなくてもよく、タウ治療を受けていても、いなくてもよい。ある例において、タウ治療は、第一および第二生物学的サンプルの取得の間の期間に対象に１回以上投与され、疾患安定性評価は、タウ治療の有効性または有効性欠如を示す。好ましい実施態様において、少なくとも１個のＭＴＢＲタウ種定量は中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ種である。さらなる実施態様において、２以上のＭＴＢＲタウ種定量は中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ種である。なおさらなる実施態様において、各ＭＴＢＲタウ種定量は中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ種である。
他の態様において、本発明は、タウオパチーを有する対象を処置する方法であって、血液サンプルまたはＣＳＦサンプルなどの対象から得た生物学的サンプルにおける１以上のＭＴＢＲタウ種を定量し；そして疾患関連病理または臨床症状の評価を改善するために対象にタウ治療を提供することを含み、ここで、対象の定量したＭＴＢＲタウ種が平均より少なくとも１標準偏差、好ましくは少なくとも１.３標準偏差、より好ましくは少なくとも１.５標準偏差またはより好ましくは少なくとも２標準偏差上または下である(すなわち、それぞれ１σ、１.３σ、１.５σまたは１.５σ異なり、ここで、σはタウオパチーの臨床徴候または症状を有さずかつＰＥＴ造影および／またはＣＳＦにおけるＡβ４２／４０測定で評価してアミロイド陰性である対照集団で評価した正規分布により規定される標準偏差であるである)、方法を提供する。閾値(例えば平均より少なくとも１標準偏差上または下)の使用に加えて、ある実施態様において平均の上または下の変化の程度を、対象を処置するための基準として使用し得る。タウオパチーは、３Ｒ－タウオパチー、混合型３Ｒ／４Ｒ－タウオパチーまたは４Ｒ－タウオパチーであり得る。疾患関連病理の測定値は、ＰＥＴ造影により測定したタウ沈着、マススペクトロメトリーまたは他の適当な方法により測定したタウ翻訳後修飾、ＰＥＴ造影により測定した脳または脳の動脈におけるアミロイドプラーク、ＣＳＦにおけるＡβ４２／４０により測定したアミロイドプラークまたは当分野で知られる他の病理学的特徴であり得る。臨床症状は、臨床的に検証された装置(例えば、MMSE、CDR-SBなど)により評価した、認知症または３Ｒ－および４Ｒ－タウオパチーについて当分野で知られる他の臨床症状である。好ましい実施態様において、少なくとも１個のＭＴＢＲタウ種定量は中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ種である。さらなる実施態様において、２以上のＭＴＢＲタウ種定量は中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ種である。なおさらなる実施態様において、各ＭＴＢＲタウ種定量は中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ種である。多くのタウ治療は、特異的病態生理学的変化を標的とする。例えば、Ａβターゲティング治療は、一般にＡβ産生減少、Ａβ凝集拮抗または脳Ａβクリアランス増加のために設計される；タウターゲティング治療は、一般にタウリン酸化パターン改変、タウ凝集拮抗(タウの一般的拮抗作用または特異的タウアイソフォームの拮抗作用)またはＮＦＴクリアランス増加のために設計される；多様な治療が、ＣＮＳ炎症または脳インスリン抵抗性減少などのために設計される。しかしながら、全てのタウオパチーが同じ病態生理学的変化を共有するわけではない。従って、これら種々のタウ治療の有効性は、３Ｒ－タウオパチー、混合型３Ｒ／４Ｒ－タウオパチーまたは４Ｒ－タウオパチーを有すると正確に同定された対象に投与することにより、改善され得る。
用語「中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ」は、タウの中間ドメイン領域の全てまたは実質的に全ておよび故にまたＮ末端領域を欠く、複数のＭＴＢＲタウ種をいう。これらの中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ種は、中間ドメインタウを含むタウ種が、生物学的サンプル、好ましくは血液またはＣＳＦサンプルから、部分的にまたは完全に、枯渇された後も残る。適当な生物学的サンプルはセクションII(ａ)に記載され、その開示は、引用により本セクションに包含させる。中間ドメインタウの枯渇は、例えば、タウのＮ末端または中間ドメイン内のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤を使用する親和性枯渇により、これらタウ種の標的枯渇により実施し得る。複数のエピトープ結合剤も使用され得る－ 例えば、タウのＮ末端内のエピトープに特異的に結合する第一エピトープ結合剤およびタウの中間ドメイン内のエピトープに特異的に結合する第二エピトープ結合剤。さらなる詳細はセクションII(ｃ)に見ることができ、その開示は、引用により本セクションに包含させる。一般に、出発物質における標的タンパク質の少なくとも５０％(例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上)が枯渇される。ある実施態様において、出発物質における標的タンパク質の約７０％またはそれ以上、約８０％またはそれ以上または約９０％またはそれ以上が枯渇される。生物学的サンプルからの中間ドメインタウの枯渇後、(１)例えば、沈殿による他のタンパク質除去および／または固相抽出によるタウタンパク質精製による、中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウを含む残存タウ種の富化または(２)例えば、ＭＴＢＲ内のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤を使用する親和性精製による、中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ種の選択的富化の工程を実施し得る。用語「富化」は、量または数の増加を意味する。さらなる詳細はセクションIIに見ることができ、その開示は、引用により本セクションに包含させる。好ましくは、中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ種は、ＣＳＦにおける量の少なくとも１００倍富化される。ある例において、中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ種は、約１００倍～約１０００倍 － 例えば、約１００倍、約２００倍、約３００倍、約４００倍、約５００倍、約６００倍、約７００倍、約８００倍、約９００倍、約１０００倍富化され得る。ある例において、中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ種は、約５００倍～約１０００倍またはそれ以上富化され得る。ＭＴＢＲタウは、対象から得た処理ＣＳＦまたは血液サンプルで定量でき、ここで、セクションIIまたは実施例に記載のとおりまたは当分野で知られる他の方法により(例えば、多重化アッセイ(例えばLuminexによるｘＭＡＰテクノロジー、一分子タンパク質検出(例えばSimoa(登録商標)ビーズテクノロジー)など)、ＣＳＦまたは血液サンプルは中間ドメインタウが枯渇され、次いでLC-MSによりＭＴＢＲタウが富化される。生物学的サンプルから中間ドメインタウが枯渇されない実施態様において、タウは、一般に、上記方法で、かつ上記の程度まで富化される。
上記態様の各々において、適当なＭＴＢＲタウ種は、配列番号２(IGSTENLK)、配列番号３(LQTAPVPMPDLK)、配列番号４(VQIINK)、配列番号５(LDLSNVQSK)、配列番号６(HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)、配列番号８(IGSLDNITHVPGGGN)、配列番号９(VQIVYKPVDLSK)またはこれらの組み合わせのアミノ酸
配列を含むＭＴＢＲタウ種および／または中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲ種を含み得るが、これらに限定されない。評価するＭＴＢＲ種の選択は、方法の意図する目的に依存し得る。例えば、タウオパチーが３Ｒ－タウオパチーであるとき、配列番号９(VQIVYKPVDLSK)を含むＭＴＢＲタウ種が混合型３Ｒ／４Ｒ－タウオパチーまたは４Ｒ－タウオパチーと比較して減少し得て、一方配列番号２(IGSTENLK)、配列番号４(VQIINK)、配列番号５(LDLSNVQSK)、配列番号６(HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)および／または配列番号８(IGSLDNITHVPGGGN)を含むＭＴＢＲタウ種は、他のタウオパチーと比較して、変化しないかまたは増加し得る。逆に、タウオパチーが４Ｒ－タウオパチーであるとき、配列番号９(VQIVYKPVDLSK)を含むＭＴＢＲ種は混合型３Ｒ／４Ｒ－タウオパチーまたは３Ｒ－タウオパチーと比較して増加し得て、一方配列番号２(IGSTENLK)、配列番号４(VQIINK)、配列番号５(LDLSNVQSK)、配列番号６(HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)および／または配列番号８(IGSLDNITHVPGGGN)を含むＭＴＢＲタウ種は、他のタウオパチーと比較して、変化しないかまたは減少し得る。さらなる例として、４Ｒタウオパチーは、配列番号２(IGSTENLK)、配列番号４(VQIINK)、配列番号５(LDLSNVQSK)、配列番号６(HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)および／または配列番号８(IGSLDNITHVPGGGN)を含むＭＴＢＲタウ種の定量によりＡＤと識別し得る。中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ種の使用は識別力を押し上げることができ、これは、２種の異なる中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ種の比の使用によりさらに押し上げられ得る。例えば、タウオパチーが３Ｒ－タウオパチーまたは混合型３Ｒ／４Ｒ－タウオパチーであるとき、配列番号３対配列番号６、配列番号３対配列番号８または配列番号６対配列番号８の比が使用され得る。タウオパチーが４Ｒ－タウオパチーであるとき、配列番号２、４、５または９対配列番号６、７または８の比が使用され得る。比以外の数学的手法も使用され得る。
中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ２４３の使用の例は、上記の種々の態様の説明に役立ち得るが、このような記載は本発明の範囲を限定しない。「中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ２４３」は実施例３に詳述される。配列番号３(LQTAPVPMPDLK)のアミノ酸配列を有し、全て配列番号３のアミノ酸配列を含む複数の中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ種のトリプシン消化ペプチドである。中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ２４３の量の測定は、あるサンプルにおける、中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ種のこの特定の群の量を測定する、一手段である。実施例２および３に示すとおり、ＣＳＦ中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ２４３の量の増加は、アルツハイマー病(ＡＤ)と関連する脳におけるＡβ沈着およびタウ沈着増加の直接測定を再現する。換言すると、ＣＳＦ中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ２４３の量(およびそれ故に配列番号３を含むＣＳＦ中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウの量)は、ＡＤ関連病理(例えば、脳におけるタウ沈着、脳におけるＡβ沈着など)を表す。これらの量を、それ故に使用して、ＡＤ関連病理の評価、対象のアミロイド状態の決定および疾患の臨床症状がない対象におけるＡＤの診断をし得る。ＣＳＦ中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ２４３の量はまた、例えばMMSEまたはCDR-SB試験の結果により定義したＡＤの臨床病期間に測定した変化も再現する。従って、中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ２４３の量(およびそれ故に配列番号３を含む中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウの量)を使用して、疾患スペクトラム全体(例えば、前臨床から臨床)にわたる対象におけるＡＤを診断および病期分類できる。疾患スペクトラム全体にわたる対象におけるＡＤの診断および病期分類のための有用性は、中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウの全トリプシン消化ペプチドで観察された。例えば、実施例３における中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ２９９および中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ３５４データ参照。これは、「配列番号３を含む中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ」を構成するペプチド群が、「配列番号６を含む中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ」を構成するペプチド群と異なり得て(重複しているかもしれないが)、測定法(例えば、マススペクトロメトリー、ＥＬＩＳＡなど)と無関係に、ＡＤ(およびおそらく他のタウオパチー)の疾患特異的バイオマーカーとしての配列番号３の存在量(とりわけ)の使用を支持する。疾患診断および／または病期分類後、ＣＳＦにおける中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ２４３の量の減少またはさらなる増加の阻止および／またはＡＤの他の臨床徴候または症状の減少またはさらなる増加の阻止のために、対象に処置を施し得る。処置の選択は、中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ２４３の量により情報提供される特異的疾患段階の知識により、さらに方向づけられる － 例えば、Ａβ沈着予防、Ａβ沈着逆転、予防タウ沈着、タウ沈着逆転および疾患の臨床徴候改善のために設計された治療は、おそらくは重複するであろうが、異なる中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ２４３の量の対象に使用される。実施例は、さらにＣＳＦ中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ２４３がＡＤのバイオマーカーとして極めて有用であるが、非ＡＤタウオパチーには有用ではないことを示す。非ＡＤタウオパチーは、配列番号２(IGSTENLK)、配列番号４(VQIINK)、配列番号５(LDLSNVQSK)、配列番号６(HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)または配列番号８(IGSLDNITHVPGGGN)を含む中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ種の定量およびそれらの比率により区別される。実施例は、ＣＳＦサンプルで上記原理を示すが、血液サンプルは、適当な代替として意図される。
特定の実施態様において、本発明は、対象におけるアルツハイマー病(ＡＤ)関連病理を評価する方法であって、対象から得た、中間ドメインタウが枯渇され、ＭＴＢＲタウが富化された処理ＣＳＦまたは血液サンプルを準備し；そして、処理サンプルにおける配列番号３(LQTAPVPMPDLK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号６(HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号７(IGSLDNITHVPGGGNK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号８(IGSLDNITHVPGGGN)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種またはこれらの組み合わせを定量することを含み、ここで、定量したＭＴＲＢタウ種の量またはそれらの比率が対象の脳におけるＡＤ関連病理を表すものである、方法を提供する。
