JP6345655B2 - タウに対する抗体 - Google Patents

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Description

政府の支援
本発明は、米国国立神経疾患・脳卒中研究所によって交付された１Ｒ０１ＮＳ０７１８３５の下で、政府の支援を受けてなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
発明の分野
本発明は、タウに対する抗体およびそれらの使用方法に関する。
発明の背景
微小管結合タンパク質タウの凝集は、アルツハイマー病（ＡＤ）や前頭側頭型認知症を含むいくつかの神経変性障害と関連している。ＡＤでは、病理学的タウ凝集が、おそらくは既存の神経ネットワークに沿って、脳全体に進行性に拡がる。ＡＤは認知症の最も一般的な原因であり、深刻さを増しつつある公衆衛生上の問題である。これは現在、米国において５００万人を苦しめていると推定され、それが２０５０年までに１３００万人に増加すると予想されている。アルツハイマー病は、記憶や認知機能の喪失につながり、最終的には自立できなくなる。これは患者とその家族に大きな人的および経済的犠牲を強いる。ＡＤや、タウの凝集に関連する他の神経変性疾患は、重症度が高く、人口に占める罹患率が増加しつつあることから、より良い処置および検出方法を開発することが急がれている。
カラー図面への言及
本出願ファイルにはカラーで作成された写真が少なくとも１枚は含まれている。カラー写真を含めた本特許出願公報の写しは、請求と必要な手数料の支払いにより、特許庁から提供されるであろう。
Ｎ末端（Ａ）およびＣ末端（Ｂ）ヒトタウ（ｈｔａｕ）のアミノ酸配列である。 ヒトタウ（Ａ）およびマウスタウ（Ｂ）に対するＨＪ８．１のＫＤを示すグラフである。 ヒトタウ（Ａ）およびマウスタウ（Ｂ）に対するＨＪ８．２のＫＤを示すグラフである。 ヒトタウ（Ａ）およびマウスタウ（Ｂ）に対するＨＪ８．３のＫＤを示すグラフである。 ヒトタウ（Ａ）およびマウスタウ（Ｂ）に対するＨＪ８．４のＫＤを示すグラフである。 ヒトタウ（Ａ）およびマウスタウ（Ｂ）に対するＨＪ８．５のＫＤを示すグラフである。 ヒトタウ（Ａ）およびマウスタウ（Ｂ）に対するＨＪ８．７のＫＤを示すグラフである。 ヒトタウ（Ａ）およびマウスタウ（Ｂ）に対するＨＪ８．８のＫＤを示すグラフである。 ヒトタウ（Ａ）およびマウスタウ（Ｂ）に対するＨＪ９．１のＫＤを示すグラフである。 ヒトタウ（Ａ）およびマウスタウ（Ｂ）に対するＨＪ９．２のＫＤを示すグラフである。 ヒトタウ（Ａ）およびマウスタウ（Ｂ）に対するＨＪ９．３のＫＤを示すグラフである。 ヒトタウ（Ａ）およびマウスタウ（Ｂ）に対するＨＪ９．４のＫＤを示すグラフである。 ヒトタウ（Ａ）およびマウスタウ（Ｂ）に対するＨＪ９．５のＫＤを示すグラフである。 野生型マウスおよびＰ３０１Ｓ ｔｇマウスのＩＳＦにおける完全長タウの存在を示す免疫ブロットである。（Ａ）タウＫＯマウス（ＫＯ）、野生型マウス（ＷＴ）およびＰ３０１Ｓ ｔｇマウス（Ｐ３０１Ｓ ｔｇ）からの海馬溶解物を、抗タウ抗体ＢＴ−２または抗アクチン抗体による免疫ブロットで解析した。各ウェルに１３マイクログラムのタンパク質をローディングした。内在性マウスタウに対応する４本のバンドとヒトタウに対応する１本のバンドを、それぞれ白丸および黒丸として示す。Ｐ３０１Ｓ ｔｇ海馬溶解物にはヒトタウの１形態に相当する３９ｋＤａバンドも存在する。これはタウ分解産物に相当するのだろう。野生型マウス（ＷＴ）およびＰ３０１Ｓ ｔｇマウス（Ｐ３０１Ｓ ｔｇ）からのＩＳＦタウを、抗タウモノクローナル抗体ＨＪ９．３（Ｂ）またはＨＪ８．１（Ｃ）で免疫沈降させ、免疫ブロットで解析した。ビオチン化ＢＴ−２抗体でバンドを可視化した。灰色の矢印と黒い矢印は、それぞれ内在性マウスタウおよびヒトタウを示す。 （Ａ）はこの研究で使用した異なる変異体タウコンストラクトの概略図であり、（Ｂ〜Ｄ）は、タウＲＤタンパク質がトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞中で原線維凝集体を形成することを示す画像である。（Ａ）実験計画に応じて、各形態の変異体タウを、シアン蛍光タンパク質もしくは黄色蛍光タンパク質（ＣＦＰもしくはＹＦＰ）またはヘマグルチニン（ＨＡ）タグのいずれかに、カルボキシル末端で融合した。（Ｂ）さまざまな形態のＲＤを一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞からのＳＤＳ不溶物に対して行われた原子間力顕微鏡観察（ＡＦＭ）から、ＲＤ（ΔＫ）−ＨＡおよびＲＤ（ＬＭ）−ＨＡは明白な原線維種を生成することが明らかである。耐凝集性ＲＤ（ＰＰ）−ＨＡでは原線維は検出されなかった。（ｎ＝２）。スケールバー、１μｍ。（Ｃ）さまざまな形態のＲＤ−ＹＦＰおよびＹＦＰのみを一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を、アミロイド特異的色素Ｘ−３４で染色した。共焦点顕微鏡法で可視化された、ＲＤ（ｗｔ）−ＹＦＰ、ＲＤ（ΔＫ）−ＹＦＰおよびＲＤ（ＬＭ）−ＹＦＰが形成する封入体は、Ｘ−３４でも陽性に染色された。ＹＦＰのみまたはＲＤ（ＰＰ）−ＹＦＰを発現させてもＸ−３４陽性細胞は検出されなかった。矢印はＸ−３４で染色された封入体を示す。（ｎ＝３）。（Ｄ）非トランスフェクト細胞（ＮＴ）と、さまざまな形態のＲＤ−ＹＦＰ／ＣＦＰをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞に、Ｔｒｉｔｏｎ／ＳＤＳ抽出と、ＲＤ領域に対する抗体を使ったウェスタンブロッティングとを行なった。単量体と高次分子量種がどちらも検出された（Ｓ＝可溶性タンパク質、Ｐ＝ペレット不溶性タンパク質）。これを３回繰り返したが、同一の結果が得られた。 ＨＥＫ２９３細胞中のタウＲＤ凝集体が、ＦＲＥＴによって検出されることを示している。蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によって細胞内のＲＤタンパク質凝集を定量するために、ＹＦＰおよびＣＦＰに融合されたさまざまなＲＤ変異体（ｗｔ、ΔＫ、ＰＰ、ＬＭ）をＨＥＫ２９３細胞にコトランスフェクトした。（Ａ）ＲＤ（ＬＭ）−ＣＦＰ／ＹＦＰをコトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を、ＦＲＥＴアクセプターフォトブリーチング顕微鏡法を使って撮像し、細胞内凝集体形成を定量した。アクセプターフォトブリーチングの前（Ｐｒｅ）および後（Ｐｏｓｔ）のドナーシグナルにより、ＲＤ（ＬＭ）−ＣＦＰ／ＹＦＰ封入体は１８．２％±０．０５８ＳＤ（ｎ＝６）の平均ＦＲＥＴ効率をもたらすことが確認された。上側の図と下側の図は、それぞれ、フォトブリーチング前後のアクセプターチャネルとドナーチャネルを表している。右上の画像は、計算ＦＲＥＴ効率の代表的ヒートマップである。ヒストグラムのスケールバーは、ピクセルごとの計算ＦＲＥＴ効率を表す。タウＲＤ凝集体のＦＲＥＴ効率はこの細胞では〜３４％であった。（Ｂ）ＦＰＲを使って、さまざまなコンストラクトからの相対的ＦＲＥＴを決定した。ＲＤ（ＰＰ）−ＣＦＰ／ＹＦＰからの有意なＦＲＥＴは観察されなかった。しかしＲＤ（ΔＫ）−ＣＦＰ／ＹＦＰとＲＤ（ＬＭ）−ＣＦＰ／ＹＦＰはそれぞれ強いＦＲＥＴシグナルをもたらした（ｎ＝３）。（Ｃ）ＲＤ（ΔＫ）−ＣＦＰ／ＹＦＰを発現するＨＥＫ２９３細胞を、さまざまな濃度のＲＤ（ｗｔ）−ＨＡ原線維（単量体換算で０．０１、０．０３、０．１および０．３μＭ）に９時間ばく露した。細胞外ＲＤ（ｗｔ）−ＨＡ原線維は、ＲＤ（ΔＫ）−ＣＦＰ／ＹＦＰの凝集を用量依存的に誘導した（ｎ＝３）。（＊はｐ値＜０．０５を示し、＊＊はｐ値＜０．００１を示し、エラーバーはＳＥＭを表す）。 タウ−ＲＤ凝集体が細胞間で伝達され、さらなる凝集を誘導することを示す画像およびグラフである。（Ａ）ＲＤ（ΔＫ）−ＹＦＰをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を、同数のＲＤ（ＬＭ）−ＨＡ発現細胞と共に、４８時間にわたって共培養した。細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、免疫蛍光／Ｘ−３４染色を行なった。複数の細胞が、封入体内でのＲＤ（ＬＭ）−ＨＡとＲＤ（ΔＫ）−ＹＦＰの共局在を示した。これらの封入体はＸ−３４でも陽性に染色され、これによりベータシート構造が示された（塗りつぶされた矢印）。加えて、一部のＲＤ（ＬＭ）−ＨＡ封入体はＸ−３４で陽性に染色されたが、ＲＤ（ΔＫ）−ＹＦＰ封入体とは共局在しなかった（中空の矢印）。（Ｂ）一方がＲＤ（ΔＫ）−ＣＦＰ／ＹＦＰを発現し、他方がＲＤ（ＬＭ）−ＨＡを発現する、２つの細胞集団を、４８時間にわたって共培養した。ＲＤ（ＰＰ）−ＨＡまたは非トランスフェクト細胞（ＮＴ）を対照として使用した。ＦＲＥＴは、ＲＤ（ＬＭ）−ＨＡとの共培養では増加したが、ＲＤ（ＰＰ）−ＨＡまたはモックトランスフェクト細胞との共培養では増加しなかった（ｎ＝３）。（Ｃ）タウ放出の機序としてタウ凝集体が誘導する細胞死について調べるために、ＨＥＫ２９３細胞にＲＤ−ＨＡ（ＰＰ、ΔＫ、またはＬＭ）を４８時間トランスフェクトするか、またはモックトランスフェクションを行なった。細胞死を誘導するために、モックトランスフェクト細胞を、３７℃において、さまざまな濃度のスタウロスポリン（１、２、４、２０μＭ）で３０分間処理した。次に、細胞を５μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムにばく露し、プレートリーダーで蛍光を決定した。さまざまなトランスフェクト集団において細胞死の証拠は観察されなかった（＊＊はｐ値＜０．００１を示し、エラーバーはＳＥＭを表す）。 ＲＤ凝集体が細胞間でミスフォールディングを伝播することを示す画像およびグラフである。ＨＥＫ２９３細胞にさまざまなＲＤ−ＣＦＰおよびＲＤ−ＨＡコンストラクトをコトランスフェクトした。１５時間後に、これらの細胞を、ＲＤ（ΔＫ）−ＹＦＰまたはＲＤ（ＰＰ）−ＹＦＰを発現する細胞と共に、４８時間にわたって共培養した。（Ａ）直接タンパク質接触によって共凝集が起こるかどうかを決定するために、ＦＲＥＴ顕微鏡観察を行なった。ＹＦＰのフォトブリーチングの前および後にＣＦＰシグナルを測定した。ＲＤ（ＬＭ）−ＣＦＰおよびＲＤ（ＬＭ）−ＹＦＰ凝集体は１４．２％±０．０５３ＳＤ（ｎ＝１１）の平均ＦＲＥＴ効率を有したことから、ＲＤ（ＬＭ）−ＣＦＰとＲＤ（ＬＭ）−ＹＦＰの直接的な接触が示された。上側の図と下側の図は、それぞれ、フォトブリーチング前（Ｐｒｅ）および後（Ｐｏｓｔ）のアクセプターチャネルとドナーチャネルを表している。計算ＦＲＥＴ効率の代表的ヒートマップを右上に示す。ヒストグラムはピクセルごとの計算ＦＲＥＴ効率を表す。タウＲＤ凝集体のＦＲＥＴ効率はこの細胞では約２５％であった。負の値は対を形成していないＣＦＰに由来する。（Ｂ）ＲＤ（ΔＫ）−ＣＦＰ／ＲＤ−ＨＡ発現細胞をＲＤ（ΔＫ）−ＹＦＰ発現細胞と共培養したところ、ＦＲＥＴシグナルが観察された。易凝集型タウであるΔＫ変異体またはＬＭ変異体のどちらかの共発現によってＲＤ（ΔＫ）−ＣＦＰの凝集を誘導すると、このシグナルは増加した。ＲＤ−ＣＦＰまたはＲＤ−ＹＦＰのどちらかがβシート形成を阻止するＰＰ変異を含有する場合は有意なシグナルは認められなかった（ｎ＝３）。（Ｃ）ミスフォールディングの増幅を調べるために、ＣＦＰのみまたはＲＤ（ＬＭ）−ＣＦＰを発現する細胞の集団を、ＰＰ、ΔＫ、ＬＭ変異のいずれかを伴うＲＤ−ＨＡを発現する細胞に４８時間にわたって事前ばく露することにより、ミスフォールディングをさまざまな程度に促進した。次に、これらの共培養集団を分割し、４８時間にわたってＲＤ（ΔＫ）−ＹＦＰ発現細胞と共培養することで、細胞間伝達およびＦＲＥＴによってレポートされる凝集の程度を決定した。ＲＤ（ΔＫ）−ＣＦＰ細胞集団へのＲＤ（ＬＭ）−ＨＡ細胞の事前ばく露は、ＲＤ（ＰＰ）−ＨＡへの事前ばく露と比較して、ＦＲＥＴシグナルを２．６倍増加させた。純粋なＣＦＰを発現する細胞を第２細胞集団に介在させると、易凝集性ＲＤ−ＨＡ変異体への事前ばく露の効果は完全に阻止された（ｎ＝３）。（＊はｐ値＜０．０５を示し、＊＊はｐ値＜０．００１を示し、エラーバーはＳＥＭを表す）。 細胞外媒質を介したタウ凝集体の伝播を示すグラフおよび免疫ブロットである。（Ａ）ＲＤ（ＬＭ）−ＨＡをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を同数のＲＤ（ΔＫ）−ＣＦＰ／ＹＦＰ細胞と４８時間にわたって共培養してからＦＲＥＴ解析を行なった。細胞培養培地の体積を増加させると、凝集体の経細胞移動（ｔｒａｎｓ−ｃｅｌｌｕｌａｒ ｍｏｖｅｍｅｎｔ）の効率が低下した。（Ｂ）ＲＤ（ＬＭ）−ＨＡを発現する細胞からＲＤ（ΔＫ）−ＣＦＰ／ＹＦＰを発現する細胞へと条件培地を移すだけで、凝集が６０％誘導された。（Ｃ）培地に加えたＨＪ９．３抗体はＦＲＥＴを低減し、凝集の伝播の妨害と合致した。（Ｄ）非特異的ＩｇＧは伝播に影響しなかった。（Ｅ）ＨＪ９．３は同じ細胞内で共発現したＲＤ（ΔＫ）−ＣＦＰ／ＹＦＰの細胞内凝集には影響しなかった。（Ｆ）界面活性剤分画およびウェスタンブロットで決定したところ、ＨＪ９．３は、共培養細胞中でＲＤ（ΔＫ）−ＹＦＰを誘導するＲＤ（ＬＭ）−ＨＡの効果を阻止した（Ｔ＝全タンパク質、Ｓ＝可溶性タンパク質、およびＰ＝ペレット不溶性タンパク質）、（Ｇ）３つの独立したウェスタンブロットの定量的解析により、ＨＪ９．３へのばく露後に、全画分との比較で、ペレット画分の〜６０％の減少が明らかになった。（Ｈ）ＲＤ（ＬＭ）−ＹＦＰとｍＣｈｅｒｒｙを発現する細胞を共培養し、フローサイトメトリーで解析した。ＨＪ９．３は二重陽性細胞のパーセンテージを２．０７％から１．３１％に減少させた。サイトメトリーの直前に混合した細胞をバックグランド対照とした（＊はｐ値＜０．０５を示し、＊＊はｐ値＜０．００１を示し、エラーバーはＳＥＭを表す）。 ＲＤ（ΔＫ）-ＹＦＰをトランスフェクトするか（上側の図）、またはモックトランスフェクトした（下側の図）、ＨＥＫ２９３細胞の画像である。ＨＪ９．３を４８時間にわたって培養培地に加えた。実験終了時に細胞を固定し、透過処理し、抗マウス二次抗体（Ａｌｅｘａ５４６で標識）で染色した。共焦点顕微鏡法を使って、ＨＪ９．３／タウ複合体の局在を解析した。上側の図は、ＲＤΔ（Ｋ）−ＹＦＰを発現させると多くの複合体が同定されるが、それが存在しない場合は複合体が同定されない（下側の図）ことを示している。直交解析（右側の図）により、偶発的な細胞内複合体が観察されることはあったものの、大半の複合体は細胞表面に存在することが証明される。 タウ原線維が細胞間伝播を媒介することを示す画像とグラフである。（Ａ）ＨＪ９．３または対照ＩｇＧ抗体（１：１０００）と共に０時間または４８時間にわたって共培養したトランスフェクト細胞集団から条件培地を収集し、次に免疫沈降およびウェスタンブロットを行なった。ＨＪ９．３は細胞培地からタウＲＤ種を特異的に捕捉したが、ＩｇＧはそうではなかった。ＲＤ（ΔＫ）−ＹＦＰまたはＲＤ（ＬＭ）−ＹＦＰが発現する場合は高次凝集種が存在したが、ＲＤ（ＰＰ）−ＹＦＰが発現してもそうはならなかった。（Ｂ）３つの独立したウェスタンブロットの定量的解析により、４８時間のインキュベーション後にタウは〜１０倍増加することが示された。（Ｃ）細胞をさまざまな時間、ＨＪ９．３に暴露した。（Ｄ）４８時間にわたってＨＪ９．３にばく露した培地から精製した抗体／抗原複合体を、撮像のためにＡＦＭチップに沈着させた。ＲＤ（ΔＫ）−ＨＡおよびＲＤ（ＬＭ）−ＨＡを発現する細胞の培地には明白な原線維種が観察されたが、ＲＤ（ＰＰ）−ＨＡは不定形の凝集体しか生じなかった。スケールバー、１μｍ。 組換えヒトタウに対するＨＪ８．５およびＨＪ９．４の活性を示す概略図とグラフである。（Ａ）異なるモノクローナル完全長タウ抗体の存在下および非存在下でのＲＤ（ＬＭ）−ＣＦＰ細胞とＲＤ（ΔＫ２８０）−ＹＦＰ細胞の共培養を図解する概略図である。（Ｂ）ＨＪ８．５、ＨＪ９．３およびＨＪ９．４がタウの伝播を阻止できることを示すグラフである。（Ｃ）ＨＪ８．５、ＨＪ９．３およびＨＪ９．４が、ＥＬＩＳＡアッセイにおいてＲＤ−タウ原線維を検出できることを示すグラフである。 各マウスの（Ａ）脳室内注射および（Ｂ）側脳室への浸透圧ポンプの埋め込みに関する実験計画を図解する概略図である。（Ｃ）はクレシルバイオレット染色によってカニューレの配置を検証する画像を示す。 ６週間の注入の前後にポンプから採取した抗体を使った、（Ａ）クーマシーブルー染色および（Ｂ）組換え最長ヒトタウアイソフォームｈＴａｕ４０に対する免疫ブロッティングによる、Ｐ３０１Ｓ ｔｇマウスへの６週間の注入後の抗タウ抗体の画像である。 全タウに関するＨＪ８．７−ＢＴ２Ｂ ＥＬＩＳＡにおいて、注入されたタウ抗体の妨害がないことを示すグラフである。表示した濃度の抗体を、ＥＬＩＳＡに適用する前に、組換えヒトタウタンパク質と共にプレインキュベートした。 媒体／ＰＢＳ（上側の図）または異なる抗タウモノクローナル抗体（下側の図に記すとおりＨＪ８．５、ＨＪ９．３）で処置された処置済９ヶ月齢Ｐ３０１Ｓ ｔｇマウスの梨状皮質の冠状切片の画像である。異常リン酸化型のタウを認識するビオチン化ＡＴ８抗体で切片を染色した。 （Ａ）海馬ＣＡ２およびＣＡ３、（Ｂ）扁桃体、（Ｃ）梨状皮質、および（Ｄ）嗅内皮質における神経原線維変化のＡＴ８染色によって覆われる面積のパーセントを示すグラフである。 ＥＬＩＳＡによるタウ原線維およびＲＤ−タウ単量体のＨＪ９．３抗体検出を示すグラフである。異なる濃度のＲＤ−ｗｔタウ単量体および原線維をＥＬＩＳＡプレートにコーティングした。ＨＪ９．３を一次抗体として使用した。検出には、抗マウスＨＲＰ連結抗体を使用した。 細胞培地内を原線維が伝達されることによって起こるタウ凝集の経細胞伝播（ｔｒａｎｓ−ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）を図解する概略図である。ドナー細胞中のタンパク質凝集体が細胞から漏れ出し（Ａ）、レシピエント細胞に進入し（Ｂ）、ネイティブフォールド（ｎａｔｉｖｅｌｙ ｆｏｌｄｅｄ）タンパク質と直接接触することで（Ｃ）、ミスフォールド状態を増幅する（Ｄ）。この細胞間移動は培地中に直接放出される原線維によって媒介される。これらの原線維は、細胞間伝播を妨害する抗タウ抗体（ＨＪ９．３）により、細胞外間隙内でトラップすることができる（Ｅ）。 表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）および免疫ブロッティングによる抗タウ抗体の特徴づけ。この図は、固定化組換えヒトタウ（最長アイソフォームｈＴａｕ４０、４４１ａａ）および固定化マウスタウ（最長アイソフォームｍＴａｕ４０、４３２ａａ）に対する各抗タウ抗体の結合を示すＳＰＲセンサーグラムである。各抗体をさまざまな濃度（０．１１、０．２３、０．４６、０．９０、１．８、３．７、７．５μｇ／ｍｌ）で流した。プロットは対応する色で示されている。（Ａ）固定化ヒトタウおよび固定化マウスタウ（Ｂ）に結合するＨＪ９．３抗体のＳＰＲセンサーグラム。（Ｃ）固定化ヒトタウおよび固定化マウスタウ（Ｄ）に結合するＨＪ９．４抗体のＳＰＲセンサーグラム。固定化（Ｅ）ヒトおよび（Ｆ）マウスタウに結合するＨＪ８．５抗体のＳＰＲセンサーグラム。（Ｇ）表示した抗タウ抗体を使用することにより、３ヶ月齢タウノックアウト（ＫＯ）、３ヶ月齢野生型（ＷＴ）マウス、３ヶ月齢Ｐ３０１Ｓ（３ｍｏ）マウスおよび９ヶ月齢Ｐ３０１Ｓ（９ｍｏ）マウスのＲＡＢ可溶性画分を免疫ブロットで解析した。 抗タウ抗体と固定化ヒトタウ原線維との間の相互作用のＳＰＲセンサーグラムである。固定化ヒトタウ原線維に対してさまざまな濃度で流したＨＪ９．３（Ａ）、ＨＪ９．４（Ｂ）およびＨＪ８．５（Ｃ）抗タウ抗体のＳＰＲセンサーグラム。 異なるアッセイにおける抗タウ抗体の特徴づけ。３ヶ月齢タウノックアウト（ＫＯ）マウス、３ヶ月齢野生型（ＷＴ）マウス、３ヶ月齢Ｐ３０１Ｓ（３ｍｏ）マウス、１２ヶ月齢Ｐ３０１Ｓ（１２ｍｏ）マウスの梨状皮質の領域からの脳切片、およびアルツハイマー病（ＡＤ）組織の前頭皮質からの脳切片の免疫染色を、ビオチン化ＨＪ８．５抗体による染色で行なった。１２ヶ月齢Ｐ３０１Ｓ顕微鏡像中の挿入図は、びまん性ニューロピル染色に加えて細胞体染色を示している。黒い矢印は拡大された領域を示している。ヒトＡＤ脳皮質顕微鏡像中の挿入図は、神経原線維変化（ＮＦＴ）の染色を高倍率で示している。黒い矢印は拡大された領域を示している。タウＫＯの図におけるスケールバーは２５０μｍであり、各画像の倍率は同じである。Ｐ３０１Ｓ １２ｍｏおよびＡＤの挿入図ではスケールバーは５０μｍである。 タウ抗体は、ＦＲＥＴアッセイによって検出されるＰ３０１Ｓタウ凝集体の取り込みおよびシーディング活性を阻止する。ＲＤ（ΔＫ２８０）−ＣＦＰ／ＹＦＰを発現するＨＥＫ２９３細胞を、１×ＴＢＳ脳溶解物の全タンパク質２．５μｇに、２４時間ばく露した。（Ａ）１２ヶ月齢Ｐ３０１Ｓマウスから収集した脳溶解物（ｎ＝５）は、ノックアウト（ＫＯ）マウス（ｎ＝７）、野生型（ＷＴ）マウス（ｎ＝６）または若い３ヶ月齢Ｐ３０１Ｓマウス（ｎ＝２）からの溶解物と比較して、はるかに高いシーディング活性を誘導した（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。（Ｂ）ＨＥＫ２９３細胞にＲＤ（ΔＫ２８０）−ＣＦＰとＲＤ（ΔＫ２８０）−ＹＦＰをコトランスフェクトした。１８時間後に、抗タウ抗体（ＨＪ８．５、ＨＪ９．３およびＨＪ９．４）または対照抗体（ＨＪ３．４、抗Ａβ抗体）のインキュベーションありまたはなしでプレイキュベートしたＰ３０１Ｓ脳溶解物を、細胞に加えた。Ｐ３０１Ｓ脳溶解物と共にインキュベートしたタウ抗体は全て、シーディング活性を有意に阻止した。統計的有意性は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５．０ソフトウェアを使って、一元配置ＡＮＯＶＡとそれに続くダネットの事後多重比較検定によって決定した（＊＊＊ｐ＞０．００１）。（Ｃ）固定された量のＰ３０１Ｓ脳溶解物を使って、これらの抗体の滴定を、さまざまな濃度（０．１２５μｇ／ｍｌ、０．２５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌおよび２μｇ／ｍｌ）で行なった。２４時間後にＦＲＥＴ解析を行なった。本発明者らが使用した全てのタウ抗体のなかでは、ＨＪ８．５が、Ｐ３０１Ｓ脳溶解物の取り込みおよびシーディング活性を最も強力に阻止した。統計的有意性は、二元配置ＡＮＯＶＡとそれに続くボンフェローニ事後多重比較検定によって決定した（＊＊ｐ＜０．０００１、＊ｐ＜０．０１、値は平均±ＳＥＭを表す）。 Ｐ３０１Ｓタウ凝集体に結合したタウ抗体の細胞取り込みは検出されない。Ｐ３０１Ｓ脳溶解物をＨＥＫ２９３細胞に３時間加えた。タウを検出するために、３つの異なる抗タウ抗体または対照抗体（ＨＪ３．４、Ａβ抗体）を使用し、次に、Ａｌｅｘａ−ｆｌｕｏｒ５４６抗マウスＩｇＧ染色を行なった。加えて、３つの異なる抗タウ抗体およびＨＪ３．４抗体と共に、またはこれらの抗体なしで、Ｐ３０１Ｓ脳溶解物をプレインキュベートしてからＨＥＫ２９３細胞に加え、固定し、透過処理した。内部移行した抗体を同定するために、Ａｌｅｘａ−ｆｌｕｏｒ５４６抗マウスＩｇＧを使用した。核染色には４’，６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ；青色で示される）を使用した。 抗体のＩＣＶ注入の実験概要および異なる処置方法による抗体の効力。（Ａ）脳の左側脳室への脳室内注射による抗体または媒体（ＰＢＳ）の注入に関する実験計画。（Ｂ）左側脳室に外科的に埋め込まれたプローブの配置を検証するための冠状に切片化した脳領域の代表的なクレシルバイオレット染色。本発明者らは、プローブが左側脳室内に正しく配置されていたマウスを、この研究に含めた。 抗タウ抗体はＰ３０１Ｓマウス脳におけるＡＴ８染色を強く減少させる。梨状皮質および扁桃体を含む領域において、ビオチン化ＡＴ８抗体で染色した、ＰＢＳ（Ａ）、ＨＪ３．４抗体（Ｂ）、ＨＪ８．５抗体（Ｃ）、ＨＪ９．３抗体（Ｄ）およびＨＪ９．４抗体（Ｅ）で処置された９ヶ月齢Ｐ３０１Ｓマウスの代表的な冠状切片。スケールバーは２５０μｍである。Ａ〜Ｅの挿入図は、リン酸化タウのビオチン化ＡＴ８抗体染色の高倍率像を示す。スケールバーは５０μｍである。 一定の抗タウ抗体はＰ３０１Ｓマウス脳におけるＡＴ８染色を強く減少させる。９ヶ月齢Ｐ３０１Ｓマウスにおける、抗タウ抗体ＨＪ８．５（Ｎ＝１３）、ＨＪ９．３（Ｎ＝１５）、ＨＪ９．４（Ｎ＝１３）、抗Ａβ抗体ＨＪ３．４（Ｎ＝８）、またはＰＢＳ（Ｎ＝１６）で処置されたマウスの梨状皮質（Ａ）、嗅内皮質（Ｂ）、扁桃体（Ｃ）および海馬ＣＡ１領域（Ｄ）での、異常リン酸化タウのビオチン化ＡＴ８染色によって覆われる面積のパーセント。抗タウ抗体処置マウスでは、ＰＢＳまたはＨＪ３．４抗体処置マウスと比較して、いくつかの異なる脳領域においてＡＴ８染色の低減があった。ＨＪ８．５に最も大きな効果があった。＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５。値は平均±ＳＥＭを表す。 雄および雌Ｐ３０１Ｓマウスにおけるビオチン化ＡＴ８抗体染色の定量。雄（Ａ）および雌Ｐ３０１Ｓマウス（Ｂ）における、抗タウ抗体（ＨＪ８．５、ＨＪ９．３およびＨＪ９．４）、対照抗体（ＨＪ３．４）およびＰＢＳで処置されたマウスの梨状皮質（ＡおよびＥ）、嗅内皮質（ＢおよびＦ）、扁桃体（ＣおよびＧ）ならびに海馬ＣＡ１領域（ＤおよびＨ）での、異常リン酸化タウのビオチン化ＡＴ８染色によって覆われる面積のパーセント。 いくつかの抗タウ抗体はＰ３０１Ｓマウス脳における神経原線維変化のＴｈｉｏＳ染色を強く減少させる。（Ａ）ＰＢＳ、ＨＪ３．４、ＨＪ８．５、ＨＪ９．３およびＨＪ９．４抗体で３ヶ月間処置した９ヶ月齢Ｐ３０１Ｓマウスの梨状皮質における神経原線維変化の代表的ＴｈｉｏＳ染色像。ＨＪ８．５抗体処置マウスでは、ＰＢＳまたはＨＪ３．４抗体処置マウスと比較して、神経原線維変化のＴｈｉｏＳ染色が低減した。スケールバーは１００μｍを表す。（Ｂ）全ての抗タウ抗体処置マウスおよび対照処置マウスにおいて、１（染色なし）から５（最大染色）までのスコアをつけることによる、ＴｈｉｏＳ染色の半定量的評価。ＨＪ８．５抗体処置マウスは、ＰＢＳまたはＨＪ３．４抗体処置マウスと比較して、ＴｈｉｏＳ染色が有意に少なかった。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。 ホスホ−タウ染色と活性化ミクログリア染色との間の相関関係。（Ａ）ＨＪ８．５（Ｎ＝６）、ＨＪ９．３（Ｎ＝６）およびＰＢＳで処置された９ヶ月齢Ｐ３０１Ｓマウス（各群Ｎ＝６）におけるホスホ−タウのビオチン化ＡＴ８染色は、もう一つのホスホ−タウ抗体であるＰＨＦ１染色との強い相関関係を示した。（Ｂ）活性化ミクログリアのＣＤ６８染色とホスホ−タウのビオチン化ＡＴ８染色の間には、すべての群において、強い相関関係が観察された（各群Ｎ＝６）。（Ｃ）代表的な７０％ＦＡ画分試料（Ｎ＝４）の免疫ブロッティングをポリクローナルマウス抗タウ抗体（Ａｂｃａｍ）で解析した。 活性化ミクログリアのＣＤ６８染色。マウスを、Ｐ３０１Ｓマウスにおけるミクログリア活性化について評価した。ＰＢＳ（Ａ）、ＨＪ３．４抗体（Ｂ）、ＨＪ８．５抗体（Ｃ）、ＨＪ９．３抗体（Ｄ）およびＨＪ９．４抗体（Ｅ）で処置された９ヶ月齢Ｐ３０１Ｓマウスの梨状皮質における活性化ミクログリアの代表的ＣＤ６８染色像。 Ｐ３０１Ｓマウスにおいて、不溶性タウのレベルは、抗体ＨＪ８．５およびＨＪ９．３によって低減する。全ての処置マウス［ＰＢＳ（Ｎ＝１６）、ＨＪ３．４抗体（Ｎ＝８） ＨＪ８．５（Ｎ＝１３）、ＨＪ９．３（Ｎ＝１５）、ＨＪ９．４（Ｎ＝１３）］の皮質を、ＲＡＢ（Ａ）、ＲＩＰＡ（Ｂ）および７０％ＦＡ（Ｃ）で逐次的に抽出し、それぞれのタウレベルをＥＬＩＳＡによって定量した。群間でＲＡＢ画分およびＲＩＰＡ画分における可溶性タウレベルに統計的有意差はなかった。しかし、ＨＪ８．５抗タウ抗体およびＨＪ９．３抗タウ抗体で処置されたマウスでは、ＰＢＳまたはＨＪ３．４抗体で処置された群と比較して、７０％ＦＡ画分における不溶性タウのレベルに有意な減少があった。ＨＪ９．４抗体処置マウスにおける不溶性タウのレベルは、対照群と相違しなかった（＊＊ｐ＜０．０１）。７０％ＦＡ画分におけるヒトタウ（Ｄ）、マウスタウ（Ｅ）ならびにＳｅｒ２０２およびＴｈｒ２０５でのホスホタウ（Ｆ）のレベルを、特異的抗ヒト、抗マウス、または抗ホスホタウ抗体により、ＥＬＩＳＡで評価した（各処置群につきｎ＝６匹のマウス）。全ての抗タウ抗体処置マウス群においてヒトタウレベルの減少があり、マウスタウレベルには変化がなかった。７０％ＦＡ画分では、ＡＴ８反応性によって検出されるＳｅｒ２０２およびＴｈｒ２０５でのホスホタウが、全ヒトタウと同様に、抗タウ抗体処置マウスでは、対照と比較して低減していることも、本発明者らは見出した。 抗タウ抗体処置Ｐ３０１Ｓマウスでは、ＦＲＥＴアッセイによって検出される皮質抽出物中のタウシーディング活性が減少している。（Ａ）ＰＢＳ（Ｎ＝１６）、ＨＪ３．４（Ｎ＝８）、ＨＪ８．５（Ｎ＝１３）、ＨＪ９．３（Ｎ＝１５）、およびＨＪ９．４（Ｎ＝１３）処置マウスの全てのＲＡＢ可溶性画分を使って、タウシーディング活性を、ＦＲＥＴアッセイにより、ＨＥＫ２９３細胞で測定した。ＨＥＫ２９３細胞にＲＤ（ΔＫ２８０）−ＣＦＰおよびＲＤ（ΔＫ２８０）−ＹＦＰをコトランスフェクトした。１８時間後に、ＲＡＢ可溶性画分を細胞に加えた。ＨＪ８．５抗体処置マウスおよびＨＪ９．３抗体処置マウスでは、ＰＢＳまたはＨＪ３．４抗体で処置されたマウスと比較して、シーティング活性が有意に低減していた。ＨＪ９．４抗体処置マウスからのＲＡＢ可溶性画分は、ＰＢＳまたはＨＪ３．４抗体ＲＡＢ可溶性画分と比較して、シーディング活性が減少していなかった（＊＊＊ｐ＜０．００１、値は平均±ＳＥＭを表す）。（Ｂ）ＲＡＢ可溶性画分を、タウノックアウト、ＰＢＳ、または抗タウ抗体処置マウスから免疫沈降させた。抗体／ビーズ複合体からのシーディング活性の溶出を、ＦＲＥＴアッセイによって測定した。ＨＪ８．５抗体処置マウスおよびＨＪ９．３抗体処置マウスに観察されるシーディング活性は、ＰＢＳ処置マウスと比較して、有意に少なかった（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、値は平均±ＳＥＭを表す）。