他の特定の実施態様において、本発明は、対象の脳におけるアルツハイマー病(ＡＤ)関連タウ沈を測定する方法であって、中間ドメインタウが枯渇され、ＭＴＢＲタウが富化された処理ＣＳＦまたは血液サンプルを準備し；そして、処理サンプルにおける配列番号３(LQTAPVPMPDLK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種を定量することを含み、ここで、定量したＭＴＲＢタウ種の量が対象の脳におけるＡＤ関連タウ沈殿を表すものである、方法を提供する。
他の特定の実施態様において、本発明は、対象の脳におけるアルツハイマー病(ＡＤ)関連タウ沈着を測定する方法であって、対象から得た、中間ドメインタウが枯渇され、ＭＴＢＲタウが富化された処理ＣＳＦまたは血液サンプルを準備し；そして、処理サンプルにおける配列番号３(LQTAPVPMPDLK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号６(HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号７(IGSLDNITHVPGGGNK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号８(IGSLDNITHVPGGGN)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種またはこれらの組み合わせを定量することを含み、ここで、定量したＭＴＲＢタウ種の量またはそれらの比率が対象の脳におけるＡＤ関連タウ沈着を表すものである、方法を提供する。
他の特定の実施態様において、本発明は、対象のアミロイド状態を決定する方法、方法は、対象から得た、中間ドメインタウが枯渇され、ＭＴＢＲタウが富化された処理ＣＳＦまたは血液サンプルを準備し；処理サンプルにおける配列番号６(HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種を定量することを含み、ここで、定量したＭＴＲＢタウ種の量が対象の脳におけるＡＤ関連アミロイドベータ沈着を表し、PIB-PET、例えばAnn Neurol 2016; 80:379-387に記載のPiB-PET SUVRにより決定されるアミロイド陽性を予測するものである、方法を提供する。
他の特定の実施態様において、本発明は、アルツハイマー病を診断する方法であって、対象から得た、中間ドメインタウが枯渇され、ＭＴＢＲタウが富化された処理ＣＳＦまたは血液サンプルを準備し；そして、処理サンプルにおける配列番号３(LQTAPVPMPDLK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号６(HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号７(IGSLDNITHVPGGGNK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号８(IGSLDNITHVPGGGN)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種またはこれらの組み合わせを定量し；そして、定量したＭＴＢＲタウ種が約１.５σ以上異なるときアルツハイマー病と診断することを含み、ここで、σは、タウオパチーの臨床徴候または症状を有さずＰＥＴ造影(例えばAnn Neurol 2016; 80:379-387に記載のPiB-PET SUVR)により測定しておよび／またはＣＳＦにおけるＡβ４２／４０測定(例えば、感受性％＋特異性％を最大にするPiB-PET SUVR(Ann Neurol 2016; 80:379-387)から計算したＣＳＦ Ａβ４２／４０のカットオフ値)によりアミロイド陰性である対照集団で測定した正規分布により規定される標準偏差である、方法を提供する。
他の特定の実施態様において、本発明は、対象におけるアルツハイマー病(ＡＤ)進行を評価する方法であって、第一処理ＣＳＦまたは血液サンプルおよび第二処理ＣＳＦまたは血液サンプルを準備し、ここで、各処理サンプルは一対象から得たものであり、各処理サンプルは中間ドメインタウが枯渇され、ＭＴＢＲタウが富化されており；そして、各処理サンプルについて、配列番号３(LQTAPVPMPDLK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号６(HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号７(IGSLDNITHVPGGGNK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号８(IGSLDNITHVPGGGN)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種またはこれらの組み合わせを定量し；そして、第二サンプルと第一サンプルにおける定量したＭＴＢＲタウ種の差異を計算することを含み、ここで、第二サンプルにおける定量したＭＴＢＲタウ種の統計的に有意な増加は対象のアルツハイマー病の進行を示すものである、方法を提供する。
他の特定の実施態様において、本発明は、４Ｒ－タウオパチーを識別する方法であって、対象から得た、中間ドメインタウが枯渇され、ＭＴＢＲタウが富化された処理ＣＳＦまたは血液サンプルを準備し；そして、処理サンプルにおいて、(ｉ)配列番号９(VQIVYKPVDLSK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種および(ii)配列番号７(IGSLDNITHVPGGGNK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種または配列番号８(IGSLDNITHVPGGGN)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種を定量することを含み；ここで、(ｉ)および(ii)からの定量したＭＴＢＲ種の比が、４Ｒ－タウオパチーとアルツハイマー病および健常状態を識別するものである、方法を提供する。
他の特定の実施態様において、本発明は、４Ｒ－タウオパチーを識別する方法であって、対象から得た、中間ドメインタウが枯渇され、ＭＴＢＲタウが富化された処理ＣＳＦまたは血液サンプルを準備し；そして、処理サンプルにおける(ｉ)配列番号９(VQIVYKPVDLSK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種および(ii)配列番号４(VQIINK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号５(LDLSNVQSK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号６(HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)のアミノ配列を含むＭＴＢＲタウ種またはこれらの何れかの組み合わせを定量することを含み；ここで、(ｉ)および(ii)からの定量したＭＴＢＲ種の比が、４Ｒ－タウオパチーとアルツハイマー病および健常状態を識別するものである、方法を提供する。
他の特定の実施態様において、本発明は、４Ｒ－タウオパチーを識別する方法であって、対象から得た、(ａ)Ｎ末端タウおよび中間ドメインタウが枯渇されているおよび(ｂ)ＭＴＢＲタウが富化されている処理ＣＳＦまたは血液サンプルを準備し；そして、処理サンプルにおいて、(ｉ)配列番号２(IGSTENLK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号４(VQIINK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号５(LDLSNVQSK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種またはこれらの組み合わせおよび(ii)配列番号６(HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号７(IGSLDNITHVPGGGNK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号８(IGSLDNITHVPGGGN)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種またはこれらの組み合わせを定量することを含み、ここで、(ｉ)および(ii)からの定量したＭＴＢＲ種の比が、４Ｒ－タウオパチーとアルツハイマー病および健常状態を識別するものである、方法を提供する。
他の特定の実施態様において、本発明は、４Ｒ－タウオパチーを識別する方法であって、対象から得た、(ａ)Ｎ末端タウおよび中間ドメインタウが枯渇されているおよび(ｂ)ＭＴＢＲタウが富化されている処理ＣＳＦまたは血液サンプルを準備し；そして、処理サンプルにおいて、(ｉ)配列番号２(IGSTENLK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号４(VQIINK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号５(LDLSNVQSK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種またはこれらの組み合わせおよび(ii)配列番号７(IGSLDNITHVPGGGNK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号８(IGSLDNITHVPGGGN)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種またはこれらの組み合わせを定量することを含み、ここで、(ｉ)および(ii)からの定量したＭＴＢＲ種の比が、４Ｒ－タウオパチーとアルツハイマー病および健常状態を識別するものである、方法を提供する。
他の特定の実施態様において、本発明は、４Ｒ－タウオパチーを識別する方法であって、対象から得た、(ａ)Ｎ末端タウおよび中間ドメインタウが枯渇されているおよび(ｂ)ＭＴＢＲタウが富化されている処理ＣＳＦまたは血液サンプルを準備し；そして、処理サンプルにおいて、(ａ)配列番号６(HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種および(ｂ)配列番号７(IGSLDNITHVPGGGNK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号８(IGSLDNITHVPGGGN)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種またはこれらの組み合わせを定量することを含み、ここで、(ａ)および(ｂ)からの定量したＭＴＢＲ種の比が４Ｒ－タウオパチーと他のタウオパチーおよび健常状態を識別するものである、方法を提供する。
他の特定の実施態様において、本発明は、３Ｒ－タウオパチーを識別する方法であって、対象から得た、(ａ)Ｎ末端タウおよび中間ドメインタウが枯渇されているおよび(ｂ)ＭＴＢＲタウが富化されている処理ＣＳＦまたは血液サンプルを準備し；そして、処理サンプルにおいて、(ａ)配列番号９(VQIVYKPVDLSK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種および(ｂ)配列番号２(IGSTENLK)、配列番号４(VQIINK)、配列番号５(LDLSNVQSK)、配列番号６(HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)、配列番号７(IGSLDNITHVPGGGNK)、配列番号８(IGSLDNITHVPGGGN)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種またはこれらの組み合わせを定量することを含み、ここで、(ａ)および(ｂ)からの定量したＭＴＢＲ種の比が３Ｒ－タウオパチーと他のタウオパチーおよび健常状態を識別するものである、方法を提供する。
他の特定の実施態様において、本発明は、対象におけるタウオパチー関連病理を評価する方法であって、対象から得た、中間ドメインタウが枯渇され、ＭＴＢＲタウが富化された処理ＣＳＦまたは血液サンプルを準備し；そして、処理サンプルにおいて、配列番号２(IGSTENLK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲ種、配列番号３(LQTAPVPMPDLK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲ種、配列番号４(VQIINK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲ種、配列番号５(LDLSNVQSK)、配列番号６(HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲ種、配列番号８(IGSLDNITHVPGGGN)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲ種、配列番号９(VQIVYKPVDLSK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲ種またはこれらの組み合わせを定量することを含み、ここで、定量したＭＴＲＢタウ種の量またはそれらの比率が対象の脳におけるタウオパチー関連病理を表すものである、方法を提供する。
他の特定の実施態様において、本発明は、対象におけるタウ沈着を評価する方法であって、対象から得た、中間ドメインタウが枯渇され、ＭＴＢＲタウが富化された処理ＣＳＦまたは血液サンプルを準備し；そして、処理サンプルにおいて、配列番号２(IGSTENLK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲ種、配列番号３(LQTAPVPMPDLK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲ種、配列番号４(VQIINK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲ種、配列番号５(LDLSNVQSK) のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲ種、配列番号６(HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲ種、配列番号８(IGSLDNITHVPGGGN)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲ種、配列番号９(VQIVYKPVDLSK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲ種またはこれらの組み合わせを定量することを含み、ここで、定量したＭＴＲＢタウ種の量またはそれらの比率が対象の脳におけるタウ沈着を表すものである、方法を提供する。
他の特定の実施態様において、本発明は、対象におけるタウ沈着を評価する方法であって、対象から得た、中間ドメインタウが枯渇され、ＭＴＢＲタウが富化された処理ＣＳＦまたは血液サンプルを準備し；そして、処理サンプルにおいて、配列番号２(IGSTENLK)のアミ酸配列を含むＭＴＢＲ種、配列番号４(VQIINK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲ種、配列番号５(LDLSNVQSK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲ種、配列番号６(HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲ種、配列番号８(IGSLDNITHVPGGGN)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲ種、配列番号９(VQIVYKPVDLSK)のアミノ配列を含むＭＴＢＲ種またはこれらの組み合わせを定量することを含み、ここで、定量したＭＴＲＢタウ種の量またはそれらの比率が、３Ｒ－タウオパチーまたは４Ｒ－タウオパチー(すなわち、非ＡＤタウオパチー)を有する対象の脳におけるタウ沈着を表すものである、方法を提供する。
次の特定の実施態様は、生物学的サンプルにおけるタウを評価する方法を含む、方法に関する。これらの実施態様の各々において、生物学的サンプルにおけるタウ測定方法は、(ａ)生物学的サンプルにおけるＮ末端タウ、中間ドメインタウまたはＮ末端タウおよび中間ドメインタウを親和性枯渇により減少させ、所望によりアミロイドベータの親和性枯渇により減少させ、ここで、生物学的サンプルは血液サンプルまたはＣＳＦサンプルであり、生物学的サンプルは所望により同位体標識、タウ内部標準を含むものであり；(ｂ)(ｉ)タンパク質沈殿および沈殿タンパク質の分離により生物学的サンプルからさらなるタンパク質を除去して上清を得て、次いで固相抽出によりタウを上清から精製しまたは(ii)ＭＴＢＲタウを親和性精製し、それにより(ｉ)または(ii)富化タウを産生することを含む方法によりタウを富化し；(ｃ)富化タウをプロテアーゼで開裂し、次いで所望により固相抽出により得られた切断生成物を脱塩して、タウのタンパク分解ペプチドを含むサンプルを得て；そして(ｄ)タウのタンパク分解ペプチドを含むサンプルの液体クロマトグラフィー－マススペクトロメトリー(ＬＣ／ＭＳ)を実施して、タウのタンパク分解ペプチドの少なくとも１種を検出し、かつ量を測定することを含む。工程(ａ)～(ｄ)の各々のさらなる詳細は、引用によりここに包含させる、セクションIIに見られ得る。
他の特定の実施態様において、本発明は、対象におけるアルツハイマー病(ＡＤ)関連病理を評価する方法であって、上記方法で生物学的サンプルにおけるタウを測定することを含み、ここで、測定するタウは配列番号３(LQTAPVPMPDLK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号６(HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号８(IGSLDNITHVPGGGN)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種またはこれらの組み合わせであり、ここで、ＭＴＲＢタウ種の量が対象の脳におけるＡＤ関連病理を表すものである、方法を提供する。
他の特定の実施態様において、本発明は、対象の脳におけるアルツハイマー病(ＡＤ)関連タウ沈着を測定する方法であって、上記方法で生物学的サンプルにおけるタウを測定することを含み、ここで、測定するタウは配列番号３(LQTAPVPMPDLK)のアミノ酸を含むＭＴＢＲタウ種であり、ここで、ＭＴＲＢタウ種の量が対象の脳におけるＡＤ関連病理を表すものである、方法を提供する。
他の特定の実施態様において、本発明は、対象の脳におけるアルツハイマー病(ＡＤ)関連タウ沈着を評価する方法であって、上記方法で生物学的サンプルにおけるタウを測定することを含み、ここで、測定するタウは配列番号３(LQTAPVPMPDLK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号６(HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号７(IGSLDNITHVPGGGNK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号８(IGSLDNITHVPGGGN)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種またはこれらの組み合わせであり、ここで、ＭＴＲＢタウ種の量が対象の脳におけるＡＤ関連病理を表すものである、方法を提供する。
他の特定の実施態様において、本発明は、対象のアミロイド状態を決定する方法であって、上記方法で生物学的サンプルにおけるタウを測定することを含み、ここで、測定するタウは配列番号６(HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種であり、ここで、ＭＴＲＢタウ種の量が対象の脳におけるＡＤ関連アミロイドベータ沈着を表し、PIB-PETにより決定されるアミロイド陽性を予測するものである、方法を提供する。
他の特定の実施態様において、本発明は、アルツハイマー病を診断する方法であって、上記方法で生物学的サンプルにおけるタウを測定することを含み、ここで、測定するタウは配列番号３(LQTAPVPMPDLK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号６(HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号７(IGSLDNITHVPGGGNK)のアミ酸ノ配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号８(IGSLDNITHVPGGGN)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種またはこれらの組み合わせであり；そして、定量したＭＴＢＲタウ種が約１.５σ以上異なるときアルツハイマー病と診断することを含み、ここで、σは、タウオパチーの臨床徴候または症状を有さず、ＰＥＴ造影および／またはＣＳＦにおけるＡβ４２／４０測定で測定してアミロイド陰性である対照集団で測定した正規分布により規定される標準偏差である、方法を提供する。
他の特定の実施態様において、本発明は、対象におけるアルツハイマー病(ＡＤ)進行を評価する方法であって、上記方法で生物学的サンプルにおけるタウを測定することを含み、ここで、測定するタウは番号３(LQTAPVPMPDLK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号６(HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号７(IGSLDNITHVPGGGNK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号８(IGSLDNITHVPGGGN)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種またはこれらの組み合わせであり；、第二サンプルと第一サンプルにおける定量したＭＴＢＲタウ種の差異を計算することを含み、ここで、第二サンプルにおける定量したＭＴＢＲタウ種の統計的に有意な増加は対象のアルツハイマー病の進行を示すものである、方法を提供する。
他の特定の実施態様において、本発明は、４Ｒ－タウオパチーを識別する方法であって、上記方法で生物学的サンプルにおけるタウを測定することを含み、ここで、測定するタウは(ｉ)配列番号９(VQIVYKPVDLSK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種および(ii)配列番号７(IGSLDNITHVPGGGNK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種または配列番号８(IGSLDNITHVPGGGN)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種であり；ここで、(ｉ)および(ii)からの定量したＭＴＢＲ種の比が、４Ｒ－タウオパチーとアルツハイマー病および健常状態を識別するものである、方法を提供する。
他の特定の実施態様において、本発明は、４Ｒ－タウオパチーを識別する方法であって、上記方法で生物学的サンプルにおけるタウを測定することを含み、ここで、測定するタウは(ｉ)配列番号９(VQIVYKPVDLSK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種および(ii)配列番号４(VQIINK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号５(LDLSNVQSK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号６(HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種またはこれらの何れかの組み合わせであり；ここで、(ｉ)および(ii)からの定量したＭＴＢＲ種の比が、４Ｒ－タウオパチーとアルツハイマー病および健常状態を識別するものである、方法を提供する。
他の特定の実施態様において、本発明は、４Ｒ－タウオパチーを識別する方法であって、上記方法で生物学的サンプルにおけるタウを測定することを含み、ここで、測定するタウは(ｉ)配列番号２(IGSTENLK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号４(VQIINK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号５(LDLSNVQSK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種またはこれらの組み合わせおよび(ii)配列番号６(HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号７(IGSLDNITHVPGGGNK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号８(IGSLDNITHVPGGGN)のアミノ配列を含むＭＴＢＲタウ種またはこれらの組み合わせであり、ここで、(ｉ)および(ii)からの定量したＭＴＢＲ種の比が、４Ｒ－タウオパチーとアルツハイマー病および健常状態を識別するものである、方法を提供する。
他の特定の実施態様において、本発明は、４Ｒ－タウオパチーを識別する方法であって、上記方法で生物学的サンプルにおけるタウを測定することを含み、ここで、測定するタウは(ｉ)配列番号２(IGSTENLK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号４(VQIINK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号５(LDLSNVQSK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種またはこれらの組み合わせおよび(ii)配列番号７(IGSLDNITHVPGGGNK)のアミノ配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号８(IGSLDNITHVPGGGN)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種またはこれらの組み合わせであり、ここで、(ｉ)および(ii)からの定量したＭＴＢＲ種の比が、４Ｒ－タウオパチーとアルツハイマー病および健常状態を識別するものである、方法を提供する。
他の特定の実施態様において、本発明は、４Ｒ－タウオパチーを識別する方法であって、上記方法で生物学的サンプルにおけるタウを測定することを含み、ここで、測定するタウは(ｉ)配列番号６(HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種および(ii)配列番号７(IGSLDNITHVPGGGNK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号８(IGSLDNITHVPGGGN)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種またはこれらの組み合わせであり、ここで、(ｉ)および(ii)からの定量したＭＴＢＲ種の比が、４Ｒ－タウオパチーとアルツハイマー病および健常状態を識別するものである、方法を提供する。
他の特定の実施態様において、本発明は、対象におけるタウオパチー関連病理を評価する方法であって、上記方法で中間ドメインタウが枯渇されており、かつＭＴＢＲタウが富化されている生物学的サンプルにおけるタウを測定することを含み；そして、処理サンプルにおいて、配列番号２(IGSTENLK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲ種、配列番号３(LQTAPVPMPDLK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲ種、配列番号４(VQIINK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲ種、配列番号５(LDLSNVQSK) のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲ種、配列番号６(HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲ種、配列番号８(IGSLDNITHVPGGGN)、配列番号９(VQIVYKPVDLSK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲ種またはこれらの組み合わせを定量することを含み、ここで、定量したＭＴＲＢタウ種の量またはそれらの比率が対象の脳におけるタウオパチー関連病理を表すものである、方法を提供する。
特定の実施態様において、本発明は、対象におけるタウ沈着を測定する方法であって、上記方法で中間ドメインタウが枯渇されており、かつＭＴＢＲタウが富化されている生物学的サンプルにおけるタウを測定することを含み；そして、処理サンプルにおいて、配列番号２(IGSTENLK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲ種、配列番号３(LQTAPVPMPDLK)のアミノ配列を含むＭＴＢＲ種、配列番号４(VQIINK)のアミノ配列を含むＭＴＢＲ種、配列番号５(LDLSNVQSK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲ種、配列番号６(HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)のアミノ配列を含むＭＴＢＲ種、配列番号８(IGSLDNITHVPGGGN)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲ種、配列番号９(VQIVYKPVDLSK)のアミノ配列を含むＭＴＢＲ種またはこれらの組み合わせを定量することを含み、ここで、定量したＭＴＲＢタウ種の量またはそれらの比率が対象の脳におけるタウ沈着を表すものである、方法を提供する。
他の特定の実施態様において、本発明は、処置を必要とする対象を処置する方法であって、(ａ)対象から得た(ｉ)中間ドメインタウが枯渇されているおよび(ii)MTBRタウが富化されている処理ＣＳＦまたは血液サンプルを準備し；(ｂ)処理サンプルにおいて、配列番号２(IGSTENLK)のアミノ酸配列を含むMTBRＭＴＢＲタウ種、配列番号３(LQTAPVPMPDLK)のアミノ酸配列を含むMTBRＭＴＢＲタウ種、配列番号４(VQIINK)のアミノ酸配列を含むMTBRＭＴＢＲタウ種、配列番号５(LDLSNVQSK)のアミノ酸配列を含むMTBRＭＴＢＲタウ種、配列番号６(HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)のアミノ酸配列を含むMTBRＭＴＢＲタウ種、配列番号７(IGSLDNITHVPGGGNK)のアミノ酸配列を含むMTBRＭＴＢＲタウ種、配列番号８(IGSLDNITHVPGGGN)のアミノ酸配列を含むMTBRＭＴＢＲタウ種、配列番号９(VQIVYKPVDLSK)のアミノ酸配列を含むMTBRＭＴＢＲタウ種またはこれらの組み合わせを定量し；そして(ｃ)対象にタウ病理を変えるために処置を投与することを含み、ここで、対象の処理ＣＳＦまたは血液サンプルは、定量したMTBRＭＴＢＲタウ種の量または定量したMTBRＭＴＢＲタウ種の比率が１.５σ以上異なり、ここで、σは、タウオパチーの臨床徴候または症状を有さず、ＰＥＴ造影および／またはＣＳＦにおけるＡβ４２／４０測定で評価してアミロイド陰性である対照集団で測定した正規分布により規定される標準偏差であり、ここで、定量したＭＴＲＢタウ種の量またはそれらの比率が対象の脳におけるタウ病理を表すものである、方法を提供する。ある実施態様において、タウ病理を変えるために対象に処置を投与することは、定量したＭＴＢＲ種の量を変えるまたは安定化する。ある実施態様において、処置は、コリンエステラーゼ阻害剤、Ｎ－メチルＤ－アスパルテート(ＮＭＤＡ)アンタゴニスト、抗うつ剤(例えば、選択的セロトニン再取り込み阻害剤、非定型抗うつ剤、アミノケトン、選択的セロトニンおよびノルエピネフリン再取り込み阻害剤、三環式抗うつ剤など)、ガンマ－セクレターゼ阻害剤、ベータ－セクレターゼ阻害剤、抗Ａβ抗体(その抗原結合フラグメント、バリアントまたは誘導体を含む)、抗タウ抗体(その抗原結合フラグメント、バリアントまたは誘導体を含む)、抗ＴＲＥＭ２抗体(その抗原結合フラグメント、バリアントまたは誘導体を含む、ＴＲＥＭ２アゴニスト、幹細胞、栄養補助食品(例えばリチウム水、リポ酸を有するオメガ－３脂肪酸、長鎖トリグリセリド、ゲニステイン、レスベラトロール、クルクミンおよびグレープシード抽出物など)、セロトニン受容体６アンタゴニスト、ｐ３８アルファＭＡＰＫ阻害剤、組み換え顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、受動的免疫療法、活性ワクチン(例えばＣＡＤ１０６、ＡＦ２０５１３など)、タウタンパク質凝集阻害剤(例えばＴＲｘ０２３７、塩化メチルチオニニウムなど)、血糖管理を改善するための治療(例えば、インスリン、エキセナチド、リラグルチド、ピオグリタゾンなど)、抗炎症剤、ホスホジエステラーゼ９Ａ阻害剤、シグマ－１受容体アゴニスト、キナーゼ阻害剤、ホスファターゼアクティベーター、ホスファターゼ阻害剤、アンギオテンシン受容体ブロッカー、ＣＢ１および／またはＣＢ２エンドカンナビノイド受容体部分アゴニスト、ｂ－２アドレナリン受容体アゴニスト、ニコチンアセチルコリン受容体アゴニスト、５－ＨＴ２Ａ逆アゴニスト、アルファ－２ｃアドレナリン受容体アンタゴニスト、５－ＨＴ１Ａおよび１Ｄ受容体アゴニスト、グルタミニル－ペプチドシクロトランスフェラーゼ阻害剤、ＡＰＰ生成選択的阻害剤、モノアミンオキシダーゼＢ阻害剤、グルタミン酸受容体アンタゴニスト、ＡＭＰＡ受容体アゴニスト、神経増殖因子刺激因子、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ阻害剤、神経栄養剤、ムスカリンＭ１受容体アゴニスト、ＧＡＢＡ受容体モジュレーター、ＰＰＡＲ－ガンマアゴニスト、微小管タンパク質モジュレーター、カルシウムチャネルブロッカー、抗高血圧剤、スタチンおよびこれらの何れかの組み合わせを含む医薬組成物である。例示的実施態様において、医薬組成物は、キナーゼ阻害剤を含み得る。適当なキナーゼ阻害剤は、非常に多くのアミノ酸キナーゼ(ＴＡＯＫ)、ＣＤＫ、ＧＳＫ－３ｐ、ＭＡＲＫ、ＣＤＫ５またはＦｙｎを阻害し得る。他の例示的実施態様において、医薬組成物は、ホスファターゼアクティベーターを含み得る。非限定的例として、ホスファターゼアクティベーターは、タンパク質ホスファターゼ２Ａの活性を増加し得る。ある実施態様において、処置は、タウリン酸化パターンを改変する、タウ凝集に拮抗するまたは病理学的タウアイソフォームおよび／または凝集体のクリアランスを増加させる活性医薬成分を含むが、これらに限定されないタウターゲティング治療を含む医薬組成物である。ある実施態様において、処置は、抗Ａβ抗体、抗タウ抗体、抗ＴＲＥＭ２抗体、ＴＲＥＭ２アゴニスト、ガンマ－セクレターゼ阻害剤、ベータ－セクレターゼ阻害剤、キナーゼ阻害剤、ホスファターゼアクティベーター、ワクチンまたはタウタンパク質凝集阻害剤である。