（Ｃ）ＥＬＩＳＡで解析した全ての処置群の９ヶ月齢Ｐ３０１Ｓ脳皮質領域の７０％ＦＡ画分は、ＲＡＢ可溶性画分で行なったＦＲＥＴ解析との強い相関関係を示した。（Ｄ）評価した全ての処置マウスの９ヶ月齢Ｐ３０１Ｓ脳皮質のＲＡＢ可溶性画分中に存在するタウレベル（Ｘ軸）とシーディング活性（Ｙ軸）の比較。これら２つの尺度の間に有意な相関関係はなかった。（Ｅ）３ヶ月齢ノックアウト（ＫＯ）マウス、３ヶ月齢野生型（ＷＴ）マウス、３ヶ月齢Ｐ３０１Ｓマウス、および９ヶ月齢ＰＢＳ処置Ｐ３０１ＳマウスのＲＡＢ可溶性画分中のタウ種をＳＤＤ−ＡＧＥで分離してから、ウェスタンブロッティングを行なった。タウ種の検出にはポリクローナルマウス抗タウ抗体を使用した。３ヶ月齢Ｐ３０１Ｓマウスでは高分子量タウ種がＲＡＢ可溶性画分中に存在し、９ヶ月齢Ｐ３０１Ｓマウスではさらに大量に存在する。 群は、自発運動活性、感覚運動機能、または条件恐怖試験の聴覚キューコンポーネントに関して、有意に相違しなかった。ｒｍＡＮＯＶＡの結果は、ホールボード試験における全歩行運動（Ａ）、レッジ（ｌｅｄｇｅ）試験（Ｂ）および他のどの感覚運動尺度（図解なし）についても、または加速ロータロッド（Ｃ）に関して、処置に関わる主効果または交互作用効果を明らかにすることができなかった。条件恐怖試験の３日目における変更文脈（ａｌｔｅｒｅｄ ｃｏｎｔｅｘｔ）ベースラインからのデータは、有意な処置効果を与え（＊ｐ＝０．０２７）、続いて行なった比較により、この効果の大部分はＨＪ９．４マウス群とＰＢＳ＋ＨＪ３．４対照群の間の有意な相違によることが示された（ｐ＝０．０００７）。（Ｄ）しかし、聴覚キューデータ（３分〜１０分）に関するｒｍＡＮＯＶＡ後に、処置の有意な主効果または交互作用効果は見出されず、この期間中に群間でフリージングレベルに有意差はないことが示唆された（Ｅ）。活性レベルが２日目の文脈的恐怖試験中のフリージングに影響を有しえたかどうかを評価するために、本発明者らは、ホールボード試験中に測定された全歩行運動と、文脈的恐怖試験中のフリージング時間％との間のピアソンの相関係数（ｒ）を算出し、これらの間に有意な相関関係はない（ｐ＝０．３９）ことを見出した（Ｆ）。 Ｐ３０１Ｓタウトランスジェニックマウスにおける文脈的恐怖条件づけの欠損は、ＨＪ８．５抗体処置およびＨＪ９．４抗体処置によって回復する。（Ａ）条件恐怖試験の１日目には、２分間のベースライン条件中も、音／ショック（Ｔ／Ｓ）トレーニング中も、これらのデータに関するｒｍＡＮＯＶＡ後に処置に関わる有意な主効果または交互作用効果がないことによって示されるとおり、群間にフリージングレベルの相違は観察されなかった。（Ｂ）対照的に、２日目の文脈的恐怖試験では、有意な処置の効果（＊ｐ＝０．０１９）および有意な処置×分数交互作用（＊＊ｐ＝０．０００１）が、フリージングレベルに関するｒｍＡＶＯＶＡ後に観察された。ＨＪ９．４群だけが、８分目との比較で、１分目からの有意な慣れを示した（＃ｐ＝０．００２）。（Ｃ）続く計画的比較により、ＨＪ８．５タウ抗体群およびＨＪ９．４タウ抗体群におけるフリージングは、８分間のセッション全体を平均すると、ＰＢＳ＋ＨＪ３．４対照群との比較で意に増加していることが示された（それぞれ＊＊ｐ＝０．００６および＊ｐ＝０．０２２）。しかし、データのさらなる解析により、「Ｂ」に図示されるとおり、ＨＪ９．４群とＰＢＳ＋ＨＪ３．４対照との間の最も大きな相違は２分目において生じ（†ｐ＝０．００４）、一方、ＨＪ８．５処置マウスと対照群との間の最も大きな相違は４〜７分目に見出される（††ｐ＜０．００４）ことが示された。 シーディング活性について陽性である血漿試料と、シーディング活性について陰性である血漿試料とを識別するために、サンドイッチタウＥＬＩＳＡアッセイを使用できることを示すグラフである。シーティング活性は、Ｋｆｏｕｒｙ ｅｔ ａｌ ２０１２ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８７（２３）に記載されているように決定した。タウ凝集体の量を、健常若年ヒトから収集した血漿からのシグナル（すなわちアッセイのバックグラウンドシグナル）に対する相対的誘導倍率変化として報告する。 タウ細胞伝播アッセイに対する本発明の抗タウ抗体の効果を示すグラフである。各グラフにおいて、最初のバーは抗体が加えられていない培地を表し、伝播のベースライン効率に相当する。（Ａ）ＨＪ８．１およびＨＪ８．２；（Ｂ）ＨＪ８．３およびＨＪ８．４；（Ｃ）ＨＪ８．５およびＨＪ８．７；（Ｄ）ＨＪ８．８およびＨＪ９．１；（Ｅ）ＨＪ９．２およびＨＪ９．３；（Ｆ）ＨＪ９．４およびＨＪ９．５。 細胞ベースアッセイにおける個々の抗タウ抗体または抗タウ抗体の等モル混合物のタウ伝播に対する効果を示すグラフである。 （Ａ）は、ＲＤ（ΔＫ）−ＣＦＰ／ＹＦＰを同じ細胞内で共発現させた場合に、ＨＪ９．３抗体が細胞内タウ凝集に影響しないことを示すグラフであり、（Ｂ）は、特異的ＩｇＧがタウ凝集の経細胞伝播に影響しないことを示すグラフである。 ＨＪ９．３がフローサイトメトリーによって測定されるタウ凝集体の取り込みを阻害することを示すグラフである。細胞を、蛍光色素で化学的に標識した組換えＲＤ原線維にばく露した。トリプシン処理および分散後に、フローサイトメーターを使って、細胞をカウントした。ＨＪ９．３は、蛍光標識細胞の数を用量依存的に低減したことから、凝集体取り込みの阻害が示された。
詳細な説明
アルツハイマー病と全てのタウオパチーとの間の最低限のつながりは、タウの凝集状態である。これらの罹患状態のいずれにおいても、単量体型タウはポリマー状の規則的原線維に転化することが知られている。原線維性タウ凝集体から構成される神経原線維変化（ＮＦＴ）は、タウオパチーの神経病理学的特徴である。本出願人らは、脳におけるタウ病態の拡がりが「ドナー（ｄｏｎｏｒ）」細胞から放出されて第２の「レシピエント（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）」細胞に進入し、直接的なタンパク質−タンパク質接触を介してレシピエント細胞におけるタウのさらなるミスフォールディングと凝集を誘導する、タウ凝集体の一形態によって引き起こされうることを発見した。この細胞から細胞へのタウ凝集体の拡がりを容易にする特別な形態のタウ凝集体を「タウシード（ｔａｕ ｓｅｅｄ）」と呼び、その活性を本明細書では「シーディング活性」と呼ぶ場合がある。というのも、この形態のタウ凝集体は、それが進入した細胞（すなわち「レシピエント細胞」）におけるタウ凝集の種晶または核になるからである。
タウは、単量体型でも、さまざまな凝集型でも、存在することができる。本明細書において使用する「タウ凝集体」という用語は、２つ以上のタウ単量体を含む分子複合体を指す。理論に束縛されることは望まないが、タウ凝集体はほぼ無制限な数の単離体を一つに結合した状態で含みうる。例えばタウ凝集体は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上のタウ単量体を含みうる。あるいは、タウ凝集体は、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００個またはそれ以上のタウ単量体を含みうる。タウ凝集体は、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００個またはそれ以上のタウ単量体を含むこともできる。「原線維性タウ凝集体」および「タウ原線維」という用語はタウ凝集体の形態を指し、これらの用語は本明細書では互換的に使用される。原線維性タウ凝集体は、タウを含むポリマー状の規則的線維である。タウ原線維は一般的には可溶性でないが、短い集合体またはオリゴマーは可溶であることができる。タウ凝集体は、タウ凝集に際して中間体として作用しうる可溶性タウオリゴマーおよびプロトフィブリルも指す。タウ凝集体の定義には、細胞内部に取り込まれた時またはインビトロで単量体型タウに暴露された時に細胞内タウ凝集の核となるタウ凝集体、または細胞内タウ凝集を「シーディング」する能力を有するタウ凝集体を指す用語である「タウシード」も包含される。タウシーディング活性は本明細書に記載する細胞タウ凝集アッセイにおいて評価することができる。
加えて、本出願人らは、タウに特異的に結合する抗体およびそれらの使用方法も発見した。ある態様において、本発明はタウに特異的に結合する抗体を提供する。もう一つの態様において、本発明は、細胞から細胞へのタウ凝集の伝播を効果的に遅らせかつ／または低減するための手段を提供する。本発明の抗体は、タンパク質原線維の脱凝集を促進すること、細胞内で単量体型タウが凝集したタウに転化するのを阻止すること、タウ凝集体の細胞内分解を促進すること、隣接細胞へのタウ凝集体の進入を妨げること、またはそれらの組み合わせによって、タウ凝集の伝播を遅らせかつ／または低減しうる。もう一つの態様において、本発明は、対象から得た生物学的液体の試料中のタウ凝集体を検出するための手段を提供する。もう一つの態様において、本発明は、対象から得た生物学的液体の試料中のタウ凝集体の量を測定するための手段を提供する。もう一つの態様において、本発明は、対象から得た生物学的液体の試料において測定されたタウ凝集体の量に基づいて対象を分類するための手段を提供する。対象から得た生物学的液体の試料において測定されたタウ凝集体の量に基づく対象の分類は、タウ凝集に関連する症状および／または疾患をその生涯において発生させるであろう対象を同定するために使用しうる。
本発明は、抗タウ抗体が、細胞から放出された細胞外タウに結合し、それによってタウ凝集体が隣接細胞に進入することを防止し、タウ凝集の拡がりを遅らせることにより、原線維性タウ凝集体の伝播を遅らせうるという発見を包含する。一態様において、本発明は、細胞へのタウ凝集体の進入を防止するための手段を提供する。もう一つの態様において、本発明は、細胞内タウ凝集を低減するための手段を提供する。もう一つの態様において、本発明は、タウシーディング活性を減少させるための手段を提供する。隣接細胞へのタウ凝集体の進入を防止するのに有用な本発明の抗体には、タウ内のエピトープに結合するものが含まれる。
Ｉ．タウに結合する抗体
ヒトでは、エクソン２、３、および１０の選択的スプライシングによって生成するタウのアイソフォームが６種類存在する。これらのアイソフォームは３５２アミノ酸から４４１アミノ酸の範囲にある。エクソン２およびエクソン３はそれぞれＮ末端に２９アミノ酸インサートをコードしている（これはＮと呼ばれ、したがってタウアイソフォームは２Ｎ（両インサート）、１Ｎ（エクソン２のみ）、０Ｎ（どちらもなし）になりうる）。どのタウアイソフォームでも、微小管結合ドメインが３回繰り返されている。Ｃ末端にエクソン１０を含めると、エクソン１０によってコードされる４つ目の微小管結合ドメインが含まれることになる。したがってタウアイソフォームは、微小管結合ドメインが４回繰り返されている場合（エクソン１０が含まれている場合）と、微小管結合ドメインが３回繰り返されている場合（エクソン１０が排除されている場合）とがある。本発明の抗タウ抗体は、タウのアイソフォームのいずれかに結合する抗体を含みうる。例示的一実施形態において、本発明の抗タウ抗体は、エクソン１０を含むタウのアイソフォームに結合する抗体を包含しうる。
上述のようにタウは、可溶性コンパートメントおよび不溶性コンパートメントに、単量体の形態および凝集した形態で、規則的な構造または不規則な構造で、細胞内および細胞外に見出すことができ、他のタンパク質または分子との複合体を形成しうる。本発明の抗タウ抗体は、上述した１つまたはそれ以上の形態のタウに結合する抗体を含みうる。いくつかの実施形態では、抗タウ抗体がタウ単量体に結合する。別の実施形態では、抗タウ抗体がタウ凝集体に結合する。さらに別の実施形態では、抗タウ抗体がタウ原線維に結合する。異なる実施形態では、抗タウ抗体がタウ単量体とタウ凝集体に結合する。これに代わる実施形態では、抗タウ抗体がタウ凝集体とタウ原線維に結合する。異なる実施形態では、抗タウ抗体がタウ原線維とタウ単量体に結合する。
ここで有用な抗タウ抗体には、生物学的試料中に存在するタウ凝集体に特異的に結合する抗体も全て含まれる。ここで有用な抗タウ抗体には、細胞から細胞へのタウ凝集の伝播を低減する抗体も全て含まれる。言い換えると、有用な抗体は、レシピエント細胞に進入するタウの量を、本発明の抗体の非存在下でレシピエント細胞に進入するであろう量と比較して、遅らせかつ／または減少させる。したがって有用な抗体は、レシピエント細胞中で起こるタウ凝集の量を減少させる。
一態様において、ここで有用な抗体には、単離され、特徴づけられ、精製された、機能的な抗体であって、生きている対象に投与される機能的治療組成物において使用するために回収（取得）された抗体が含まれる。もう一つの態様において、ここで有用な抗体には、単離され、特徴づけられ、精製された、機能的な抗体であって、生きている対象から得られた生物学的試料中のタウ凝集体を検出し、その対象の生涯にわたるタウ凝集に関連する症状の発生を予測するためのアッセイにおいて使用するために回収（取得）された抗体が含まれる。もう一つの態様において、ここで有用な抗体には、単離され、特徴づけられ、精製された、機能的な抗体であって、生きている対象から得られた生物学的試料中のタウ凝集体を検出し、その対象の生涯にわたってタウ凝集に関連する症状が発生するリスクが増加していると対象を分類するためのアッセイにおいて使用するために回収（取得）された抗体が含まれる。もう一つの態様において、ここで有用な抗体には、単離され、特徴づけられ、精製された、機能的な抗体であって、使用のために回収（取得）された、表Ａに列挙する抗体ならびにその変異型（例えばヒト化型、キメラ型、および免疫学的フラグメント）が含まれる。
表Ａ．本発明の抗体
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用語「抗体」には、用語「モノクローナル抗体」が包含される。「モノクローナル抗体」とは、単一コピーまたは単一クローン、例えば任意の真核生物、原核生物またはファージクローンに由来する抗体を指す。「モノクローナル抗体」はハイブリドーマ技術によって生産された抗体に限定されない。モノクローナル抗体は、例えば当技術分野において周知のハイブリドーマ技法を使って生産することができるだけでなく、組換え技術、ファージディスプレイ技術、合成技術またはそのような技術と当技術分野ではすぐにわかる他の技術との組み合わせを使って生産することもできる。さらにまた、モノクローナル抗体は、当技術分野において知られている方法に従って、検出可能なラベルで標識し、固相に固定化し、かつ／または異種化合物（例えば酵素または毒素）とコンジュゲートすることもできる。
さらに「抗体」は、機能的なモノクローナル抗体、または免疫学的に有効なそのフラグメント、例えばそのＦａｂ、Ｆａｂ’、またはＦ（ａｂ’）２フラグメントも意味する。本明細書ではいくつかの文脈において、強調のために特にフラグメントに言及する場合があるが、それでもなお、フラグメントと明記したかどうかにかかわりなく、「抗体」という用語には、そのようなフラグメントならびに一本鎖型が包含されることは理解されるであろう。タンパク質がその意図するターゲットに特異的に結合する能力を保っている限り、それは「抗体」という用語に包含される。また、例えばこの特異性を伴う一本鎖型の抗体（一般にＦｖ領域と呼ばれるもの）も、「抗体」の定義に包含される。適当な特異性を持つ、典型的にはマウス抗体または他の非ヒト抗体の操作が、それらをヒト化型に転化するために必要になるので、本開示において有用な抗体は好ましくは組換え的に生産されるが、必ずしもそうでなくてもよい。抗体はグリコシル化されていてもグリコシル化されていなくてもよい。抗体は、知られているとおり、ジスルフィド結合により、適正に架橋される。
ここで有用な抗体の基本的抗体ユニットは四量体を含む。各四量体は、２つの同一なポリペプチド鎖ペアから構成され、各ペアは１本の「軽」鎖（約２５ｋＤａ）と１本の「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）とを有する。各鎖のアミノ末端部分は、主として抗原認識を担う約１００〜１１０アミノ酸またはそれ以上の可変領域を含んでいる。各鎖のカルボキシ末端部分は主としてエフェクター機能を担う定常領域を規定している。
ここで有用な抗タウ抗体には、単離され、特徴づけられ、精製され、機能的であって、それらを調製するためのプロセスから回収（取得）されたものであり、それゆえに、ここでの使用に、有用な形態、かつ治療的、医学的、または診断的に十分な量で、利用することができるものが含まれる。
軽鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、およびラムダと分類される。重鎖はガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンと分類され、抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＯ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥと規定する。軽鎖および重鎖内では、可変領域と定常領域が約１２アミノ酸以上の「Ｊ」領域で接合されており、重鎖は約１０アミノ酸以上の「Ｄ」領域も含んでいる。
各軽鎖／重鎖ペアの可変領域は抗体結合部位を形成する。したがって無傷の抗体は２つの結合部位を有する。鎖は、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）が相補性決定領域（以下「ＣＤＲ」という）とも呼ばれる３つの超可変領域によって接合されている同じ一般構造を呈する。２つの鎖からのＣＤＲは、フレームワーク領域によって整列されて、特異的エピトープに結合することが可能になる。Ｎ末端からＣ末端に向かって、軽鎖と重鎖はどちらも、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を、それぞれ含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、既知の慣例に従う（Ｋａｂａｔ「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」米国国立衛生研究所、メリーランド州ベセスダ、１９８７および１９９１；Ｃｈｏｔｈｉａ， ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏ． （１９８７） １９６：９０１−９１７；Ｃｈｏｔｈｉａ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ （１９８９） ３４２：８７８−８８３参照）。
一態様では、哺乳動物を免疫化し、該哺乳動物の抗体産生細胞からハイブリドーマを形成させるか、他の方法でそれらを不死化し、そのハイブリドーマまたは不死化細胞を培養して適当な特異性についてそれらを評価する標準的技法により、適当な特異性を持つモノクローナル抗タウ抗体を生成させる。この場合、そのような抗体は、例えばヒト、ウサギ、ラットまたはマウスを、タウタンパク質コード配列の領域またはその適当な小領域を包含するエピトープに相当するペプチドで免疫化することによって、生成させることができるだろう。組換え操作のための材料は、所望の抗体をコードするヌクレオチド配列を、それを産生するハイブリドーマまたは他の細胞から回収することによって得ることができる。次に、これらのヌクレオチド配列を操作し、単離し、特徴づけ、精製し、回収することで、所望であればここで使用するために、それらをヒト化型で提供することができる。
本明細書にいう「ヒト化抗体」には、非ヒト相補性決定領域（「ＣＤＲ」）を有する抗体の配列を改変することによって一部または全部がヒト抗体生殖細胞系に由来するアミノ酸配列から構成されている抗タウ抗体が含まれる。そのような改変の最も簡単なものは、単にマウス定常領域をヒト抗体の定常領域で置換することで、医薬的使用にとって許容されうる十分に低い免疫原性を有しうるヒト／マウスキメラをもたらすことからなりうる。しかし好ましくは、抗体の可変領域も、さらにはＣＤＲも、現在では当技術分野において周知である技法によってヒト化される。可変領域のフレームワーク領域は、対応するヒトフレームワーク領域で置換され、非ヒトＣＤＲは実質的に無傷のままにしておくか、またはヒトゲノムに由来する配列でさえＣＤＲで置き換えられる。ＣＤＲは、完全ヒト生殖細胞系フレームワーク領域または実質的にヒトであるフレームワーク領域を背景として、タウに対する結合活性およびアフィニティが維持されるか、または強化されるように、ランダムに変異させることもできる。実質的にヒトであるフレームワークは、既知のヒトフレームワーク配列に対して少なくとも９０％、９５％、または９９％の配列同一性を有する。ヒト免疫系と一致するように改変された免疫系を有する遺伝子改変マウスにおいて、十分に有用なヒト抗体を生産することもできる。上述のように、本開示の方法における使用には、一本鎖型に相当するフラグメントなど、抗体の、免疫学的に特異的なフラグメントを使用すれば足りる。
さらに、本明細書において使用する用語「ヒト化抗体」は、ヒトフレームワークと、非ヒト抗体からの少なくとも１つのＣＤＲとを含み、存在する定常領域がいずれもヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一である（すなわち、少なくとも約８５〜９０％、好ましくは少なくとも９５％同一である）ような抗タウ抗体を指す。したがって、ヒト化抗体のパーツは、おそらくＣＤＲを除いて全て、１つまたはそれ以上のネイティブヒト免疫グロブリン配列の対応するペアと、実質的に同一である。
所望であれば、ヒト化免疫グロブリンの設計は、次のように行いうる。アミノ酸が以下のカテゴリーに属する場合は、使用されるヒト免疫グロブリン（アクセプター免疫グロブリン）のフレームワークアミノ酸を、ＣＤＲを提供する非ヒト免疫グロブリン（ドナー免疫グロブリン）からのフレームワークアミノ酸で置き換える：（ａ）アクセプター免疫グロブリンのヒトフレームワーク領域中のアミノ酸が、その位置において、ヒト免疫グロブリンにとって普通ではないのに対して、ドナー免疫グロブリン中の対応するアミノ酸がその位置においてヒト免疫グロブリンにとって典型的である；（ｂ）アミノ酸の位置がＣＤＲの１つのすぐ隣である；または（ｃ）フレームワークアミノ酸のいずれかの側鎖原子が、三次元免疫グロブリンモデルにおいてＣＤＲアミノ酸のいずれかの原子から約５〜６オングストローム（中心間距離）以内にある（Ｑｕｅｅｎ， ｅｔ ａｌ．， 前掲書、およびＣｏ， ｃｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ （１９９１） ８８：２８６９）。アクセプター免疫グロブリンのヒトフレームワーク領域のアミノ酸のそれぞれと、ドナー免疫グロブリン中の対応するアミノ酸が、その位置において、ヒト免疫グロブリンにとって普通ではない場合、そのようなアミノ酸は、その位置においてヒト免疫グロブリンにとって典型的なアミノ酸で置き換えられる。
いずれの場合も、本発明の抗体はタウに特異的に結合する。例示的実施形態では、本発明の抗体がヒトタウに特異的に結合する。本明細書における「特異的に結合する」という文言は、抗体が、０．１ｐＭ〜１０ｎＭの範囲のアフィニティ定数または相互作用のアフィニティ（ＫＤ）（好ましい範囲は０．１ｐＭ〜１ｎＭである）で、タンパク質に結合することを意味する。さまざまな種からのタウの配列が当技術分野では知られており、抗体がタウに結合するかどうかを決定する方法が当技術分野では知られている。例えば実施例を参照されたい。
本発明の抗体は、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）として知られている融合タンパク質として使用することもできる。これらのｓｃＦｖはリンカーによって接続された重鎖可変領域と軽鎖可変領域から構成される。全てではないが、ほとんどの例で、リンカーはペプチドであるだろう。リンカーペプチドは好ましくは約１０〜２５アミノ酸長である。好ましくはリンカーペプチドはグリシンならびにセリンまたはスレオニンに富む。ｓｃＦｖはファージディスプレイを容易にするために使用することができ、フローサイトメトリー、免疫組織化学に使用するか、またはターゲティングドメインとして使用することもできる。ｓｃＦｖの作成および使用方法は、当技術分野では知られている。
好ましい一実施形態では、本発明のｓｃＦｖがヒト定常ドメインにコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、重鎖定常ドメインがＩｇＧドメイン、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４に由来する。別の実施形態では、重鎖定常ドメインがＩｇＡ、ＩｇＭ、またはＩｇＥに由来しうる。
タウに結合する本発明の単離された抗体は、好ましくは、いくつかあるエピトープの１つを認識する。一実施形態では、タウに結合する本発明の単離された抗体が、表Ａに列挙するエピトープを認識する。もう一つの実施形態では、タウに結合する本発明の単離された抗体が、配列番号１（ＤＲＫＤＱＧＧＹＴＭＨＱＤ）のアミノ酸配列内のエピトープを認識する。好ましくは、単離された抗体が、配列番号１の少なくとも３個の連続するアミノ酸内、例えば配列番号１の少なくとも６個の連続するアミノ酸内、配列番号１の少なくとも７個の連続するアミノ酸内、配列番号１の少なくとも８個の連続するアミノ酸内、配列番号１の少なくとも９個の連続するアミノ酸内、配列番号１の少なくとも１０個の連続するアミノ酸内、配列番号１の少なくとも１１個の連続するアミノ酸内、配列番号１の少なくとも１２個の連続するアミノ酸内、および配列番号１の少なくとも１３個の連続するアミノ酸内のエピトープを認識する。例示的一実施形態では、配列番号１内のエピトープを認識する本発明の単離された抗体が、抗体ＨＪ８．５である。もう一つの例示的実施形態では、配列番号１内のエピトープを認識する本発明の単離された抗体が、抗体ＨＪ８．１．１である。
もう一つの実施形態では、タウに結合する本発明の単離された抗体が、配列番号２のアミノ酸配列（ＫＴＤＨＧＡＥ）内のエピトープを認識する。好ましくは、単離された抗体は、配列番号２の少なくとも３個の連続するアミノ酸内、例えば配列番号２の少なくとも４個の連続するアミノ酸内、配列番号２の少なくとも５個の連続するアミノ酸内、配列番号２の少なくとも６個の連続するアミノ酸内、および配列番号２の少なくとも７個の連続するアミノ酸内のエピトープを認識する。例示的一実施形態では、配列番号２内のエピトープを認識する本発明の単離された抗体が、抗体ＨＪ８．１．２である。もう一つの例示的実施形態では、配列番号２内のエピトープを認識する本発明の単離された抗体が、抗体ＨＪ８．４である。
もう一つの実施形態では、タウに結合する本発明の単離された抗体が、配列番号３のアミノ酸配列（ＰＲＨＬＳＮＶ）内のエピトープを認識する。好ましくは、単離された抗体は、配列番号３の少なくとも３個の連続するアミノ酸内、例えば配列番号３の少なくとも４個の連続するアミノ酸内、配列番号３の少なくとも５個の連続するアミノ酸内、配列番号３の少なくとも６個の連続するアミノ酸内、および配列番号３の少なくとも７個の連続するアミノ酸内のエピトープを認識する。例示的一実施形態では、配列番号３内のエピトープを認識する本発明の単離された抗体が、抗体ＨＪ８．２である。もう一つの例示的実施形態では、配列番号３内のエピトープを認識する本発明の単離された抗体が、抗体ＨＪ８．３である。
さらにもう一つの実施形態では、タウに結合する本発明の単離された抗体が、配列番号４のアミノ酸配列（ＥＰＲＱ）内のエピトープを認識する。好ましくは、単離された抗体が、配列番号４の少なくとも３個の連続するアミノ酸内、例えば配列番号４の少なくとも４個の連続するアミノ酸内のエピトープを認識する。例示的一実施形態では、配列番号４内のエピトープを認識する本発明の単離された抗体が、抗体ＨＪ８．８である。
さらにもう一つの実施形態では、タウに結合する本発明の単離された抗体が、配列番号５のアミノ酸配列（ＡＡＧＨＶ）内のエピトープを認識する。好ましくは、単離された抗体は、配列番号５の少なくとも３個の連続するアミノ酸内、例えば配列番号５の少なくとも４個の連続するアミノ酸内、および配列番号５の少なくとも５個の連続するアミノ酸内のエピトープを認識する。例示的一実施形態では、配列番号５内のエピトープを認識する本発明の単離された抗体が、抗体ＨＪ８．７である。
さらにもう一つの実施形態では、タウに結合する本発明の単離された抗体が、配列番号６のアミノ酸配列（ＴＤＨＧＡＥＩＶＹＫＳＰＶＶＳＧ）内のエピトープを認識する。好ましくは、単離された抗体は、配列番号６の少なくとも５個の連続するアミノ酸内、例えば配列番号６の少なくとも６個の連続するアミノ酸内、配列番号６の少なくとも７個の連続するアミノ酸内、配列番号６の少なくとも８個の連続するアミノ酸内、配列番号５の少なくとも９個の連続するアミノ酸内、配列番号６の少なくとも９個の連続するアミノ酸内、配列番号６の少なくとも１０個の連続するアミノ酸内、配列番号６の少なくとも１１個の連続するアミノ酸内、配列番号６の少なくとも１２個の連続するアミノ酸内、配列番号６の少なくとも１３個の連続するアミノ酸内、配列番号６の少なくとも１４個の連続するアミノ酸内、配列番号６の少なくとも１５個の連続するアミノ酸内、および配列番号６の少なくとも１６個の連続するアミノ酸内のエピトープを認識する。例示的一実施形態では、配列番号６内のエピトープを認識する本発明の単離された抗体が、抗体ＨＪ９．１である。
もう一つの実施形態では、タウに結合する本発明の単離された抗体が、配列番号７のアミノ酸配列（ＥＦＥＶＭＥＤ）内のエピトープを認識する。好ましくは、単離された抗体は、配列番号７の少なくとも３個の連続するアミノ酸内、例えば配列番号６の少なくとも４個の連続するアミノ酸内、配列番号７の少なくとも５個の連続するアミノ酸内、配列番号７の少なくとも６個の連続するアミノ酸内、および配列番号７の少なくとも７個の連続するアミノ酸内のエピトープを認識する。例示的一実施形態では、配列番号７内のエピトープを認識する本発明の単離された抗体が、抗体ＨＪ９．２である。例示的一実施形態では、配列番号７内のエピトープを認識する本発明の単離された抗体が、抗体ＨＪ９．４である。例示的一実施形態では、配列番号７内のエピトープを認識する本発明の単離された抗体が、抗体ＨＪ９．５である。
さらにもう一つの実施形態では、タウに結合する本発明の単離された抗体が、配列番号８のアミノ酸配列（ＧＧＫＶＱＩＩＮＫＫ）内のエピトープを認識する。好ましくは、単離された抗体は、配列番号８の少なくとも３個の連続するアミノ酸内、例えば配列番号８の少なくとも４個の連続するアミノ酸内、配列番号８の少なくとも５個の連続するアミノ酸内、配列番号８の少なくとも６個の連続するアミノ酸内、配列番号８の少なくとも７個の連続するアミノ酸内、配列番号８の少なくとも８個の連続するアミノ酸内、配列番号８の少なくとも９個の連続するアミノ酸内、および配列番号８の少なくとも１０個の連続するアミノ酸内のエピトープを認識する。例示的一実施形態では、配列番号８内のエピトープを認識する本発明の単離された抗体が、抗体ＨＪ９．３である。
好ましい抗体は、ＨＪ８．５と呼ばれるハイブリドーマに由来するマウス抗体のヒト化型である。本明細書で使用する「に由来する（ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ）」という用語は、「誘導された（ｄｅｒｉｖｅｄ）」抗体が、ハイブリドーマＨＪ８．５によって生産される抗体からのＣＤＲ領域を少なくとも１つは含むことを意味する。別の言い方をすると、「誘導された抗体」は、配列番号１６、１７、１８、１９、２０および２１からなる群より選択されるアミノ酸配列から構成されるＣＤＲ領域を少なくとも１つは含む。
一実施形態では、本発明の抗体が、ハイブリドーマＨＪ８．５に由来し、配列番号１２の軽鎖可変領域に対して９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の同一性を含む核酸配列によってコードされるか、または配列番号１３の重鎖可変領域に対して９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の同一性を含む核酸配列によってコードされうる。もう一つの実施形態では、本発明の抗体が、ハイブリドーマＨＪ８．５に由来し、配列番号１４の軽鎖可変領域に対して９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または配列番号１５の重鎖可変領域に対して９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含みうる。上述した実施形態のそれぞれにおいて、抗体はヒト化されていてもよい。
タウに結合する本発明の抗体の例示的一実施形態では、抗体が配列番号１２の軽鎖核酸配列と配列番号１３の重鎖核酸配列を含む［すなわち本明細書においてＨＪ８．５と呼ばれるモノクローナル抗体］。タウに結合する本発明の抗体のもう一つの例示的実施形態では、抗体が配列番号１４の軽鎖アミノ酸配列と配列番号１５の重鎖アミノ酸配列を含む［すなわち本明細書においてＨＪ８．５と呼ぶモノクローナル抗体］。
一実施形態では、本発明の抗体が軽鎖ＣＤＲ１を含みうる（例えば表Ｂの抗体１）。もう一つの実施形態では、本発明の抗体が軽鎖ＣＤＲ２を含みうる（例えば表Ｂの抗体４）。さらにもう一つの実施形態では、本発明の抗体が軽鎖ＣＤＲ３を含みうる（例えば表Ｂの抗体６）。これに代わる一実施形態では、本発明の抗体が、２つまたは３つの軽鎖ＣＤＲの組み合わせを含みうる（例えば表Ｂの抗体２、３、および５）。
同様に、一実施形態では、本発明の抗体が重鎖ＣＤＲ１を含みうる（例えば表Ｂの抗体７）。もう一つの実施形態では、本発明の抗体が重鎖ＣＤＲ２を含みうる（例えば表Ｂの抗体１０）。さらにもう一つの実施形態では、本発明の抗体が重鎖ＣＤＲ３を含みうる（例えば表Ｂの抗体１２）。これに代わる一実施形態では、本発明の抗体が２つまたは３つの重鎖ＣＤＲの組み合わせを含みうる（例えば表Ｂの抗体８、９、１１）。
あるいは、本発明の抗体が、１つ以上の軽鎖ＣＤＲと１つ以上の重鎖ＣＤＲを含みうる（例えば表Ｂの抗体１３〜４８）。
表Ｂ
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さまざまな実施形態において、本発明の抗体はヒト化される。例えば一実施形態では、本発明のヒト化抗体が０〜２個のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列・配列番号１６のＣＤＲ１、０〜２個のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列・配列番号１７のＣＤＲ２、および０〜２個のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列・配列番号１８のＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むか、または０〜２個のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列・配列番号１９のＣＤＲ１、０〜２個のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列・配列番号２０のＣＤＲ２、および０〜２個のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列・配列番号２１のＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含みうる。好ましい実施形態では、本発明のヒト化抗体が、０〜２個のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列・配列番号１６のＣＤＲ１、０〜２個のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列・配列番号１７のＣＤＲ２、０〜２個のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列番号１８のＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、０〜２個のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列・配列番号１９のＣＤＲ１、０〜２個のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列・配列番号２０のＣＤＲ２、および０〜２個のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列・配列番号２１のＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む。例示的一実施形態では、本発明のヒト化抗体が、アミノ酸配列・配列番号１６のＣＤＲ１、アミノ酸配列・配列番号１７のＣＤＲ２、アミノ酸配列・配列番号１８のＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、アミノ酸配列・配列番号１９のＣＤＲ１、アミノ酸配列・配列番号２０のＣＤＲ２、およびアミノ酸配列・配列番号２１のＣＤＲ３を含む重鎖可変領域とを含む。本発明は、対応する配列番号１６、１７、１８、１９、２０、および２１の核酸配列も包含し、これらは当業者には容易に決定することができ、本発明の抗体を発現させるために、ベクターまたは他の大きなＤＮＡ分子、例えば染色体に組み込まれていてもよい。
ＩＩ．使用方法
一態様において、本発明は、生きている対象に投与される機能的治療組成物において使用するための抗体を提供する。もう一つの態様において、本発明は、生きている対象から得られた生物学的液体の試料中のタウ凝集体を検出するために、イムノアッセイにおいて使用するための抗体を提供する。もう一つの態様において、本発明は、生きている対象から得られた生物学的液体の試料中のタウ凝集体の量を測定する目的で、イムノアッセイにおいて使用するための抗体を提供する。対象から得た生物学的液体の試料中のタウ凝集体の量は、多量または少量のタウ凝集体を有すると対象を分類するために使用することができ、さらに、対象がその生涯にわたってタウ凝集に関連する症状および／または疾患を発症するリスクを予測するために使用することができる。
適切な対象には、ヒト、家畜、伴侶動物、実験動物、および動物園動物が含まれるが、これらに限るわけではない。一実施形態において、対象はげっ歯類、例えばマウス、ラット、モルモットなどであることができる。もう一つの実施形態において、対象は家畜であることができる。適切な家畜の非限定的な例には、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ラマおよびアルパカを含めることができる。さらにもう一つの実施形態において、対象は伴侶動物であることができる。伴侶動物の非限定的な例には、イヌ、ネコ、ウサギ、および鳥などのペットを含めることができる。さらにもう一つの実施形態において、対象は動物園動物であることができる。本明細書にいう「動物園動物」とは、動物園に見出されうる動物を指す。そのような動物には、非ヒト霊長類、大型のネコ科動物、オオカミ、およびクマを含めることができる。好ましい実施形態では、動物が実験動物である。実験動物の非限定的な例には、げっ歯類、イヌ、ネコ、および非ヒト霊長類を含めることができる。一定の実施形態では、動物がげっ歯類である。げっ歯類の非限定的な例には、マウス、ラット、モルモットなどを含めることができる。動物がマウスである実施形態において、マウスはＣ５７ＢＬ／６マウス、Ｂａｌｂ／ｃマウス、１２９ｓｖ、または他の任意の実験室系統であることができる。例示的一実施形態では対象がＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスである。好ましい実施形態では対象がヒトである。
Ａ．処置方法
一態様において、本発明は、対象の脳におけるタウ凝集の拡がりを低減する方法を含む。もう一つの態様において、本発明は、タウシードによって誘導されるタウの細胞内凝集を低減するための方法を含む。それぞれの態様において、本方法は、対象に薬学的有効量の抗タウ抗体を投与することを含む。適切な抗体は上記Ｉ項で述べた。好ましい一実施形態では、抗体が、表１の抗体および表２の抗体（そのヒト化抗体、キメラ抗体または免疫学的フラグメントを含む）からなる群より選択される。
対象は、薬学的有効量の抗タウ抗体の投与に先立って、タウ凝集に関連する症状を有しても有さなくてもよい。別の言い方をすると、対象はタウ凝集に関連する症状を体験していても体験していなくてもよい。タウ凝集に関連する症状の診断または発症に先立って病理学的タウ凝集がおそらく始まっていることは、当業者には理解されるであろう。いくつかの実施形態では、対象がタウ凝集に関連する症状を有している。別の実施形態では、対象がタウ凝集に関連する症状を有していない。さらに別の実施形態では、対象が検出可能なタウ病態を有するが、タウ凝集に関連する症状を他にはなにも有していない。患者の脳におけるタウ凝集の拡がりを低減することで、タウの病理学的凝集に関連する症状の発生および／または進行が低減されうる。
原線維性タウ凝集体の伝播を防止することで、タウ凝集体の生成および拡がりに関連する病態を処置しうる。本明細書で使用する用語「処置する」または「処置」には、タウ凝集に関連する少なくとも１つの症状またはその症状の徴候の防止、減弱、反転、または改善が含まれる。タウ凝集に関連する症状の一つの定義は、一部がタウ原線維から構成されるタウ凝集体の形成によって引き起こされる任意の症状を指す。タウ凝集に関連する症状を有する例示的障害には、進行性核上性麻痺、ボクサー認知症（慢性外傷性脳症）、１７番染色体に連鎖する前頭側頭型認知症およびパーキンソニズム、リティコ・ボーディグ（Ｌｙｔｉｃｏ−Ｂｏｄｉｇ）病（グアムのパーキンソン−認知症複合病）、神経原線維変化優位型（ｔａｎｇｌｅ−ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ）認知症、神経節膠腫および神経節細胞腫、髄膜血管腫症、亜急性硬化性全脳炎、鉛脳症、結節性硬化症、ハーラーフォルデン・シュパッツ病、リポフスチン沈着症、ピック病、大脳皮質基底核変性症、嗜銀顆粒病（ＡＧＤ）、前頭側頭葉変性症、アルツハイマー病、および前頭側頭型認知症などがあるが、これらに限定されるわけではない。これらの障害を診断するための方法は、当技術分野では知られている。
タウ凝集に関連する症状の典型例として、認知機能障害、行動変化、情動失調、発作、および神経系の構造または機能の障害を挙げることができる。認知機能障害には、記憶、注意、集中、言語、抽象的思考、創造性、実行機能、立案、および組織化に伴う困難などがあるが、これらに限定されるわけではない。行動変化には、身体的または言語的攻撃、衝動性、抑制の減少、無感情、発動性（ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ）の減少、人格の変化、アルコール、タバコまたは薬物の濫用、および他の嗜癖関連行動などがあるが、これらに限定されるわけではない。情動失調には、うつ病、不安、躁病、易怒性、および情動失禁などがあるが、これらに限定されるわけではない。発作には、全般性強直間代発作、複雑部分発作、および非てんかん性心因性発作などがあるが、これらに限定されるわけではない。神経系の構造または機能の障害には、水頭症、パーキンソニズム、睡眠障害、精神病、平衡失調および協調失調などがあるが、これらに限定されるわけではない。これには、不全単麻痺、不全片麻痺、四肢不全麻痺、運動失調、バリズムおよび振戦などの運動障害が含まれる。これには、例えば嗅覚、触覚、味覚、視覚および聴覚を含む感覚消失または感覚機能障害も含まれる。さらにまた、これには、腸および膀胱の機能障害、性機能障害、血圧および体温調節不全などの自律神経系障害も含まれる。最後に、これには、視床下部および下垂体の機能障害、例えば成長ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン、ゴナドトロピン放出ホルモン、プロラクチン、ならびに数多くの他のホルモンおよび調節因子の欠乏および調節不全に帰することができる、ホルモン障害が含まれる。タウ凝集に関連する症状を検出し評価するための方法は、当技術分野では知られている。
いくつかの実施形態では、タウ凝集に関連する症状が、認知症を指す。認知症それ自体は具体的な疾患ではなく、日々の活動を実施する人の能力を低減するほど重篤な、記憶その他の思考技能の低下に関連する幅広い症状を表す包括的用語である。認知症は、タウ凝集に関連する多くの疾患に共通する臨床的特徴でもある。熟練した実務家は認知症の重症度を診断するために利用することができる数多くの方法を熟知しているだろう。例えば、当技術分野では、認知機能検査および認知症に関するスクリーニング質問票がいくつか知られており、いずれも感度と特異度はさまざまである。非限定的な例として、ミニメンタルステート検査（ｍｉｎｉ ｍｅｎｔａｌ ｓｔａｔｅ ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ）（ＭＭＳＥ）、短縮されたメンタルテストの得点（ａｂｂｒｅｖｉａｔｅｄ ｍｅｎｔａｌ ｔｅｓｔ ｍａｙ ｓｃｏｒｅ）（ＡＭＴＳ）、修正ミニメンタルステート検査（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｍｉｎｉ ｍｅｎｔａｌ ｓｔａｔｅ ｅｘａｍ）（３ＭＳ）、認知能力スクリーニングインストルメント（ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ａｂｉｌｉｔｉｅｓ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）（ＣＡＳＩ）、トレイルメイキング検査（Ｔｒａｉｌ−ｍａｋｉｎｇ ｔｅｓｔ）、時計描画検査（ｃｌｏｃｋ ｄｒａｗｉｎｇ ｔｅｓｔ）、高齢者における認知機能低下に関する介護者への質問表（Ｉｎｆｏｒｍａｎｔ Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ ｏｎ ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ｄｅｃｌｉｎｅ ｉｎ ｔｈｅ ｅｌｄｅｒｌｙ）、一般医向け認知機能評価（Ｇｅｎｅｒａｌ ｐｒａｃｔｉｔｉｏｎｅｒ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｃｏｇｎｉｔｉｏｎ）、臨床認知症評価（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｍｅｎｔｉａ Ｒａｔｉｎｇ）（ＣＤＲ）、加齢と認知症を鑑別するための８項目にわたる介護者面談（Ｅｉｇｈｔ−ｉｔｅｍ ｉｎｆｏｒｍａｎｔ ｉｎｔｅｒｖｉｅｗ ｔｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ ａｇｉｎｇ ａｎｄ ｄｅｍｅｎｔｉａ）（ＡＤ８）などが挙げられる。
いくつかの実施形態では、認知症の症状の重症度が、ＣＤＲを使って定量される。ＣＤＲを使用した場合、スコア０は症状がないことを示し、スコア０．５は極めて軽度な症状を示し、スコア１は軽度な症状を示し、スコア２は中等度の症状を示し、スコア３は重度な症状を示す。したがって、対象に関するＣＤＲスコアが増えれば、それは、認知機能の悪化および認知症の増大を示す。また、０から０より高い値へのＣＤＲの変化は、認知症の発生または発症を示す。
いくつかの実施形態では、タウ凝集に関連する症状が、タウ病態を指す。「タウ病態」という用語は、タウの病理学的凝集を指す。いくつかの実施形態では、タウ病態が、神経原線維変化を指す。別の実施形態では、タウ病態が過剰リン酸化タウを指す。さらに別の実施形態では、タウ病態が、疾患を持たない個体に検出されるものより１．２〜約４０倍高い、血液、血漿、血清、ＣＳＦ、またはＩＳＦ中に検出されうる高レベルのタウ凝集体を指す。タウの病理学的凝集を検出するための方法は、当技術分野において知られており、実施例でも詳述する。
例示的一実施形態では、対象の脳におけるタウ凝集の拡がりを低減する方法が、対象に薬学的有効量の抗タウ抗体を投与することを含み、ここでは抗体が、０〜２個のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列・配列番号１６のＣＤＲ１を含む軽鎖可変領域を含む単離された抗体、０〜２個のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列・配列番号１７のＣＤＲ２を含む軽鎖可変領域を含む単離された抗体、０〜２個のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列・配列番号１８のＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む単離された抗体、０〜２個のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列・配列番号１９のＣＤＲ１を含む重鎖可変領域を含む単離された抗体、０〜２個のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列・配列番号２０のＣＤＲ２を含む重鎖可変領域を含む単離された抗体、および０〜２個のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列・配列番号２１のＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む単離された抗体からなる群より選択される。
もう一つの例示的実施形態では、対象の脳におけるタウ凝集の拡がりを低減する方法が、対象に薬学的有効量の抗タウ抗体を投与することを含み、ここでは抗体がタウに特異的に結合し、配列番号１（ＤＲＫＤＱＧＧＹＴＭＨＱＤ）を含むエピトープを認識する。
もう一つの例示的実施形態では、対象の脳におけるタウ凝集の拡がりを低減する方法が、対象に薬学的有効量の抗タウ抗体を投与することを含み、ここでは抗体がタウに特異的に結合し、配列番号１（ＤＲＫＤＱＧＧＹＴＭＨＱＤ）からなるエピトープを認識する。
薬学的有効量の、好ましくは医薬グレードの抗体（免疫学的に反応性のフラグメントを含む）を対象に投与することができる。投与は標準的な効果的技法を使って行われ、これには、末梢投与（すなわち中枢神経系への投与によらない技法）または中枢神経系への局所投与が含まれる。末梢投与には、静脈内、腹腔内、皮下、肺、経皮、筋肉内、鼻腔内、口腔粘膜、舌下、または坐剤投与などがあるが、これらに限定されるわけではない。中枢神経系（ＣＮＳ）への直接的な投与を含む局所投与には、腰椎、脳室内または実質内カテーテルによるもの、または外科的に埋め込まれた放出制御製剤を使用するものなどがあるが、これらに限定されるわけではない。
効果的投与のための医薬組成物は、選択した投与様式に適するように計画的に設計され、医薬上許容される賦形剤、例えば適合する分散剤、緩衝剤、界面活性剤、保存剤、可溶化剤、等張化剤、安定剤などが適宜使用される。引用により本明細書にそのまま組み込まれる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、ペンシルバニア州イーストン、第１６版、ＩＳＢＮ：０−９１２７３４−０４−３、最新版）には、実務者には広く知られているように、製剤技法の大要が記載されている。本開示において有用な抗体の溶解度特徴を改変して、例えばそれらをリポソームに封入することにより、または極性基をブロックすることにより、それらの親油性を高めることは、特に有用でありうる。
静脈内または腹腔内または皮下注射による効果的な末梢全身性送達は、生きている患者への好ましい投与方法である。そのような注射のための適切な媒体は簡単である。しかし、他にも、鼻エアロゾルまたは坐剤を利用することで、粘膜を介して投与を達成することもできる。そのような投与のための適切な製剤はよく知られており、典型的には、膜越しの伝達を容易にする界面活性剤を含む。そのような界面活性剤は、ステロイドまたはカチオン性脂質、例えばＮ−［１−（２，３−ジオレオイル）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、またはコレステロールヘミスクシナート、ホスファチジルグリセロールなどのさまざまな化合物から誘導されることが多い。
投与される製剤中のヒト化抗体の濃度は有効量であり、下は約０．１重量％から上は約１５重量％または約２０重量％までの範囲にわたり、所望であれば選択された特定投与様式に応じて、主に液量、粘度などに基づいて選択されるであろう。生きている患者に注射するための典型的組成物は、１〜５ｍＬのリン酸緩衝食塩水の滅菌緩衝水１〜５ｍＬと、本開示のヒト化抗体のいずれか１つまたはその組み合わせ約１〜５０００ｍｇとを含有するように構成させることができるだろう。製剤は、調剤後に滅菌濾過されるか、または他の方法で、微生物学的に許容されるものにされるだろう。静脈内注入用の典型的組成物は、液体、例えば滅菌リンゲル液の量が１〜２５０ｍＬ、抗タウ抗体濃度が１ｍｌあたり１〜１００ｍｇまたはそれ以上であるだろう。本開示の治療剤は、貯蔵のために凍結または凍結乾燥し、使用前に適切な滅菌担体に再構成することができる。凍結乾燥と再構成は、さまざまな度合いの抗体活性喪失につながりうる（例えば従来型の免疫グロブリンの場合、ＩｇＭ抗体はＩｇＧ抗体より活性喪失が大きくなりがちである）。投与される投薬量は有効な投薬量であり、補償のために調節する必要がありうる。一般に医薬グレードの品質である製剤のｐＨは、抗体の安定性（化学的および物理的）と投与される時の患者にとっての快適さとのバランスをとるように、選択されるであろう。一般的には４〜８のｐＨが認容される。用量は、適切な投与を受ける個体の大きさ、体重、および他の物理生物学的特徴に基いて、個体ごとに変動するだろう。
本明細書において使用する用語「有効量」は、化合物などの物質の量であって、その物質を投与された患者に測定可能で有益な効果、すなわち有意な効力をもたらすものを意味する。本開示に従って投与される化合物の有効量または用量は、例えば投与される化合物、投与経路、処置される症状の状態など、その症例を取り巻く状況に基いて、また同様の患者および投与状況その他を考慮して、決定されるであろう。一態様において、典型的用量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの、本明細書に記載の抗タウ抗体を含有する。用量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、または０．５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの範囲をとることができる。投薬の頻度は、症状が効果的に処置されるように必要に応じて、毎日、または週もしくは月に１回、２回、３回もしくはそれ以上であることができる。あるいは、投薬の頻度は、症状が効果的に処置されるように必要に応じて、３ヶ月に少なくとも１回であってもよい。例えば投薬は、約５週間ごと、約６週間ごと、約７週間ごと、約８週間ごと、約９週間ごと、約１０週間ごと、約１１週間ごと、または約１２週間ごとであってもよい。
疾患そのものに関する処置の施行のタイミングおよび処置の継続期間は、その症例を取り巻く状況によって決まるであろう。処置はタウ凝集に関連する疾患の診断後に開始することができるだろう。あるいは、処置は、タウ凝集に関連する症状の臨床的確認後に開始することができるだろう。さらにまた、処置はタウ病態の検出後に開始することもできるだろう。処置は、病院または診療所で直ちに開始するか、後日、病院からの退院後に開始するか、または外来診療所で受診した後に開始することができるだろう。処置の継続期間は、１回で投与される単回投与から、一生続く治療的処置まで、さまざまでありうる。
前述の方法は、ヒト化抗体などのタンパク質の投与には、最も好都合で、最も適切かつ効果的であると思われるが、適切に適応させることにより、他の効果的な投与技法、例えば脳室内投与、経皮投与および経口投与なども、適正な製剤がここで利用されるのであれば、使用することができる。
加えて、生分解性フィルムおよびマトリックス、または浸透圧ミニポンプ、またはデキストランビーズ、アルギナートもしくはコラーゲンに基づく送達システムを使った放出制御製剤を使用することが望ましい場合もありうる。
典型的投薬量レベルは、標準的な臨床技法を使って決定し、最適化することができ、投与様式に依存するであろう。
Ｂ．生物学的液体中のタウ凝集体を検出する方法
一態様において、本発明は、対象から得た生物学的液体の試料中のタウ凝集体を検出するための手段を提供する。もう一つの態様において本発明は、対象から得た生物学的液体の試料中のタウ凝集体の量を測定するための手段を提供する。本方法は、一般に、（ｉ）対象から生物学的液体の試料を得ること、および（ｉｉ）タウに特異的に結合する抗体を使って、試料中のタウ凝集体の量を測定することを含む。適切な抗体は上記Ｉ項で述べた。適切な対象は上述した。
本明細書において使用する用語「生物学的液体」は、対象から得られる液体を指す。タウ凝集体を含む生物学的液体はいずれも適切である。非限定的な例として、血液、血漿、血清、尿、ＣＳＦおよびＩＳＦが挙げられる。液体は「そのまま」使用してもよいし、標準的技法を使って、細胞コンポーネントを液体から単離してもよいし、タンパク質画分を液体から単離してもよい。
当業者には理解されるであろうが、生物学的液体の試料を収集する方法は、生物学的液体の性質および実行しようとする解析のタイプに応じて変わりうるし、さまざまであるだろう。当技術分野において広く知られているさまざまな方法はいずれも、生物学的液体の試料を収集するために利用することができる。一般論として、本発明に従ってタウ凝集体を正確に検出し、その量を測定することができるように、試料の完全性が保たれる方法であることが好ましい。
試料が得られたら、抗タウ抗体を使ってタウ凝集体を検出し、その量を測定するために、試料をインビトロで加工する。いくつかの実施形態では、検出および測定に先立って、試料中のタウ凝集体の濃度を増加させる。いくつかの実施形態では、検出および測定に先立ち、少なくとも１つの単離された抗タウ抗体を使って、タウ凝集体を試料から免疫沈降させる。別の実施形態では、検出および測定に先立ち、少なくとも２つの単離された抗タウ抗体を使って、タウ凝集体を試料から免疫沈降させる。少なくとも２つの抗体を使ってタウ凝集体を免疫沈降させる実施形態では、好ましくは、第１抗体がタウの第１エピトープに結合し、第２抗体がタウの第２のオーバーラップしていないエピトープに結合する。タウの２つの異なるエピトープに結合する２つの抗体を使用することにより、考えうる全てのタウ凝集体コンフォーマーを捕捉する効率が向上しうる。免疫沈降用の適切な抗体ペアの非限定的な例を表Ｃに列挙する。好ましい一実施形態では、タウ凝集体を、検出および測定に先立ち、少なくとも２つの単離された抗タウ抗体を使って、試料から免疫沈降させ、こでは、少なくとも第１抗体が配列番号１内のエピトープを認識し、少なくとも第２抗体が配列番号８内のエピトープを認識する。当業者は、検出および測定に先立って試料中のタウ凝集体を濃縮または免疫沈降する必要があるかどうかを、日常的な実験で決定することができ、当技術分野で知られている方法を使ってそうすることができるであろう。
表Ｃ
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抗体を使ってタンパク質を検出しその量を測定するための方法は、当技術分野ではよく知られている。抗体を使ってタンパク質を検出しその量を測定するための方法であって、当業者に知られている適切な方法は全て本発明の範囲内で想定される。非限定的な例として、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチイムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、免疫ブロットまたはウェスタンブロット、フローサイトメトリー、免疫組織化学、およびアレイが挙げられる。