他の特定の実施態様において、本発明は、処置を必要とする対象を処置する方法であって、(ａ)対象から得た(ｉ)中間ドメインタウが枯渇されているおよび(ii)ＭＴＢＲタウが富化されている処理ＣＳＦまたは血液サンプルを準備し；(ｂ)処理サンプルにおいて、配列番号３(LQTAPVPMPDLK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号６(HVPGGGSVQIVYKPVDLSK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号７(IGSLDNITHVPGGGNK)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号８(IGSLDNITHVPGGGN)のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種またはこれらの組み合わせを定量し；そして(ｃ)対象にタウ病理を変えるために処置を投与することを含み、ここで、対象の処理ＣＳＦまたは血液サンプルは、定量したＭＴＢＲタウ種の量または定量したＭＴＢＲタウ種の比率が１.５σ以上異なり、ここで、σは、タウオパチーの臨床徴候または症状を有さず、ＰＥＴ造影および／またはＣＳＦにおけるＡβ４２／４０測定で評価してアミロイド陰性である対照集団で測定した正規分布により規定される標準偏差であり、ここで、定量したＭＴＲＢタウ種の量またはそれらの比率が対象の脳におけるタウ病理を表すものである、方法を提供する。ある実施態様において、タウ病理を変えるために対象に処置を投与することは、定量したＭＴＢＲ種の量を変えるまたは安定化する。ある実施態様において、処置は、コリンエステラーゼ阻害剤、Ｎ－メチルＤ－アスパルテート(ＮＭＤＡ)アンタゴニスト、抗うつ剤(例えば、選択的セロトニン再取り込み阻害剤、非定型抗うつ剤、アミノケトン、選択的セロトニンおよびノルエピネフリン再取り込み阻害剤、三環式抗うつ剤など)、ガンマ－セクレターゼ阻害剤、ベータ－セクレターゼ阻害剤、抗Ａβ抗体(その抗原結合フラグメント、バリアントまたは誘導体を含む)、抗タウ抗体(その抗原結合フラグメント、バリアントまたは誘導体を含む)、抗ＴＲＥＭ２抗体(その抗原結合フラグメント、バリアントまたは誘導体を含む、ＴＲＥＭ２アゴニスト、幹細胞、栄養補助食品(例えばリチウム水、リポ酸を有するオメガ－３脂肪酸、長鎖トリグリセリド、ゲニステイン、レスベラトロール、クルクミンおよびグレープシード抽出物など)、セロトニン受容体６アンタゴニスト、ｐ３８アルファＭＡＰＫ阻害剤、組み換え顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、受動的免疫療法、活性ワクチン(例えばＣＡＤ１０６、ＡＦ２０５１３など)、タウタンパク質凝集阻害剤(例えばＴＲｘ０２３７、塩化メチルチオニニウムなど)、血糖管理を改善するための治療(例えば、インスリン、エキセナチド、リラグルチド、ピオグリタゾンなど)、抗炎症剤、ホスホジエステラーゼ９Ａ阻害剤、シグマ－１受容体アゴニスト、キナーゼ阻害剤、ホスファターゼアクティベーター、ホスファターゼ阻害剤、アンギオテンシン受容体ブロッカー、ＣＢ１および／またはＣＢ２エンドカンナビノイド受容体部分アゴニスト、ｂ－２アドレナリン受容体アゴニスト、ニコチンアセチルコリン受容体アゴニスト、５－ＨＴ２Ａ逆アゴニスト、アルファ－２ｃアドレナリン受容体アンタゴニスト、５－ＨＴ１Ａおよび１Ｄ受容体アゴニスト、グルタミニル－ペプチドシクロトランスフェラーゼ阻害剤、ＡＰＰ生成選択的阻害剤、モノアミンオキシダーゼＢ阻害剤、グルタミン酸受容体アンタゴニスト、ＡＭＰＡ受容体アゴニスト、神経増殖因子刺激因子、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ阻害剤、神経栄養剤、ムスカリンＭ１受容体アゴニスト、ＧＡＢＡ受容体モジュレーター、ＰＰＡＲ－ガンマアゴニスト、微小管タンパク質モジュレーター、カルシウムチャネルブロッカー、抗高血圧剤、スタチンおよびこれらの何れかの組み合わせを含む医薬組成物である。例示的実施態様において、医薬組成物は、キナーゼ阻害剤を含み得る。適当なキナーゼ阻害剤は、非常に多くのアミノ酸キナーゼ(ＴＡＯＫ)、ＣＤＫ、ＧＳＫ－３ｐ、ＭＡＲＫ、ＣＤＫ５またはＦｙｎを阻害し得る。他の例示的実施態様において、医薬組成物は、ホスファターゼアクティベーターを含み得る。非限定的例として、ホスファターゼアクティベーターは、タンパク質ホスファターゼ２Ａの活性を増加し得る。ある実施態様において、処置は、タウリン酸化パターンを改変する、タウ凝集に拮抗するまたは病理学的タウアイソフォームおよび／または凝集体のクリアランスを増加させる活性医薬成分を含むが、これらに限定されないタウターゲティング治療を含む医薬組成物である。ある実施態様において、処置は、抗Ａβ抗体、抗タウ抗体、抗ＴＲＥＭ２抗体、ＴＲＥＭ２アゴニスト、ガンマ－セクレターゼ阻害剤、ベータ－セクレターゼ阻害剤、キナーゼ阻害剤、ホスファターゼアクティベーター、ワクチンまたはタウタンパク質凝集阻害剤である。
次の実施例は、本発明の種々のイテレーションを説明する。次の実施例に開示する技術は、本発明の実施に際し、十分に機能することが本発明者らにより発見された技術を表すことは、当業者には認識されるべきである。しかしながら、当業者は、本明細書の記載に基づいて、ここに開示された特定の実施態様を変化させることができ、なお、本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様のまたは類似する結果が得られることを認識し得る。従って、添付する図面に記載されまたは示される全ての事項は、限定的意味ではなく、説明的であると解釈されるべきである。
実施例１
ＭＴＢＲタウを富化するためのいくつかのサンプル処理方法が開発されている － Sato et al., 2018に記載のＮ末端タウおよび中間ドメインタウ(ＩＰ)の免疫沈降方法；化学抽出方法(ＣＸ)；およびＩＰおよびＣＸ方法の組み合わせ(PostIP-CX)。ＣＸおよびPostIP-CX方法は、ＭＴＢＲタウの検出および定量のために特に開発された。これらの方法の概要を図２に示す。
簡潔には、ＣＳＦ(約４７５μL)を、内部標準として、１５Ｎタウ４４１(２Ｎ４Ｒ)均一標識(１００pg／μL溶液約１０μLまたは２００pg／μL溶液約５μL)を含む溶液と混合した。Ｎ末端タウおよび中間ドメインタウ種をＴａｕ１およびＨＪ８.５抗体で免疫沈降させ、次いで先に記載のとおり、処理し、トリプシン消化した(Sato et al., 2018)。
ＣＸ方法について、ＣＳＦ(約４７５μL)を、内部標準として、１５Ｎタウ４４１(２Ｎ４Ｒ)均一標識(１００pg／μL溶液約１０μLまたは２００pg／μL溶液約５μL)を含む溶液と混合した。次いで、タウを化学抽出した。高存在量のＣＳＦタンパク質を、２５μLの過塩素酸を使用して、沈殿させた。氷上での混合および１５分間のインキュベーション後、混合物を２０,０００ｇで１５分間、４℃で遠心分離し、上清を、次の工程に従い、Oasis HLB 96プレートμElution Plate(Waters)を使用して、さらに精製した。プレートを３００μLのメタノールで１回洗浄し、５００μLの０.１％ＦＡ水溶液で１回平衡化した。上清をOasis HLB 96プレートμElution Plateに加え、固相に吸着させた。次いで、固相を５００μLの０.１％ＦＡ水溶液で１回洗浄した。溶出緩衝液(１００μL；３５％アセトニトリルおよび０.１％ＦＡ水溶液)を加え、溶離液をSpeed-vacで乾燥させた。乾燥サンプルを、５０mM ＴＥＡＢＣ中５０μLのトリプシン溶液(１０ng／μL)に溶解し、３７℃で２０時間インキュベートした。
PostIP-CX方法について、免疫沈降後ＣＳＦ(すなわち、上記ＩＰ方法後残存する上清)を、ＣＸ方法に記載のとおり処理した。
トリプシン消化後、全サンプルを、C18 TopTipでの固相抽出により精製した。この精製過程で、残基３５４～３６９(ＭＴＢＲタウ３５４)および３５４～３６８(タウ３６８)のAQUA内部標準ペプチドの各々５fmolを、識別的定量のために添加した。サンプルの溶出前、３％過酸化水素および３％ＦＡ水溶液をビーズに加え、続いて一夜、４℃でインキュベーションして、メチオニン含有ペプチドを酸化した。溶離液を凍結乾燥し、２７.５μLの２％アセトニトリルおよび０.１％ＦＡ水溶液に再懸濁して、その後ＰＲＭモードで操作するOrbitrap Fusion Lumos TribridまたはOrbitrap Tribrid Eclipseマススペクトロメーター(Thermo Scientific)に連結したnanoAcquity UPLC系でＭＳ分析した。
図３Ａに示すとおり、ＣＸおよびPostIP-CX方法は、マススペクトロメトリーで検出および定量可能なＭＴＢＲタウ含有サンプルをもたらした。ＭＴＢＲタウの定量可能シグナルは、ＩＰ方法で得られなかった。証明されていないが、類似する感受性を有するＭＴＢＲタウを検出および定量する方法も使用され得ると考えられる。
実施例２
この実施例において、晩発性アルツハイマー病を有する対象の２つの臨床コホート(LOAD100およびLOAD60)からのＣＳＦサンプルを分析した。この分析に使用するサンプルの臨床的認知症等級(ＣＤＲ)スコアおよびアミロイド状態を表１および２に示す。ＣＳＦサンプル(各約５００μl)を、実施例１に記載のとおりPostIP-CX方法で処理し、マススペクトロメトリーで評価した。ＣＳＦからのＣＳＦ Ａβ４２およびＡβ４０免疫沈降は、先に記載のとおり、マススペクトロメトリーにより測定した(Patterson BW, et al., Ann Neurol 2015, 78: 439-453)。pT217％は、先に記載のとおり、マススペクトロメトリーにより測定した(Barthelemy, N.R., et al., Alz Res Therapy, 2020, 12: 26)。
ＣＳＦ Ａβ４２／４０のカットオフ値を、アミロイド状態を決定するためのPiB-PET SUVR結果から計算した。PiB-PET SUVRで確立されたカットオフ＞１.４２に基づき(Ann Neurol 2016; 80:379-387)、(感受性％＋特異性％)は、ＣＳＦ Ａβ４２／４０について０.１３８９で最大化された。特に、pT217％は、一つの外れ値を伴うものの、確立されたカットオフにより定義されるアミロイド状態と優れた相関を示した(図４)。
図５～７に示すとおり、PostIP-CXサンプルで測定してＭＴＢＲと関連するタウのトリプシン消化ペプチドは、アミロイド陽性対象で有意に増加した。HVPGは、最も有意に、臨床的に無症候性段階でさえ、増加した(図５～６)。HVPGおよびIGSLの増加は症候性発症後飽和し、一方LQTAは、臨床的発症後も増加し続けた(図７～８)。LQTAの濃度は、タウの陽電子放出断層撮影(ＰＥＴ)で評価されるタウ病理(ピアソンｒ＝０.８４、ｎ＝３５)および認知試験評価と最高の相関を示した(図９～１２)。上記分析のいくつかで、アミロイド陽性ＣＤＲ１およびＣＤＲ２サンプルのデータをＣＤＲ＞１として合わせ、アミロイド陰性ＣＤＲ０.５およびＣＤＲ１のデータをＣＤＲ＞０.５として合わせた。統計分析を、ＦＤＲを５％に設定したベンジャミン・ホッシュバーグＦＤＲ方法を使用する複数比較について調節した一元配置ANOVAにより実施した。
特に、サンプル処理は、タウの診断有用性に影響することが示された。一例として、ＭＴＢＲタウのトリプシン消化ペプチドHVPGは、PostIP-CXサンプルで発症前段階でアミロイド陽性とアミロイド陰性対象を識別するが、この識別力は、ＩＰサンプルの中間ドメインタウのトリプシン消化ペプチドTPPSでは観察されなかった(図５)。TPPSトリプシン消化ペプチドのアミノ酸配列はTPPSSGEPPK(配列番号１０)である。サンプル処理は、種々のＣＳＦサンプル間のＭＴＢＲタウ量の変化を識別する能力への有意な影響も示した。例えば、トリプシン消化ペプチドLQTAは、PostIP-CXサンプルにおいて症候性段階後ＣＳＦサンプルで直線的増加を示すが、ＩＰサンプルでは示さず(図１３)、PostIP-LQTA(中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ２４３)がIP-LQTAより良好にアミロイド状態を識別することを示す(図１４)。
上記データは、ＡＤ脳凝集体で富化されるＭＴＢＲタウが、ＡＤ ＣＳＦでも増加することを示唆する。トリプシン消化ペプチドLQTAおよびHVPGがファジーコートの一部であり、それぞれタウ線維凝集の出発点であり、一方IGSLはコアの内側であるとの仮説が立てられる。ファジーコートとしての線維表面のLQTAペプチドの位置は常に露出され、ＣＳＦへの放出の可能性が増加する。HVPGの凝集における役割を考えると、未成熟線維はなお表面にHPVGを露出し、一方、本ペプチドは、成熟線維のコアに補充され得る。IGSLの線維コアにおける位置は、早期のＡＤ段階で予測され得る。
根柢の機構とは無関係に、データは、ＣＳＦにおけるトリプシン消化ペプチドHVPGおよびLQTAを、それぞれＡＤにおけるアミロイド状態およびタウ病理を再現するためのバイオマーカーとして使用し得ることを示唆する。殊に、LQTAのみTau-PETならびにアミロイド状態および認知低下の観点で疾患進行を通した継続的増加が示され、この領域がＡＤにおけるタウ病理の識別に重要であることを示唆する。これらのペプチドとトリプシン消化ペプチドIGSLおよび／または他のバイオマーカーの組み合わせの使用は、対象の疾患軌道のステージ分類のときの識別力を後押しする(図１５～１７)。さらに、LQTAおよび他のＭＴＢＲタウペプチドを、種々のタウオパチーを識別するバイオマーカーとして使用し得る。
Figure 2022544514000003
Figure 2022544514000004
実施例３
この実施例において、アルツハイマー病バイオマーカーとしてのＭＴＢＲタウ種の存在および潜在的有用性が詳述される。結果は、中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウの相当量がＣＳＦに存在することを示す － すなわち、Ｎ末端および中間ドメイン領域を欠くＣ末端フラグメント(「Ｃ末端切取り部分」)をもたらすポリペプチド配列中心付近(例えば、タウ４４１のアミノ酸２２４前後)で開裂されているタウ種。さらに、ＣＳＦ ＭＴＢＲタウの種々の領域が疾患進行をステージ分離し、アルツハイマー病脳内のタウ凝集と相関する。これらの発見は、脳におけるＭＴＢＲタウとＣＳＦの相関についての新しい知見を提供し、アルツハイマー病の体液バイオマーカーとしてのＣＳＦタウを支持する。
材料：ヒト脳サンプルの２つの異なるコホートを、この実施例の実験で使用した － 発見コホートおよび検証コホート。発見コホートは、アルツハイマー病病理を有する２参加者および病理がない２対照参加者からの死後凍結脳組織サンプルを含み、これは、Knight ADRC Pathology Core at Washington University School of Medicineから提供された。各サンプルを、National Institute on Aging and Alzheimer's Associationによりアミロイド沈着についてアミロイド段階Ａ３(Thai相)およびタウ凝集についてTau Braak段階VI、Ｂ３と分類した。各参加者からのサンプルは、小脳、上前頭回、前頭極、側頭、後頭部、視床、扁桃体、橋、頭頂葉および線条体を含む、６～１０脳領域から集めた。検証コホートとして、２０参加者(ＣＳＦ Ａβ ４２／４０比により８アミロイド陰性および１２アミロイド陽性)の頭頂葉からのさらなる死後凍結脳組織サンプルを分析した。１２アミロイド陽性サンプルを、臨床的認知症等級(ＣＤＲ)スコアにより臨床群にさらに分け、極軽度乃至中程度アルツハイマー病(アミロイド陽性、ＣＤＲ＝０.５～２、ｎ＝５)または重度アルツハイマー病(アミロイド陽性、ＣＤＲ＝３、ｎ＝７)として分類した。これらのヒト試験は、Washington University Institutional Review Boardにより承認された。