一般に、タウ凝集体を検出しその量を測定する抗体ベースの方法は、タウ凝集体を含む試料の一部または全部を、抗体とタウ凝集体の間の複合体の形成を可能にするのに有効な条件下で、抗タウ抗体と接触させることを含む。典型的には、試料全体が必要というわけではないので、当業者は、試料中のタウ凝集体を、ある期間にわたって、繰り返し検出し、その量を測定することができる。この方法は溶解状態で行うことができ、抗体またはタウ凝集体を固体表面に固定化することもできる。適切な表面の非限定的な例として、マイクロタイタープレート、試験管、ビーズ、樹脂、および他のポリマーが挙げられる。当業者には理解されるであろうが、基材への取り付けは、幅広い多様な方法で行うことができる。例えば、基材と抗体とを化学官能基で誘導体化してから、それら２つを結合させてもよい。例えば基材は、限定するわけではないがアミノ基、カルボキシル基、オキソ基またはチオール基などの化学官能基で誘導体化することができる。これらの官能基を使用すれば、それらの官能基を使って直接的に、またはリンカーを使って間接的に、抗体を取り付けることができる。抗タウ抗体を基材に非共有結合的に取り付けてもよい。例えば、ストレプトアビジンで共有結合的にコーティングされた表面に結合して取り付けをもたらしうるビオチン化抗タウ抗体を、調製することができる。あるいは、光重合およびフォトリソグラフィーなどの技法を使って、抗体を表面上に合成することもできる。
複合体を形成させるのに有効な条件下で十分な時間、試料を抗体と接触させる際は、一般に、抗タウ抗体組成物を試料に（または免疫沈降もしくは濃縮したタウ凝集体に）加え、その混合物を、存在する抗原に抗タウ抗体が結合するのに十分な時間、インキュベートする。この時間の後、複合体を洗浄してもよく、次に、当技術分野においてよく知られている任意の方法によって、複合体が検出され、その量が測定される。抗体−ポリペプチド複合体を検出し測定する方法は、一般に、ラベルまたはマーカーの検出に基づく。本明細書において使用する用語「ラベル」は、抗体に取り付けられた任意の物質または他の基質材料であって、ある検出方法によって検出することができるものを指す。適切なラベルの非限定的な例には、発光分子、化学発光分子、蛍光色素、蛍光消光剤、着色分子、放射性同位体、シンチラント、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、プロテインＡ、プロテインＧ、抗体またはそのフラグメント、ポリヒスチジン、Ｎｉ２＋、Ｆｌａｇタグ、ｍｙｃタグ、重金属、および酵素（アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、およびルシフェラーゼなど）がある。ラベルまたはマーカーの検出に基いて抗体−ポリペプチド複合体を検出しその量を測定する方法は、当技術分野ではよく知られている。
好ましい一実施形態では、試料中のタウ凝集体の量を測定するための方法が、２つの捕捉抗体と検出抗体とを含むイムノアッセイであり、ここで、各捕捉抗体は互いに異なるタウエピトープを認識する単離された抗タウ抗体であり、検出抗体は、ラベルに取り付けられた単離抗タウ抗体である。検出抗体は２つの捕捉抗体の一方と同じ抗体であってもよいし、あるいは検出抗体は、どちらの捕捉抗体によっても認識されないタウエピトープを認識してもよい。典型的には、第１捕捉抗体と第２捕捉抗体が、約１０：１〜約１：１０、約５：１〜約１：５、約３：１〜約１：３、または約２：１〜約１：２の量で使用される。いくつかの実施形態では、第１捕捉抗体と第２捕捉抗体が、ほぼ等価な濃度で使用される。適切な捕捉抗体ペアの非限定的な例として、表Ｄおよび表Ｅに開示する抗体が挙げられる。適切な検出抗体の非限定的な例として、表Ａに列挙する抗体、ならびにタウに特異的に結合しかつ配列番号１〜１１からなる群より選択されるアミノ酸配列内のエピトープを認識する抗体が挙げられる。例示的一実施形態では、第１捕捉抗体が、タウに特異的に結合し、配列番号７内のエピトープを認識する単離された抗体であり、第２捕捉抗体が、タウに特異的に結合し、配列番号８内のエピトープを認識する単離された抗体であり、検出抗体が、タウに特異的に結合し、配列番号８内のエピトープを認識する単離された抗体である。
表Ｄ 第１および第２捕捉抗体
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 表Ｅ 第１および第２捕捉抗体：各抗体はタウに特異的に結合し、表示した配列番号によって示されるアミノ酸配列内のエピトープを認識する。
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もう一つの態様において、本発明は、対象から得た生物学的液体の試料において測定されるタウ凝集体の量に基いて対象を分類するための手段を提供する。本方法は一般に（ｉ）対象から生物学的液体の試料を得て、タウに特異的に結合する抗体を使って、試料中のタウ凝集体の量を測定すること、（ｉｉ）試料中のタウ凝集体の量を参照値と比較すること、および（ｉｉｉ）試料中に測定されるタウ凝集体の量に基いて多量または少量のタウ凝集体を有すると対象を分類することを含む。対象から生物学的液体の試料を得て、タウに特異的に結合する抗体を使って、試料中のタウ凝集体の量を測定するための方法は、上に詳述しており、実施例でもさらに説明する。
当技術分野において知られる任意の適切な参照値を使用することができる。例えば適切な参照値は、臨床的に検出可能なタウ凝集の症状を有さない同じ種の対象または対象の群から得られる生物学的液体の試料中のタウ凝集体の量でありうる。もう一つの例では、適切な参照値が、検出可能なタウ病態を有さない同じ種の対象または対象の群から得られる生物学的液体試料中のタウ凝集体の量でありうる。もう一つの例では、適切な参照値が、０の臨床認知症評価スコア（ＣＤＲ＝０）を有する同じ種の対象または対象の群から得られる生物学的液体試料中のタウ凝集体の量でありうる。もう一つの例では、適切な参照値が、当技術分野において知られている方法によって決定されるアッセイのバックグラウンドシグナルでありうる。もう一つの例では、適切な参照値が、同じ対象から得られる参照試料中のタウ凝集体の量の測定値でありうる。参照試料は試験試料と同じタイプの生物学的液体を含み、対象が臨床的に検出可能なタウ凝集の症状を有していなかった時に、その対象から得たものであることができる。対象が他の点では健常である場合に、その対象から参照試料を得ることが必ずしも可能ではなく、また必ずしも望ましいわけではないことは、当業者には理解されるであろう。例えば、治療の有効性のモニタリングを行う場合、参照試料は、治療開始前の対象から得られた試料でありうる。そのような例では、対象がタウ病態を有しうるが、タウ凝集の他の症状（例えば認知症、認知機能低下など）を有さないか、または対象がタウ病態を有し、かつタウ凝集の他の症状を１つ以上有しうる。さらにもう一つの例では、適切な参照試料が、タウ凝集体を有さないことが示された個体または個体の群からの生物学的液体でありうる。
本発明によれば、試料中に測定されるタウ凝集体の量に基づいて、対象を分類することができる。対象から得た生物学的液体の試料中に測定されるタウ凝集体の量に基づく対象の分類は、対象の生涯においてタウ凝集に関連する疾患および／または症状を発生させるであろう対象を同定するために使用することができる。一般論として、対象は、参照値と比較して多量または少量のタウ凝集体を有すると分類することができ、ここで、多量のタウ凝集体とは参照値を上回る量であり、少量は参照値以下の量である。好ましい実施形態では、多量のタウ凝集体を有すると対象を分類するには、参照値と比較した生物学的液体の試料中のタウ凝集体の量が、少なくとも２倍は増加している。例えば、参照値と比較した試料中のタウ凝集体の量が、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも３０倍、少なくとも３５倍、少なくとも４０倍、少なくとも４５倍、または少なくとも５０倍は増加している。対象から得た生物学的液体の試料中のタウ凝集体の量が参照値と比較して少なくとも２倍は増加していて、参照値が、検出可能なタウ凝集の症状を持たない１人以上の無病個体から得られる同じタイプの生物学的液体の試料（またはそれと等価な試料）である場合、対象は、その生涯において、タウ凝集に関連する疾患および／または症状を発生させる可能性が高くなっている。
定義
本明細書にいう「抗体」は、タウを特異的に認識する免疫グロブリン由来分子を指す。本発明の抗体は、完全長抗体（ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）であるか、抗体フラグメント（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ）であることができる。抗体はキメラ抗体であるか、ヒト化抗体でありうる。
本明細書にいう「ＣＤＲ」は、「相補性決定領域」を意味する。ＣＤＲを超可変領域ということもある。
本明細書にいう「軽鎖」は抗体の小ポリペプチドサブユニットである。典型的抗体は２本の軽鎖および２本の重鎖を含む。
本明細書にいう「重鎖」は抗体の大ポリペプチドサブユニットである。抗体の重鎖は一連の免疫グロブリンドメインを含有し、少なくとも１つは可変ドメイン、少なくとも１つは定常ドメインである。
本明細書にいう「ヒト化」は、ヒト細胞培養中で発現する能力を有するコンストラクトを作製するために組換えＤＮＡを使って、モノクローナル抗体を生産するプロセスを指す。これらのコンストラクトを製作するための既知の技法はいずれも、本発明の目的に役立つであろう。
本明細書にいう「一本鎖可変フラグメント」または「ｓｃＦｖ」または「ｓｃＦｖｓ」は、リンカーを介して接続された免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変領域の融合タンパク質を指す。いくつかの実施形態では、リンカーが約１０〜２５アミノ酸のペプチドである。
本発明の好ましい実施形態を例示するために、以下に実施例を挙げる。以下の実施例で開示する技法は、本発明の実施に際してよく機能することを本発明者らが見出した技法に相当し、したがってその実施の好ましい形態を構成するとみなしうることは、当業者には理解されるはずである。しかし、開示する具体的実施形態には多くの変更を加えることができ、それでもなお、本発明の本旨および範囲から逸脱することなく、ほぼ同じまたは類似する結果が得られることは、この開示に照らして、当業者には理解されるはずである。
実施例１〜８の序論
ニューロンおよびグリアにおける微小管結合タンパク・タウの凝集は、アルツハイマー病（ＡＤ）、進行性核上性麻痺、および前頭側頭型認知症を含む２０を超える神経変性障害と関連している。ヒト研究から得られた最近の証拠は、タウ病態は脳中にランダムに分布するのではなく、ニューロン接続の既存のネットワークと関係していることを示唆している。ＡＤの原線維性タウ病態は既知の解剖学的接続に沿って進行するが、ネットワークが変性する機序はわかっていない。重要なことに、最近の病理学的研究は、ヒト脳およびマウス脳ではタンパク質凝集体がある細胞から別の細胞へと移動しうることを示唆している。さらにまた、タウ、ＳＯＤ−１、α−シヌクレインおよびポリグルタミン（ｐｏｌｙｇｕｔａｍｉｎｅ）などの組換えヒト疾患関連タンパク質の原線維型は、細胞外間隙から容易に取り込まれて、細胞内ミスフォールディングを誘発する。これらの現象は、エキソソームおよびトンネリングナノチューブが経細胞的拡がり（ｔｒａｎｓ−ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｐｒｅａｄ）を媒介すると提唱されたプリオン伝播を連想させる。タウ凝集体が細胞から細胞へとタンパク質ミスフォールディングを拡げるのは、直接的な細胞間接触によるのか、それとも細胞外間隙を介して起こるのかは、未解決の問題である。さらにまた、病理学的タウ種が、凝集体が「ドナー」細胞から放出され、第２の「レシピエント」細胞に進入し、他の間接的な機序ではなくて直接的なタンパク質−タンパク質接触によって、さらなるミスフォールディングを誘導するという、凝集の真の経細胞伝播を媒介しうるのかどうかも、まだ決定されていない。ここでは、タウ原線維が細胞外間隙に直接放出されるかどうか、そしてこの機序によって凝集を伝播することができるかどうかを検証する。
実施例１．抗タウ抗体
標準的な技法を使って２系列の抗タウ抗体、すなわちＨＪ８系列（組換えヒトタウに対するマウスモノクローナル抗体）およびＨＪ９系列（組換えマウスタウに対するマウスモノクローナル抗体）を作製した（表１）。結合エピトープは多くの抗体についてマッピングされている（表Ａ）。
表１ ヒトタウおよびマウスタウに対するＨＪ８系列およびＨＪ９系列
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マウスタウおよびヒトタウに対するＨＪ８およびＨＪ９系列抗体の結合アフィニティを特徴づけるために、ＢｉａｃｏｒｅのＳＰＲ技術を使用した。ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド）およびＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）を１：１の比で使用することで、ＢｉａｃｏｒｅセンサーチップＣＭ−５（カルボキシメチル化デキストランマトリックス）を活性化した。２）次にリガンド（マウスタウまたはヒトタウ）を、５μｌ／分の流速で、Ｂｉａｃｏｒｅ ＣＭ−５センサーチップ上に固定化した（２０ｕｇ／ｍｌ、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）中）。１Ｍエタノールアミン（ｐＨ８．５）を通過させることで、Ｂｉａｃｏｒｅ ＣＭ−５センサーチップ上の残存未結合領域を失活させた。
センサーチップ表面の調製後に、分析物（例えば抗体）を濾過脱気０．０１Ｍ Ｈｅｐｅｓ緩衝液、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．００５％サーファクタントＰ２０、ｐＨ７．４中、異なる濃度（０．７８ｎＭ〜４００ｎＭ）で、１０μｌ／分の流速で注入した。全ての試料を２つ組（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）にして実験した。単一の抗体濃度での各サイクル／実験後に、１０ｍＭグリシン（ｐＨ１．７）を使って結合している抗体／分析物を除去し、表面に取り付けられた単量体／原線維／リガンドを残すことにより、チップの表面を再生した。
ＳＰＲセンサーグラム（図２−１３）から、会合速度またはオン速度（Ｋａ）、解離速度またはオフ速度（Ｋｄ）、およびアフィニティ定数または相互作用のアフィニティ（ＫＤ、ここでＫＤ＝Ｋｄ／Ｋａ）を得た（表２および表３）。
表２ マウスタウに対するＨＪ８系列およびＨＪ９系列の結合データ
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 表３ ヒトタウに対するＨＪ８系列およびＨＪ９系列の結合データ
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実施例２．完全長タウがＩＳＦ中に存在する
マウスタウとヒトタウの両方を認識するタウ抗体を使って、野生型マウスとＰ３０１Ｓヒトタウトランスジェニックマウス（Ｐ３０１Ｓ ｔｇマウス、方法の項に詳細）の両方のＩＳＦ試料から、タウを免疫沈降させた。ＩＳＦ中の単量体型タウの量は比較的低いので、免疫沈降アッセイにおいてうまく作用する２つの抗タウモノクローナル抗体を使用した。免疫沈降後に、免疫ブロットによってタウを解析した。内在性マウスタウアイソフォームは４８〜６２ｋＤａに泳動する。野生型脳溶解物では、タウがＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で４つの独立したバンドに現れた（図１４Ａ）。野生型マウスでは最も豊富な種が４８ｋＤａに泳動した。Ｐ３０１Ｓ ｔｇマウス脳では、４つの内在性マウスタウバンドに加えて、過剰発現したヒト１Ｎ４Ｒタウが、５５ｋＤａに泳動する強いバンドとして観察されると共に、タウ分解産物に相当すると思われる３９ｋＤａバンドとして観察された。
全脳溶解物とは対照的に、免疫沈降後は、野生型マウスからのＩＳＦ中に、タウの微小管結合領域（ＭＴＢＲ）を認識する抗体ＨＪ９．３で、単一のタウバンドが検出された（図１４Ｂ）。このバンドは、マウス脳溶解物に観察される最も大きいアイソフォーム２Ｎ４Ｒに対応した。Ｐ３０１Ｓ ｔｇマウスのＩＳＦでは、ヒト特異的タウバンドが上述のマウスタウバンドと共沈し、その分子量はわずかに低かった（図１４Ｂ）。これら２つのバンドは、タウＨＪ８．１に対して産生されたもう一つのマウスモノクローナル抗体でも沈降した（図１４Ｃ）。これらのデータから、ＥＬＩＳＡによって評価されるＩＳＦ中の主要種はおそらく完全長単量体型タウであることが示唆された。
実施例３．タウＲＤタンパク質はトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞中で原線維凝集体を形成する
タウ遺伝子は６つのタンパク質アイソフォームをコードし、複数の変異が優性遺伝性神経変性疾患を引き起こす。スプライシングに依存して、タウタンパク質は、リピートドメイン（ＲＤ）と呼ばれる、タンパク質の易凝集性コアを構成する３つまたは４つのリピート領域を有する。タウＲＤの発現はトランスジェニックマウスにおける病態の原因となり、完全長タウの切断が患者において原線維を含むフラグメントを形成するという証拠がある。このコンストラクトは培養細胞中で確実に原線維を形成するので、完全長タウではなく、このコンストラクトを使用した。タウ凝集を増加させることが知られているさまざまな変異、すなわちΔＫ２８０（ΔＫと呼ぶ）、Ｐ３０１Ｌ、およびＶ３３７Ｍを、４リピートＲＤタンパク質に工学的に組み入れた。Ｐ３０１Ｌ変異体とＶ３３７Ｍ変異体を合わせて一つのタンパク質（ＬＭと呼ぶ）にすることにより、以前に記載したものと同様に凝集能が著しく増加しているＲＤの変異体型を作製した。この「非生理的」変異体は、細胞内凝集体の効率のよい形成に依存するミスフォールディングの伝達事象および経細胞伝播のアッセイを容易にし、類似しているがより弱い（ｌｅｓｓ ｒｏｂｕｓｔ）「生理的」ΔＫ変異体の凝集表現型を補う。βシート形成および原線維化を阻害するが、不定形凝集体の形成は阻止しない２つのプロリン置換、Ｉ２２７ＰおよびＩ３０８Ｐ（ＰＰと呼ぶ）も、ΔＫ変異体に工学的に組み入れた。各形態の変異体タウを、カルボキシル末端で、シアン蛍光タンパク質もしくは黄色蛍光タンパク質（ＣＦＰまたはＹＦＰ）またはＨＡタグのいずれかに融合した。コンストラクトを図１５Ａに図解する。
タウＲＤ細胞内凝集体の特徴を評価するために、さまざまな形態のＲＤをＨＥＫ２９３細胞に一過性にトランスフェクトした。原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）を使って、ＳＤＳ不溶物を評価した。ＲＤ（ΔＫ）−ＨＡおよびＲＤ（ＬＭ）−ＨＡは明白な原線維種を生産した（図１５Ｂ）。細胞内でのＲＤ（ΔＫ）−ＨＡおよびＲＤ（ＬＭ）−ＨＡ凝集体は、Ｘ−３４（ベータシート原線維を標識し、青色スペクトルで放射する、チオフラビン誘導体）についても陽性に染色された（図１５Ｃ）。さらに、光学顕微鏡で見える封入体が生化学的相関関係を有するかどうかを試験するために、界面活性剤分画を使用した。ＳＤＳ不溶性ペレット（プロテアーゼ阻害剤を含む１×ＰＢＳ中の１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で可溶性ペレットを単離した後、不溶性ペレットをＳＤＳ／ＲＩＰＡ抽出）では、単量体と、オリゴマーに合致する高分子量種とが検出された（図１５Ｄ）。
以前、本出願人らは蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を使って、細胞内ハンチントンタンパク質凝集を定量した。この方法を使ってタウＲＤ凝集を追跡することができるかどうかを調べるために、さまざまなＲＤ変異体（ｗｔ、ΔＫ、ＰＰ、ＬＭ）を黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ：ＦＲＥＴアクセプター）およびシアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ：ＦＲＥＴドナー）に融合した。これらのコンストラクトをＨＥＫ２９３細胞にコトランスフェクトし（ＲＤ−ＣＦＰ／ＲＤ−ＹＦＰと表記する）、ＦＲＥＴアクセプターフォトブリーチング共焦点顕微鏡法、および蛍光プレートリーダー（ＦＰＲ）を使ったスペクトル放射ＦＲＥＴ（ｓｐｅｃｔｒａｌ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ＦＲＥＴ）を用いて、細胞内凝集体形成を定量した。共焦点顕微鏡法では、ＲＤ（ＬＭ）−ＣＦＰ／ＲＤ（ＬＭ）−ＹＦＰを共発現する細胞を撮像し、部分的なおよび完全なアクセプターフォトブリーチングの前後に、ドナーシグナルを測定した。フォトブリーチング後のドナーシグナルの増加により、平均ＦＲＥＴ効率は１８．２％±０．０５８（ｎ＝６、データは±標準偏差である）となり、ＦＲＥＴペア化したＲＤ種間の分子間相互作用が確認された（図１６Ａ）。ＦＰＲを使ったスペクトルＦＲＥＴによるＲＤ−ＣＦＰ／ＹＦＰ凝集の測定には、確立された方法を使用した。これは、シグナル検出の限度内でドナー消光を最大化するために、３：１の比でのＲＤ−ＹＦＰとＲＤ−ＣＦＰのコトランスフェクションに基いた。ＲＤ（ＰＰ）−ＣＦＰ／ＹＦＰからは有意なＦＲＥＴが観察されなかった。しかし、ＲＤ（ΔＫ）−ＣＦＰ／ＹＦＰおよびＲＤ（ＬＭ）−ＣＦＰ／ＹＦＰはそれぞれが強いＦＲＥＴシグナルを生じ（図１６Ｂ）、顕微鏡法での知見が確証された。
さまざまな細胞が組換えタウ原線維を細胞外培地から取り込むであろうということは、以前から観察されていた。これは、ＹＦＰに融合されたネイティブフォールドの完全長タウタンパク質の細胞内原線維化を誘発する。この現象を確かめるために、さまざまな量の組換えＲＤ原線維によって誘導されるＲＤ（ΔＫ）−ＣＦＰ／ＹＦＰの凝集を、ＦＲＥＴを使ってモニターした。ＨＥＫ２９３細胞にＲＤ（ΔＫ）−ＣＦＰ／ＹＦＰをコトランスフェクトし、１５時間培養した。次に、さまざまな濃度のＲＤ−ＨＡ原線維（単量体換算で０．０１、０．０３、０．１および０．３μＭ）を、９時間、培地に加えた。次に、培地を変えることによって原線維を除去し、細胞を４時間回復させてから固定し、ＦＲＥＴを使って解析した。無処理のＲＤ（ΔＫ）−ＣＦＰ／ＹＥＰと比較して、組換え原線維によって誘導されるＦＲＥＴシグナルの用量依存的増加が観察された（図１６Ｃ）。要約すると、細胞内でのタウＲＤ凝集および原線維形成の顕微鏡的、分子的、生化学的、および生物物理学的尺度の間に相関関係が観察された。一定の限度内で、特にタンパク質発現レベルを制御すれば、プレートリーダーに基づくＦＲＥＴアッセイは、このプロセスの手軽な尺度になる。
実施例４．ＲＤ凝集の経細胞誘導（ｔｒａｎｓ−ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）
以前、本出願人らは、ある細胞からのタウ封入体が共培養中のナイーブ細胞に伝達されるであろうことを決定した。しかし、これらの伝達された凝集体がレシピエント細胞中でさらなる凝集を誘導できるかどうかも、凝集の誘導が直接的なタンパク質−タンパク質相互作用に基づくかどうかも証明されていなかった。まず、あるドナー細胞集団に由来するＲＤ（ＬＭ）−ＨＡ凝集体が、共培養時に、異なるレシピエント集団中のＲＤ（ΔＫ）−ＹＦＰと共に封入体を形成するかどうかを調べた。一つの細胞群に易凝集性ＲＤ（ＬＭ）−ＨＡをトランスフェクトし、別個の群にはＲＤ（ΔＫ）−ＹＦＰをトランスフェクトした。翌日、それらの細胞集団を一緒に再プレーティングして、４８時間、共培養した。固定後に、ＨＡ抗体を使ってそれらを免疫染色し、Ｘ−３４で対比染色した。ＲＤ（ＬＭ）−ＨＡとＲＤ（ΔＫ）−ＹＦＰが封入体中に共局在している細胞が数多く観察された（図１７Ａ）。これらの封入体はＸ−３４についても陽性に染色されることが多く、これはベータシート構造を示している。ＦＲＥＴアッセイを使ってこれらの研究を拡張することにより、ＲＤ（ＬＭ）−ＨＡを発現する細胞との共培養によって誘導されるＲＤ（ΔＫ）−ＣＦＰ／ＹＦＰの凝集をモニターした。この例では２つの細胞集団を共培養した。ドナー集団はＲＤ（ＬＭ）−ＨＡを発現し、レシピエント集団はＲＤ（ΔＫ）−ＣＦＰ／ＹＦＰを発現した。βシート耐性型のタウＲＤ（ＰＰ）−ＨＡまたはモックトランスフェクト細胞を陰性対照として使用した。４８時間後に、細胞単層からのＦＲＥＴを測定した。ＲＤ（ＰＰ）−ＨＡまたはモックトランスフェクト細胞との対比で、ＲＤ（ＬＭ）−ＨＡとの共培養によって誘導されるＦＲＥＴの著しい増加が観察された（図１７Ｂ）。ＲＤ（ＬＭ）−ＨＡ細胞をＲＤ（ＷＴ）−ＣＦＰ／ＹＦＰレシピエント細胞と共培養すると、ＦＲＥＴシグナルの小さな増加が観察された（非掲載データ）。これらの結果から、一つの易凝集性タウ種がある細胞から別の細胞へと移動して、ベータシートに富む封入体での共局在を誘発することが示唆された。凝集体の放出が細胞死後に起こる可能性はあるが、さまざまなトランスフェクト集団のヨウ化プロピジウム染色では、その証拠は観察されなかった（図１７Ｃ）。
実施例５．直接的なタンパク質接触によるミスフォールディングの伝播
これらの結果は、共凝集が、直接的なタンパク質接触により、レシピエント細胞中の対応タンパク質と接触するドナー由来のタウＲＤ間の分子間会合を伴って起こったことを強く示唆するものの、その当否を正式に扱うことはできなかった。ＦＲＥＴを使ってこの問題に取り組んだ。まず、ＲＤ（ＬＭ）−ＣＦＰをドナー細胞集団内で発現させ、同時に、ＲＤ（ＬＭ）−ＹＦＰを第２のレシピエント集団内で発現させた。４８後に、共焦点顕微鏡法とＦＰＲの両方を使って、細胞単層からのＦＲＥＴを測定した。共焦点顕微鏡法を使って、ＹＦＰのフォトブリーチングの前後で、ＣＦＰシグナルを測定した。〜１４．２％という平均ＦＲＥＴ効率が記録されたことから、封入体は直接接触したＲＤ（ＬＭ）−ＣＦＰとＲＤ（ＬＭ）−ＹＦＰを含有することが示された（図１８Ａ）。次に、異なる形態の非標識ＲＤを使ってＲＤ−ＣＦＰの凝集を誘導することにより、相対的ＦＲＥＴシグナルをＦＰＲで比較した。まず、ＲＤ（ΔＫ）−ＣＦＰとＲＤ（ＬＭ）−ＨＡをドナー細胞集団内で共発現させ、第２のレシピエント細胞集団内でＲＤ（ΔＫ）−ＹＦＰを発現させた。ＲＤ（ＬＭ）−ＨＡは、ＲＤ（ΔＫ）−ＣＦＰの凝集および移動の強化因子として働き、続いてそれがＲＤ（ΔＫ）−ＹＦＰレシピエント細胞に伝達されるのを促進する。これにより、共培養細胞では、小さいが再現性のあるＦＲＥＴシグナルの増加がもたらされた。このシグナルは、ＣＦＰタグ付きまたはＹＦＰタグ付きのＲＤコンストラクトが、βシート形成を阻止するＰＰ変異を含有する場合には、消失したことから（図１８Ｂ）、このペアのどちらのメンバーも、ベータシート構造を形成する能力を有さなければならないことが示された。これらの結果は、先の実験と合わせて考えると、直接接触によるミスフォールディングの伝播が起こること、すなわち凝集体はある細胞を出て、第２の細胞中でネイティブフォールドタンパク質のミスフォールディングを誘発することを示唆している。このデータから、ミスフォールディングの増幅は、逐次的細胞共培養（ｓｅｒｉａｌ ｃｅｌｌ ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅｓ）でも起こるかもしれないことが暗示された。「ドナー」細胞集団を凝集シードに事前ばく露することにより、レシピエント細胞集団中に検出される最終凝集は増加するだろうと予測された。３つの細胞集団を順次培養することによって、これを調べた。第１集団は、さまざまな形態の非蛍光性ＲＤ−ＨＡを発現して、凝集「シード」を形成した。第２群はＣＦＰまたはＲＤ（ΔＫ）−ＣＦＰを発現して、凝集体維持に関して非許容的（ＣＦＰ）または許容的ＲＤ（ΔＫ）−ＣＦＰ）である。ミスフォールディングを増幅させるために、これら２つの群を４８時間、共培養した。次に、第１群と第２群の複合物の５０％を、ＲＤ（ΔＫ）−ＹＦＰを発現する第３の細胞群と共に、４８時間、共培養した。この第３のレシピエント群は、ＲＤ（ΔＫ）−ＣＦＰ細胞内凝集および伝播の程度を示す「レポーター」として働いた。ＲＤ（ΔＫ）−ＣＦＰ集団へのＲＤ（ＬＭ）−ＨＡの事前ばく露により、易凝集性タウに事前ばく露しなかった細胞と比較して、最終ＦＲＥＴは２．６倍増加した。予想どおり、第２細胞集団における純粋なＣＦＰを発現する細胞の介在は、タウＲＤ「シード」への事前ばく露の効果を完全に阻止した（図１８Ｃ）。これらのデータは全体として、逐次的に培養された細胞集団内でのタウ凝集の増幅を示している。
実施例６．細胞外間隙への凝集体の放出によって媒介される細胞間伝播
タンパク質凝集体が細胞間を移動する機序はわかっていない。例えばトンネリングナノチューブを介したプリオンタンパク質伝播を推論するものもいたし、エキソソームを示唆するものもいた。タウタンパク質に対する抗体はインビボで病態を低減すると以前に報告されているので、タウ凝集体は細胞外間隙に直接放出されるのかもしれないという仮説を立てた。細胞−細胞接触に基づく経細胞移動が細胞外培地の体積には依存しないはずであるのに対して、タウの経細胞移動は、ＳＯＤ１について述べられているように、細胞外体積に鋭敏であるかもしれないと予測した。手始めに、さまざまな培地体積の設定下で共培養の効果をまず調べた。細胞培養培地体積を増加させると、凝集体の経細胞移動の効率は低減することが観察された（図１９Ａ）。さらに、ＲＤ（ＬＭ）−ＨＡを発現する細胞からの条件培地の導入は、ＲＤ−ＣＦＰ／ＹＦＰを発現する細胞における凝集を誘発するのに十分であった（図１９Ｂ）。これらの結果は、細胞外間隙を通る細胞間でのタウの移動と合致したが、タンパク質がエンドソームに封入されているかどうかは決定することができなかった。
封入されたタウへのアクセスは脂質膜によって阻止されると思われるのに対し、遊離のタウであれば抗体にもアクセスできるであろうと推論した。そこで、タウを免疫沈降させることができるマウスモノクローナル抗体（ＨＪ９．３）が経細胞伝播を阻止するかどうかを調べた。上述したタウＲＤ伝播の細胞モデルの変法を使用し、ここでは、ＲＤ（ＬＭ）−ＨＡおよびＲＤ（ΔＫ）−ＣＦＰを一つの細胞集団内で共発現させ、ＲＤ（ΔＫ）−ＹＦＰを発現する細胞と共に４８時間共培養してから、ＦＲＥＴによる解析を行なった。４８時間の共培養期間にわたって、ＨＪ９．３をプールマウスＩｇＧとの対比で試験した。ＨＪ９．３では経細胞伝播の用量依存的低減が観察され、一方、非特異的ＩｇＧには効果がなかった（図１９ＣおよびＤ）。重要なことにＨＪ９．３は、ＲＤ（ΔＫ）−ＣＦＰおよびＲＤ（ΔＫ）−ＹＦＰの細胞内凝集に対して、これら２つのタンパク質を同じ細胞内で共発現させた場合には効果がなかったことから（図１９Ｅ）、抗体は細胞内凝集を直接阻害しているわけではないことが示された。タウミスフォールディングの誘導を生化学的に評価することにより、経細胞伝播における遊離タウの役割をさらに調べた。ＲＤ（ＬＭ）−ＨＡとの共培養によって誘導される不溶性画分におけるＲＤ（ΔＫ）−ＹＦＰの増加を明らかにする界面活性剤分画とウェスタンブロットにより、凝集の誘導が確認された。ＨＪ９．３は、共培養細胞におけるＲＤ−ＹＦＰの不溶性を誘導するＲＤ（ＬＭ）−ＨＡの効果を阻止した（図１９ＦおよびＧ）。