ヒトＣＳＦサンプルの３つの異なるコホートもこの実施例の実験で使用した － 横断的コホート、長期的コホートおよびTau-PETコホート(表３Ａおよび表３Ｂ)。１００参加者からのＣＳＦサンプルを、横断的コホートとして分析のためにアミロイドベータ(Ａβ)安定同位体標識化動態(ＳＩＬＫ)試験(Patterson et al., 2015)から集めた。このコホートは、実施例２でＬＯＡＤ１００コホートとも称する。ＣＳＦ収集を、先に記載のとおり実施した(Patterson et al., 2015)。簡潔には、ＣＳＦをベースライン時に集めた。次に、参加者は、１０分間かけてロイシンボーラス点滴を受けた。６mLのＣＳＦを、３６時間毎時得た。３０時間目に採取したＣＳＦアリコートを、この試験でタウ種のＭＳ測定のために使用した。アミロイド状態を、先に報告されたＣＳＦ Ａβ ４２／４０比を使用して定義した(Patterson et al., 2015)。対応するカットオフ比(０.１３８９)は、ピッツバーグ化合物Ｂ(ＰｉＢ)ＰＥＴにより決定されたアミロイド陽性の予測精度を最大化した。アミロイド群を、表３Ａに示すＣＤＲスコアによりさらに臨床群に分けた。横断的コホートから、２８参加者(１４アミロイド陽性および１４アミロイド陰性)を、ＣＳＦにおけるタウ種の長期的軌道の評価のために２～９年追跡した。ＣＳＦサンプルを、横断的コホートと同じ方法で集め、分析した。ＣＳＦ収集時点から３年以内にTau-PET AV-1451正規化取り込み値比(SUVR)を測定した３５参加者からなるTau-PETコホート(２０アミロイド陽性および１５アミロイド陰性、長期的コホートからの１６参加者を含む)を含んだ。ＰＥＴ走査を先に記載のとおり実施し(Sato et al., 2018)、部分容積効果補正領域拡散関数技術を使用してSUVRに対して実施した(Su et al., 2015)。ＣＳＦサンプルを、他のコホートと同じ方法で集め、分析した。
Figure 2022544514000005
Figure 2022544514000006
ＭＳによる脳タウ分析：凍結脳組織サンプルをクリオスタットを－２０℃で使用してスライスし、チューブに集めた。組織(３００～４００mg)を、０.３mg／μLの脳組織の濃度で、２５mM ｔｒｉｓ－塩酸塩(ｐＨ７.４)、１５０mM 塩化ナトリウム、１０mM エチレンジアミン四酢酸、１０mM エチレングリコール四酢酸、ホスファターゼ阻害剤カクテルおよびプロテアーゼ阻害剤カクテルを含む氷冷緩衝液中、超音波処理した。ホモジネートを、２０分間、１１,０００ｇ、４℃での遠心分離により浄化した。上清(全脳抽出物)を新しいチューブに等分し、使用するまで－８０℃に維持した。全脳抽出物を、１％サルコシルと６０分間、氷上でインキュベートし、続いて１００,０００ｇ、４℃で６０分間超遠心分離して、不溶性ペレットを得た。不溶性ペレットを２００μLのＰＢＳに再懸濁し、続いて超音波処理し、不溶性懸濁液を使用するまで－８０℃に維持した。
可溶性タウ分析について、全脳抽出物におけるタウ種をＴａｕ１およびＨＪ８.５抗体で免疫沈降させた。免疫沈降可溶性タウ種を、先に記載のとおり、処理し、消化した(Sato et al., 2018)。
不溶性タウ分析について、不溶性懸濁液(総タンパク質２.５μgを含む１０～２０μL)を、２００μLの溶解緩衝液(７Ｍ 尿素、２Ｍ チオ－尿素、３％３－[(３－コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]－１プロパンスルホネート、１.５％ｎ－オクチルグルコシド、１００mMトリエチル重炭酸アンモニウム(ＴＥＡＢＣ))と混合し、続いて内部標準として１５Ｎタウ４４１(２Ｎ４Ｒ)均一標識(２ng／μL、Dr. Guy Lippens, Lille University, Franceから恵与)を含む５μLの溶液を加えた。５μLの５００mM ジチオトレイトールを懸濁液に加え、続いて超音波処理した。得られた溶液を１５μLの５００mM ヨードアセトアミドと混合し、３０分間、室温、暗所でインキュベートした。タンパク質消化を、先に報告されたフィルター支援サンプル調製方法を使用して実施した(Roberts et al., 2020)。簡潔には、各調製溶液を、Nanosep 10Kフィルターユニット(ＰＡＬＬ)に充填し、遠心分離した。１００mM ＴＥＡＢＣ溶液中８Ｍ 尿素でフィルターユニット上のサンプルを洗浄後、固定化タンパク質を、０.２５μgのエンドプロテイナーゼＬｙｓ－Ｃを使用して、３７℃で６０分間、フィルター上で消化した。次いで、サンプルを、３７℃で一夜、０.４μgトリプシンを使用してさらに消化した。
消化サンプル(可溶性および不溶性タウ種)を遠心分離により集め、次いでC18 TopTip(Glygen)で脱塩した。この精製過程で、残基３５４～３６９(ＭＴＢＲタウ３５４)および３５４～３６８(タウ３６８)のAQUA内部標準ペプチドの各々５０fmolを、識別的定量のために添加した。サンプルの溶出前、３％過酸化水素および３％ギ酸(ＦＡ)水溶液をビーズに加え、続いて一夜、４℃でインキュベーションして、メチオニン含有ペプチドを酸化した。溶離液を凍結乾燥し、２７.５μLの２％アセトニトリルおよび０.１％ＦＡ水溶液に再懸濁して、その後並列反応モニタリング(ＰＲＭ)モードで操作するOrbitrap Fusion TribridまたはOrbitrap Tribrid Eclipse(Thermo Scientific)に連結したnanoAcquity UPLC系(Waters)でＭＳ分析した。
可溶性および不溶性タウ種両者からの１６脳タウペプチドを、１５ＮまたはAQUA内部標準からの対応するアイソトポマーシグナルの比較により定量した(表４)。脳サンプルにまたがるペプチドプロファイル比較を、中間ドメインタウペプチド(残基１８１～１９０)により各ペプチド量を正規化して実施した。
Figure 2022544514000007
ＭＳによるＣＳＦタウ分析：ＣＳＦ(４５５μL)を、内部標準として１０μLの１５Ｎタウ４４１(２Ｎ４Ｒ)均一標識(１００pg／μL)を含む溶液と混合した。主にＮ末端～中間ドメイン領域からなるタウ種をＴａｕ１およびＨＪ８.５抗体で免疫沈降させた。免疫沈降タウ種を、先に記載のとおり、処理し、消化した(Sato et al., 2018)。続いて、２０μLの１５Ｎ－タウ内部標準(１００pg／μL)を、免疫沈降後ＣＳＦに添加した。次いで、タウを、一部改変した先の報告(Barthelemy et al., 2016b)のとおり、化学抽出した。高存在量のＣＳＦタンパク質を、２５μLの過塩素酸を使用して、沈殿させた。氷上での混合および１５分間のインキュベーション後、混合物を２０,０００ｇで１５分間、４℃で遠心分離し、上清を、次の工程に従い、Oasis HLB 96プレートμElution Plate(Waters)を使用して、さらに精製した。プレートを３００μLのメタノールで１回洗浄し、５００μLの０.１％ＦＡ水溶液で１回平衡化した。上清をOasis HLB 96プレートμElution Plateに加え、固相に吸着させた。次いで、固相を５００μLの０.１％ＦＡ水溶液で１回洗浄した。溶出緩衝液(１００μL；３５％アセトニトリルおよび０.１％ＦＡ水溶液)を加え、溶離液をSpeed-vacで乾燥させた。乾燥サンプルを、５０mM ＴＥＡＢＣ中５０μLのトリプシン溶液(１０ng／μL)に溶解し、３７℃で２０時間インキュベートした。
免疫沈降および化学抽出サンプル両者をインキュベーション後、各トリプシン消化物を、C18 TopTipの固相抽出により精製した。この精製過程で、残基３５４～３６９(ＭＴＢＲタウ３５４)および３５４～３６８(タウ３６８)のAQUA内部標準ペプチドの各々５fmolを、識別的定量のために添加した。サンプルの溶出前、３％過酸化水素および３％ＦＡ水溶液をビーズに加え、続いて一夜、４℃でインキュベーションして、メチオニン含有ペプチドを酸化した。溶離液を凍結乾燥し、２７.５μLの２％アセトニトリルおよび０.１％ＦＡ水溶液に再懸濁して、その後ＰＲＭモードで操作するOrbitrap Fusion Lumos TribridまたはOrbitrap Tribrid Eclipseマススペクトロメーター(Thermo Scientific)に連結したnanoAcquity UPLC系でＭＳ分析した。１９ＣＳＦタウペプチドを定量した(表４)。ＣＳＦタウ分析の概略手順を図２に示す。
統計分析：バイオマーカー値の差異を、特に断らない限り、一元配置ANOVAで評価した。両側ｐ＜０.０５を統計的有意とみなし、５％のＦＤＲ設定でベンジャミン・ホッシュバーグ偽陽性率(ＦＤＲ)方法を使用する複数比較について補正した(Benjamini and Hochberg, 1995)。スピアマン相関を使用して、タウバイオマーカーおよび認知試験測定およびTau-PET SUVRの相関を評価した。
結果 － アルツハイマー病脳におけるタウ種の富化プロファイリング：アルツハイマー病脳におけるタウ凝集は、ＣＳＦにおけるタウプロファイルに反映されることが仮設立てられた。従って、アルツハイマー病および対照脳からの不溶性抽出物におけるタウプロファイルをまず分析して(図１８Ｂ：発見コホート)、後にＣＳＦタウプロファイルと比較した。それぞれＲ２とＲ３ドメインの間およびＲ４ドメイン内に位置する残基２９９～３１７(ＭＴＢＲタウ２９９)および３５４～３６９(ＭＴＢＲタウ３５４)を含む種が、アルツハイマー病脳からの不溶性抽出物で対照より３～４倍富化された。残基２４３～２５４(ＭＴＢＲタウ２４３)を含むＭＴＢＲの上流領域も、対照と比較してアルツハイマー病脳で約３倍多く、一方それぞれＲ１およびＲ２ドメイン内に位置する残基２６０～２６７および２７５～２８０を含む種は、アルツハイマー病と対照組織間で異ならなかった。タウの他の領域は、対照と比較してアルツハイマー病脳で富化されなかった。顕著なことに、中間ドメイン内の残基１９５～２０９を含む種は、対照と比較してアルツハイマー病脳で特に低く、不溶性タウ凝集体における残基１９９、２０２、２０５および２０８で生ずる広範な過剰リン酸化の結果の可能性がある(Malia et al., 2016)。注目すべきことには、対照およびアルツハイマー病愛で可溶性タウ(全脳抽出物)における同定されたＭＴＢＲタウ種で変化は観察されなかった(図２３Ａ)。これらの結果は、対照(アミロイド陰性、ｎ＝８)、極軽度乃至中程度アルツハイマー病(アミロイド陽性、ＣＤＲ＝０.５～２、ｎ＝５)および重度アルツハイマー病(アミロイド陽性、ＣＤＲ＝３、ｎ＝７)参加者(図１８Ｃおよび図２３Ｂ：検証コホート)からの脳サンプルで再現され、ＭＴＢＲタウ２４３、２９９および３５４種が疾患進行段階をとおして不溶性タウ凝集体に特に富化されたことが示唆される。
次に、最近報告されたアスパラギンエンドペプチダーゼにより産生された切断タウ３６８(残基３５４～３６８)種(Zhang et al., 2014; Blennow et al., 2020)を、そのペアの非切断種、ＭＴＢＲタウ３５４に対して試験し、両種を脳不溶性抽出物で定量した(図２４)。タウ３６８とＭＴＢＲタウ３５４の高相関が判明し(ｒ＝０.９７８３)、残基３６８での短縮化が、脳病理の種々の段階で同じ割合で起こることが示唆される。
結果 － ＣＳＦにおけるＭＴＢＲタウの定量：アルツハイマー病脳凝集体におけるＭＴＢＲタウ富化がＣＳＦにおける可溶性タウ種のレベルと相関するかを決定するために、ＣＳＦにおけるＭＴＢＲタウを分析する方法を開発した。方法は、免疫沈降後(Ｔａｕ１／ＦＩＪ８.５)ＣＳＦにおけるタウ化学抽出、続いてＭＳ分析を含む(図２Ａ)。この方法は、ＭＴＢＲペプチド定量のための十分な回収をもたらした(図２５)。化学抽出前のＴａｕ１／ＦＩＪ８.５免疫沈降方法により回収したタウペプチド存在量は、残基２２２後劇的に減少した(Sato et al., 2018)。対照的に、PostIP-CX方法により定量されたＭＴＢＲタウ種濃度は、Ｎ末端～中間ドメイン領域と比較して相対的に低かったが、免疫沈降によるタウの他の領域となお同等であった(図１９)。正常対照参加者のＣＳＦ濃度(免疫沈降および化学抽出方法からの合計値として計算)は、中間ドメイン種(残基１５１～１５５、１８１～１９０、１９５～２０９および２１２～２２１)について８.２～３２.０ng／mL、ＭＴＢＲタウ種(残基２４３～２５４、２６０～２６７、２７５～２８０、２８２～２９０、２９９～３１７および３５４～３６９)について０.４～３.７ng／mLおよび非ＭＴＢＲ Ｃ末端タウ種(残基３８６～３９５および３９６～４０６)について６.５～５.１ng／mLの範囲であった。Ｃ末端含有切断タウ種のＣＳＦ濃度は、中間ドメイン(残基１９５～２０９および２１２～２２１)を含むものに類似する範囲であり、タウのＣ末端側もＮ末端～中間ドメインタウと同じ方法でニューロン細胞で切断され、細胞外に分泌されることを示唆する(Sato et al., 2018)。
結果 － アルツハイマー病横断的コホートにおけるＣＳＦ ＭＴＢＲタウ：細胞外空間に存在するＭＴＢＲ含有種がアルツハイマー病関連変化を反映するか否かを決定するために、ＣＳＦを種々の臨床病期のアミロイド陰性およびアミロイド陽性参加者の横断的コホートで分析した：アミロイド陰性ＣＤＲ＝０(対照、ｎ＝３０)、アミロイド陽性ＣＤＲ＝０(発症前ＡＤ、ｎ＝１８)、アミロイド陽性ＣＤＲ＝０.５(極軽度ＡＤ、ｎ＝２８)、アミロイド陽性ＣＤＲ＞１(軽度～中程度ＡＤ、ｎ＝１２)およびアミロイド陰性ＣＤＲ＞０.５(非ＡＤ認知機能障害、ｎ＝１２)。
まず、アルツハイマー病脳で特に富化されている３ＭＴＢＲタウ種のＣＳＦレベル(ＭＴＢＲタウ２４３、ＭＴＢＲタウ２９９およびＭＴＢＲタウ３５４)を試験した(図２０)。全３種は、アルツハイマー病および対照ＣＳＦ両方に存在し、レベルは、対照群と比較して、無症候性段階(ＣＤＲ＝０)でもアミロイド陽性群で高かった(ＭＴＢＲタウ２４３ ｐ＝０.０１７０、ＭＴＢＲタウ２９９ ｐ＝０.０００２およびＭＴＢＲタウ３５４ ｐ＝０.００７６)。顕著なことに、これらの種は、臨床的疾患発症後、ＣＳＦで異なる特徴を有した。ＭＴＢＲタウ２９９レベルは、対照と比較して発症前ＡＤで２０４％高かったが、極軽度ＡＤ(ＣＤＲ＝０.５)および軽度～中程度ＡＤ(ＣＤＲ＞１)の間に飽和され(ｐ＝０.２５４１)、一方ＭＴＢＲタウ３５４レベルは、症状発症後集めたサンプルで有意に低かった(ｐ＝０.０３４５)。対照的に、ＭＴＢＲタウ２４３レベルは症状発症後を含む全疾患段階にわたり、徐々に高くなった(ｐ＝０.００２５)。これらの結果は、ＭＴＢＲタウ種内の領域的特異性が、種々のアルツハイマー病段階にわたり識別でき、ＭＴＢＲタウ２４３が良好なアルツハイマー病段階特異的マーカーであることを示唆する。
次に、ＣＳＦ ＭＴＢＲタウ種が他の領域を含むタウ種と比較して、アルツハイマー病ステージ分類に感受性および特異性の増加を提供するか否かを試験した。Ｎ末端、中間ドメイン、ＭＴＢＲおよびＣ末端ドメインを含む複数種を領域特異的方法により定量した(図２６、図２７、図２８)。Ｎ末端および中間ドメイン種を免疫沈降(ＩＰ方法)および免疫沈降後ＣＳＦについて化学抽出(PostIP-CX方法)により定量し、一方Ｃ末端種のＭＴＢＲは、免疫沈降で定量可能シグナルが得られなかったため、免疫沈降後ＣＳＦの化学抽出方法(PostIP-CX方法)でのみ定量した。免疫沈降方法により定量したＮ末端ドメインを含む種のレベルは、対照と無症候性段階(残基６～２３、ｐ＝０.０３６２以外)または他の近隣疾患段階で異ならなかった。免疫沈降方法による中間ドメイン種レベルは、対照より無症候性アミロイド段階で有意に高かったが(残基２１２～２２１、ｐ＝０.０７６２以外)、ＭＴＢＲタウ種(例えば、ＭＴＢＲタウ２９９レベルは、発症前ＡＤ段階で対照より＞２００％大きかった)と比較して有効サイズは相対的に中程度であり(１２３％～１６８％対対照)であり、後期疾患段階と異ならなかった。抽出法にかかわらず、ＭＴＢＲタウ２４３、２９９および３５４種は、Ｎ末端～中間ドメイン種(残基６～２３～２２６～２３０、図２８)と比較して、対照と疾患段階間で大きな差を示した。ＭＴＢＲに対するＣ末端ドメイン(残基２６０～２６７、２７５～２８０、２８２～２９０、３８６～３９５および３９６～４０６)を含む他の種からのプロファイルは、中間ドメイン種に類似し、アルツハイマー病臨床的認知症の段階に特異的ではなかった。
まとめると、アルツハイマー病脳で富化されたＭＴＢＲ(ＭＴＢＲタウ２４３、ＭＴＢＲタウ２９９およびＭＴＢＲタウ３５４)を含む代表的３種(図１８)は、ＣＳＦで類似する特徴を有し、ＭＴＢＲタウ２４３はアルツハイマー病認知症段階に最高の特異性を示した。注目すべきことには、高相関がＣＳＦにおけるタウ３６８切断形態とＭＴＢＲタウ３５４非切断形態の間で観察された(ｒ＝０.８３８２)(図２９)。アルツハイマー病の臨床病期を信頼可能に識別する唯一の種は、ＭＴＢＲタウ２４３であった。
結果 － アルツハイマー病の病期分類のための特異的バイオマーカーとしての中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ２４３：アルツハイマー病臨床的認知症段階にわたるＭＴＢＲタウ－２４３種の徐々のレベル増加は、疾患進行の信頼可能な予測印紙であり得ることを示唆する。次に、そのＭＴＢＲタウ種(ＭＴＢＲタウ２４３、ＭＴＢＲタウ２９９およびＭＴＢＲタウ３５４)が、ＣＤＲ－ボックス総和(CDR-SB)およびミニメンタルステート試験(MMSE)などの認知試験の結果と最高の相関を有するかを試験した。アミロイド陽性群の中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ２４３種がCDR-SBおよびMMSE両方と高度に相関することが判明した(それぞれｒ＝０.５５６２、ｐ＜０.０００１およびｒ＝－０.５４３３、ｐ＜０.０００１)(図３０および図３１)。他の種レベルは、認知試験とはるかに低い相関であるかまたは有意な相関がなく(表５)、CSF ＭＴＢＲタウ２４３が無症候性段階からアルツハイマー病の臨床病期の進行を通して臨床病期および包括的疾患進行を特異的に識別することを示唆する。
Figure 2022544514000008
結果 － アルツハイマー病長期的コホートにおけるＣＳＦ ＭＴＢＲタウ：横断的コホートから、参加者(ｎ＝２８)のサブセットを２～９年追跡して、ＣＳＦにおけるＭＴＢＲタウの長期的軌道を測定した(表６)。アルツハイマー病脳で富化されるＭＴＢＲタウ種(ＭＴＢＲタウ２４３、ＭＴＢＲタウ２９９およびＭＴＢＲタウ３５４)は、アミロイド陽性群で経時的に有意に増加するが(１回目と２回目の来院間の両側対応ありｔ検定によりｐ＜０.０１)、ＭＴＢＲタウ２４３以外アミロイド陰性群では増加しなかった(図３２)。アミロイド陰性群は、ＭＴＢＲタウ２４３のわずかな長期的増加も示したが、アミロイド陽性群で観察されるより低かった(それぞれアミロイド陰性および陽性群で差異の平均＝０.４９２６および２.２０８)。