抗体添加の有効性は遊離のタウが細胞間で直接伝達されることを示唆したが、抗体阻害の機序は不明なままだった。ＨＪ９．３は細胞へのタウ原線維の取り込みを阻止しているという仮説を立てた。この考えを検定するために、フローサイトメトリーを使って、凝集体の経細胞移動に対する抗体の効果をモニターした。本出願人らは、以前に、一方の細胞集団をｍＣｈｅｒｒｙで標識し、もう一つがタウ−ＹＦＰ融合物を含有するサイトメトリーパラダイムを、確立している。共培養後は、二重陽性（ＹＦＰ／ｍＣｈｅｒｒｙ）細胞の相対パーセンテージに基づいて、経細胞移動をモニターすることができる。ＨＥＫ２９３細胞の集団にタウＲＤ（ＬＭ）−ＹＦＰをトランスフェクトし、第２の集団をｍＣｈｅｒｒｙを発現するレンチウイルスで形質導入した。２つの集団を洗浄し、再懸濁してから、細胞を、培地中のＨＪ９．３の１０倍希釈液の存在下または非存在下で、４８時間、共培養した。細胞を回収（ｈａｒｖｅｓｔ）し、二重陽性細胞の相対数をフローサイトメトリーを使って測定した。陰性対照は、選別前に混合された同じ細胞集団からなった。各データポイントは生物学的三重試料からなった。共培養細胞では、ＲＤ（ＬＭ）−ＹＦＰ／ｍＣｈｅｒｒｙ二重陽性細胞（２．０７％）が、事前混合細胞（バックグラウンド）の０．１４２％と比較して有意に多かった。ＨＪ９．３は二重陽性細胞のパーセンテージを２．０７％から１．３１％に減少させた（図１９Ｈ）。これは、ＦＲＥＴによって測定される凝集の経細胞伝播に対するこの抗体の効果と類似している。ＦＲＥＴとフローサイトメトリーによって測定される伝播の阻止に関するこの抗体の効力の差は、おそらく、このイベントを測定するために使用した２つの技法の相違によるのだろう。
凝集体の経細胞移動に対するＨＪ９．３抗体の効果をさらにモニターするために、ＨＪ９．３／抗体複合体が沈着した場所を画定する試みとして、直接免疫蛍光法を使用した。ＲＤ（ΔＫ）−ＹＦＰ細胞または非トランスフェクト細胞をＨＪ９．３の存在下で４８時間培養した。細胞を４％ＰＦＡで固定し、０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で透過処理してから、ヤギ抗マウスＡｌｅｘａ５４６標識二次抗体にばく露した。ごく小数のＨＪ９．３／タウ複合体が細胞内部に存在した。しかし大半の複合体は細胞の外に、主に細胞膜に結合した状態で見出された。この抗体デコレーションは、非トランスフェクト細胞には存在しなかったことから、シグナルはＨＪ９．３／タウ複合体に特異的であることが示された（図２０）。このようにＨＪ９．３は、細胞の外側で凝集体をトラップすることで、タウ凝集体取り込みを阻止する。
実施例７．タウ原線維が細胞間伝播を媒介する
伝播アッセイにおけるＨＪ９．３の活性により、原因となるタウ種を明確にする機会が得られた。ＨＪ９．３を使って細胞培地からタウを抽出した。ＨＪ９．３または対照ＩｇＧを、さまざまなＲＤコンストラクト（ｗｔ、ＰＰ、ΔＫ、ＬＭ）を発現する細胞培地に加えた。抗体は、４８時間の培養期間の最初または最後のどちらかに加えた。プロテインＧ−アガロースビーズを用いる抗体／抗原複合体のアフィニティ精製のために、培地を回収（ｈａｒｖｅｓｔ）した。複合体を洗浄してから、ウェスタンブロットによる解析のために、ＳＤＳローディング緩衝液中で煮沸した。ＨＪ９．３は細胞培地からタウＲＤ種を特異的に捕捉したが、ＩｇＧには感知しうる効果はなかった（図２１Ａ）。培養期間の終了時に添加するのではなく、ＨＪ９．３が培養期間中ずっと存在する場合は、培地中に存在するタウタンパク質が〜１０倍増加することが観察された（図２１Ｂ）。ＲＤ（ΔＫ）−ＨＡおよびＲＤ（ＬＭ）−ＨＡトランスフェクト細胞の培地には、ＲＤ凝集体と合致する高次分子量種も認められた。ＲＤ（ＰＰ）−ＨＡタウは、培地中に存在する量が最も少ないタンパク質であり、ウェスタンブロットでは高次種は観察されなかった。先に述べた実験の時間経過（０時間、３時間、６時間、９時間、１２時間、２４時間および４８時間）は、培地中のタウレベルの時間依存的な増加を示した。これは、ＨＪ９．３インキュベーションが条件培地中に存在するタウタンパク質の定常状態レベルを実際に増加させていることを含意する（図２１Ｃ）。これらのデータは全体として、ＨＪ９．３が、細胞への凝集体の取り込みを妨害することによって、細胞から細胞への伝播を阻止することを示し、細胞の内外へのタウ凝集体の定常状態フラックスと合致している。
経細胞伝播を媒介するタウ種の正確な性質はわかっていない。そこで、ＡＦＭによる撮像のためにＨＪ９．３を使ってこれらの種をトラップした。さまざまなタウ変異体をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を、ＨＪ９．３の存在下で培養した。４８時間後に抗体／抗原複合体をプロテインＧアガロースビーズで精製した。次に複合体を高塩濃度緩衝液中でビーズから溶出し、撮像のためにＡＦＭチップ上に沈着させた。ＲＤ（ΔＫ）−ＨＡおよびＲＤ（ＬＭ）−ＨＡを発現する細胞の培地には明白な原線維種が検出されたが、ＲＤ（ＰＰ）−ＨＡは無定形の凝集体しか産生せず（図２１Ｄ）、モックトランスフェクト細胞はシグナルを生じなかった（非掲載データ）。これらの知見は、遊離のタウ原線維が、細胞外間隙へのそれらの放出によって、タウ凝集の経細胞伝播を媒介することと、合致している。
実施例８．インビボでのタウ病態に対する抗タウ抗体の効果
完全長組換えヒトタウに対するさらに２つの抗体の活性を伝播アッセイで調べた。ＲＤ（ＬＭ）−ＣＦＰ細胞とＲＤ（ΔＫ）−ＹＦＰ細胞を、異なるタウエピトープを標的とする異なるモノクローナル抗体（ＨＪ８．５、ＨＪ９．３およびＨＪ９．４）の存在下および非存在下で４８時間、共培養した（図２２Ａ）。Ａβペプチドに対するＨＪ３．４抗体を陰性対照として使用した。３つの抗タウ抗体はいずれも、ＲＤ−タウの凝集促進変異体の細胞間での経細胞伝播を阻止した（図２２Ｂ）。陰性対照ＨＪ３．４は経細胞伝播を阻止しなかった。ＨＪ８．５、ＨＪ９．３およびＨＪ９．４はＥＬＩＳＡでもＲＤ−タウ原線維を検出した（図２２Ｃ）。
インビボで細胞から細胞へのタウ凝集体の伝播を阻止するために、タウ上の異なるエピトープを標的とする抗体による受動ワクチン接種アプローチを使用した。抗タウ抗体ＨＪ８．５およびＨＪ９．３、または媒体を、それぞれ、Ａｌｚｅｔ浸透圧ポンプ（２００６モデル、図２３Ａ）を使った脳室内注射により、６ヶ月齢Ｐ３０１Ｓ ｔｇマウスの側脳室に注入した。Ａｌｚｅｔポンプアセンブリに取り付けた脳カニューレを、ブレグマから前後方向に０．４ｍｍ、正中から側方に１．０ｍｍ、および腹背方向に２．５ｍｍの位置にある各マウスの左側脳室に、外科的に埋め込んだ（図２３Ｂ）。処置後に、カニューレの配置をクレシルバイオレット染色で検証した（図２３Ｃ）。Ａｌｚｅｔ浸透圧ポンプを６週間後に置き換え、８４日目に実験を終了した。
実験計画が抗体の分解および／または不活性をもたらさなかったことを確認するために、マウス脳への６週間の注入後にＡｌｚｅｔポンプから抗体を収集し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにローディングした。ゲルをまずクーマシーブルー色素で染色し（図２４Ａ）、次に、６週間の注入の前と後にポンプから採取した抗体を用いるウェスタンブロッティングによって解析した（図２４Ｂ）。抗体は、インビボで生理的温度のＡｌｚｅｔポンプに６週間入っていた後も、全て安定であり、活性であった。さらに、組換えヒトタウタンパク質に異なる注入抗体をスパイクしても、全タウを測定するためのＨＪ８．７−ＢＴ２Ｂ ＥＬＩＳＡアッセイは妨害されないことも確認した（図２５）。
抗体処置が病理学的タウ染色を低減したかどうかを決定するために、媒体／ＰＢＳまたは抗タウモノクローナル抗体で処置された９ヶ月齢Ｐ３０１Ｓ ｔｇマウスの組織切片におけるタウ染色を評価した。梨状皮質の冠状切片を、異常リン酸化型のタウを認識するビオチン化ＡＴ８抗体で染色した。予備的免疫組織化学データの定量的解析により、マウス脳では、ＨＪ８．５およびＨＪ９．３の注入後に、異常リン酸化タウ負荷は著しく低減することが示された（図２６および図２７）。これらの効果の生化学的解析は進行中である。うまくいけば、タウ伝播およびタウ病態に対する受動免疫化が、アルツハイマー病、前頭側頭型（ｆｒｏｎｔｏ−ｔｅｒｍｐｏｒａｌ）認知症または他のタウオパチーを処置するための治療的アプローチになりうる。
実施例３〜７に関する考察
鋳型を介したコンフォメーション変化（ｔｅｍｐｌａｔｅｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｃｈａｎｇｅ）と凝集の経細胞伝播とが関与するプリオン様の機序が、タウオパチーおよび他の神経変性疾患の容赦ない進行の説明になりうることは、以前に提唱されている。これは、ドナー細胞からのタンパク質凝集体の放出、レシピエント細胞への進入、およびネイティブフォールドタンパク質との直接的接触によるミスフォールド状態の増幅からなるだろう。しかし、タウオパチーのこのモデルを裏付ける機序的証拠は不完全であり、このようなタウミスフォールディングの経細胞伝播は今まで証明されたことがなかった。実施例３〜７には、分泌されたタウ凝集体による培養細胞におけるタウ凝集の経細胞伝播が記載され、有望な機序が提案されている。まず、トランスフェクト細胞におけるＲＤタウ原線維の自発的形成が、抽出物のＸ−３４染色およびＡＦＭを使って実証された。次に、２つの別個の細胞に由来するタウが、細胞内封入体中で同所共在することが、共焦点顕微鏡法を使って観察された。これは、易凝集型のタンパク質ＲＤ（ＬＭ）−ＨＡを発現する細胞と共培養した時の、タウＲＤ（ΔＫ）−ＹＦＰの界面活性剤不溶性の増加と関連した。また、この凝集の増加は、同じ細胞内で共発現したＲＤ（ＬＭ）−ＣＦＰ／ＹＦＰ間でも、ＦＲＥＴを使って実証された。これは、アクセプターフォトブリーチング（顕微鏡法）とスペクトル法（ＦＰＲ）によって検出された。次に、別々の細胞集団において発現したＲＤ（ＬＭ）−ＣＦＰとＲＤ（ＬＭ）−ＹＦＰの間のＦＲＥＴを使って、伝播が直接的なタンパク質接触によって起こることを実証した。次に、この方法を拡張して、逐次的培養条件における細胞集団内でのタウタンパク質ミスフォールディングの増幅を実証した。タウ凝集の経細胞伝播は、細胞外間隙中に直接放出された原線維によって媒介される、なぜなら伝達は細胞外体積に鋭敏であり、条件培地は細胞内凝集を増加させることができ、抗タウ抗体（ＨＪ９．３）が細胞間伝播を妨害し、細胞外タウ原線維をトラップしたからである。こうして、本出願人らは、さまざまな技法を使って、鋳型を介したコンフォメーション変化による経細胞凝集体伝播を実証した、また、本出願人らは、これらの現象の説明となる簡単なモデルを提案する（図２９）。
経細胞伝播−凝集したタウの細胞間での自発的移動は以前に記述されているが、タウタンパク質凝集体が、細胞への間接的効果ではなくタンパク質の直接接触によって、ミスフォールド状態を細胞間で伝播できるかどうかはわかっていなかった。α−シヌクレインの細胞培養研究でも伝播は示唆されているが、ドナー細胞に由来する種の性質（例えば凝集体か二量体か単量体か）や、レシピエント細胞中で形成されるものの性質は不明である。また、ＳＯＤ１凝集体も培地を介して細胞間で伝達され、さらなる凝集を誘導することができるが、原因となるタンパク質コンフォーマーの正確な性質や、直接的なタンパク質−タンパク質接触が起こるかどうかは不明である。精製Ａβ４２およびタウ原線維をトランスジェニックマウス脳に注射すると内在性タウの凝集が誘導され、近傍でタウ原線維が発生するが、注入したタンパク質によるシーディングの可能性を排除することは難しい。本発明者らの研究室での研究と、それに続く他の研究者による研究で、細胞の外部から内部へのタウ凝集体の移動と組換えタンパク質による凝集の誘導が実証されている。しかし、タウタンパク質の先行研究では、真の伝播、すなわち、ある細胞から別の細胞への凝集体の移動、ネイティブタンパク質との直接的接触、レシピエント細胞中のタンパク質の原線維状態への転化、およびミスフォールド種の増幅は証明されていない。
この研究ではこれらの現象をいくつかの方法で証明した。まず、易凝集型のタウＲＤ（ＬＭ）−ＨＡを、ＲＤ（ΔＫ）−ＹＦＰを発現する細胞と共培養すると、βシート陽性封入体での共局在が起こることを見出した。次に、ＲＤ（ＬＭ）−ＨＡを発現する細胞を、ＲＤ（ΔＫ）−ＣＦＰとＲＤ（ΔＫ）−ＹＦＰの両方を発現するもう一つの集団と共培養すると、ＦＲＥＴシグナルの増加が起こることが観察されたことから、ＦＲＥＴペアを発現する細胞へのＲＤ（ＬＭ）−ＨＡの移動がそれらの凝集を誘導していることが示唆された。細胞間を移動するタウ凝集体の直接的接触と共凝集を証明するために、ＲＤ（ΔＫ）−ＣＦＰとＲＤ（ΔＫ）−ＹＦＰを別々の集団内で発現させた。これは、経細胞移動および共凝集に由来するＦＲＥＴシグナルをもたらし、このシグナルは、どちらか一方のコンストラクトがβシート形成を阻止する二重プロリン変異を含有する場合には消失した。ＲＤ−ＣＦＰ凝集体の伝達による完全長タウ−ＹＦＰ凝集の誘導も観察されたが、その効率は低い（非掲載データ）。最後に、タンパク質凝集体の経細胞移動によって誘導されるＦＲＥＴの効率は、ＲＤ（ＬＭ）−ＨＡ発現細胞をＲＤ（ΔＫ）−ＣＦＰを発現する細胞と予備的に共培養することにより、有意に増加したことから、凝集状態は細胞の集団内で増幅されうることが証明された。
タウ凝集体伝播の抗体による調節−主に細胞外にあるＡβペプチドに対する抗体は、脳におけるＡβ凝集を防止し、既存の凝集体を除去することができる。潜在的副作用はあるものの、このような抗体は処置薬として期待できる。しかし、タウオパチーおよびシヌクレイノパチーのマウスモデルにおけるワクチン接種の成功は、ターゲットタンパク質が主に細胞内にあるという事実を踏まえると、困惑するものであった。タウ−ＲＤに対するマウスモノクローナル抗体であるＨＪ９．３はタウ凝集の経細胞伝播を阻害することが観察された。しかしこの抗体はタウの細胞内凝集には効果がなかった。この抗体への細胞培地の慢性的ばく露は、培地中の定常状態タウレベルを著しく増加させた。これは、ＨＪ９．３がある細胞から別の細胞への凝集体の伝達を阻止することを示すフローサイトメトリーによって確証された。最後に、細胞表面にトラップされたＨＪ９．３／タウ複合体が観察された。この抗体の効果は、タウ原線維が細胞外間隙中に放出されること、そしてプリオンについて提唱されているように主にエキソソームやトンネリングナノチューブにおける細胞間伝達によってミスフォールディングを伝播しているのではないことを、強く示唆した。さらに、細胞の外側に存在する凝集体は、ＨＪ９．３によってトラップされなければ、細胞中に再び取り込まれると思われる。治療用抗体には、タンパク質原線維の脱凝集、細胞内での転化の阻止、および細胞内分解の促進など、複数の阻害様式が考えられる。ＨＪ９．３での本発明者らの結果は、タウオパチーを阻止するために使用することができるであろう一つの機序として、細胞取り込みの妨害と最もよく合致し、神経変性疾患のための治療用抗体の開発と最適化を検討するための新しい方法を示唆している。
原線維性タウによる経細胞伝播−タウ凝集の伝播の阻止にＨＪ９．３が有効であることから、原因となる種をトラップするために、この抗体を使用することが可能になった。条件培地からのタウの免疫アフィニティ精製により、原線維性タウが明らかになった。対照細胞からの培地にも、無定形凝集体を生じるβシート耐性ＲＤ（ＰＰ）−ＨＡを発現する細胞からの培地にも、タウ原線維は観察されなかった。ＲＤ（ΔＫ）−ＨＡおよびＲＤ（ＬＭ）−ＨＡ発現は、それぞれ、細胞外間隙への原線維分泌を引き起こした。ある細胞におけるタンパク質凝集が隣接細胞における凝集にどのように影響を及ぼすかは明確でなく、形式的には、サイトカイン、エキソソーム、または細胞間の直接的接続が、このプロセスを容易にするのかもしれないという可能性があった。これらの可能性を完全に排除することはできない。しかし、これらの結果は、遊離の原線維腫が細胞外間隙を通した伝播の媒介物質であることと最もよく合致している。この研究は、タンパク質凝集体が培養中のある細胞から別の細胞へと伝播する機序に関する、そしてそれゆえに、それらがインビボでどのようにしてそれを行いうるのかに関する、いくつかの重要な疑問への解答を示唆している。経細胞伝播をモニターするためのここで述べた方法に関連して、タウオパチーおよび他の神経変性疾患をより効果的に処置するために、このプロセスを薬理学的および生物学的薬剤の標的にすることも可能であるだろう。
実施例１〜８のための方法
抗体
最も長いマウス組換えタウアイソフォームｍＴａｕ４０（４３２ａａ）と最も長いヒトタウアイソフォームｈＴａｕ４０（４４１ａａ）はＥｖａ Ｍａｎｄｅｌｋｏｗの研究室で生産され、タウＥＬＩＳＡではそれらを標準として使用した。ヒトタウとマウスタウの両方（残基２１８〜２２５にあるエピトープ）を認識するマウスモノクローナル抗体Ｔａｕ−５は、Ｌ．Ｂｉｎｄｅｒの研究室から得た（ＬｏＰｒｅｓｔｉ ｅｔ ａｌ．， １９９５；Ｐｏｒｚｉｇ ｅｔ ａｌ．， ２００７）。モノクローナル抗体ＨＪ８．１およびＨＪ９．３は、タウノックアウトマウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）において、それぞれヒトタウおよびマウスタウに対して免疫化することによって生じさせたマウスモノクローナル抗体である。どちらの抗体も、ウェスタンブロット上で、免疫沈降によって、そしてＥＬＩＳＡアッセイにおいて、マウスタウとヒトタウを認識する。ＨＪ９．３はタウの微小管結合領域（ＭＴＢＲ）を認識する。同様にヒトタウおよびマウスタウ（残基１９４〜１９８にあるエピトープ）を認識するマウスモノクローナル抗体ＢＴ−２は、Ｐｉｅｒｃｅから入手した。タウに対するウサギポリクローナル抗体（ａｂ６４１９３、リピートドメイン領域中にあるエピトープ）はＡｂｃａｍ（マサチューセッツ州ケンブリッジ）から購入した。ヘマグルチニンＨＡに対するマウスモノクローナル抗体（ＨＡ．１１クローン１６Ｂ１２）はＣｏｖａｎｃｅ（カリフォルニア州エメリービル）から購入した。ウサギポリクローナルＧＦＰ抗体（ｓｃ−８３３４）はＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。
プラスミド
タンパク質発現には微小管結合タンパク質タウの４リピートドメイン（ＲＤ）をコードする配列を使用した。野生型に加えて、さまざまなタウ変異体を作製した：ΔＫ２８０Δ（Ｋ）； Ｐ３０１Ｌ／Ｖ３３７Ｍ（ＬＭ）；ΔＫ２８０／Ｉ２２７Ｐ／Ｉ３０８Ｐ（ＰＰ）。これらの配列を、Ｃ末端ヘマグルチニン（ＨＡ）タグと共にｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングするか、またはｐＥＹＦＰ−Ｎ１もしくはｐＥＣＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にサブクローニングして、Ｃ末端蛍光タンパク質融合物を作製した。
動物
Ｐ３０１ＳヒトＴ３４アイソフォームタウ（１Ｎ４Ｒ）を過剰発現するＰ３０１Ｓ ｔｇマウス（ＰＳ１９系統）は以前に作出し、特徴づけたもので、Ｂ６Ｃ３背景を持つ。Ｐ３０１Ｓ ｔｇマウスはＴｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した。タウノックアウトマウスはＴｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した。同年齢および同遺伝的背景の非トランスジェニックマウス同腹仔を野生型マウスとして使用した。どの実験でも、本研究では雄と雌の両方を使用した。
免疫沈降および免疫ブロット解析
免疫沈降および免疫ブロット解析．Ｐ３０１Ｓタウトランスジェニックマウスおよび野生型マウスから海馬微小透析試料を１．０ ｌ／分の流量で１５時間収集した。製造者の説明書に従ってＨＪ８．１またはＨＪ９．３タウ抗体でコーティングしたＤｙｎａｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により、ＩＳＦを免疫沈降した。沈降した画分を還元４-１２％ビス−トリスミニゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にローディングし、ニトロセルロース膜に転写した。沈降した抗体の妨害を排除するために、ビオチン化ＢＴ−２抗体（Ｐｉｅｒｃｅ）およびポリＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用した。ＨＥＫ２９３細胞は、１０％ウシ胎児血清、１００μｇ／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補足したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。培養物は５％ＣＯ２の湿潤雰囲気下、３７℃で維持した。一過性トランスフェクションには、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ／Ｐｌｕｓ試薬と６００ｎｇの適当なＤＮＡコンストラクトとを使用し（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州カールズバッド）、製造者の推奨に従って、Ｏｐｔｉｍｅｍ培地にプレーティングした細胞をトランスフェクトし、２４時間後または４８時間後に、さらなる解析のために回収（ｈａｒｖｅｓｔ）した。
界面活性剤分画およびウェスタンブロット解析
ＨＥＫ２９３細胞を１２穴プレートに４００，０００細胞／ウェルでプレーティングした。翌日、細胞に６００ｎｇのプラスミドをトランスフェクトした。４８時間後に、３７℃で３分間、０．０５％トリプシンを使って、細胞を回収（ｈａｒｖｅｓｔ）し、７０００×ｇで手短にペレット化し、プロテアーゼ阻害剤を含有するＰＢＳ中の１％Ｔｒｉｔｏｎ １００μｌ中で溶解した。次に、１４，０００×ｇで１０分間の遠心分離によって可溶性サイトゾルタンパク質を収集した。ペレットをＲＩＰＡ／ＳＤＳ緩衝液に再懸濁し、２０，０００×ｇで１５分間の遠心分離後に、核酸のベンゾナーゼヌクレアーゼ消化を行うことにより、不溶性タンパク質を得た。共培養実験の場合は、ＲＤ（ＬＭ）−ＨＡおよびＲＤ（ΔＫ）−ＹＦＰがトランスフェクトされた同数の細胞を４８時間、共培養してから、回収（ｈａｒｖｅｓｔ）し、ウェスタンブロッティングを行なった。各フラクションから等量のＨＥＫ２９３細胞タンパク質抽出物を、４％−２０％ポリアクリルアミドゲル（Ｂｉｏｒａｄ）；１：２０００希釈のタウＲＤに対する抗体（ＲＤ領域中のエピトープを認識するもの）（ａｂ６４１９３、Ａｂｃａｍ、マサチューセッツ州ケンブリッジ）および／または１：１０００希釈のＧＦＰに対する抗体（ｓｃ−８３３４、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ．）を使って解析した。化学発光に基づくペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体反応を行い、Ｘ線フィルムで検出した。定量はＩｍａｇｅ Ｊ解析ソフトウェアを使って行なった。
共培養実験：ＦＲＥＴによるＲＤ−ＣＦＰ／ＹＦＰ共凝集の測定
ＨＥＫ２９３細胞を１２穴プレートに３００，０００細胞／ウェルでプレーティングした。翌日、上述のように、６００ｎｇのプラスミドを細胞にトランスフェクトした。コトランスフェクト細胞には、１５０ｎｇのＲＤ−ＣＦＰコンストラクトと４５０ｎｇのＲＤ−ＹＦＰコンストラクトの組み合わせを与えた。１５時間後に、３７℃で３分間、０．０５％トリプシンを使って、細胞を回収（ｈａｒｖｅｓｔ）し、細胞の一部を９６穴プレートに４つ一組にして再プレーティングするか、顕微鏡法による撮像のためにｉｂｉｄｉ μ−スライド（ｉｂｉｄｉ ＧｍｂＨ、ドイツ）に再プレーティングした。次に細胞をさらに４８時間培養してから、４％パラホルムアルデヒドで固定し、解析した。
共培養実験：ＲＤ−ＨＡによるＲＤ−ＹＦＰ凝集の誘導の測定
１２穴プレートにおいてＨＥＫ２９３細胞にＲＤ（ΔＫ）−ＹＦＰかＲＤ（ＬＭ）−ＨＡのどちらか一方をトランスフェクトした。１５時間後に、細胞をｉｂｉｄｉ μ−スライド上に一緒に再プレーティングし、さらに４８時間培養した。次に、それらを固定し、顕微鏡法による解析のために、抗ＨＡ抗体とＸ−３４で染色した。
共培養実験：共培養物における伝播アッセイ
１２穴プレート中の２つのＨＥＫ２９３細胞集団に、３００ｎｇのＲＤ（ＬＭ）−ＨＡと３００ｎｇのＲＤ（ΔＫ）−ＣＦＰとを一緒にコトランスフェクトするか、またはＲＤΔ（Ｋ）−ＹＦＰをトランスフェクトした。１５時間後に、等パーセンテージのそれら２つの集団を、９６穴プレートフォーマットで４８時間、共培養した。次に、４％パラホルムアルデヒドで細胞を固定し、蛍光プレートリーダー（ＦＰＲ）を使ってＦＲＥＴ解析を行なった。ＦＲＥＴ顕微鏡解析の場合は、１２穴プレート中の２つのＨＥＫ２９３細胞集団に、６００ｎｇのＲＤ（ＬＭ）−ＣＦＰまたはＲＤ（ＬＭ）−ＹＦＰをトランスフェクトした。１５時間後に、等パーセンテージのそれら２つの集団を、ｉｂｉｄｉ μ−スライド上で４８時間、共培養した。次に、４％パラホルムアルデヒドで細胞を固定し、ＦＲＥＴアクセプターフォトブリーチングを行なった。
共培養実験：逐次的培養におけるタウ凝集の増幅
１２穴プレートにおいてＨＥＫ２９３細胞に６００ｎｇのさまざまな形態の非蛍光ＲＤ−ＨＡをトランスフェクトし、２４時間培養した。第２の細胞群にはＣＦＰまたはＲＤ（ΔＫ）−ＣＦＰをトランスフェクトした。次に、等パーセンテージの第１集団と第２集団を４８時間、共培養した。この時点で、この集団の５０％を、９６穴プレートに、ＲＤ（ΔＫ）−ＹＦＰをトランスフェクトした細胞の集団と共にプレーティングし、４８時間培養した。次に、ＦＰＲを使ったＦＲＥＴ解析のために、４％パラホルムアルデヒドで細胞を固定した。
培地移行（ｍｅｄｉａ ｔｒａｎｓｆｅｒ）および条件培地実験
１２穴プレート中でＨＥＫ２９３細胞に６００ｎｇのＲＤ（ＬＭ）−ＨＡをトランスフェクトするか、または１５０ｎｇのＲＤ（ΔＫ）−ＣＦＰコンストラクトと４５０ｎｇのＲＤ（ΔＫ）−ＹＦＰコンストラクトの組み合わせをコトランスフェクトした。１５時間後に、３７℃で３分間、０．０５％トリプシンを使って、細胞を回収（ｈａｒｖｅｓｔ）した。ＲＤ（ΔＫ）−ＹＦＰ／ＣＦＰを発現する細胞とＲＤ（ＬＭ）−ＨＡを発現する細胞を同数ずつ、さまざまな量の細胞培養培地中で、４８時間、共培養した。次に、４％パラホルムアルデヒドで細胞を固定し、ＦＲＥＴ解析を行なった。条件培地実験では、トランスフェクションの１５時間後に、トランスフェクション複合体を含有するＲＤ（ＬＭ）−ＨＡ細胞からの培地を新鮮な培地で置き換えた。３７℃で３分間、０．０５％トリプシンを使って、ＲＤ（ΔＫ）−ＹＦＰ／ＣＦＰを発現する細胞を回収（ｈａｒｖｅｓｔ）し、９６穴プレートに再プレーティングした。２４時間後に、ＲＤ（ＬＭ）−ＨＡをトランスフェクトした細胞から条件培地を収集し、ＲＤ（ΔＫ）−ＹＦＰ／ＣＦＰを発現する細胞に加えた。４８時間後に、４％パラホルムアルデヒドで細胞を固定し、ＦＲＥＴ解析を行なった。
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）アッセイ：フォトブリーチングを使った顕微鏡法によるＦＲＥＴ測定
前述のようにコトランスフェクション実験および共培養実験用にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を、ＦＲＥＴアクセプターフォトブリーチング顕微鏡法のために調製した。画像は全て、Ｃ−Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ ４０× １．２ＮＡレンズ（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、ドイツ０７７４０イエーナ）を使って得た。１００×（ＣＦＰ）。デジタル画像は、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００ＭでＺｅｉｓｓ ＬＳＭ５１０ Ｍｅｔａ ＮＬＯ多光子／共焦点レーザー走査型顕微鏡システムを使って取得した。撮像に使用したチャンネルは次のとおりだった：ドナーＣＦＰは４５８ｎｍアルゴンレーザーを使って刺激し、４８０〜５２０ｎｍ帯域フィルタで蛍光を収集した；アクセプターＹＦＰは５１４ｎｍアルゴンレーザーを使って刺激し、ロングパス５６０ｎｍフィルタで蛍光を収集した。強度がＦＲＥＴ効率の概算値を反映する画像を作成するために、初期ＣＦＰ画像の値をフォトブリーチング後に得られる最終ＣＦＰ画像からピクセルごとに差し引き、この相違に１００を掛けて、最終ＣＦＰ画像強度で割った：１００×（ＣＦＰ最終−ＣＦＰ初期）／ＣＦＰ最終。部分アクセプターフォトブリーチングについて適正な調整を行なった。画像算術変換およびグレースケールからカラーへの画像変換は、ＮＩＨ ＩｍａｇｅＪ １．４４ソフトウェアを使って行なった。
ＦＲＥＴアッセイ：蛍光プレートリーダー
スペクトルＦＲＥＴ測定値（ＦＲＥＴ／ドナー）は、既述の方法に従い、ＴｅｃａｎＭ１０００蛍光プレートリーダーを使って得た。ドナーとアクセプターが同じタンパク質に融合されていない場合、スペクトルＦＲＥＴ測定値は、細胞内で発現させるドナータンパク質とアクセプタータンパク質の相対量の注意深い制御に依存する。プレートリーダーでの値は全て、まず、モックトランスフェクト細胞に対して背景差分をとった。各ウェル中のＹＦＰシグナル（Ｓｍｐｌ４８５ｅｘ／５２８ｅｍ ＦＲＥＴ）を使ってＲＤ−ＹＦＰ発現レベルを見積もり、実験条件下では、ＲＤ−ＣＦＰ／ＹＦＰが独立して変動しないとも仮定した。これは、見かけのＦＲＥＴの変化が単にＲＤ発現レベルの変動によるものである可能性を排除するのに役立つ。ドナー励起シグナル（４３５ｎｍ）によるアクセプター活性化（５２８ｎｍ）の総ＦＲＥＴ測定値に対する相対的寄与は、アクセプターの「クロスオーバー活性化」分率Ｘ（ここでＸ＝４３５ｅｘ／５２８ｅｍで測定されたＲＤ−ＹＦＰシグナルを４８５ｅｘ／５２８ｅｍで測定されたシグナルで割ったもの）を決定することによって補正した。この「クロスオーバー活性化」は、実験中に直面するＲＤ−ＹＦＰの発現レベルが異なっても、本質的に一定である。各試料のＦＲＥＴ「実測」値を４３５ｅｘ／５２８ｅｍで記録し、「ドナー」値（ＣＦＰ）を４３５ｅｘ／４８５ｅｍで記録する。各ウェルの「実際の」ＦＲＥＴ／ドナー値は、