図２１は、個々の参加者におけるＭＴＢＲタウ種濃度の長期的変化率を示す。顕著なことに、疾患発症後最高ＣＤＲを有する１参加者(参加者Ａ)(７年間でＣＤＲ＝１～２に変化)は、各ＭＴＢＲタウ種に特異的軌道プロファイルを示した。ＭＴＢＲタウ２４３は、軽度ＡＤ(ＣＤＲ＝１)～中程度ＡＤ(ＣＤＲ＝２)でさえ継続的に増加し、一方ＭＴＢＲタウ２９９およびＭＴＢＲタウ３５４は、軽度ＡＤ後、この参加者のＣＳＦで減少した。アミロイド陽性群の他の参加者は、１回目の来院時発症前ＡＤまたは極軽度ＡＤ(それぞれＣＤＲ＝０または０.５)と診断され、各種レベルの増加傾向は、大部分の参加者で見られるものであり、横断的コホートからの発見を支持する。
Figure 2022544514000009
結果 － Tau-PET造影との相関：Tau-PET走査により測定したタウ病理は、アルツハイマー病の認知低下および臨床病期と強く相関した(Arriagada et al., 1992; Johnson et al., 2016; Ossenkoppele et al., 2016; Bejanin et al., 2017; Jack et al., 2018; Gordon et al., 2019)。次に、ＣＳＦにおけるＭＴＢＲタウがTau-PETにより評価した脳タウ病理と相関するかを試験した(図２２)。中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ２４３はTau-PET SUVRと有意に相関し(ｒ＝０.７５８８、ｐ＜０.０００１)、一方ＭＴＢＲタウ２９９およびＭＴＢＲタウ３５４の相関ははるかに低かった(それぞれｒ＝０.４５８４、ｐ＝０.００５６およびｒ＝０.４３７５、ｐ＝０.００８６)。残基２２６～２３０を含むタウ種も、Tau-PET SUVRとの高相関を示したが(ｒ＝０.６２４８、ｐ＜０.０００１、表７)、ＭＴＢＲタウ２４３で観察されるより低かった。これは、CSF ＭＴＢＲタウ２４３および周辺領域が、脳におけるタウ凝集のサロゲートバイオマーカーであり得ることを示す。脳におけるタウ病理を特異的かつ定量的に追跡する能力は、アルツハイマー病臨床的試験で切望されるバイオマーカーである。
Figure 2022544514000010
考察：タウのＭＴＢＲ領域は、主に脳凝集体で試験されているが、ＣＳＦでは広範囲にはされていない。この試験において、ＣＳＦタウを分析するための感受性および抗体非依存的方法を使用して、ヒト参加者からのＣＳＦサンプルにおけるタウのＭＴＢＲ領域の存在および定量を示した。抗体依存性アッセイを利用した過去の試験(Meredith et at., 2013; Sato et at., 2018)は、抗体特異性または感受性またはＣＳＦにおけるＭＴＢＲ種により選択される可能性のある形態を回収する能力を含むアッセイ限界により、ＣＳＦにおけるＭＴＢＲ含有タウ種を検出できていない可能性がある。あるいは、ＭＴＢＲタウは、種々のプロテアーゼにより切断され、慣用の免疫アッセイまたは免疫沈降、続くＭＳアッセイで検出されないフラグメントを産生し得る(Gamblin et al., 2003; Cotman et al., 2005; Zhang et al., 2014; Zhao et al., 2016; Chen et al., 2018; Quinn et al., 2018)。この試験において、驚くべきことに、PostIP-CX方法、続くマススペクトロメトリーの使用により、中間ドメインタウ種と比較して、約１％～１０％で、確固たる濃度のＭＴＢＲタウ種が測定された(図１９および図２Ａ)。
今日まで、ＭＴＢＲタウが細胞外タウ増殖に関与するか否か、細胞外レベルが病理の播種および拡散に低すぎると考えられていたため、不明であった。ＣＳＦにおけるＭＴＢＲの化学量論のこれら新知見は、ＭＴＢＲ含有種が病理学的種と同様細胞外に拡散するとの仮説を支持する。これらの測定は、アルツハイマー病のための抗タウ薬物開発の潜在的標的の情報を提供し、アルツハイマー病患者からのＣＳＦにおけるＭＴＢＲタウ種の２～３倍増加により示されるとおり、標的の定量的測定を提供する。しかしながら、病理学的種がＣＳＦではなく間質液(ＩＳＦ)に存在し得ることが制限である(Colin et al., 2020)。ＣＳＦタウが主にＩＳＦに由来し(Reiber, 2001)、アルツハイマー病患者からのヒトＣＳＦがトランスジェニックマウスモデルにおけるタウ播種を誘導できることがいくつかの報告で示されているが(Skachokova et al., 2019)、ＣＳＦで検出されるタウ種がヒト脳で増殖し得る病理学的タウを反映するか否かの解明には、さらなる研究が必要である。
先の試験は、アルツハイマー病脳タウ凝集体のマウス脳への接種が重度タウ病理を誘導したことを示す(Guo et al., 2016; Narasimhan et al., 2017)；しかしながら、ヒトにおける疾患進行にまた結びついた細胞外空間内の病理学的タウ種を同定する報告はない。これにより、アルツハイマー病におけるＣＳＦ ＭＴＢＲタウ種変化の試験および新規アルツハイマー病バイオマーカーとしての適性の探索に至った。ＣＳＦ ＭＴＢＲタウレベルはアルツハイマー病で上昇し、アルツハイマー病脳不溶性フラクションで富化される種に一致することが判明した。ＣＳＦ ＭＴＢＲタウがアルツハイマー病臨床病期およびタウ病理と相関するとの発見は、ＭＴＢＲタウがアルツハイマー病におけるタウ増殖と関連することを示唆するが、細胞外ＣＳＦ ＭＴＢＲタウの性質(すなわち、モノマー、オリゴマーまたは原線維種)および起源はなお未知である。ＣＳＦ ＭＴＢＲタウがモノマー種を能動的に分泌する脳凝集体またはニューロンに由来し得る可能性があり、さらなる試験は、この問題に取り組むために設計されるべきである。
興味深いことに、ＣＳＦ ＭＴＢＲタウ種の変化の軌道は、ＭＴＢＲの種々の領域およびアルツハイマー病の各臨床病期にわたり異なることが判明した。この発見は、最近のＣｒｙｏ－ＥＭ発見により決定されたタウの構造変化によるものと仮定した。Ｃｒｙｏ－ＥＭ分析は、残基３０６から始まるタウ凝集体の秩序だったβシートコアを示唆する(Fitzpatrick et at., 2017)。故に、ＭＴＢＲタウ３５４(残基３５４～３６９を含む)、ＭＴＢＲタウ２９９(残基２９９～３１７を含む)およびＭＴＢＲタウ２４３(残基２４３～２５４を含む)は、それぞれ線維コアの内側、境界および外側を示す。ＭＴＢＲタウ３５４およびＭＴＢＲタウ２９９両者と対照的に、ＭＴＢＲタウ２４３レベルは、全疾患段階にわたり徐々に増加した。ＣＳＦにおけるＭＴＢＲタウ２４３および近隣領域(すなわち、残基２２６～２３０)レベルも、Tau-PET SUVRパフォーマンスと高度に相関し(図２２および表７)、ＭＴＢＲタウ２４３およびおそらく近隣領域が脳タウ凝集体に沈着し、細胞外に分泌されるとの仮説を支持する(図１７)。
ＭＴＢＲタウがアルツハイマー病病理および臨床的進行段階と高度に相関するとの発見は、タウオパチー処置のための治療抗タウ薬物の有望な標的の重要な知見を提供する。例えば、ＭＴＢＲの上流領域(残基２３５～２５０)におけるエピトープを認識する新規タウ抗体は、細胞ベースのアッセイにおけるアルツハイマー病および進行性核上性麻痺脳からのタウ播種を軽減する有意かつ選択的能力を示す(Courade et at., 2018)。これらの発見は、ＭＴＢＲの上流領域が細胞外、病理学的タウと関係することを示す。これは、ヒトアルツハイマー病脳抽出物を注射されているトランスジェニックマウスにおける遠位脳領域へのタウ病理増殖を軽減する抗体により支持される(Albert et al., 2019)。ＭＴＢＲの上流領域(残基２４９～２５８)のエピトープを認識する他の新規タウ抗体は、細胞およびヒトアルツハイマー病脳抽出物を播種されたインビボトランスジェニックマウスモデルにおけるタウ病理の誘導の減少を示す(Vandermeeren et al., 2018)。抗体ターゲティングＭＴＢＲタウ２９９およびＭＴＢＲタウ３５４種も、Ｐ３０１Ｌタウまたはアルツハイマー病脳抽出物の播種により誘導されたタウ病理を軽減し(Weisova et al., 2019; Roberts et al., 2020)、ＭＴＢＲの特異的領域を含む種がタウオパチーにおけるタウ病理拡散を担うとの仮説を支持する。
まとめると、ＣＳＦにおけるＭＴＢＲタウ種がＣ末端フラグメントとして存在し、アルツハイマー病で特異的に増加し、アルツハイマー病脳凝集体で見られる富化を反映することを示す。発見は、特異的ＭＴＢＲ含有種(ＭＴＢＲタウ２９９およびＭＴＢＲタウ２４３)がアルツハイマー病におけるアミロイドおよびタウ病理を評価する有望なＣＳＦバイオマーカーであることを示唆する。特に、中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウ２４３はアルツハイマー病の疾患進行およびタウ病理と平行し、タウ病理のバイオマーカーおよび新規抗タウ抗体治療の標的として利用され得る。
実施例４
「PostIP-IP」と称するさらなるサンプル処理方法を開発し、実施例１および２に記載のPostIP-CX方法と比較した。PostIP-IP方法の例示的ワークフローを図３３に示す。
実施例２に記載するＬＯＡＤ１００コホートから得たＣＳＦサンプルをPostIP-CX方法(実施例１)またはPostIP-IP方法(本実施例)により処理し、次いで実施例２に一般的に記載するLC-MSで分析した。
図３４Ａに示すとおり、トリプシン消化ペプチドLQTAは、２サンプル間で異なるプロファイルを示した。例えば、PostIP-CX方法で処理したサンプルで測定された臨床的発症でさえ継続的に増加するLQTAの量は、PostIP-IP方法で処理したサンプルでは見られなかった。対照的に、トリプシン消化ペプチドHVPGおよびIGSLは、PostIP-CXおよびPostIP-IP方法により処理したサンプル間で類似のプロファイルを示した(図３４Ｂおよび図３４Ｃ)。さらなるトリプシン消化ペプチドのさらなる分析は、LQTAとIGSTペプチド間のアミノ酸配列内のＲ１で生じる重要な切断事象があり得ることを示唆する(図３５Ａ)。
LQTA下流(すなわち、Ｃ末端)の全トリプシン消化ペプチドの存在量は、サンプル処理方法間で良好な相関を示したが(Ｒ２値に基づく、図３５参照)、トリプシン消化ペプチドHVPGおよびIGSL間のＲ２値の顕著な増加があった。これをさらに探索するため、サンプルをＣＤＲスコアでグループ分けした － より具体的に、認知障害対象(Ｃｌ、ＣＤＲ＞０.５)および認知非障害対象(ＣＤＲ＜０.５)。図３６Ｂに示すとおり、認知障害対象のみが、HVPGおよびIGSLトリプシン消化ペプチドについて、PostIP-CX対PostIP-IP方法で処理したサンプル間で低相関を示した。これは、凝集体におけるHVPGおよびIGSLトリプシン消化ペプチドを含むタウ領域に補充され、それにより、ＣＳＦおよび他の体液でこれらのペプチドを含むタウ種の量の変化に至る、脳のタウ凝集体の発生を反映し得る。
全体として、これらのデータは、サンプル処理方法の選択が、ＣＳＦおよび他の体液における、ＣＮＳにおけるタウ病理を再現するＭＴＢＲタウ種の検出能に影響することを示す。
実施例５
この実施例において、３臨床的コホートの対象からのＣＳＦサンプルを、ＩＰ方法(実施例１)およびPostIP-IP方法(実施例４)により処理し、実施例３に一般的に記載するマススペクトロメトリーで評価した。サンプルを、対照対象(ｎ＝９３)、アミロイド陽性ＡＤを有する対象(ｎ＝４１)、非ＡＤタウオパチーを有する対象(ｎ＝８７)から得た。非ＡＤタウオパチーを有する対象は、ＣＢＤまたはＣＢＤ／ＰＳＰ(ｎ＝２０)、ＦＴＤ(ｎ＝２９)、FTLD(Ｒ４０６Ｗ ｎ＝７、Ｐ３０１Ｌ ｎ＝３)、ＰＳＰ(ｎ＝１８)および未確定非ＡＤ認知症(ｎ＝３)を有すると臨床的に診断された。３Ｒおよび４Ｒアイソフォームに特異的なトリプシン消化ペプチドは特に興味深かった。ＣＳＦ Ａβ４２／４０を、Ovod et al., Alzheimers Dement J. Alzheimers Assoc, 2017, 13:841-849に一般的に記載されるマススペクトロメトリーで測定した。アミロイド状態を、０.０８５のカットオフ値を使用して定義した(すなわち、アミロイド陽性＞０.０８５、アミロイド陰性＜０.０８５)。pT217％は、先に記載のとおり、マススペクトロメトリーにより測定した。
図３７に示すとおり、サンプルにおけるトリプシン消化ペプチドVQIV／LDLS比は、PostIP-IP方法で処理したサンプルにおいて非ＡＤタウオパチーと対照を識別するが(図３７Ｃ)、ＩＰ方法ではしない(図３７Ｂ)。PostIP-IP方法で処理したサンプルのさらなる分析は、対照対象と比較して、非ＡＤタウオパチーを有する対象からのＣＳＦにおいてLDLSの存在量が低いことを示した(図３８)。
VQIV／LDLS比の増加が、非ＡＤタウオパチーを有する対象から得たPostIP-IP処理サンプルで測定されたが、ＡＤを有する対象または対照対象からのサンプルではされなかった(図３９)。PostIP-IPサンプル処理後のさらなるトリプシン消化ペプチドの分析は、ＡＤを有する対象または対照対象と比較して、非ＡＤタウオパチーを有する対象におけるＲ１－Ｒ２トリプシン消化ペプチド(例えば、IGST、VQII、LDLSなど)と後期Ｒ２－Ｒ３トリプシン消化ペプチド(例えば、HVPGなど)の相関が低いことを同定した(図４０、表８)。非ＡＤタウオパチー間を比較すると、ＰＳＰ、ＣＢＤおよびＦＴＤを有する特定の対象は外れ値であった(図４１)。HPVGではなく、トリプシン消化ペプチドIGSLとの比較で、類似する結果が得られた(図４２)。
全体として、これらのデータは、PostIP-IPサンプル処理後測定したＣＳＦタウプロファイルが、脳タウ凝集状態を反映することを示唆する。例えば、４Ｒ－タウオパチーは、VQIIトリプシン消化ペプチドを含むＲ２領域が富化された脳不溶性タウを含み、４Ｒ－タウオパチーを有する対象からの一部ＣＳＦサンプルは、HVPGまたはIGSLに対して、トリプシン消化ペプチドIGST、VQIIおよびLDLS量の減少を示した。これはＡＤを有する対象で観察されなかった。これらのデータから見て、４Ｒ－タウオパチーを識別する方法は、ＭＴＢＲタウのＲ２領域についての富化に焦点を絞るべきである。
Figure 2022544514000011
実施例６
この実施例において、非ＡＤタウオパチーを含む対象の単一臨床的コホートから得たＣＳＦおよび脳サンプルのさらなる分析は、非ＡＤタウオパチーを有する対象から得たＣＳＦサンプルと、ＡＤを有する対象を有する対象から得たＣＳＦサンプルを識別するための中間ドメイン非依存的ＭＴＢＲタウの有用性のさらなる証拠を提供した。このコホートにおける対象は、ＡＤを有する対象(ｎ＝２８)、ＣＢＤまたはＣＢＤ／ＰＳＰを有すると臨床的に診断された対象(ｎ＝２０)、ＦＴＤを有すると臨床的に診断された対象(ｎ＝２２)およびＰＳＰを有すると臨床的に診断された対象(ｎ＝１１)を含んだ。これら対象から得たＣＳＦサンプルを、実施例４に一般的に記載するPostIP-IP方法で処理し、実施例３に一般的に記載するマススペクトロメトリーで評価した。脳不溶性タウを、実施例３に記載するとおり評価した。
実施例５に記載するとおり、ＣＳＦのPostIP-IPサンプル処理後のトリプシン消化ペプチドの分析は、非ＡＤタウオパチーを有する対象におけるＲ１および早期Ｒ２トリプシン消化ペプチド(例えば、IGST、VQII、LDLSなど)と後期Ｒ２、Ｒ３および／またはＲ４トリプシン消化ペプチド(例えば、IGSLなど)の低い相関を同定した(図４３、図４４および図４５)。ＣＳＦにおいて、非ＡＤタウオパチーのタウ種は、ＡＤのタウ種より(１)少ないＲ１およびＲ２および(２)多いＲ３およびＲ４を含むことおよびこれが脳タウ沈着の兆候であることが仮設立てられた(図４６)。この仮説を試験するために、脳不溶性タウを分析した。図４７に示すとおり、トリプシン消化ペプチドVQIIは、４Ｒ－タウオパチーの脳タウ凝集体で富化される。トリプシン消化ペプチドＦＩＶＰＧおよびIGSLも脳タウ凝集体で富化されるが、ＡＤと比較して少ない。これらのデータは、非ＡＤタウオパチーとＡＤを識別する方法としてのＲ１またはＲ２対Ｒ３またはＲ４の比をさらに支持する。
次いで、分析をさらに拡大して、遺伝的に確認されたFTLD症例から得たＣＳＦサンプル(Ｒ４０６Ｗ、ｎ＝７；Ｐ３０１Ｌ、ｎ＝３)、対照対象から得たＣＳＦサンプル(ｎ＝４４)およびＡＤを有する対象から得たさらなるＣＳＦサンプル(ｎ＝４１)を含めた。これら対象から得たＣＳＦサンプルを、実施例４に一般的に記載するPostIP-IP方法で処理し、実施例３に一般的に記載するマススペクトロメトリーで評価した。ＣＳＦのPostIP-IPサンプル処理後のトリプシン消化ペプチドの分析は、同様に、非ＡＤタウオパチーを有する対象におけるＲ１および早期Ｒ２トリプシン消化ペプチド(例えば、IGST、VQII、LDLSなど)と後期Ｒ２、Ｒ３および／またはＲ４トリプシン消化ペプチド(例えば、IGSLなど)の低い相関を同定した(図４８および図４９)。これらのデータは、非ＡＤタウオパチーとＡＤを識別する方法としてのＲ１またはＲ２対Ｒ３またはＲ４の量の比の用途を確認し、また対照対象と非ＡＤタウオパチーを識別する能力も示す。特に、遺伝的に確認されたFTLD症例から得たＣＳＦサンプルは、分析をさらに厳密にする。