ＦＲＥＴａｃｔｕａｌ＝（Ｓｍｐｌ４３５ｅｘ／５２８ｅｍ−Ｘ＊（Ｓｍｐｌ４３５ｅｘ／５２８ｅｍ））／Ｓｍｐｌ４３５ｅｘ／５２８ｅｍ
として反映される。
ＦＲＥＴでタンパク質凝集を測定するこの方法により、視覚的解析および生化学的解析によって確証されたアンドロゲン受容体およびハンチントンタンパク質凝集の薬学的操作ならびに遺伝子操作に呼応して起こる微細な変化の検出が、確実に可能になった。測定されるスペクトルＦＲＥＴの相対量はアクセプター：ドナーの比に依存するので、ＲＤ−ＣＦＰとＲＤ−ＹＦＰを同じ細胞内で共発現させる場合は、３：１という一定の比を使用した。これにより、ドナーシグナルの測定におけるシグナル：ノイズを許容できるものにしつつ、最大に近いＦＲＥＴ効率が得られる。
原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）
ＲＩＰＡ不溶性タンパク質をトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞から抽出し、マイカチップ（Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ， Ｉｎｃ）上で１０分間インキュベートした。次に、試料を１００μｌのｄｄＨ２Ｏで２回すすぎ、室温で放置して乾燥させた。翌日、ＭＦＰ−３Ｄ原子間力顕微鏡（Ａｓｙｌｕｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使って原子間力顕微鏡観察を行なった。
免疫蛍光および共焦点顕微鏡法
前述のように共培養実験用にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を、免疫蛍光およびＸ−３４染色用に調製した。４％パラホルムアミド中、室温で１５分間、固定した後、細胞を２回、室温（ＲＴ）のＰＢＳで５分間洗浄し、ＰＢＳ中の０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中、室温で１０分間、透過処理した。ＰＢＳ中に１％正常ヤギ血清、２０ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有するブロッキング溶液を使って、細胞を、室温で３時間、ブロッキングした。ＨＡに対する一次マウスモノクローナル抗体（Ｃｏｖａｎｃｅ、カリフォルニア州エメリービル）をブロッキング溶液に１：２０００希釈し、４℃で細胞に終夜、適用した。次に、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有するＰＢＳで細胞を５分ずつ３回洗浄し、ブロッキング溶液に１：４００希釈した抗マウスＡｌｅｘａ５４６コンジュゲート二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共にインキュベートした。次に、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有するＰＢＳで、５分ずつ３回、細胞を洗浄し、４０％エタノール、６０％ＰＢＳ、および２０ｍＭ ＮａＯＨの溶液中に調製した１μＭ Ｘ−３４に、室温で１０分間ばく露した。次に、４０％ＥｔＯＨ、６０％ＰＢＳ中で、２分ずつ３回、細胞を洗浄し、１×ＰＢＳで５分ずつ２回すすいだ。共焦点顕微鏡法（４０５共焦点顕微鏡−Ｚｅｉｓｓ）を使って画像をキャプチャした。ＨＪ９．３抗体による伝播阻止の機序を特徴づけるために、ＨＥＫ２９３細胞にＲＤ（ΔＫ）−ＹＦＰをトランスフェクトするか、モックトランスフェクションを行なった。ＲＤ（ΔＫ）−ＹＦＰ細胞またはモックトランスフェクト細胞をＨＪ９．３の存在下で４８時間培養してから、細胞を４％ＰＦＡで固定し、０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で透過処理し、次にヤギ抗マウスＡｌｅｘａ５４６標識二次抗体にばく露した。共焦点顕微鏡法（共焦点顕微鏡−Ｚｅｉｓｓ）を使って画像をキャプチャした。
ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）細胞死アッセイ
ＨＥＫ２９３細胞を９６穴プレートに７５，０００細胞／ウェルでプレーティングした。翌日、細胞に、１００ｎｇのさまざまな形態の非蛍光性ＲＤ−ＨＡプラスミドを、４つ一組にしてトランスフェクトするか、ＤＮＡなしのトランスフェクション複合体にばく露した。翌日、トランスフェクション複合体を含有する培地を取り除き、新鮮な培地で置き換えた。細胞死の陽性対照として、非トランスフェクト細胞を、３７℃で３０分間、さまざまな濃度のスタウロスポリン（１、２、４、２０μＭ）で処理した。次にスタウロスポリン溶液を取り除き、全ての細胞を、３７℃で１０分間、５μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムにばく露した。次に、ヨウ化プロピジウム溶液をフェノール非含有培地で置き換え、励起波長５３５ｎｍおよび放射波長６１７ｎｍのプレートリーダーで蛍光を読み取った。
免疫沈降
トランスフェクト細胞集団を、それだけで、またはマウスモノクローナル抗体ＨＪ９．３（２．５ｎｇ／μｌの抗体に相当する１：１０００）もしくはプールマウスＩｇＧ抗体の存在下で、３時間、６時間、９時間、１２時間、２４時間または４８時間、共培養した。条件培地を収集し、プロテインＧ−アガロースビーズ（Ｐｉｅｒｃｅの５０％スラリービーズ１００μｌ）を培地に加え、回転させながら４℃で終夜インキュベートした。１８時間後に、５００μｌの結合緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ）を試料に加え、２０００×ｇで３分間遠心分離した。上清を捨て、この洗浄ステップを３回繰り返した。次に、ビーズに結合したタンパク質を、高塩濃度溶出緩衝液（５０μｌ）を使って、室温で５分間インキュベートすることで溶出させた。次に試料を２０００×ｇで３分間遠心分離し、上清を収集した。この溶出ステップを１回繰り返し、溶出液を合計１００μｌとした。最初にＨＪ９．３にもＩｇＧにも暴露していない条件培地のもう一つの試料を、ＨＪ９．３（１：１０００）またはＩｇＧ抗体と共に、回転させながら４℃で終夜インキュベートした後、上述と同じ免疫沈降プロトコールに付した。全ての条件からの試料を、４−２０％ポリアクリルアミドゲル（ＢｉｏＲａｄ）で解析し、ＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ中の５％粉乳に１：２０００希釈したタウＲＤに対するウサギポリクローナル抗体（ａｂ６４１９３、Ａｂｃａｍ、マサチューセッツ州ケンブリッジ）で検出した。化学発光に基づくペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体反応を行い、Ｘ線フィルムで検出した。
フローサイトメトリー
ＨＥＫ２９３細胞を１０ｃｍプレートで〜８０％コンフルエントまで平板培養した。次に、細胞に２４μｇのＲＤ（ＬＭ）−ＹＦＰコンストラクトをトランスフェクトするか、ｍＣｈｅｒｒｙレンチウイルスで形質導入した。翌日、３７℃で３分間、０．０５％トリプシンを使って処理することにより、細胞を回収（ｈａｒｖｅｓｔ）し、ペレット化し、新鮮培地に再懸濁した。２つの細胞集団を、それらだけで、または１：１０００希釈もしくは１：１０，０００希釈のタウ−ＲＤに対するマウスモノクローナル抗体ＨＪ９．３（１：１０００は２．５ｎｇ／μｌの抗体に相当する）の存在下で、４８時間、共培養した。その後、細胞を回収（ｈａｒｖｅｓｔ）し、１％ＦＢＳおよび１ｍＭのＥＤＴＡを含有するハンクス平衡培地に再懸濁した。サイトメトリーの直前に事前混合した細胞を陰性対照として使用した。ＭｏＦｌｏ高速セルソーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使って細胞をカウントし、二重陽性細胞のパーセンテージを各条件について解析した。各条件につき３つの生物学的複製を用意し、各実験条件で５０，０００細胞を解析した。
抗タウモノクローナル抗体の脳室内（ＩＣＶ）注射
この研究ではＰ３０１ＳヒトＴ３４アイソフォーム（１Ｎ４Ｒ）を発現するＰ３０１Ｓタウトランスジェニックマウスを使用した。これらのマウスは６ヶ月齢でタウ病態を発生させる。そこで、抗体を６ヶ月齢時に脳室注射によって左側脳室に注入し、これらの注入を１２週間続けた。処置後に、免疫組織化学ならびにＥＬＩＳＡおよび免疫ブロッティングによる生化学的解析のために、マウス脳を加工した。
脳室内注射はＡｌｚｅｔ浸透圧ポンプ２００６モデルを使って行った。Ａｌｚｅｔポンプアセンブリに取り付けた脳カニューレを、ブレグマから前後方向に０．４ｍｍ、正中から側方に１．０ｍｍ、および腹背方向に２．５ｍｍの位置にある各マウスの左側脳室に、外科的に埋め込んだ。処置後に、カニューレの配置をクレシルバイオレット染色で検証した。
実施例９〜１５の序論
タウは、タウオパチーと総称されるいくつかの神経変性疾患において細胞内凝集体を形成する微小管結合タンパク質である。これらには、アルツハイマー病（ＡＤ）、進行性核上性麻痺（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｓｕｐｒａｎｃｕｌｅａｒ ｐａｌｓｙ）（ＰＳＰ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、および前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）が含まれる。タウは、微小管に結合しその集合を促進する可溶性の高い天然解鎖（ｎａｔｉｖｅｌｙ ｕｎｆｏｌｄｅｄ）タンパク質である。タウオパチーでは、適切に染色した場合に変性神経突起および細胞体内に可視化される過剰リン酸化神経原線維変化（ＮＦＴ）中に、タウが蓄積する。タウ病態の量は、進行性神経機能障害およびシナプシス消失、ならびにヒトおよびトランスジェニックマウスモデルにおける機能低下と相関する。
ヒトタウオパチーでは、病態がある脳領域から別の脳領域へと疾患特異的パターンで進行するが、基礎となる機序はまだ明確でない。プリオン仮説では、タウ凝集体は元の細胞から漏れだして隣接する細胞に進入し、そこで、さらなるタウ凝集をシーディングし、病態を伝播すると考える。本発明者らは、以前に、組換えタウ原線維が培養細胞中で完全長細胞内タウの凝集を誘導するであろうこと、および凝集した形態のタウが細胞間で伝達されることを観察していた（Ｆｒｏｓｔ ｅｔ ａｌ．， ２００９；Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １１， １５５−１５９）。さらに、本発明者らは、細胞内タウ原線維が培地中に遊離状態で放出され、それらがレシピエント細胞中のネイティブタウとの直接相互作用によって凝集を伝播することを見出した。抗タウ抗体（ＨＪ９．３）は、レシピエント細胞へのタウ凝集体の取り込みを防止することによって、このプロセスを阻止する（Ｋｆｏｕｒｙ ｅｔ ａｌ．， ２０１２； Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８７， １９４４０−１９４５１）。組換えタウを使った類似の実験に加えて、ＡＤ脳からの対らせん状細線維が細胞質タウ凝集を誘導することが示されている。野生型ヒトタウを発現するマウスの脳にヒトＰ３０１Ｓタウトランスジェニックマウスからの脳抽出物を注射すると、細線維への野生型ヒトタウの集合と病態の拡がりが誘導される。同様の効果は、組換え完全長タウ原線維または切断型タウ原線維の注入後にも起こり、それらは、注射部位から接続された脳領域へと時間依存的に伝播するＮＦＴ様封入体の迅速な誘導を引き起こした。最後に、嗅内皮質における選択的タウ発現は、歯状回および海馬中の細胞の軸索終末域において遅発型の病態を引き起こしたが、これは、凝集体の経シナプス移動と合致する。このように、現在も増えつつある多くの研究が、タウ凝集体は細胞間で伝達され、治療用抗体の標的となりうるという考えを支持している。
ＡＤおよびパーキンソン病（ＰＤ）の諸相を模倣するマウスモデルにおいて、Ａβおよびアルファ−シヌクレインに対する抗体を使った受動免疫化は、脳におけるＡβおよびアルファ−シヌクレイン沈着を低減し、行動欠陥を改善することができる。タウホスホペプチドを使ったタウオパチーマウスモデルにおける能動免疫化は、タウ病態を低減し、いくつかの研究では、行動欠陥を改善した。しかし、ある研究では、完全長組換えタウによるＣ５７ＢＬ／６野生型マウスの能動的免疫化が、タウ病態および神経脱落を誘導した。２つの受動ワクチン接種研究では、病態の発症前に抗体を与えた場合には、タウ病態の低減と運動機能の改善があった。タウ免疫化研究のいくつかには多少の有益な効果があるようだが、病態の発症後に投与される抗タウ抗体に予想される最大効力、標的とするのに最適なタウ種、および治療効果の機序は、まだわかっていない。
実施例９．抗タウ抗体の特徴づけ
以前、本発明者らは、タウ凝集体は培養細胞によって取り込まれるが、単量体は取り込まれないこと、そして内部移行したタウ凝集体は、レシピエント細胞において細胞内タウ凝集を誘発することを観察した（Ｆｒｏｓｔ ｅｔ ａｌ．， ２００９；Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １１， １５５−１５９；Ｋｆｏｕｒｙ ｅｔ ａｌ．， ２０１２；Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８７， １９４４０−１９４５１）。８つのマウスモノクローナル抗体のＨＪ８系列（完全長ヒトタウに対して産生させたもの）および５つの抗体のＨＪ９系列（完全長マウスタウに対して産生させたもの）を、タウ凝集体を含有する脳溶解物の添加によって誘導される細胞タウ凝集を測定するＫｆｏｕｒｙ ｅｔ ａｌ．（２０１２；Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８７， １９４４０−１９４５１）に既述の適合細胞バイオセンサー系で特徴づけた。どの抗体もタウ単量体に効率よく結合し、神経原線維変化を染色するという事実にもかかわらず、シーディングの阻止に関する抗体の効果は一様でなかった。ここに提示する研究には、シーディングを阻止する能力が異なる３つの抗体を選択した。
インビボでの試験に先立って、いずれもＩｇＧ２ｂアイソタイプである抗体の結合アフィニティおよびエピトープを決定した。ヒトタウおよびマウスタウを表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）用のセンサーチップＣＭ５上に固定化した（図３０）。マウスタウに対して産生されたＨＪ９．３抗体は、ヒトタウ（図３０Ａ）とマウスタウ（図３０Ｂ）の両方を、同じ結合定数（ＫＤ＝Ｋｄ／Ｋａ＝１００ｐＭ）で認識する（図３０Ｇ）。会合（Ｋａ）と解離（Ｋｄ）は、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ）を使用し、「Ｆｉｔ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ｋａ／Ｋｄ」（グローバルフィッティング）を選択することにより、１：１（ラングミュア）相互作用モデルで計算した。ヒトタウ（Ｋａ＝７．５×１０４Ｍｓ−１、Ｋｄ＝７．５×１０−６ｓ−１）およびマウスタウ（Ｋａ＝８．６×１０４Ｍｓ−１、Ｋｄ＝９．１×１０−６ｓ−１）に対するＨＪ９．３のＫａおよびＫｄは、両者への強い結合を示す。ＨＪ９．３のエピトープは、アミノ酸３０６〜３２０にあるリピードドメイン（ＲＤ）領域にマッピングされた。マウスタウに対して産生されたＨＪ９．４は、マウスタウに対して高いアフィニティＫＤ（２．２ｐＭ）を有し、会合速度定数が高く（Ｋａ＝２．２８×１０５Ｍｓ−１）、解離定数は極めて低かった（Ｋｄ＝５．１×１０−７ｓ−１）（図３０Ｄおよび表４。しかし、同じ抗体のヒトタウに対するアフィニティ（ＫＤ＝６．９ｎＭ）ははるかに低く（図３０Ｃおよび表４）、会合速度定数（Ｋａ＝１．５×１０５Ｍｓ−１）はマウスタウの場合と同じぐらいだったが、解離がはるかに速かった（Ｋｄ＝１．０７×１０−３ｓ−１）。このように、ＨＪ９．４とヒトタウとの相互作用は、マウスタウとの相互作用より安定性が低い。この抗体のエピトープはアミノ酸７〜１３である。ＨＪ８．５はヒトタウに対して産生させたものである。これはヒトタウに結合するが（図３０Ｅ）、マウスタウには結合しない（図３０Ｆ）。ＫＤ（０．３ｐＭ）（図３０Ｅおよび表４）ならびに低い解離速度（Ｋｄ＝４．３８×１０−８ｓ−１）は、ＨＪ８．５がヒトタウに極めて高いアフィニティで結合することを示している。ＨＪ８．５のエピトープは、アミノ酸２５〜３０にマッピングされた。３つの抗タウ抗体はいずれもＳＰＲにおいてヒトタウ原線維を強く認識した（図３１）。原線維は複数の同一エピトープを有するので、会合速度および解離速度を直接的に計算することはできなかった。
表４ ヒトタウおよびマウスタウに対する各抗体の会合速度定数（Ｋａ）、解離速度定数（Ｋｄ）および結合定数（ＫＤ）。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ）を使用し、「Ｆｉｔ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ｋａ／Ｋｄ」（グローバルフィッティング）を選択することにより、１：１（ラングミュア）相互作用モデルで、ＫａおよびＫｄを計算した。Ｍｓ−１＝ミリ秒、Ｍ＝モル濃度、ｓ＝秒
Figure 0006345655
抗体を免疫ブロッティングおよび免疫染色でも評価した。ウェスタンブロットでは、３つの抗体がいずれもヒトタウに結合した（図３０Ｈ）。ＨＪ９．３およびＨＪ９．４はマウスタウに結合したが、ＨＪ８．５はマウスタウには結合しなかった（図３０Ｈ）。本発明者らの以前の知見と合致して（Ｙａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．， ２０１１；Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ３１， １３１１０−１３１１７）、３ヶ月齢と比較して９ヶ月齢のＰ３０１Ｓマウスでは、リアセンブリ（ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ）緩衝液（ＲＡＢ）可溶性タウが少ないようであった。３ヶ月齢および９〜１２ヶ月齢のトランスジェニックＰ３０１Ｓマウス脳においてＨＪ８．５がヒトタウを染色することも見出された。タウ免疫反応性は細胞体および細胞突起全体に存在した（図３２）。タウ凝集体を持つ９〜１２ヶ月齢のＰ３０１Ｓマウスでは、ＨＪ８．５が細胞体中のタウ凝集体を検出した（図３２Ａ）。他の抗体も同様の結果をもたらした（表５）。全ての抗体がＡＤ脳内の神経原線維変化およびニューロピルスレッドに結合した（図３２）。
表５ 異なるアッセイにおける抗タウ抗体の相対的効力
Figure 0006345655
実施例１０．タウ抗体はＰ３０１Ｓタウ凝集体の取り込みおよびシーディング活性を阻止する
Ｐ３０１Ｓ脳溶解物中に存在するシーディング活性を評価するために、本発明者らが以前に記載した細胞バイオセンサー系（Ｋｆｏｕｒｙ ｅｔ ａｌ．， ２０１２）を適合させた。これは、シアン蛍光タンパク質または黄色蛍光タンパク質のいずれかに融合されたΔＫ２８０変異を含有するタウのリピートドメイン（ａａ２４３〜３７５）（ＲＤ（ΔＫ）−ＣＦＰ／ＹＦＰ）の発現に基づく。これらの細胞への外因性凝集体の取り込みは、ＲＤ（ΔＫ）−ＣＦＰ／ＹＦＰの細胞内凝集を誘発し、それは、蛍光プレートリーダーで記録される蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によって検出される。バイオセンサー細胞系に添加された１２ヶ月齢Ｐ３０１Ｓマウスからの清澄化脳溶解物は、ＲＤ（ΔＫ）−ＣＦＰ／ＹＦＰレポーターの強い凝集を誘導したことから、タウシーディング活性の存在が示された（図３３Ａ）。１２ヶ月Ｐ３０１Ｓ脳ホモジネートマウスからのシーディング活性は、５０ｎＭ（単量体換算）の組換え完全長原線維にほぼ匹敵する（非掲載データ）。
タウノックアウトマウス、野生型マウス、またはタウ病態を欠く３ヶ月齢Ｐ３０１Ｓマウスからの溶解物によって誘導される凝集はほとんどまたは全くなかった（図３３Ａ）。抗タウ抗体（ＨＪ８．５、ＨＪ９．３およびＨＪ９．４）を、これらの溶解物の取り込みおよびシーディング活性を阻止するその能力について評価した。ＨＪ３．４（マウスモノクローナル抗Ａβ抗体）を陰性対照とした。抗タウ抗体はシーディング活性を効果的に阻止した（図３３Ｂ）。抗体の相対的効力を決定するために、抗体（０．１２５、０．２５、０．５、１、２μｇ／ｍｌ）を、固定された量のＰ３０１Ｓ脳溶解物に対して滴定した（図３３Ｃ）。ＨＪ８．５抗体は、対照と比較して、わずか０．２５μｇ／ｍｌの濃度でシーディング活性を阻止した。０．５μｇ／ｍｌでは、ＨＪ８．５抗体とＨＪ９．３抗体の両方が、対照と比較して、取り込みおよびシーディング活性を有意に阻止した。ＨＪ９．４は、取り込みおよびシーディング活性の阻止に関してもっとも弱く、このことはマウスタウに対するその高いアフィニティと合致した。３つの抗タウ抗体はいずれも、事後の細胞透過処理および染色によって検出されるとおり、ＨＥＫ２９３細胞による取り込み後に、内部移行したタウ凝集体を検出した。しかし、これらの抗体をＰ３０１Ｓ脳溶解物と共に、およびＰ３０１Ｓ脳溶解物なしで、プレインキュベートした場合、これらの抗体はいずれも、抗マウス二次抗体による染色時に細胞内部には検出されなかった（図３４）。他の阻害様式も考えられるものの、これらのデータは、タウ凝集体の細胞取り込みの阻止に基づく機序と合致している。
実施例１１．抗タウ抗体の脳室内注入
マウスコロニーにおいて、Ｐ３０１Ｓマウスが最初に細胞内タウ病態を発生させるのは５ヶ月齢からである。慢性的脳室内（ＩＣＶ）投与によって３つの抗体の効力を調べるために、６ヶ月齢で各マウスの左側脳室にカテーテルを外科的に埋め込み、Ａｌｚｅｔ皮下浸透圧ミニポンプにより、３ヶ月間にわたって抗タウ抗体を持続的に注入した（図３５Ａ）。抗Ａβ抗体ＨＪ３．４およびリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を陰性対照として使用した。６週間後に、各ポンプを、新鮮な抗体溶液またはＰＢＳを充填したものと置き換えた。脳切離時に、各マウスの左側脳室におけるカテーテルの配置をクレシルバイオレット染色によって検証した（図３５Ｂ）。カテーテルが正しく設置されていたマウスだけを解析に含めた。インビボで６週間後の抗体の安定性を調べるために（図３５Ａ）、動物から取り出した時に、残存するポンプ内容物を収集し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシーブルー染色を使って抗体を評価した。軽鎖および重鎖は無傷であって断片化しておらず、ウェスタンブロット上でタウ結合活性を保っていた（非掲載データ）。注入中のＣＳＦおよび血清における抗タウ抗体の濃度を見積もるために、ビオチン化ＨＪ８．５（ＨＪ８．５Ｂ）を４８時間投与した（約７．２μｇ／日）（図３５Ａ）。遊離ＨＪ８．５Ｂの濃度はＣＳＦ中では７．３μｇ／ｍｌ、血清中では６．２μｇ／ｍｌであったことから、ＣＮＳから末梢への抗体の有意なクリアランスが示された（表６）。ヒトタウに結合したＨＪ８．５ＢもＣＳＦと血清の両方に検出されたが、濃度は遊離抗体より低かった（表６）。
表６ ＩＰ投与またはＩＣＶ投与の４８時間後の血清および脳脊髄液（ＣＳＦ）における遊離の（タウに結合していない）ビオチン化ＨＪ８．５抗体およびタウに結合しているＨＪ８．５抗体のレベル
Figure 0006345655
実施例１２．抗タウ抗体処置は異常リン酸化タウを低減する
３ヶ月間の処置後のＰ３０１Ｓマウスにおけるタウ病態の程度を決定するために、タウ病態に関する多重染色を行なった。脳切片をまず抗ホスホタウ抗体ＡＴ８による免疫染色によって評価した（図３６）。ＡＴ８は、マウスタウとヒトタウの両方のリン酸化残基Ｓｅｒ２０２およびＴｈｒ２０５に結合する（図３６）。ＰＢＳおよびＨＪ３．４で処置されたマウスでは、ＡＴ８が、複数の脳領域において、特に梨状皮質、嗅内皮質、扁桃体、および海馬において、ニューロン細胞体およびニューロピルを強く染色した（図３６Ａおよび図３６Ｂ）。ＨＪ８．５処置はＡＴ８染色を著しく低減し（図３６Ｃ）、ニューロピルでは特にそうであった。ＨＪ９．３およびＨＪ９．４もＡＴ８染色を減少させたが、その効果はわずかに低かった（図３６Ｄおよび３６Ｅ）。梨状皮質（図３７Ａ）、嗅内皮質（図３７Ｂ）、および扁桃体（図３７Ｃ）におけるＡＴ８染色の定量的解析により、全ての抗タウ抗体処置マウスにおけるホスホ−タウの著しいが一様ではない低減が証明された。ＨＪ８．５抗体は梨状皮質、嗅内皮質、および扁桃体におけるＡＴ８染色を著しく低減した。ＨＪ９．３はＨＪ８．５と比較して効果がわずかに減少しており、ＨＪ９．４は嗅内皮質でも扁桃体でも有意な効果があったが、梨状皮質では効果がなかった（図３７）。海馬は、他の領域と比べてはるかに多様なＡＴ８染色を主に細胞体において呈し、それゆえに処置群には対照群との対比で統計的有意差がなかった（図３７Ｄ）。雄Ｐ３０１Ｓマウスは雌よりタウ病態が多いと報告されているので、両性別と処置の効果も評価した（図３８）。処置の効果に加えて、雄マウスで解析された全ての脳領域においてＡＴ８染色は有意に多かった（表７）。しかし、性別に関する調整後も、抗体の効果は依然として著しく有意であり、事実上同一であった（表８）。雄および雌における処置群と対照も別々に比較したところ、抗体ＨＪ８．５の効果は依然としてもっとも有意であった（図３８Ａおよび図３８Ｂ）。
表７ 処置／性別のｐ値
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 表８
Figure 0006345655
実施例１３．複数の染色様式の相関関係
タウアミロイド沈着について調べるために、チオフラビンＳ（ＴｈｉｏＳ）を使って脳切片を染色した（図３９）。盲検評価者を使ってＴｈｉｏＳ染色を半定量的に評価し、全ての対照および抗タウ抗体処置マウスにおいて、１（染色なし）から５（最大染色）までのスコアを与えた。半定量的評価によれば、ＨＪ８．５処置は、ＰＢＳおよびＨＪ３．４と比較して、ＴｈｉｏＳ染色を有意に低減した（図３９Ａおよび図３９Ｂ）。ＰＢＳ、ＨＪ８．５、およびＨＪ９．３で処置されたマウス（各群からｎ＝６）を、タウホスホ残基Ｓｅｒ３９６およびＳｅｒ４０４を認識するＰＨＦ１モノクローナル抗体でも染色した。ＡＴ８染色とＰＨＦ１染色は有意に相関したことから（ｒ＝０．６３０、ｐ＝０．００５）（図４０Ａ）、異なるタウエピトープに対する２つの抗ホスホタウ抗体は類似する結果を与えることが示された。
タウオパチーを含む多くの神経変性疾患は、タンパク質凝集および細胞傷害を取り囲む脳の領域にミクログリア活性化を呈する。抗ＣＤ６８抗体を使って処置群におけるミクログリア活性化を評価した（図４１）。ＨＪ８．５処置およびＨＪ９．３処置は、対照と比較して、梨状皮質、嗅内皮質、および扁桃体におけるミクログリア活性化を低減した（図４１Ａ〜４１Ｄ）。ＨＪ９．４はＨＪ８．５およびＨＪ９．３と比較して梨状皮質における効果が弱く（図４１Ｃ〜４１Ｅ）、これは、ＡＴ８染色結果（図３７Ａ）と合致した。ミクログリア活性化は全ての試料においてＡＴ８染色と強く相関した（ｒ＝０．５１１、ｐ＝０．００３８）（図４０Ｂ）。
実施例１４．抗タウ抗体は界面活性剤不溶性タウおよびシーディング活性を低減する
皮質における可溶性タウおよび不溶性タウのレベルを決定するために、ＲＡＢ（水性緩衝液）、放射性免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）（界面活性剤緩衝液）、および７０％ギ酸（ＦＡ）による逐次的な生化学的抽出を行うことで、最終ペレットを可溶化した。全タウは、ヒトタウとマウスタウの両方を同じＫＤ（０．３４ｐＭ）で検出する抗タウ抗体ＨＪ８．７によるＥＬＩＳＡで定量した。処置抗体がＥＬＩＳＡを妨害する可能性は、解析に先立って陽性対照試料にこれらの抗体をスパイクし、妨害がないことを観察することによって排除した（非掲載データ）。図３７における病理学的解析で評価した全てのマウスを解析した。ＲＡＢ可溶性画分（図４２Ａ）またはＲＩＰＡ可溶性画分（図４２Ｂ）中の全タウレベルは全ての群間で類似していた。界面活性剤不溶性／７０％ＦＡ可溶性画分は、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットに先立ち試料を中和することによって解析した。研究された各動物を解析したところ、ＨＪ８．５およびＨＪ９．３は界面活性剤不溶性タウを対照との対比で＞５０％減少させることがわかった（図４２Ｃ）。代表的な試料（各群からｎ＝４）は、ＨＪ８．５およびＨＪ９．３で処置されたマウスにおける不溶性タウレベルの減少を、ウェスタンブロットで例証している（図４０Ｃ）。ＨＪ９．４処置群ではＰＢＳまたはＨＪ３．４との対比で不溶性タウレベルに相違はなかった。平均ＡＴ８染色が図３７における結果の平均値を反映している各群Ｎ＝６匹のマウスにおいて、界面活性剤不溶性／７０％ＦＡ可溶性画分中のヒトタウおよびマウスタウも特異的に評価した。７０％ＦＡ可溶性画分にはマウスタウよりヒトタウの方が有意に多く存在し、抗体はこの画分におけるヒトタウを有意に低下させたが、マウスタウは有意に低下させなかった（図４２Ｄおよび図４２Ｅ）。これらと同じ試料において、ＡＴ８免疫反応性シグナルのレベルをＥＬＩＳＡによって評価した。ＡＴ８シグナルは、この画分における全タウについてみられたものと同様に、抗体処置試料の方が低くかった（図４２Ｆ）。