Claims (75)

  1. 生物学的サンプルにおけるタウを測定する方法であって、
    (ａ)(ｉ)所望によりタウの同位体標識内部標準を含むおよび(ii)所望によりアミロイドベータ、Ｎ末端タウ、中間ドメインタウまたはこれらの何れかの組み合わせが枯渇されている血液サンプルまたはＣＳＦサンプルから選択される生物学的サンプルを準備し；
    (ｂ)タンパク質沈殿および沈殿タンパク質の分離により生物学的サンプルからタンパク質を除去して上清を得て；
    (ｃ)固相抽出によりタウを上清から精製し；
    (ｄ)プロテアーゼで精製タウを開裂し、次いで所望により得られた切断生成物を固相抽出により脱塩して、タウのタンパク分解ペプチドを含むサンプルを得て；そして
    (ｅ)タウのタンパク分解ペプチドを含むサンプルで液体クロマトグラフィー－マススペクトロメトリーを実施して、タウのタンパク分解ペプチドの少なくとも１種を検出しかつ量を測定することを含む、
    方法。
  2. 生物学的サンプルがアミロイドベータ、Ｎ末端タウ、中間ドメインタウまたはこれらの何れかの組み合わせが枯渇されている、請求項１の方法。
  3. (ｉ)生物学的サンプルがアミロイドベータ、Ｎ末端タウおよび中間ドメインタウが枯渇されている、(ii)生物学的サンプルがＮ末端タウおよび中間ドメインタウが枯渇されているまたは(iii)生物学的サンプルが中間ドメインタウが枯渇されている、請求項２の方法。
  4. 工程(ｃ)の固相がタウを吸着する逆相吸着剤を含む、請求項１の方法。
  5. 工程(ｂ)が生物学的サンプルのタンパク質を沈殿させるために酸を混合することを含み、所望により酸が過塩素酸である；および／または
    工程(ｅ)において、液体クロマトグラフィー－マススペクトロメトリーがｎａｎｏ－ＬＣ／ＭＳ系により実施される、
    請求項１～５の何れかの方法。
  6. 生物学的サンプルにおけるタウを測定する方法であって、
    (ａ)生物学的サンプルにおけるＮ末端タウ、中間ドメインタウまたはＮ末端タウおよび中間ドメインタウを親和性枯渇により減少させ、そして所望によりアミロイドベータを親和性枯渇により減少させ、ここで、生物学的サンプルが血液サンプルまたはＣＳＦサンプルであり、生物学的サンプルが所望により同位体標識、タウ内部標準を含むものであり；
    (ｂ)(ｉ)タンパク質沈殿および沈殿タンパク質の分離により生物学的サンプルからさらなるタンパク質を除去して上清を得て、次いで固相抽出によりタウを上清から精製するまたは(ii)ＭＴＢＲタウを親和性精製することを含む方法によりＭＴＢＲタウを富化して、(ｉ)または(ii)の富化ＭＴＢＲタウを産生し；
    (ｃ)富化ＭＴＢＲタウをプロテアーゼで開裂し、次いで所望により固相抽出により得られた切断生成物を脱塩して、タウのタンパク分解ペプチドを含むサンプルを得て；そして
    (ｄ)タウのタンパク分解ペプチドを含むサンプルの液体クロマトグラフィー－マススペクトロメトリー(ＬＣ／ＭＳ)を実施して、タウのタンパク分解ペプチドの少なくとも１種を検出し、かつ量を測定することを含む、
    方法。
  7. 工程(ａ)が(ｉ)Ｎ末端タウ、中間ドメインタウまたはＮ末端タウおよび中間ドメインタウおよび(ii)アミロイドベータを減少させることを含む、請求項６の方法。
  8. 生物学的サンプルがヒトタウを含み、ここで、工程(ａ)がさらに
    生物学的サンプルとタウ４４１のエピトープアミノ酸１～２４３内(両端を含む)と特異的に結合する少なくとも１個のエピトープ結合剤を接触させる；または
    生物学的サンプルとタウ４４１のエピトープアミノ酸１～１０３内(両端を含む)と特異的に結合する第一エピトープ結合剤およびタウ４４１のエピトープアミノ酸１０４～２４３内(両端を含む)と特異的に結合する第二エピトープ結合剤を接触させる；または
    生物学的サンプルとタウ４４１のエピトープアミノ酸１～１０３内(両端を含む)と特異的に結合する第一エピトープ結合剤、タウ４４１のエピトープアミノ酸１０４～２４３内(両端を含む)と特異的に結合する第二エピトープおよびアミロイドベータのエピトープと特異的に結合する第三エピトープ結合剤を接触させる；または
    生物学的サンプルとタウ４４１のエピトープアミノ酸１～１０３内(両端を含む)と特異的に結合する第一エピトープ結合剤、アミロイドベータのエピトープと特異的に結合する第二エピトープ結合剤を接触させる；または
    生物学的サンプルとタウ４４１のエピトープアミノ酸１０４～２４３内(両端を含む)と特異的に結合する第一エピトープ結合剤およびアミロイドベータのエピトープと特異的に結合する第三エピトープ結合剤を接触させることを含む、
    請求項６の方法。
  9. アミロイドベータに特異的に結合するエピトープ結合剤がＨＪ５.１である、請求項８の方法。
  10. タウ４４１のエピトープアミノ酸１～１０３内(両端を含む)、に特異的に結合するエピトープ結合剤がＨＪ８.５である、請求項８の方法。
  11. タウ４４１のエピトープアミノ酸１０４～２４３内(両端を含む)に特異的に結合するエピトープ結合剤がＴａｕ１である、請求項８の方法。
  12. 固相抽出がタウを吸着する逆相吸着剤を含む、請求項６～１１の何れかの方法。
  13. ＭＴＢＲタウを富化する方法が工程(ｂ)(ｉ)を含み、ここで、タンパク質沈殿が生物学的サンプルのタンパク質を沈殿させるために酸と混合することを含み、所望により酸が過塩素酸である；および／または
    工程(ｅ)において、液体クロマトグラフィー－マススペクトロメトリーがｎａｎｏ－ＬＣ／ＭＳ系により実施される、
    請求項６～１１の何れかの方法。
  14. 工程(ｂ)および(ｃ)で実施される固相抽出がタウを吸着する逆相吸着剤を含む、請求項１３の方法。
  15. ＭＴＢＲタウを富化する方法が工程(ｂ)(ii)を含み、ここで、ＭＴＢＲタウの親和性精製が工程(ａ)の生成物と工程(ａ)のエピトープに対してＣ末端であるエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤を含む；および／または
    工程(ｅ)において、液体クロマトグラフィー－マススペクトロメトリーがｎａｎｏ－ＬＣ／ＭＳ系により実施される、
    請求項８～１１の何れかの方法。
  16. 工程(ｂ)のエピトープ結合剤がエピトープ
    タウ４４１のアミノ酸２２１～４４１(両端を含む)内または
    タウ４４１のアミノ酸２３５～４４１(両端を含む)内または
    タウ４４１のアミノ酸２３５～３６８(両端を含む)内または
    タウ４４１のアミノ酸２４４～３６８(両端を含む)内または
    タウ４４１のアミノ酸２４４～２９９(両端を含む)内
    に特異的に結合する、請求項１５の方法。
  17. エピトープ結合剤が７７Ｇ７、ＲＤ３、ＲＤ４、ＵＣＢ０１０７、ＰＴ７６、Ｅ２８１４および７Ｇ６からなる群から選択される抗体である、請求項１６の方法。
  18. 工程(ｃ)で実施する固相抽出がタウを吸着する逆相吸着剤を含む、請求項１５、１６または１７の方法。
  19. プロテアーゼがトリプシンである、請求項１～５の何れかの方法。
  20. 工程(ｄ)がタウのタンパク分解ペプチドの少なくとも１種を検出しかつ量を測定することを含み、ここで、タウのタンパク分解ペプチドが配列番号２、配列番号４、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号９から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１９の方法。
  21. 工程(ｄ)が少なくとも２個のタウのタンパク分解ペプチドを検出しかつ量を測定することを含み、ここで、２個のタウのタンパク分解ペプチドが配列番号２、配列番号４、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８および配列番号９から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１９の方法。
  22. 少なくとも２個のタウのタンパク分解ペプチドが配列番号６および配列番号７、配列番号６および配列番号８、配列番号３および配列番号６、配列番号３および配列番号７、配列番号３および配列番号８、配列番号２および配列番号７、配列番号２および配列番号８、配列番号４および配列番号７、配列番号４および配列番号８、配列番号５および配列番号７、配列番号５および配列番号８、配列番号２および配列番号６、配列番号４および配列番号６、配列番号５および配列番号６、または配列番号９および配列番号５のアミノ酸配列を有する、請求項２１の方法。
  23. プロテアーゼがトリプシンである、請求項６～１１の何れかの方法。
  24. 工程(ｄ)がＭＴＢＲタウの少なくとも１個のタンパク分解ペプチドを検出しかつ濃度を測定することを含み、ここで、タウのタンパク分解ペプチドが配列番号２、配列番号４、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８および配列番号９から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項２３の方法。
  25. 工程(ｄ)がＭＴＢＲタウの少なくとも２個のタンパク分解ペプチドを検出しかつ濃度を測定することを含み、ここで、２個のタウのタンパク分解ペプチドが配列番号２、配列番号４、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８および配列番号９から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項２３の方法。
  26. ＭＴＢＲタウの少なくとも２個のタンパク分解ペプチドが配列番号６および配列番号７、配列番号６および配列番号８、配列番号３および配列番号６、配列番号３および配列番号７、配列番号３および配列番号８、配列番号２および配列番号７、配列番号２および配列番号８、配列番号４および配列番号７、配列番号４および配列番号８、配列番号５および配列番号７、配列番号５および配列番号８、配列番号２および配列番号６、配列番号４および配列番号６、配列番号５および配列番号６、または配列番号９および配列番号５のアミノ酸配列を有する、請求項２５の方法。
  27. プロテアーゼがトリプシンである、請求項１２の方法。
  28. プロテアーゼがトリプシンである、請求項１３の方法。
  29. プロテアーゼがトリプシンである、請求項１５の方法。
  30. 工程(ｄ)がＭＴＢＲタウの少なくとも１個のタンパク分解ペプチドを検出しかつ濃度を測定することを含み、ここで、タウのタンパク分解ペプチドが配列番号２、配列番号４、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８および配列番号９から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項２７、２８または２９の何れかの方法。
  31. 工程(ｄ)がＭＴＢＲタウの少なくとも２個のタンパク分解ペプチドを検出しかつ濃度を測定することを含み、ここで、タウのタンパク分解ペプチドが配列番号２、配列番号４、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８および配列番号９から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項２７、２８または２９の何れかの方法。
  32. ＭＴＢＲタウの少なくとも２個のタンパク分解ペプチドが配列番号６および配列番号７、配列番号６および配列番号８、配列番号３および配列番号７、配列番号３および配列番号８、配列番号２および配列番号７、配列番号２および配列番号８、配列番号４および配列番号７、配列番号４および配列番号８、配列番号５および配列番号７、配列番号５および配列番号８、配列番号２および配列番号６、配列番号４および配列番号６、配列番号５および配列番号６ならびに配列番号９および配列番号５のアミノ酸配列を有する、請求項３１の方法。
  33. 方法がさらに工程(ａ)において生物学的サンプルから除去したＮ末端タウ、中間ドメインタウまたはアミロイドベータを検出しかつ濃度を測定することを含む、請求項６～３２の何れかの方法。
  34. 対象におけるアルツハイマー病(ＡＤ)関連病理因子を測定する方法であって、
    対象から得た、中間ドメインタウが枯渇され、ＭＴＢＲタウが富化された処理ＣＳＦまたは血液サンプルを準備し；そして
    該処理サンプルにおいて、配列番号３のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号６のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号７のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号８のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種またはこれらの組み合わせを定量することを含み、ここで、定量したＭＴＲＢタウ種の量またはそれらの比率が対象の脳におけるＡＤ関連病理を表すものである、
    方法。
  35. 対象におけるアルツハイマー病(ＡＤ)関連病理因子を測定する方法であって、請求項６～１８の何れかの方法によりＣＳＦまたは血液サンプルにおけるタウを測定することを含み、
    ここで、測定するタウが配列番号３のアミノ配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号６のアミノ配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号７のアミノ配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号８のアミノ配列を含むＭＴＢＲタウ種またはこれらの組み合わせであり、ここで、測定されたＭＴＲＢタウ種の量またはそれらの比率が対象の脳におけるＡＤ関連病理状態を表すものである、
    方法。
  36. ＡＤ関連病理状態が対象の脳におけるタウ沈着である、請求項３４または３５の方法。
  37. ＡＤ関連病理状態が対象の脳または脳動脈におけるアミロイドベータ沈着である、請求項３４または３５の方法。
  38. 対象の脳におけるアルツハイマー病(ＡＤ)関連タウ沈着を測定する方法であって、
    中間ドメインタウが枯渇され、ＭＴＢＲタウが富化された処理ＣＳＦまたは血液サンプルを準備し；そして
    処理サンプルにおいて、処理ＣＳＦまたは血液サンプルにおける配列番号３のアミノ配列(LQTAPVPMPDLK)を含むＭＴＢＲタウ種を定量することを含み、ここで、定量したＭＴＲＢタウ種の量が対象の脳におけるＡＤ関連タウ沈着を表すものである、方法を含む、
    方法。
  39. 対象の脳におけるアルツハイマー病(ＡＤ)関連タウ沈着を測定する方法であって、請求項６～１８の何れかの方法によりＣＳＦまたは血液サンプルにおけるタウを測定することを含み、
    ここで、測定するタウが配列番号３のアミノ配列(LQTAPVPMPDLK)を含むＭＴＢＲタウ種であり、ここで、測定されたＭＴＲＢタウ種の量が対象の脳におけるＡＤ関連病理を表すものである、
    方法。
  40. 対象の脳におけるアルツハイマー病(ＡＤ)関連タウ沈着を測定する方法であって、
    対象から得た、中間ドメインタウが枯渇され、ＭＴＢＲタウが富化された処理ＣＳＦまたは血液サンプルを準備し；そして、処理サンプルにおいて、配列番号３のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号６のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号７のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号８のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種またはこれらの組み合わせを定量することを含み、ここで、定量したＭＴＲＢタウ種の量またはそれらの比率が対象の脳におけるＡＤ関連タウ沈着を表すものである、
    方法。
  41. 対象の脳におけるアルツハイマー病(ＡＤ)関連タウ沈着を測定する方法であって、請求項６～１８の何れかの方法によりＣＳＦまたは血液サンプルにおけるタウを測定することを含み、
    ここで、測定するタウが配列番号３のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号６のアミノ配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号７のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号８のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種またはこれらの組み合わせであり、ここで、測定されたＭＴＲＢタウ種の量またはそれらの比率が対象の脳におけるＡＤ関連病理を表すものである、
    方法。
  42. アルツハイマー病を診断する方法であって、対象から得た、中間ドメインタウが枯渇され、ＭＴＢＲタウが富化された処理ＣＳＦまたは血液サンプルを準備し；そして、処理サンプルにおける配列番号３のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号６のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号７のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号８のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種またはこれらの組み合わせを定量し；そして
    定量したＭＴＢＲタウ種が約１.５σ以上異なるときアルツハイマー病を診断し、ここで、σはＰＥＴ造影および／またはＣＳＦにおけるＡβ４２／４０測定により測定してアミロイド陰性である対照集団で測定した正規分布により規定される標準偏差である、
    方法。
  43. アルツハイマー病を診断する方法であって、請求項６～１８の何れかの方法によりＣＳＦまたは血液サンプルにおけるタウを測定することを含み、ここで、測定するタウが配列番号３のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号６のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号７のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号８のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種またはこれらの組み合わせであり；そして
    定量したＭＴＢＲタウ種が約１.５σ以上異なるときアルツハイマー病を診断し、ここで、σはＰＥＴ造影および／またはＣＳＦにおけるＡβ４２／４０測定により測定してアミロイド陰性である対照集団で測定した正規分布により規定される標準偏差である、
    方法。
  44. 対象におけるアルツハイマー病(ＡＤ)進行を測定する方法であって、
    第一処理ＣＳＦまたは血液サンプルおよび第二処理ＣＳＦまたは血液サンプルを準備し、ここで、各処理サンプルが一対象から得たものであり、各処理サンプルが中間ドメインタウが枯渇され、ＭＴＢＲタウが富化されており；そして、各処理サンプルについて、配列番号３のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号６のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号７のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号８のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種またはこれらの組み合わせを定量し；そして
    第二サンプルおよび第一サンプルにおける定量したＭＴＢＲタウ種の差異を計算し、ここで、第二サンプルにおける定量したＭＴＢＲタウ種の統計的に有意な増加が対象のアルツハイマー病の進行を示すものである、
    方法。
  45. 対象におけるアルツハイマー病(ＡＤ)進行を測定する方法であって、
    請求項６～１８の何れかの方法により第一および第二ＣＳＦまたは血液サンプルにおけるタウを測定し、ここで、測定するタウが配列番号３のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号６のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号７のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号８のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種またはこれらの組み合わせであり；そして
    第二サンプルおよび第一サンプルにおける定量したＭＴＢＲタウ種の差異を計算し、ここで、第二サンプルにおける定量したＭＴＢＲタウ種の統計的に有意な増加が対象のアルツハイマー病の進行を示すものである、
    方法。
  46. 対象がアミロイド陰性である、請求項３８～４５の何れかの方法。
  47. 対象が認知症を有しない、請求項４６の方法。
  48. 対象が認知症を有する、請求項４６の方法。
  49. 対象がアミロイド陽性である、請求項３８～４５の何れかの方法。
  50. 対象が認知症を有しない、請求項４９の方法。
  51. 対象が認知症を有する、請求項４９の方法。
  52. 対象が０.５～１.０のＣＤＲスコアを有する、請求項４６または請求項４９の方法。
  53. 対象が＞１.０～２.０(中程度ＡＤ)のＣＤＲスコアを有する、請求項４６または請求項４９の方法。
  54. 対象が＞２.０のＣＤＲスコアを有する、請求項４６または請求項４９の方法。
  55. 生物学的またはＣＳＦサンプルにおけるアミロイドベータ定量、Ｎ末端タウ定量、中間ドメインタウ定量、タウの翻訳後修飾定量またはＡｐｏＥアイソフォーム同定をさらに含む、請求項３８～５４の何れかの方法。
  56. 対象の脳におけるタウ病理を測定する方法であって、
    対象から得た、中間ドメインタウが枯渇され、ＭＴＢＲタウが富化された処理ＣＳＦまたは血液サンプルを準備し；そして
    処理サンプルにおいて、配列番号２のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号３のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号４のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号５のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号６のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号７のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号８のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号９のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種またはこれらの組み合わせを定量することを含み、ここで、定量したＭＴＲＢタウ種の量またはそれらの比率が対象の脳におけるタウ病理を表すものである、
    方法。
  57. 対象の脳におけるタウ病理因子を測定する方法であって、請求項６～１８の何れかの方法によりＣＳＦまたは血液サンプルにおけるタウを測定することを含み、ここで、測定するタウが配列番号２のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号３のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号４のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号５のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号６のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号７のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号８のアミノ配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号９のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種またはこれらの組み合わせであり、ここで、定量したＭＴＲＢタウ種の量またはそれらの比率が対象の脳におけるタウ病理を表すものである、
    方法。
  58. ４Ｒ－タウオパチーを識別する方法であって、
    対象から得た、中間ドメインタウが枯渇され、ＭＴＢＲタウが富化された処理ＣＳＦまたは血液サンプルを準備し；そして
    処理サンプルにおいて(ａ)配列番号９のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種および(ｂ)配列番号４のアミノ配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号５のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号６のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号７のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種または配列番号８のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種を定量することを含み；
    ここで、(ａ)の定量したＭＴＢＲ種対(ｂ)の定量したＭＴＢＲ種の比が４Ｒ－タウオパチーを識別する、
    方法。
  59. ４Ｒ－タウオパチーを識別する方法であって、請求項６～１７の何れかの方法により生物学的サンプルにおけるタウを測定することを含み、ここで、測定するタウが(ａ)配列番号９のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種および(ｂ)配列番号４のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号５のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号６のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号７のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種または配列番号８のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種であり；
    ここで、(ａ)の定量したＭＴＢＲ種対(ｂ)の定量したＭＴＢＲ種の比が４Ｒ－タウオパチーを識別するものである、
    方法。
  60. ３Ｒ－タウオパチーまたは４Ｒ－タウオパチーとアルツハイマー病を識別する方法であって、
    (ａ)中間ドメインタウが枯渇されているおよび(ｂ)ＭＴＢＲタウが富化されている対象から得た処理ＣＳＦまたは血液サンプルを準備し；そして
    処理サンプルにおいて、(ａ)配列番号２のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号４のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号５のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種またはこれらの組み合わせおよび(ｂ)配列番号６のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号７のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号８のアミノ配列を含むＭＴＢＲタウ種またはこれらの組み合わせを定量し、
    ここで、(ａ)の定量したＭＴＢＲ種対(ｂ)の定量したＭＴＢＲ種の比が３Ｒ－タウオパチーまたは４Ｒ－タウオパチーとアルツハイマー病を識別するものである、
    方法。
  61. ３Ｒ－タウオパチーまたは４Ｒ－タウオパチーとアルツハイマー病を識別する方法であって、請求項６～１８の何れかの方法により生物学的サンプルにおけるタウを測定することを含み、ここで、測定されるタウが(ａ)配列番号２のアミノ配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号４のアミノ配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号５のアミノ配列を含むＭＴＢＲタウ種またはこれらの組み合わせおよび(ｂ)配列番号６のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号７のアミノ配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号８のアミノ配列を含むＭＴＢＲタウ種またはこれらの組み合わせであり、
    ここで、(ａ)の定量したＭＴＢＲ種対(ｂ)の定量したＭＴＢＲ種の比が３Ｒ－タウオパチーまたは４Ｒ－タウオパチーとアルツハイマー病を識別するものである、
    方法。
  62. ４Ｒ－タウオパチーを診断する方法であって、
    請求項６～１８の何れかの方法によりＣＳＦまたは血液サンプルにおけるタウを測定することを含み、ここで、測定するタウが(ａ)配列番号２のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号４のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号５のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種またはこれらの組み合わせおよび(ｂ)配列番号６のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種)、配列番号７のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号８のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種またはこれらの組み合わせであり；そして
    定量したＭＴＢＲタウ種が約１.５σ以上異なるとき４Ｒ－タウオパチーと診断することを含み、ここで、σがタウオパチーの臨床徴候または症状を有さず、ＰＥＴ造影および／またはＣＳＦにおけるＡβ４２／４０測定で測定してアミロイド陰性である対照集団で測定した正規分布により規定される標準偏差であるを含む、
    方法。
  63. 対象が認知症を有しない、請求項５６～６２の何れかの方法。
  64. ４Ｒ－タウオパチーが大脳皮質基底核変性症、前頭側頭葉変性症、前頭側頭骨性認知症または進行性核上性麻痺である、請求項６３の方法。
  65. 対象が認知症を有する、請求項５６～６２の何れかの方法。
  66. ４Ｒ－タウオパチーが大脳皮質基底核変性症、前頭側頭葉変性症、前頭側頭骨性認知症または進行性核上性麻痺である、請求項６５の方法。
  67. 処置を必要とする対象を処置する方法であって、
    (ａ)中間ドメインタウが枯渇されているおよび(ｂ)ＭＴＢＲタウが富化されている対象から得た処理ＣＳＦまたは血液サンプルを準備し；
    処理サンプルにおいて配列番号２のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号３のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号４のアミノ配酸列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号５のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号６のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種)、配列番号７のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号８のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種、配列番号９のアミノ酸配列を含むＭＴＢＲタウ種またはこれらの組み合わせを定量し；そして
    タウ病理を改変するために対象に処置をすることを含み、ここで、対象の処理ＣＳＦまたは血液サンプルは、定量したＭＴＢＲタウ種または定量したＭＴＢＲタウ種の比が約１.５σ以上異なり、ここで、σがタウオパチーの臨床徴候または症状を有さず、ＰＥＴ造影および／またはＣＳＦにおけるＡβ４２／４０測定で測定してアミロイド陰性である対照集団で測定した正規分布により規定される標準偏差であり、ここで、定量したＭＴＲＢタウ種の量またはそれらの比率が対象の脳におけるタウ病理状態を表すものである、
    方法。
  68. 処置が定量したＭＴＢＲ種の量を変えるまたは安定化する、請求項６７の方法。
  69. 処置がコリンエステラーゼ阻害剤、Ｎ－メチルＤ－アスパルテート(ＮＭＤＡ)アンタゴニスト、抗うつ剤、ガンマ－セクレターゼ阻害剤、ベータ－セクレターゼ阻害剤、抗Ａβ抗体、抗タウ抗体、抗ＴＲＥＭ２抗体、ＴＲＥＭ２アゴニスト、幹細胞、栄養補助食品、セロトニン受容体６アンタゴニスト、ｐ３８アルファＭＡＰＫ阻害剤、組み換え顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、受動的免疫療法、活性ワクチン、タウタンパク質凝集阻害剤、血糖管理を改善するための治療、抗炎症剤、ホスホジエステラーゼ９Ａ阻害剤、シグマ－１受容体アゴニスト、キナーゼ阻害剤、ホスファターゼアクティベーター、ホスファターゼ阻害剤、アンギオテンシン受容体ブロッカー、ＣＢ１および／またはＣＢ２エンドカンナビノイド受容体部分アゴニスト、ｂ－２アドレナリン受容体アゴニスト、ニコチンアセチルコリン受容体アゴニスト、５－ＨＴ２Ａ逆アゴニスト、アルファ－２ｃアドレナリン受容体アンタゴニスト、５－ＨＴ１Ａおよび１Ｄ受容体アゴニスト、グルタミニル－ペプチドシクロトランスフェラーゼ阻害剤、ＡＰＰ生成選択的阻害剤、モノアミンオキシダーゼＢ阻害剤、グルタミン酸受容体アンタゴニスト、ＡＭＰＡ受容体アゴニスト、神経増殖因子刺激因子、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ阻害剤、神経栄養剤、ムスカリンＭ１受容体アゴニスト、ＧＡＢＡ受容体モジュレーター、ＰＰＡＲ－ガンマアゴニスト、微小管タンパク質モジュレーター、カルシウムチャネルブロッカー、抗高血圧剤およびスタチンからなる群から選択される、請求項６７または６８の方法。
  70. 処置が抗Ａβ抗体、抗タウ抗体、抗ＴＲＥＭ２抗体、ＴＲＥＭ２アゴニスト、ガンマ－セクレターゼ阻害剤、ベータ－セクレターゼ阻害剤、キナーゼ阻害剤、ホスファターゼアクティベーター、ワクチンおよびタウタンパク質凝集阻害剤からなる群から選択される、請求項６９の方法。
  71. キナーゼ阻害剤が非常に多くのアミノ酸キナーゼ(ＴＡＯＫ)、ＣＤＫ、ＧＳＫ－３ｐ、ＭＡＲＫ、ＣＤＫ５またはＦｙｎの阻害剤である、請求項７０の方法。
  72. ホスファターゼアクティベーターがタンパク質ホスファターゼ２Ａの活性を増加させる、請求項７０の方法。
  73. ワクチンがＣＡＤ１０６またはＡＦ２０５１３である、請求項７０の方法。
  74. タウタンパク質凝集阻害剤がＴＲｘ０２３７または塩化メチルチオニニウムである、請求項７０の方法。
  75. 抗Ａβ抗体がアデュカヌマブである、請求項７０の方法。
JP2022508907A 2019-08-13 2020-08-13 Ｍｔｂｒタウアイソフォームを検出する方法およびその使用 Pending JP2022544514A (ja)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962886165P 2019-08-13 2019-08-13
US62/886,165 2019-08-13
US202062970950P 2020-02-06 2020-02-06
US62/970,950 2020-02-06
US202063044836P 2020-06-26 2020-06-26
US63/044,836 2020-06-26
PCT/US2020/046224 WO2021030615A1 (en) 2019-08-13 2020-08-13 Methods to detect mtbr tau isoforms and use thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2022544514A true JP2022544514A (ja) 2022-10-19

Family

ID=74570452

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2022508907A Pending JP2022544514A (ja) 2019-08-13 2020-08-13 Ｍｔｂｒタウアイソフォームを検出する方法およびその使用

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20220299527A1 (ja)
EP (1) EP4013772A4 (ja)
JP (1) JP2022544514A (ja)
KR (1) KR20220062287A (ja)
CN (1) CN114555631A (ja)
AU (1) AU2020331020A1 (ja)
CA (1) CA3147548A1 (ja)
IL (1) IL290492A (ja)
MX (1) MX2022001817A (ja)
WO (1) WO2021030615A1 (ja)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2603051B (en) 2020-01-30 2023-04-26 Prognomiq Inc Lung biomarkers and methods of use thereof
US20220328134A1 (en) 2021-03-31 2022-10-13 PrognomIQ, Inc. Multi-omic assessment
KR20230163548A (ko) * 2021-03-31 2023-11-30 워싱턴 유니버시티 타우병증의 바이오마커로서의 csf 인산화 타우 및 아밀로이드 베타 프로파일
US12387508B2 (en) 2021-09-10 2025-08-12 PrognomIQ, Inc. Direct classification of raw biomolecule measurement data
WO2023039579A1 (en) * 2021-09-13 2023-03-16 PrognomIQ, Inc. Enhanced detection and quantitation of biomolecules
WO2023220276A1 (en) * 2022-05-11 2023-11-16 Washington University METHODS TO DETECT Aβ PROTEOFORMS AND USE THEREOF
KR20250109226A (ko) * 2022-11-14 2025-07-16 워싱턴 유니버시티 Csf mtbr-타우 검출 방법 및 이의 용도

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015511014A (ja) * 2012-03-13 2015-04-13 ヤンセン アルツハイマー イミュノセラピー アルツハイマー病の診断、予後および監視におけるオリゴマー型Ａβ
US20150253341A1 (en) * 2014-02-10 2015-09-10 Merck Sharp & Dohme Corp. Quantification of tau in biological samples by immunoaffinity enrichment and mass spectrometry
WO2017053739A1 (en) * 2015-09-25 2017-03-30 Steen Judith Methods and compositions for tauopathy diagnosis and treatment
US20170138964A1 (en) * 2014-07-01 2017-05-18 Brigham Young University Systems, Assays, and Methods for Determining Risk Factors for Alzheimer's Disease

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2656442T3 (es) * 2011-09-19 2018-02-27 Axon Neuroscience Se Terapia basada en proteínas y diagnóstico de una patología mediada por tau en la enfermedad de Alzheimer
US20150337030A1 (en) * 2012-05-31 2015-11-26 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods to treat alzheimer's disease using apoe inhibitors
HK1209768A1 (en) * 2012-07-03 2016-04-08 Washington University Antibodies to tau
WO2014011972A1 (en) * 2012-07-13 2014-01-16 Bristol-Myers Squibb Company Tau immunoassay
AU2015325043B2 (en) * 2014-09-30 2021-02-18 Washington University Tau kinetic measurements
MX2017015817A (es) * 2015-07-06 2018-04-10 Ucb Biopharma Sprl Anticuerpos de union a tau.
WO2018148593A1 (en) * 2017-02-10 2018-08-16 C2N Diagnostics, Llc Methods for measuring concentrations of biomolecules in biofluids
SG11202010094TA (en) * 2018-05-03 2020-11-27 Univ Washington Methods of diagnosing and treating based on site-specific tau phosphorylation

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015511014A (ja) * 2012-03-13 2015-04-13 ヤンセン アルツハイマー イミュノセラピー アルツハイマー病の診断、予後および監視におけるオリゴマー型Ａβ
US20150253341A1 (en) * 2014-02-10 2015-09-10 Merck Sharp & Dohme Corp. Quantification of tau in biological samples by immunoaffinity enrichment and mass spectrometry
US20170138964A1 (en) * 2014-07-01 2017-05-18 Brigham Young University Systems, Assays, and Methods for Determining Risk Factors for Alzheimer's Disease
WO2017053739A1 (en) * 2015-09-25 2017-03-30 Steen Judith Methods and compositions for tauopathy diagnosis and treatment

Also Published As

Publication number Publication date
IL290492A (en) 2022-04-01
KR20220062287A (ko) 2022-05-16
EP4013772A4 (en) 2024-06-05
CA3147548A1 (en) 2021-02-18
US20220299527A1 (en) 2022-09-22
WO2021030615A1 (en) 2021-02-18
AU2020331020A1 (en) 2022-03-03
EP4013772A1 (en) 2022-06-22
CN114555631A (zh) 2022-05-27
MX2022001817A (es) 2022-03-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2022544514A (ja) Ｍｔｂｒタウアイソフォームを検出する方法およびその使用
KR102787585B1 (ko) 부위-특이적 타우 인산화에 기반한 진단 및 치료 방법
US11085935B2 (en) Methods of treating based on site-specific tau phosphorylation
JP7668027B2 (ja) 部位特異的タウリン酸化をベースとする診断および処置のための血液ベースアッセイ
US20250147049A1 (en) Methods for detecting csf tau species with stage and progression of alzheimer's disease, and use thereof
US20230280357A1 (en) Csf phosphorylated tau and amyloid beta profiles as biomarkers of tauopathies
KR20250109226A (ko) Csf mtbr-타우 검출 방법 및 이의 용도
CN117355750A (zh) 检测阿尔茨海默病阶段和进展的csf tau物质的方法及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20230519

RD04 Notification of resignation of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424

Effective date: 20240502

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20240806

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20241101

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20241225

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20250205

RD04 Notification of resignation of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424

Effective date: 20250206

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20250603