脳におけるタウ凝集の低減はシーディング活性の低減と相関するであろうという仮説を立てた。そこで、細胞バイオセンサーアッセイを使って、異なる処置群からの皮質ＲＡＢ可溶性画分中のＰ３０１Ｓ脳シーディング活性を調べた。Ｐ３０１ＳマウスにおけるＩＳＦタウを評価した本発明者らによる以前のデータでは、タウの生化学的に可溶なプールと不溶なプールの両方と平衡状態にある細胞外タウ凝集体が存在する可能性が示唆された（Ｙａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．， ２０１１；Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ３１， １３１１０−１３１１７）。まず、ＰＢＳまたはＨＪ３．４で処置されたマウスからの溶解物で細胞を処理した後に、ＲＤ（ΔＫ）−ＣＦＰ／ＹＦＰの細胞内凝集を評価した。これらの群からの溶解物は、ＦＲＥＴシグナルを強く誘導した（図４３Ａ）。ＨＪ８．５およびＨＪ９．３で処置されたマウスの皮質組織からの溶解物には、著しく低いシーディング活性が観察された（図４３Ａ）。これは脳溶解物中の残存抗体によるのではなかった、なぜなら、脳溶解物の免疫沈降後に抗体／ビーズ複合体からシーディング活性を溶出させた場合も、同じパターンが生じたからである（図４３Ｂ）。このように、ＨＪ８．５およびＨＪ９．３は、Ｐ３０１Ｓタウトランスジェニックマウス脳におけるシーディング活性を低減する。ＨＪ９．４はシーディング活性を有意に低減しなかった（図４３Ａ）。シーティング活性は、ＥＬＩＳＡによって検出される界面活性剤不溶性／ギ酸可溶性タウの量と強く相関したが（ピアソンのｒ＝０．５２９、ｐ＝０．０００１）（図４３Ｃ）、ＲＡＢ画分中の全タウとは相関しなかった（図４３Ｄ）。シーディング活性はＲＡＢ可溶性画分中に存在するタウ凝集体によるものであるという仮説を立てた。これを検証するために、半変性界面活性剤−アガロースゲル電気泳動（ＳＤＤ−ＡＧＥ）を行なってから、ウェスタンブロットを行なった。３ヶ月齢Ｐ３０１Ｓマウスには、タウ単量体に加えて、高分子量タウ種が存在し、９ヶ月齢Ｐ３０１Ｓマウスにはさらに多量に存在することが観察された（図４３Ｅ）。これら高分子量種の構成要素は、おそらく、ＦＲＥＴアッセイにおいて検出されるシーディング活性を構成すると思われ、界面活性剤不溶性／ギ酸可溶性画分中に存在するタウと平衡状態にあるのだろう。
実施例１５．抗タウ抗体は文脈的恐怖消失を回復する
９ヶ月齢のＰ３０１Ｓタウトランスジェニックマウスの研究において、対照群と抗タウ抗体処置群を、さまざまな行動について比較した。自発運動活性、探索行動、または感覚運動機能の尺度に、群間の相違はなかった（図４４）。Ｐ３０１Ｓマウスにおける認知機能欠損を回復する抗タウ抗体処置の能力を、条件恐怖手法でマウスの成績を評価することによって、査定した。１日目には、マウスの４つの処置群の全てが、トレーニングチャンバにおける最初の２分間に、類似するレベルのベースラインフリージングを呈した。これは、ｒｍＡＮＯＶＡによって確認され、ここでは処置に関わる有意な全体的主効果または交互作用は何も明らかにならなかった（図４５Ａ）。加えて、４つの群の全てが音−ショック（Ｔ／Ｓ）条件刺激−無条件刺激（ＣＳ−ＵＳ）ペアリング中に、類似するレベルのフリージングを示した（図４５Ａ）。３回のＴ／Ｓペアリングで群間にフリージングレベルの相違が全般的に欠如していることは、有意でない処置の効果と、有意でない遺伝子型×分数交互作用によって実証された。
１日目の試験中に群間で相違がなかったのとは対照的に、２日目に実施した文脈的恐怖試験（連合学習の一形態）からのフリージングレベルには、２つの抗タウ抗体群とＰＢＳ＋ＨＪ３．４対照マウスとの間で、強い（ｒｏｂｕｓｔ）相違があった（図４５Ｂ）。続く計画的比較では、ＨＪ８．５マウスが、ＰＢＳ＋ＨＪ３．４対照群との比較で、８分間の試験セッション全体を平均して、有意に上昇したフリージングレベルを示したこと（図４５Ｃ）［Ｆ（１，４５）＝８．３０、ｐ＝０．００６］、またＨＪ９．４マウスも同様であったがその程度は低かったこと［Ｆ（１，４５）＝５．６０、ｐ＝０．０２２］がわかった。このように、ＨＪ８．５は、連合学習の保存に全体として、より強い効果を有するようであった。
実施例９〜１５に関する考察
タウオパチーの病理発生に関するモデルの一つでは、ある細胞中で生産された凝集体が細胞外間隙に漏れ出すか放出されて、隣接する細胞または接続された細胞における凝集を促進すると考えられている。脳溶解物からのタウシーディング活性を特異的に阻止する治療用抗体の選択により、以前になされた能動的または受動的タウワクチン接種の報告と比べて、それ以上ではないとしても、少なくとも同じ程度には強い、強力なインビボ応答が予測されることが観察された。細胞外タウ凝集体の存在に対して高感度な細胞バイオセンサーアッセイで実験を開始した。Ｐ３０１Ｓトランスジェニックマウスからの脳溶解物は、さらなる細胞内凝集を誘導することができるシーディング活性を含有することがわかった。一群の抗タウ抗体をスクリーニングした後、タウシーディング活性の阻止に関してさまざまな活性を持つ３つを選択した。これらの抗体を、Ｐ３０１Ｓタウオパチーマウスに、病態が始まった時点（６ヶ月）から開始して、３ヶ月にわたってＩＣＶ注入した。抗体の注入により、ＣＳＦと血清の両方にかなりの濃度の抗体が存在する結果となり、ＣＮＳから末梢へと抗体が流出するという以前の報告と合致した。インビトロでもっとも強力な抗体であるＨＪ８．５による処置は、タウ病態を大きく低減し、ニューロピルからそれを著しく減少させた。この効果は、複数の独立した染色、不溶性タウの生化学的解析、および脳溶解物中に存在する残存タウシーディング活性の解析によって検出された。さらに、この処置は、このモデルにおいて検出される行動欠陥の一つを改善した。全ての抗体が、細胞へのタウ凝集体の取り込みを阻止し、このアッセイでは細胞外凝集体の存在下または非存在下で、どの抗体も細胞内には観察されなかった。これらの抗体の効力は、かつては細胞自律的であると考えられていた神経病態の病理発生における細胞外タウの明確な役割を暗示している。さらにまた、この研究は、細胞内病態の状況下で凝集体フラックスが起こりうることを示唆する本発明者らの先の知見を拡張するものであり、細胞外種を標的とすることによって凝集体のクリアランスを補助することができる治療法の可溶性を高めるものである。最後に、この研究は治療用抗体の設計に関して重要な意味を有し、特にシーディング活性を標的とすることで最も効果的な薬剤が得られるであろうことを示唆している。
機序に基づく抗体治療．タウに対する以前の能動的および受動的末梢免疫療法アプローチのいくつかもタウ病態を低減し、行動欠陥を改善したが、基礎にある抗体選択の論理的根拠は、ホスホ−エピトープ、神経原線維変化との反応性に基づくか、または明示されていなかった。マウスを完全長タウでワクチン接種することによって行われたタウ免疫化研究の一つは、野生型マウスにおいて、病態を誘導した。しかし、その後の、タウトランスジェニックモデルにおけるホスホ−タウペプチドによる能動免疫化アプローチは、タウ病態を低減し、行動改善を示した。ある受動免疫化研究では、ＪＮＰＬ３タウトランスジェニックマウスに、タウオパチーの発症に先立って、２〜３ヶ月齢の時点でＰＨＦ１抗体が腹腔内投与された。ＰＨＦ−１は病態型の異常リン酸化タウを標的とする。処置はタウ病態を低減し、行動を改善した。しかし、これは不溶性リン酸化タウを減少させたものの、全不溶性タウは変化しなかった。もう一つの受動免疫化研究では、ＪＮＰＬ３マウスおよびＰ３０１Ｓマウス（２〜３ヶ月齢時、タウオパチーの発症前）にＰＨＦ１抗体が末梢投与されるか、または凝集体関連エピトープを標的とするＭＣ１抗体が末梢投与された。どちらの処置もタウ病態を改善し、運動機能障害の発症を遅延させた。これらの先行研究では、抗体の作用機序が明確でなく、いずれも明示的には検定されなかった。実際、細胞内機序を提案した者もあった。そのうえ、どの研究も、本明細書に掲載する実施例で述べる規模のタウ病態の低減をもたらすことはなかったようである。ただし、他の研究では末梢注入が利用されたのに対して、抗体はＣＮＳに注入され、利用した動物モデルも異なった。
この研究は、細胞外タウシードが病理発生の重要な構成要素であるという予測を検定するために、明示的に設計された。この研究は、予測される活性の範囲で薬剤を試験する目的で、インビトロでタウシーディングを阻止する能力を有する抗体を拾い上げるための選択プロセスから始めた。インビボで試験した抗体はすべて、凝集体の取り込みおよびシーディングを効果的に阻止し、観察されたそれらの活性の根拠となった。加えて、抗体アフィニ、エピトープ、アイソタイプ、グリコシル化、およびリン酸化型のタウに結合する能力の相関関係も、将来の研究において評価することが重要であるだろう。これは、抗タウ抗体の直接的ＣＮＳ内注入の効果を報告する初めての研究でもある。利用した抗体がそれぞれ異なるタウエピトープを標的とし、いずれもホスホ−タウを標的とはしなかったという事実にもかかわらず、３つのうち２つは、免疫組織学的にも生化学的にも異常タウ負荷を著しく低減し、２つは記憶を有意に改善し、そのうちの一方は他方よりその程度が大きかった。タウ病態に対する効果は、内在するシーディング活性の低減とも非常によく相関した。
ＨＪ８．５およびＨＪ９．３は、インビボで病理学的タウシードを著しく減少させた。タウ病態の著しい低減は、隣接細胞におけるタウ凝集の誘導を防止することによって起こったのかもしれない。ＨＪ９．４は病態をそれほど強くは減少させなかったが、扁桃体におけるタウ病態は減少させた。抗体間での異なる脳領域における有効性のばらつきは、抗体が結合アフィニティに微細な相違を有する領域特異的凝集体コンフォーマーの形成によるのかもしれない。
細胞外タウ凝集体がインビボで抗タウ抗体によって隔離された場合のそれらの代謝運命はまだ明確でない。３ヶ月の抗体投与後に、ミクログリア活性化の低減が見出されたが、これはおそらく、タウ関連病態および神経変性の減少によるのであろう。しかしこれは、細胞外凝集体のクリアランスの効率が向上したことによるものであって、それが、関連するミクログリア活性化の低減を伴うのかもしれない。抗Ａβ抗体による数ヶ月間の受動免疫化も、ミクログリオーシスを低減することが注目されている。抗体／タウ複合体がインビボで取り除かれる機序およびそれらがタウ病態を減少させる機序は、まだ決定的には解明されていない。抗α−シヌクレイン抗体による免疫化は、リソソーム分解を促進することによって、α−シヌクレイン凝集体を取り除くことが示唆されている。抗α−シヌクレイン抗体を使った最近の研究では、抗体は、主としてミクログリアによる、おそらくはＦｃ受容体を介した、α−シヌクレインクリアランスを標的とすることが示された。ニューロンはＦｃγ受容体を発現するので、抗原との複合体を形成したＩｇＧを、高アフィニティＦｃγＲＩ受容体によって内部移行させることができるだろう。内部移行したタウ抗体もエンドソーム中のタウと接触し、最終的には、エンドソーム／オートファジー−リソソーム系による細胞内タウ凝集体のクリアランスを誘導するかもしれない。この研究で使用した抗タウ抗体は、細胞外タウ集合体に結合することができるが、細胞内での有意な局在化の証拠は見つからなかった。ただし、だからといって、細胞がインビボで抗体／タウ複合体を取り込むことでタウ凝集体クリアランスおよび炎症に影響を及ぼすという可能性が排除されることはない。例えば、ウイルスとの複合体を形成した抗体は、サイトゾルのＩｇＧ受容体ＴＲＩＭ２１に結合して、抗体／ウイルス複合体をプロテアソームにターゲティングすることが、最近になって示されている。加えて、ＴＲＩＭ２１に結合した抗体は、免疫シグナリングを活性化することも示された。抗体／非感染性抗原複合体とＴＲＩＭ２１との相互作用はまだわかっていないが、そのような機序が抗タウ抗体と関連するかどうかを決定することは興味深いことであるだろう。興味深いことに、タウオパチーのＰ３０１Ｓモデルでは、有意なタウ病態の発生に先立って先天免疫系が活性化され、早期の免疫抑制がタウ病態を減弱するという証拠もある。抗体が炎症によって誘導されるタウ凝集体を捕捉して、その後の凝集体誘導性の炎症および疾患進行を低減する可能性もありうる。
細胞外タウおよびタウ病態の拡がり．本明細書に記載する研究では、病理発生における細胞外タウの役割が、暗黙的に試験される。細胞外タウ凝集体が、その供給源が組換えタンパク質であるか哺乳動物細胞から抽出されたタウであるかを問わず、細胞の内部にあるネイティブタウの原線維形成を誘発できることは、現在では十分明確になっている。細胞培地に加えられたＨＪ９．３が内部移行を阻止し、遊離の原線維を免疫沈降させた本発明者らの以前の研究に基いて、経細胞伝播の媒介物質としての遊離タウ凝集体の役割が、最初に仮定された（すなわち膜封入型でない）（Ｋｆｏｕｒｙ ｅｔ ａｌ．， ２０１２；Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８７， １９４４０−１９４５１）。
動物モデルにおいて、タウ凝集体は、ある領域から別の領域へ（例えば嗅内皮質から歯状回および海馬中の下流のニューロンへ）と、見かけ上、拡がることができる。本発明者らは、単量体型タウが、インビボでは、非病理学的条件下でさえ、脳間質液中に絶えず放出されることを見出している（Ｙａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．， ２０１１；Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ３１， １３１１０−１３１１７）。本発明者らは、外因性凝集体が可溶性ＩＳＦタウのレベルを低減することも見出し、この間隙においてシーディングおよび／または隔離現象が起こりうることを示唆した（Ｙａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．， ２０１１；Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ３１， １３１１０−１３１１７）。総合すると、細胞外タウ凝集体が形成され、隣接する細胞、接続された細胞によって取り込まれるか、場合によっては同じ細胞に再び取り込まれ、それによってタンパク質ミスフォールディングの負荷量を増加させることができるという概念を、豊富な証拠が支持している。この証拠から、細胞外シーディング活性を捕捉する治療法は疾患を寛解させるはずであると、明確に予測される。本明細書に提示する実施例に記載する知見は、この考えに合致している。
病理発生におけるタウフラックスの役割．事実上全てのニューロンにおいてプリオンプロモーターによって変異体タウ発現を駆動するＰ３０１Ｓなどのマウスモデルは、凝集の経細胞伝播を阻止する抗体処置の恩恵を受けるはずであると、演繹的に予測されることはないであろう。理論上、病態は、この易凝集性タンパク質を発現する全てのニューロンにおいて独立して起こりうる。しかし本発明者らによる以前の研究では、タウ凝集体のフラックスの役割が示唆された、というのも、細胞培地に添加されたＨＪ９．３は、凝集体の定常状態レベルを、経時的に増加させたからである。凝集体フラックスのモデルにはさらなる検討が必要であるが、本明細書に提示する結果はこの考えと合致している、というのも抗体処置は、細胞内タウ病態を大きく低減させたからである。タウ取り込みを阻止する抗体は、もう一つの機序（おそらくミクログリアが関連するもの）によるクリアランスを促進しうる「シンク」を、細胞外間隙に作りうると予測される。
治療用抗体およびシーディング活性の標的化．医薬産業では、細胞内に蓄積する易凝集性タンパク質を標的とする治療用抗体を開発する努力がますます盛んになっている。最も重要な基準は、患部脳内に蓄積することが知られているエピトープに抗体が結合することであった。このアプローチはインビボで最適な活性を持つ抗体をもたらす場合もあるし、もたらさない場合もある。本明細書の実施例は、脳内に存在するシーディング活性を阻止する効力を強調する治療用抗体開発の新しいモデルを支持するものである。このアプローチを使用することにより、今までに報告されたものより高い見かけの効力を有する抗体が同定された。プリオン仮説の拡張として、異なるタイプのタウオパチーを持つ患者では異なるタウ凝集体「株（ｓｔｒａｉｎ）」が優勢であり、それらは異なる抗体に対してユニークな感受性を有しうることを、さらに提唱する。いずれにせよ、本明細書に記載するような抗体効力の高感度インビトロアッセイを使用することにより、抗体に基づく治療法のはるかに効率のよい開発と最適化が可能になるであろう。
抗タウ抗体の、特にＨＪ８．５抗体での、強い保護効果は、ヒトタウオパチーの処置戦略として、このタイプのアプローチを考慮すべきであることを示唆している。ＩＣＶアプローチでの抗体の慢性的投与も考えうるが、将来の研究では、予防的に与えられた場合と治療的に与えられた場合の両方で、これらの抗体の末梢投与でのＰＫ／ＰＤ応答を決定することが重要であるだろう。加えて、タウシーディングアッセイは、抗体によるターゲット結合をモニターするのにも役立ちうる。
実施例９〜１５の実験手法
抗体．ＨＪ９．３およびＨＪ９．４マウスモノクローナル抗体は、タウノックアウトマウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）をマウスタウに対して免疫化することによって産生させ、ＨＪ８．５およびＨＪ８．７はモノクローナル抗体は、タウノックアウトマウスをヒトタウに対して免疫化することによって産生させた。ＨＪ９．３、ＨＪ９．４およびＨＪ８．７モノクローナル抗体は、マウスタウとヒトタウをどちらも認識する。しかしＨＪ８．５モノクローナル抗体はヒトタウだけに結合する（エピトープは残基２５〜３０にある［ＮＣＢＩリファレンス配列：ＮＰ＿００５９０１］）。ＨＪ９．３抗体はタウのＲＤ領域（残基３０６〜３２０にあるエピトープ）を認識する。ＨＪ９．４抗体はタウのＮ末端領域（残基７〜１３にあるエピトープ）を認識する。対照抗体として、ヒトＡβ配列のＮ末端領域（残基１〜１６にあるエピトープ）を認識するＨＪ３．４マウスモノクローナル抗体を使用した。ＨＪ８．５、９．３、および９．４モノクローナル抗体はＩｇＧ２ｂアイソタイプである。ウサギポリクローナルタウ抗体（ａｂ６４１９３、エピトープはリピートドメイン領域に位置する）はＡｂｃａｍから購入した。マウスモノクローナルビオチン化ＢＴ−２抗体はヒトタウとマウスタウ（残基１９４〜１９８にあるエピトープ）を認識する。これはＰｉｅｒｃｅから購入した。ラット抗マウスモノクローナルＣＤ６８抗体はＡｂＤ ＳｅｒｏＴｅｃから購入した。ビオチン化ＡＴ８抗体はＴｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。
表面プラズモン共鳴．表面プラズモン共鳴実験はＢＩＡｃｏｒｅ ２０００表面プラズモン共鳴計測器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ−ＢＩＡｃｏｒｅ）で行なった。ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド）およびＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）を１：１の比で使用して、ＢｉａｃｏｒｅセンサーチップＣＭ−５を、７分間活性化した。１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）中の５μｇ／ｍｌの組換えヒトタウもしくはマウスタウまたはヒトタウ原線維を５μｌ／分の流速で固定化することにより、センサーチップ表面を飽和させた。残存する未結合領域を１Ｍエタノールアミン（ｐＨ８．５）でブロッキングした。参照用に、１つのフローセルをＮＨＳおよびＥＤＳで活性化した後、１Ｍエタノールアミンでブロッキングする。次に、全ての抗タウ抗体を、濾過脱気０．０１Ｍ Ｈｅｐｅｓ緩衝液、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．００５％サーファクタントＰ２０、ｐＨ７．４中、異なる濃度（０．１１、０．２３、０．４６、０．９、１．８、３．７、７．５μｇ／ｍｌ）で、流速を１０μｌ／分にして注入した。全ての試料を２つ組にして実験した。一つの抗体濃度での実験が終わるごとに、１０ｍＭグリシン（ｐＨ１．７）を使って、チップ上の固定化タウを乱さずに、タウに結合した抗体を除去することにより、チップの表面を完全に再生した。データ解析はＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ−ＢＩＡｃｏｒｅ）を使って行なった。
タウ線維化．８μＭ組換え完全長ヒトタウを２ｍＭジチオスレイトールと共に室温で４５分間プレインキュベートしてから、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび１００ｍＭ ＮａＣｌおよび８μＭヘパリンを２００μｌの総体積になるように加え、次に、３７℃で７日間インキュベートすることにより、原線維を形成させた。原線維形成後に、１００ｋＤａ Ｍｉｃｒｏｃｏｎ遠心分離フィルタを製造者の説明書（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に従って使用することにより、試料中の残存タウ単量体を分離した。
ビオチン化ＨＪ８．５抗体のＩＰ投与およびＩＣＶ投与．マウスモノクローナルＨＪ８．５抗体を製造者の説明書（スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンキット、Ｐｉｅｒｃｅ）に従ってビオチン化した。ビオチン化ＨＪ８．５（ＨＪ８．５Ｂ）を５０ｍｇ／ｋｇで５〜６ヶ月齢Ｐ３０１Ｓマウス（ｎ＝３）に腹腔内（ｉｎｔｅｒｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ）注射（ＩＰ）によって投与した。４８時間後にマウスを屠殺した。血清およびＣＳＦを収集し、使用時まで−８０℃で保存した。ＨＪ８．５Ｂは、５〜６ヶ月齢Ｐ３０１Ｓマウス（ｎ＝３）の左側脳室中に、外科的に埋め込まれた浸透圧ポンプにより、脳室内注射（ＩＣＶ）でも投与した。抗体を４８時間持続的に注入した。４８時間後にマウスを屠殺した。血清およびＣＳＦを収集し、使用時まで−８０℃で保存した。
脳室内（ＩＣＶ）注射法．ＩＣＶ注入はＡｌｚｅｔ浸透圧ポンプ２００６モデル（Ｄｕｒｅｃｔ）で行なった。マウスの齢は手術の時点で６ヶ月だった。手術の前に、Ｌ字型カニューレを管（３ｃｍ長）に取り付け、次にそれを、抗体または媒体（リン酸緩衝食塩水−ＰＢＳ、ｐＨ７．４）を保持するＡｌｚｅｔポンプに取り付けた。側脳室への配置に先立ってポンプを活性化するために、このアセンブリをＰＢＳ中、３７℃で６０時間プレインキュベートした。定位装置（Ｄａｖｉｄ Ｋｏｐｆ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使って、イソフルラン麻酔下に、ブレグマから前後方向に０．４ｍｍ、正中から側方に１．０ｍｍ、および脳の表面から腹背方向に２．５ｍｍの位置にある各マウスの左側脳室に、アセンブリを外科的に埋め込んだ。湾曲した鈍先仕上げの剪刀で皮下ポケットを作ることにより、Ａｌｚｅｔ浸透圧ポンプを皮下に置いた。埋め込まれたカニューレのそれぞれを、アンカーステンレス鋼スクリューに沿って歯科用セメントで固定した。セメントの乾燥後に、皮膚を縫合した。ポンプ中の抗体（２ｍｇ／ｍｌ）またはＰＢＳは、脳の左側脳室中に継続的に注入された。これらの浸透圧ポンプは、最大２００μｌの容量を保持し、３．６μｌ／日の流速で送出することで、１日あたり７．２μｇの抗体の注入をもたらす。各マウスにおいて、６週間の注入後に、浸透圧ポンプを代えた。各マウスからＡｌｚｅｔポンプを取り出した後に、ポンプ内に残っている溶液を収集し、−８０℃で保存した。９ヶ月齢の時点で、全てのマウスを屠殺した。外科的埋め込みを行なったマウスは全て個別に飼育した。
組織学．１２週間の処置後に、Ｐ３０１Ｓマウスをペントバルビタール２００ｍｇ／ｋｇ）で腹腔内麻酔した後、冷ダルベッコＰＢＳ中の３Ｕ／ｍｌヘパリンで灌流した。脳を取り出し、２つの半球に切断した。脳の左側を４％パラホルムアルデヒド中で２４時間固定し、ＰＢＳ中の３０％スクロースに移し、４℃で保存してから、ドライアイス粉末中で凍結し、−８０℃で保存した。半分の脳を凍結滑走式ミクロトームで５０μｍ切片に冠状切断し、全ての切片を凍結保護物質溶液（０．２Ｍリン酸緩衝食塩水、３０％スクロース、３０％エチレングリコール）と共に２４穴プレートに入れて、使用時まで−２０℃で保存した。海馬と皮質を、各脳の灌流したばかりの右半球から、生化学的解析のために切離した。切離した組織は全て解析時まで−８０℃で保存した。左側脳室中へのカニューレの配置は、既述のように（Ｈｏｌｔｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９６；Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ ３９， １１４−１２２）、３００μｍ離れた脳切片をマウントし、クレシルバイオレットで染色することによって検証した。染色された組織は、ＮａｎｏＺｏｏｍｅｒデジタル病理システム（浜松ホトニクス）を使ってスキャンした。
細胞培養／シーディングアッセイ：Ｐ３０１Ｓ脳溶解物および抗体処置
１０％ウシ胎児血清、１００μｇ／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補足したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中でＨＥＫ２９３細胞を培養した。培養物を、３７℃、５％ＣＯ２の湿潤雰囲気で維持した。一過性トランスフェクションのために、ＨＥＫ２９３細胞を、ｏｐｔｉｍｅｍ培地中、２５０，０００細胞／ウェルで、１２穴プレートにプレーティングし、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００試薬と６００ｎｇの適当なＤＮＡコンストラクト（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とを使用し、製造者の推奨に従って、トランスフェクトした。コトランスフェクト細胞には、１５０ｎｇのＲＤ（ΔＫ２８０）−ＣＦＰコンストラクトと４５０ｎｇのＲＤ（ΔＫ２８０）−ＹＦＰコンストラクトの組み合わせを与えた。１５時間後に、３７℃で３分間、０．０５％トリプシンを使って、細胞を回収（ｈａｒｖｅｓｔ）し、次に９６穴プレートに４つ一組にして再プレーティングし、１５時間培養した。次に、全ての抗タウモノクローナル抗体（ＨＪ８．５、９．３および９．４）またはＨＪ３．４抗体（モノクローナル抗Ａβ抗体）と共にプレインキュベートしたＰ３０１Ｓ脳溶解物［プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）およびホスファターゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を含む１×ＴＢＳ中に調製］を、回転させながら４℃で１６時間、さまざまな濃度（０．１２５μｇ／ｍｌ、０．２５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌおよび２μｇ／ｍｌ）で加えた。異なる抗体で３ヶ月間処置したＰ３０１Ｓマウスにおけるシーディング活性を決定するために、全ての処置マウスのＲＡＢ可溶性画分も、さまざまな濃度で細胞に加えた。細胞をさらに２４時間培養してから４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＦＲＥＴ解析を行なった。
免疫沈降．ＰＢＳ処置マウスまたは抗体処置マウスからのＲＡＢ可溶性画分を、プロテインＧ−アガロースビーズに架橋したマウスモノクローナル抗タウ抗体ＨＪ９．３およびＨＪ８．５（キットの推奨に従った−Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋ Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎキット）の存在下、４℃で、エンドオーバーエンド（ｅｎｄ−ｏｖｅｒ−ｅｎｄ）回転させながら、２４時間インキュベートした。加えて、抗体処置マウスからのＲＡＢ可溶性画分を、非コンジュゲートプロテインＧ−アガロースビーズの存在下でも、４℃で、エンドオーバーエンド回転させながら、２４時間インキュベートした。１８時間後に、５００μｌの結合／洗浄緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ）を試料に加え、２０００×ｇで３分間遠心分離した。上清を捨て、この洗浄ステップを３回繰り返した。次に、ビーズに結合したタンパク質を、低ｐＨ溶出緩衝液（２５μｌ）を使って、室温で５分間インキュベートすることで溶出させた。次に試料を２０００×ｇで３分間遠心分離し、上清を収集した。この溶出ステップを１回繰り返し、溶出液を合計５０μｌとした。タウ凝集体を含有するタウ免疫沈降物（ＩＰ）を、シーディングアッセイによるさらなる解析のために、最初の脳溶解物実験と等価な量でコトランスフェクトＲＤ（ΔＫ）−ＣＦＰ／ＹＦＰ細胞に再び適用した。
脳組織抽出．各脳の皮質を３０μｌ／ｍｇのＲＡＢ緩衝液［プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）およびホスファターゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を補足した１００ｍＭ ＭＥＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ ＭｇＳＯ４、７５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４］中でホモジナイズした。簡単に述べると、Ｏｐｔｉｍａ ＭＡＸ−ＴＬ超遠心機（Ｂｅｃｋｍａｎ）を使って、試料を４℃、５０，０００ｇで２０分間遠心分離した。上清をＲＡＢ可溶性画分として収集し、ペレットを３０μｌ／ｍｇのＲＩＰＡ緩衝液［プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）およびホスファターゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を補足した１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ トリス、０．５％デオキシコール酸、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．５％ＳＤＳ-２５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０］に再懸濁し、４℃、５０，０００ｇで２０分間遠心分離した。上清をＲＩＰＡ可溶性画分として集めた。ペレットをさらに１０μｌ／ｍｇの７０％ギ酸に再懸濁し、４℃、５０，０００ｇで、２０分間遠心分離した。上清を７０％ギ酸画分として収集した。全ての画分を解析時まで−８０℃で保存した。
電気泳動および免疫ブロッティング．ゲル電気泳動を、４−１２％ＮｕＰＡＧＥビス−トリスゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により、還元条件下で行なった後、ＩＢｌｏｔ装置（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使ってＰＶＤＦ膜に転写した。７０％ギ酸画分は、ローディングしてゲル電気泳動に付す前に、１０Ｎ ＮａＯＨと中和緩衝液（１ｍｏｌ／Ｌトリス塩基；０．５モル／Ｌ ＮａＨ４ＰＯ４）の１：１混合物で１：３に希釈することによって中和した。染色済み分子量標準「ＳｅｅＢｌｕｅ」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を各泳動に含めた。０．１％のＴｗｅｅｎ ２０を含有するトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）中の５％ミルクで膜をブロッキングした。次に、膜を５分ずつ３回洗浄した。ウサギポリクローナルタウ抗体（Ａｂｃａｍ、１：２０００）をギ酸画分中のタウを検出するための一次抗体として使用した。浸透圧ポンプからその注入前と注入後に収集した処置マウス抗タウ抗体も、一次抗体として使用した。次に、膜をヤギ抗ウサギまたはヤギ抗マウス二次抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１：２０００）と共にインキュベートした。全ての膜をＥＣＬ ｐｒｉｍｅ基質（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で発光させた。バンドをＧ：Ｂｏｘ化学発光イメージャー（Ｓｙｎｇｅｎｅ）で可視化した。
脳ホモジネートからのタウに対する抗タウ抗体の免疫反応性を決定するために、９ヶ月齢Ｐ３０１Ｓマウス、３ヶ月齢Ｐ３０１Ｓマウス、３ヶ月齢野生型マウスおよび３ヶ月齢タウノックアウトマウス試料のＲＡＢ可溶性画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、ウェスタンブロッティングを行なった。各ＲＡＢ可溶性画分からの全タンパク質１μｇを４−１２％ＮｕＰＡＧＥビス−トリスゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に還元条件下でローディングした後、ＩＢｌｏｔ装置（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使ってニトロセルロース膜に転写した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＴＢＳ（ＴＢＳＴ）中の５％ミルクで膜をブロッキングした後、一次抗体（ＨＪ８．５、ＨＪ９．３およびＨＪ９．４）と共にインキュベートした。ＨＲＰコンジュゲートロバ抗マウスＩｇＧ（１：２０００、Ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ）を二次抗体として使用し、Ｌｕｍｉｇｅｎ ＴＭＡ６（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使って膜を発光させた。
遊離ＨＪ８．５Ｂとタウに結合したＨＪ８．５Ｂを検出するためのＥＬＩＳＡ．ＩＰ投与またはＩＣＶ投与の４８時間後にマウスの血清およびＣＳＦにおける遊離ＨＪ８．５Ｂの濃度を決定した。９６穴ＥＬＩＳＡプレートを４℃において５０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトタウでコーティングした。ＥＬＩＳＡプレートを３７℃で１時間、４％ＢＳＡでブロッキングした。次にプレートを５回洗浄してから、試料緩衝液（プロテアーゼ阻害剤を補足したＰＢＳ、３００ｎＭトリス（ｐＨ７．４）中の０．２５％ＢＳＡ）に希釈し４℃で終夜インキュベートした血清試料およびＣＳＦ試料と共に、インキュベートした。翌日、プレートをＰＢＳで８回洗浄し、次にストレプトアビジン−ポリ−セイヨウワサビペルオキシダーゼ−４０（１：６０００、Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ）を暗所、室温で、１．５時間加えた。次に、プレートをＰＢＳで８回洗浄し、Ｓｕｐｅｒ Ｓｌｏｗ ＥＬＩＳＡ ＴＭＢ（Ｓｉｇｍａ）で発色させ、６５０ｎｍで読み取った。標準曲線を作成するために異なる濃度のＨＪ８．５Ｂを使用し、これを、各プレートで、血清試料およびＣＳＦ試料と共に処理した。
タウに結合したＨＪ８．５Ｂの濃度は、９６穴ＥＬＩＳＡプレートを４℃において２０μｇ／ｍｌのＨＪ８．７抗体でコーティングすることによって測定した。ＥＬＩＳＡプレートを３７℃で１時間、４％ＢＳＡでブロッキングした。次にプレートを５回洗浄してから、試料緩衝液に希釈し４℃で終夜インキュベートした血清試料およびＣＳＦ試料と共に、インキュベートした。翌日、プレートをＰＢＳで８回洗浄し、ストレプトアビジン−ポリ−セイヨウワサビペルオキシダーゼ−４０（１：６０００、Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ）と共に、暗所、室温で、１．５時間インキュベートした。次に、プレートをＰＢＳで８回洗浄し、Ｓｕｐｅｒ Ｓｌｏｗ ＥＬＩＳＡ ＴＭＢ（Ｓｉｇｍａ）で発色させ、６５０ｎｍで読み取った。組換えタウとの複合体を形成した精製ＨＪ８．５Ｂの異なる希釈液を使って、各プレートにおいて標準曲線を作成した。
タウサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイ．全タウレベルを決定するために、ＥＬＩＳＡハーフ９６穴プレート（Ｃｏｓｔａｒ）を、炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）中のＨＪ８．７抗体（２０μｇ／ｍｌ）でコーティングし、振とう機上、４℃で終夜インキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートをＢｉｏＴｅｋ ＥＬｘ４０５プレート洗浄機を使ってＰＢＳで５回洗浄し、ＰＢＳ中の４％ＢＳＡにより、３７℃で１時間、ブロッキングした。次に、プレートを５回洗浄してから、ウェルを、試料緩衝液（プロテアーゼ阻害剤を補足したＰＢＳ、３００ｎＭトリス（ｐＨ７．４）中の０．２５％ＢＳＡ）で希釈して４℃でインキュベートしたＲＡＢ、ＲＩＰＡ、または７０％ＦＡ生化学的抽出可溶性脳組織画分と共に、インキュベートした。７０％ＦＡ画分は、１Ｍトリス（ｐＨ１１）で１：２０希釈してから試料緩衝液で希釈することにより、中和した。翌日、プレートをＰＢＳで８回洗浄し、次に、ＰＢＳ中の０．５％ＢＳＡに入っているビオチン化マウスモノクローナル抗タウ抗体ＢＴ−２抗体（０．３μｇ／ｍｌ、Ｐｉｅｒｃｅ）を、３７℃で１．５時間加えた。次にプレートをＰＢＳで８回洗浄してから、ストレプトアビジン−ポリ−セイヨウワサビペルオキシダーゼ−４０（１：４０００）を暗所、室温で１．５時間加えた。次にプレートをＰＢＳ中で８回洗浄し、Ｓｕｐｅｒ Ｓｌｏｗ ＥＬＩＳＡ ＴＭＢ（Ｓｉｇｍａ）で発色させ、ＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ ２プレートリーダーにより、吸光度を６５０ｎｍで読み取った。各プレートにおいて組換えヒトタウを使って標準を作成した。各プレートで、陰性対照ウェルでは一次抗体を省略した。Ｅｖａ−Ｍａｒｉａ Ｍａｎｄｅｌｋｏｗの研究室で生産された最も長い組換えヒトタウ（ｈＴａｕ４０、４４１ａａ）およびマウスタウ（ｍＴａｕ４０、４３２ａａ）アイソフォームを、ＥＬＩＳＡアッセイにおける標準として使用した。
７０％ＦＡ画分中のヒトタウのレベルを決定するために、ＥＬＩＳＡ ９６穴プレートを、マウスモノクローナル抗体Ｔａｕ５（２０μｇ／ｍｌ）でコーティングし、検出にはマウスモノクローナル抗ヒトタウ特異的ビオチン化ＨＴ７抗体（０．２ｕｇ／ｍｌ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用した。７０％ＦＡ画分中のマウスタウレベルについては、ＥＬＩＳＡ ９６穴プレートをモノクローナル抗マウスタウ特異的ＨＪ９．２抗体（２０μｇ／ｍｌ）でコーティングし、検出にはモノクローナルビオチン化ＨＪ８．７を使用した。各プレート上で組換えヒトタウおよび組換えマウスタウを標準として使用した。位置Ｓｅｒ２０２およびＴｈｒ２０５でのホスホタウレベルを決定するために、ＥＬＩＳＡハーフ９６穴プレートをマウスモノクローナルＨＪ８．７抗体（２０μｇ／ｍｌ）でコーティングし、ビオチン化ＡＴ８抗体（０．２ｕｇ／ｍｌ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を検出抗体として使用した。
免疫組織化学．脳における異常リン酸化タウの存在を検出するために、全ての処置マウスから３００μｍの間隔で得た３つの５０μｍ冠状脳切片を評価した。脳切片をトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）および０．２５％（体積／体積）Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ中の３％ミルクでブロッキングした後、ｓｅｒ２０２およびｔｈｒ２０５でリン酸化されたタウを認識するビオチン化ＡＴ８抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１：５００）と共に、４℃で終夜インキュベートした。残基ｓｅｒ３９６およびｓｅｒ４０４での異常リン酸化タウを認識するビオチン化ＰＨＦ１抗体（１：２００）も使用して、ＡＴ８抗体染色とＰＨＦ１抗体染色の間の相関関係を決定した。相関関係研究のために、ＨＪ８．５、ＨＪ９．３、およびＰＢＳ処置群からマウス（Ｎ＝６）をランダムに選択した。染色された組織を、ＮａｎｏＺｏｏｍｅｒデジタル病理システムを使ってスキャンした。ＡＴ８染色と活性化ミクログリア染色の間の相関関係を決定するために、全ての処置群の選ばれたマウス（Ｎ＝６）からの脳切片を、０．２５％（体積／体積）Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含むＴＢＳ中の１０％正常ヤギ血清でブロッキングし、ラット抗マウスＣＤ６８抗体（ＡｂＤ ＳｅｒｏＴｅｃ、１：５００）と共に４℃で終夜インキュベートした。次に、切片を、ビオチン化ヤギ抗ラットＩｇＧ抗体、マウス吸着処理済み（Ｖｅｃｔｏｒ、１：２０００）と共にインキュベートした。全ての切片を、ＮａｎｏＺｏｏｍｅｒスライドスキャナー（浜松ホトニクス）でスキャンした。すべての画像をＮＤＰビューアーソフトウェアを使ってエクスポートし、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（米国国立衛生研究所）を使って定量した。ＡＴ８染色には、マウス脳アトラスにおいてブレグマ座標−１．４、−１．７、および−２．０ｍｍにある切片にほぼ対応する、３００μｍずつ離れた、各マウスからの３つの脳切片を使用した。これらの切片を使って、異常リン酸化ビオチン化ＡＴ８抗体染色が占める面積のパーセンテージを決定した。全ての変換画像を一様にしきい値処理することでＡＴ８染色を定量し、３つ全ての切片の平均を使って、異常リン酸化タウ染色で覆われた面積のパーセンテージを各マウスについて決定した。ＰＨＦ−１染色とＣＤ６８染色には、３００μｍ離れた、各マウスからの２つの脳切片を使用した。これらは、マウス脳アトラスにおいてブレグマ座標−２．３および−２．６ｍｍに対応する。ＴｈｉｏＳ染色を決定するために、全ての処置群から無作為に選択したマウス（Ｎ＝６）からの脳切片を、５０％エタノール中のＴｈｉｏＳ（０．２５ｍｇ／ｍｌ）において染色した後、５０％エタノールおよび蒸留水中で洗浄した。次に切片をマウントし、乾燥し、Ｎａｎｏｚｏｏｍｅｒを使った顕微鏡観察によって画像を評価した。ＰＨＦ−１染色およびＣＤ６８染色に使用したものに隣接する各マウスからの２つの脳切片を、記載のとおり使用した。
半変性アガロースゲル電気泳動（ＳＤＤ−ＡＧＥ）
３ヶ月齢タウノックアウト（ＫＯ）マウス、３ヶ月齢野生型（ＷＴ）マウス、３ヶ月齢Ｐ３０１Ｓマウスおよび９ヶ月齢ＰＢＳ処置Ｐ３０１Ｓマウスの異なるＲＡＢ可溶性画分中に存在するタウ種を分離するために、既述の半変性界面活性剤アガロースゲル電気泳動（ＳＤＤ−ＡＧＥ）法にわずかな変更を加えて使用した。試料を、０．２％ＳＤＳを含む緩衝液Ｇ（２０ｍＭトリス、２００ｍＭグリシン）中の水平１．５％アガロースゲルで泳動した。試料を、試料緩衝液（６０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、０．２％ＳＤＳ、５％グリセロール、および０．０５％ブロモフェノールブルー（ｂｒｏｍｐｈｅｎｏｌ ｂｌｕｅ））中、室温で７分間インキュベートした。電気泳動後に、レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）緩衝液（緩衝液Ｇ／０．１％ＳＤＳ）中、４℃で、タンパク質をゲルからＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ ＰＶＤＦシート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に転写した。抗タウ特異的ウサギポリクローナル抗体（Ａｂｃａｍ）を１：２０００で使って、膜をブロッティングした。ＧＥ ＥＣＬ Ｐｌｕｓシステムを使ってブロットを発光させた。
免疫蛍光．ポリＤ−リジンでコーティングした２４穴プレートに７５，０００細胞／ウェルでＨＥＫ２９３細胞をプレーティングした。使用した抗タウ抗体がＨＥＫ２９３細胞によって取り込まれるタウ種を検出できるかどうかを決定するために、細胞をＰ３０１Ｓ脳溶解物で２時間処理し、次にＰＢＳで３回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドを使って室温で１５分間固定した後、室温のＰＢＳで３回洗浄した。細胞を０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で１０分間透過処理し、ＰＢＳで３回洗浄した後、１０％正常ヤギ血清および２０ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを含有するＰＢＳ中の０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００でブロッキングした。次に、細胞を、Ａｌｅｘａ−ｆｌｕｏｒ ５４６とコンジュゲートした抗マウス二次抗体と共にインキュベートした。抗体が細胞に進入することができるかどうかを決定するために、Ｐ３０１Ｓ脳溶解物を、異なる抗タウ抗体ＨＪ８．５、ＨＪ９．３、およびＨＪ９．４またはＡβに対するＨＪ３．４抗体と共に、およびこれらを伴わずに、プレインキュベートした。次に、溶解物をＨＥＫ２９３細胞に２時間加え、固定し、透過処理した。Ａｌｅｘａ−ｆｌｕｏｒ ５４６とコンジュゲートした二次抗体を使って抗体を同定した。核染色には４’，６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ；青色で示す）を使用した。画像は全て、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ５共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）を使ってキャプチャした。
病理学的データおよび生化学的データの統計解析．全てのデータを平均±ＳＥＭとして表し、異なる条件を一次元配置ＡＮＯＶＡとそれに続くダネットの事後検定を使って比較することにより、対照を処置群と比較した。統計的有意性をＰ＜０．０５と設定した。統計解析はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５．０４ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）を使って行なった。ＡＴ８染色の定量的評価については、性別が有意要因であるので、ＳＡＳバージョン９．２ソフトウェアを使って、結果を性別で調整した。
処置および性別を要因として適用する統計解析．対照群（ＰＢＳおよびＨＪ３．４）の平均を、各処置群と比較した。（ＰＢＳの平均＋ＨＪ３．４の平均）／２と処置の平均との対比）。二元配置ＡＮＯＶＡを使って、性別と処置が有意要因であるかどうかを検定した。これはＳＡＳバージョン９．２中のＰＲＯＣ ＧＬＭによって行われ、それらのｐ値を表７に示す。ＳＡＳバージョン９．２のＰＲＯＣ ＧＬＭでは、ＣＯＮＴＲＡＳＴステートメントを使って、全ての比較にアクセスした。二元配置ＡＮＯＶＡにおいて調整因子として性別を適用した。調整前／後のｐ値を図３８Ｄに示す。
行動試験．認知機能を評価するために使用した条件恐怖試験の結果を解釈するための追加対照データを得るために、マウスを、自発運動活性および探索行動ならびに一連の感覚運動尺度およびロータロッドについて評価した。条件恐怖試験は、短時間フットショックが他の行動指標に及ぼす影響を排除するために、一連の試験の最後に行なった。
ホールボード探索行動、感覚運動バッテリーおよびロータロッド．全てのマウスをホールボード探索行動試験で評価した。この試験では、全歩行運動（全身運動）およびホールポーク（ｈｏｌｅ ｐｏｋｅ）を３０分間にわたって定量し、それらを自発運動活性および探索行動の指標とした。このプロトコールでは、４つのコーナーホールと４つのサイドホールを含み、サイドホールがコーナーホールの間に等間隔に存在する、コンピュータ化ホールボード装置（４１×４１×３８．５ｃｍ高）を使用した（学習ホールボード（Ｌｅａｒｎｉｎｇ Ｈｏｌｅｂｏａｒｄ）；ＭｏｔｏｒＭｏｎｉｔｏｒ、Ｋｉｎｄｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ＬＬＣ、カリフォルニア州パウェイ）。フォトビーム計測を使って、試験セッション中の全歩行運動および探索ホールポークを定量した。この手法は、本発明者らの一般ホールボード探索行動／嗅覚選好試験の慣れコンポーネントとして役立った。マウスを、バランス（レッジ、プラットフォーム）、協調（ポール、６０°および９０°傾斜スクリーン）、強さ（逆スクリーン）、および小さい区切られた領域の外への移動の開始（歩行開始）を評価するために使用される一連の７つの感覚運動尺度についても試験した。このバッテリーは以前の刊行物において使用されたものであり、手順の詳細は（Ｗｏｚｎｉａｋ ｅｔ ａｌ．（２００４；Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ｄｉｓ １７， ４０３−４１４）に見出すことができる。ロータロッド試験は以前に公表した方法と同様であり、次の３タイプの試行が含まれた：１）静止ロッド（最大６０秒；２）定速ロータロッド（２．５ｒｐｍで最大６０秒；および３）加速ロータロッド（０〜１８０秒間で２．５〜１０．５ｒｐｍ）。本発明者らのプロトコールは、運動学習を制限するために３日離した３回の試験セッションのそれぞれについて、１回の静止ロッド試行、２回の定速ロータロッド試行、および２回の加速ロータロッド試行で、各マウスを試験することからなった。
条件恐怖．マウスを条件恐怖試験で評価した。これが最後に実行した行動測定である。簡単に述べると、それぞれのチャンバが全く異なる視覚キュー、臭気キュー、および触覚キューを持つ２つのＰｌｅｘｉｇｌａｓ条件づけチャンバ（２６ｃｍ×１８ｃｍ、および１８ｃｍ高さ）（Ｍｅｄ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、バーモント州セントオルバンズ）で、マウスをトレーニングし、試験した。各マウスを５分間の試行のために条件づけチャンバに入れ、２分間のベースライン期間中のフリージング行動を定量した。３分時点から開始して、その後６０秒間隔で、マウスを３回の音−ショックペアリングにさらした。この際、各ペアリングには、広帯域ホワイトノイズからなる８０ｄＢの音（条件刺激；ＣＳ）の２０秒間の提示と、それに続いて音の最後１秒間に提示される１．０ｍＡの連続的フットショック（無条件刺激；ＣＳ）とが含まれた。加齢によって起こりうる聴覚障害の可能性を避けるために、周波数特異的な音ではなく広帯域ホワイトノイズを使用した。翌日、マウスを条件づけチャンバに戻し、文脈的恐怖条件づけを評価するために８分間にわたって、フリージング行動を定量した。２４時間後に、異なるキューを含む他方のチャンバにマウスを入れ、フリージング行動を２分間の「変更文脈」ベースライン中に定量し、その後、８分間は、聴覚キュー（音；ＣＳ）を提示しながら、定量した。フリージングは、各０．７５秒の区間における行動をフリージングまたは非フリージングと類別する「フリージングしきい値」を調整しつつ行動の同時視覚化を可能にするＦｒｅｅｚｅＦｒａｍｅ画像解析ソフトウェア（Ａｃｔｉｍｅｔｒｉｃｓ、イリノイ州エバンストン）を使って定量した。フリージングを通常の呼吸に伴うもの以外は運動がないことと定義し、フリージング時間のパーセントとしてデータを表した。文脈的恐怖条件づけの程度を評価するために、本発明者らは、１日目の２分間ベースラインにわたって平均したフリージング時間パーセントを、２日目の文脈的恐怖試験の最初の２分間での平均フリージング時間パーセントならびに８分間のセッション全体にわたって平均したフリージングレベルと比較する解析を、各処置群内で行なった。条件恐怖試験の完了後に、Ｋｈｕｃｈｕａ ｅｔ ａｌ．（２００３；Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １１９， １０１−１１１）に既述の手法に従って、ショック感度を評価した。
行動データの統計解析．行動データの解析には、通例、分散分析（ＡＮＯＶＡ）モデルを使用した（Ｓｙｓｔａｔ １２、Ｓｙｓｔａｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、イリノイ州シカゴ）。条件恐怖データは、１つの被験者間変数（処置）と１つの被験者内（反復測定）変数（分数）とを含む反復測定（ｒｍ）ＡＮＯＶＡモデルを使って解析した。ｒｍＡＮＯＶＡモデルの基礎をなす球面性／複合対称性仮定の破綻を防ぐために、水準数が２を超える被験者内効果の全てに、アルファレベルのＨｕｙｎｈ−Ｆｅｌｄｔ調整を利用した。一定の重要な仮説を検定するために、ＰＢＳ＋ＨＪ３．４対照群と３つの他の抗体処置群（すなわちＨＪ８．５、ＨＪ９．３、ＨＪ９．４）のそれぞれとの間の計画的比較を、ＡＮＯＶＡモデル内で行なった。別の例では、関連する有意な全体的ＡＮＯＶＡ効果後にペアワイズ比較を行ない、これを適宜ボンフェローニ補正に付した。ホールボード試験中に記録された全歩行運動と２日目の文脈的恐怖試験中のフリージング時間パーセントとの間のピアソンの相関関係（ｒ）も計算した。
実施例１６．タウＥＬＩＳＡアッセイ
患者の血漿試料中の病理学的タウ凝集体を検出するためにＥＬＩＳＡアッセイを開発した。このアッセイで使用される抗体には、マウスモノクローナル抗タウＨＪ９．３およびＨＪ９．２が含まれる。ワンステップ抗体ビオチン標識キット（Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を使ってＨＪ９．３をビオチン化する（ＨＪ９．３−Ｂｉｏ）。このサンドイッチＥＬＩＳＡではＨＪ９．３とＨＪ９．２を捕捉抗体として等濃度で利用する。９６穴ハーフエリアプレート（Ｃｏｓｔａｒ ３６９０）を、炭酸水素塩緩衝液（ｐＨ９．６）中に調製した２０μｇ／ｍｌのＨＪ９．２／ＨＪ９．３（５０μｌ／ウェル）でコーティングし、４℃で終夜インキュベートする。４％ＢＳＡ／ＰＢＳを使ったブロッキングステップ後に、血漿試料（試料緩衝液（０．２５％ＢＳＡ／ＰＢＳ、３００ｎＭトリス（ＰＨ７．４〜８．０）、１×プロテアーゼ阻害剤）中に１：４希釈）を３つ一組にしてウェルに適用する（５０μｌ／ウェル）。次に、プレートを４℃で終夜インキュベートする。検出のために、０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ中に０．３μｇ／ｍｌで調製したＨＪ９．３−Ｂｉｏを、ウェルに、３７℃で１．５時間加えた。ＴＭＢ ｓｕｐｅｒ ｓｌｏｗ基質を使った酵素反応による最終的検出には、０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ中に１：４，０００希釈の二次ストレプトアビジン−ポリＨＲＰ４０抗体（５０μｌ／ウェルおよび室温で振とう機上、暗所で１．５時間）を使用する。本ＥＬＩＳＡは血漿中の希少種の検出を最適化するために設計された。初期の実施形態には、凝集体のトラッピングを最適化するために、ＥＬＩＳＡプレートの表面を抗体ペアでコーティングすることが含まれた。ただし、アッセイの感度を増加させるために、より大量の液体試料から、抗体被覆ビーズを使用することも、同様に妥当であるだろう。健常若年参加者から収集した陰性血漿を使って、アッセイのバックグラウンドシグナルを計算した。実験試料におけるタウシードの存在は、陰性血漿からのシグナルに対する誘導倍率として報告される。
開示したシーディングアッセイで予め試験された発症前患者およびアルツハイマー病（ＡＤ）患者からの一組の血漿試料使って、サンドイッチタウＥＬＩＳＡアッセイを検証した。シーディング活性を伴わない１２人の対照患者（ＣＤＲ ０）（陰性）と、シーディング活性を伴う１２人の患者（ＣＤＲ＞０）（陽性）を、新しく開発したＥＬＩＳＡアッセイを使って試験した。これらの患者は、ＣＳＦおよび血漿におけるシーディング活性の有無が、バイオセンサー細胞アッセイに基いて、予め決定された。この細胞アッセイでは、ΔＫ２８０変異を含有するタウタンパク質のＲＤフラグメントが、シアン蛍光タンパク質または黄色蛍光タンパク質に融合される。これは、ＦＲＥＴで蛍光共鳴エネルギー移動を測定することによる凝集の検出を可能にする。細胞外凝集体は細胞に入ると、タウＦＲＥＴレポータータンパク質の細胞内凝集を誘発する。
図４５に示すように、シーディング活性が陽性であるＡＤ患者の血漿にはタウシードが明確に存在するのに対して、シーディング活性が陰性である患者の血漿にはタウ凝集体が検出されなかった。この無細胞ベースのアッセイは、アルツハイマー病を含む多くのタウオパチーのための非侵襲的診断ツールとして、臨床の場により近い環境で使用することができるだろう。さらに、これは、認知症を発症する運命にある初期病態を持つ人々の検出を可能にして、標本集団の質を高めることにより、臨床治験計画を容易にするであろう。最終的には、抗タウ治療法または他の抗認知症治療法の効力をモニターするために、これを使用することができるであろう。
実施例１７
一つの集団からもう一つの集団へのタウ凝集体の伝播を測定するために細胞伝播アッセイを設定した。リピートドメイン（ＲＤ）から構成されるタウのフラグメントを、ＣＦＰタグ付き型の凝集を促進するための２つの疾患関連変異（ＬＭ：Ｐ３０１Ｌ／Ｖ３３７Ｍ）を持つタグ無し型として、または１つの疾患関連変異（ΔＫ：ΔＫ２８０）として使用した。一つの細胞群に、ＲＤ（ＬＭ）とＲＤ（ΔＫ２８０）−ＣＦＰをトランスフェクトし、もう一つにはＲＤ（ΔＫ２８０）−ＹＦＰをトランスフェクトした。９６穴フォーマットで４つ一組にして成長させた細胞からのＦＲＥＴを蛍光プレートリーダーで記録した。ＦＲＥＴシグナルは、ＲＤ−ＣＦＰ凝集体がＲＤ−ＹＦＰを含有する細胞に移動するか、その逆の結果として生じる。複数の抗体を、表示したさまざまな希釈度で培地に加えた。抗体の出発濃度は約１ｍｇ／ｍｌとした。例えば１０−３希釈とは約１μｇ／ｍｌの最終濃度を示す。２４時間後に細胞を固定し、ＦＲＥＴ測定値を記録した。個々の抗体に関するデータを図４７に提示する。いくつかの抗体は凝集の経細胞伝播を極めて強力に防止した（例えばＨＪ８．２、ＨＪ９．１）。別の抗体は、それよりは中間的に有効であり（例えばＨＪ９．３）、いくつかは本質的に有効でなかった（ＨＪ８．７）。各グラフにおいて、最初のバーは、伝播のベースライン効率に相当する抗体が添加されていない培地を表す。
抗体の相乗作用を試験するために、個々の抗体を表示の濃度範囲で希釈した状況で伝播の効果を決定するか、または抗体を等モル比で混合した後、同じ範囲にわたって滴定した。いくつかのペアは著しく相乗的であったが（例えばＨＪ９．３／９．４）、互いに妨害しあうものもあった（ＨＪ８．５／９．１）（図４８）。
タウ凝集体取り込みに対する抗体の効果はフローサイトメトリーで測定することもできる。蛍光色素で化学的に標識した組換えＲＤ原線維に細胞をばく露した。トリプシン処理と分散後に、フローサイトメーターを使って細胞をカウントした。ＨＪ９．３は蛍光標識細胞の数を用量依存的に低減することから、凝集体取り込みの阻害が示された（図５０）。

Claims (14)

  1. タウに特異的に結合し、
    アミノ酸配列・配列番号１６のＣＤＲ１、アミノ酸配列・配列番号１７のＣＤＲ２、およびアミノ酸配列・配列番号１８のＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、
    アミノ酸配列・配列番号１９のＣＤＲ１、アミノ酸配列・配列番号２０のＣＤＲ２、およびアミノ酸配列・配列番号２１のＣＤＲ３を含む重鎖可変領域
    とを含む、単離された抗体。
  2. ０．１ｐＭ〜１０ｎＭの相互作用のアフィニティ（ＫＤ）で、ヒトタウに特異的に結合する、請求項１に記載の単離された抗体。
  3. ０．１ｐＭ〜１ｎＭの相互作用のアフィニティ（ＫＤ）で、ヒトタウに特異的に結合する、請求項１に記載の単離された抗体。
  4. ヒトタウに特異的に結合し、マウスタウに結合しない、請求項１に記載の単離された抗体。
  5. ヒト化抗体である、請求項１に記載の単離された抗体。
  6. 細胞タウ凝集アッセイにおいてタウシーディング活性を特異的に阻止することができる、請求項１に記載の単離された抗体。
  7. キメラ抗体である、請求項１に記載の単離された抗体。
  8. 軽鎖可変領域および重鎖可変領域がフレームワーク領域を含む、請求項１に記載の単離された抗体。
  9. ＩｇＧアイソタイプである、請求項８に記載の単離された抗体。
  10. キメラ抗体である、請求項９に記載の単離された抗体。
  11. ヒト化抗体である、請求項９に記載の単離された抗体。
  12. ＩｇＧ４アイソタイプである、請求項９に記載の単離された抗体。
  13. キメラ抗体である、請求項１２に記載の単離された抗体。
  14. ヒト化抗体である、請求項１２に記載の単離された抗体。
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