ES2229817T3

ES2229817T3 - Uso de la tau como un marcador para la deteccion temprana del daño del sistema nervioso central (cns).

Info

Publication number: ES2229817T3
Application number: ES99968716T
Authority: ES
Inventors: Frank Hulstaert; Eugeen Vanmechelen; Hugo Vanderstichele; Andre Van De Voorde; Stefaan Van Gool
Original assignee: Innogenetics NV SA
Current assignee: Fujirebio Europe NV SA
Priority date: 1998-09-08
Filing date: 1999-09-07
Publication date: 2005-04-16
Anticipated expiration: 2019-09-07
Also published as: AU5974699A; CN1325491A; HK1040429B; HK1040429A1; DE69920487D1; JP4624559B2; JP2002524740A; CA2340433A1; ATE277353T1; BR9913112A; DE69920487T2; WO2000014546A1; EP1112500A1; CN101046476B; EP1112500B1; CN101046476A; AU772151B2

Abstract

Un método para la detección y/o la cuantificación in vitro del daño del CNS en un individuo antes que dicho daño del CNS sea detectable por los métodos de diagnóstico estándares basados en una imagen del cerebro, punción lumbar o fondo de ojo, dicho daño del CNS siendo provocado por un tumor primario del cerebro, benigno o maligno, metástasis del cerebro, quistes derivados de parásitos, hematoma subdural y/o hidrocefalia, por invasión o metástasis del CNS, por organismos, por anoxia o isquemia, por un agente químico el cual es una terapia génica, productos farmacéuticos, quimioterapia, o exposición a compuestos químicos, por agentes físicos, o por una combinación de estos mecanismos, dicho método comprendiendo el paso de determinar el nivel de tau en una muestra de CSF de dicho individuo y compararlo con el nivel de tau en una muestra del CSF de individuos saludables de control, donde un nivel de tau por encima de un valor límite, determinado sobre la base del nivel de tau en una muestra del CSF de los individuos saludables de control, es una indicación de que el individuo tiene un daño cerebral.

Description

Uso de la tau como un marcador para la detección temprana del daño del sistema nervioso central (CNS).

Campo de la invención

La presente invención se relaciona con el campo del daño del CNS. La presente invención se relaciona con un nuevo método para el diagnóstico temprano del daño del CNS por detección y/o cuantificación de las tau.

Antecedentes de la invención

El daño del sistema nervioso central (daño del CNS) es causado por varios agentes que lo inducen dentro de los cuales encontramos diferentes procesos de enfermedades, agentes químicos y físicos, anoxia e isquemia. Los procesos de enfermedades incluyen las lesiones que ocupan espacio, la invasión o metástasis del cerebro causada por diferentes malignidades y/o infección por un número de organismos.

Los tumores del CNS pueden originarse localmente (tumores primarios) o pueden ser propagados al CNS (metástasis). Los tumores primarios surgen a partir de células glial (astrocitoma, oligodendroglioma, glioblastoma), células ependimales (ependimoma) o tejido de soporte (meningioma, schwannoma, papiloma del plexo coroideo). En la infancia, los tumores surgen a partir de células más primitivas (meduloblastoma, neuroblastoma, cordoma). El astrocitoma o glioblastoma maligno es el tipo más común de tumor primario en adultos mayores de veinte años. Ambos, los tumores primarios del CNS malignos y benignos son capaces de producir deterioro neurológico.

La leucemia es el tipo de cáncer más común en niños. Durante los últimos veinte años la supervivencia de niños con leucemia ha mejorado marcadamente basado en el uso rutinario de quimioterapia intensiva sola o como tratamiento combinado (radioterapia y quimioterapia). Actualmente el rango de supervivencia estimado total de 10 años es de alrededor del 75%. Dado el número creciente de sobrevivientes de leucemia en la infancia, ha surgido la preocupación en relación con los efectos a largo plazo de la radioterapia y/o quimioterapia anti-cáncer que resulta en un posible daño al sistema nervioso central y es creciente la necesidad de una determinación cuantitativa temprana de este daño del CNS.

La meningitis bacteriana puede ser definida como una inflamación en respuesta a una infección bacteriana del pia-aracnoide y del fluido que reside en el espacio que este encierra y también del fluido en los ventrículos del cerebro. La incidencia de la meningitis bacteriana está entre 4.6 y 10 casos por 100000 personas por año. H. influenzae es la causa más frecuente seguida por N. meningitidis y S. pneumoniae. Una vez desarrollada, los rasgos distintivos característicos de la meningitis bacteriana incluyen un incremento en la presión intracraneal, interrupción de la barrera sangre-cerebro, edema cerebral, y alteraciones en el flujo de sangre cerebral. Mientras más larga es la duración de la meningitis y menos efectivo el tratamiento serán mayores las posibilidades de que se desarrollen complicaciones y secuelas neurológicas. Aproximadamente el 10 por ciento de los infantes y niños que tienen meningitis bacteriana quedarán con perdida persistente auditiva sensorial unilateral o bilateral. Aproximadamente el 30% de los niños que han tenido una meningitis bacteriana luego presentan agudas deficiencias en el aprendizaje. (Wilson y otros, 1991).

Los virus pueden también afectar el sistema nervioso central en una variedad de formas que resulta en una distinción entre meningitis viral, encefalitis viral, mielitis y enfermedades del CNS debido a la infección lenta del virus. Otras condiciones que pueden causar daño del CNS son los agentes químicos tales como productos farmacéuticos, quimioterapia o exposición a compuestos químicos, y agentes físicos. Las lesiones en la cabeza son frecuentes en los países industrializados, afectando a muchos pacientes en la flor de la vida. Para apreciar la magnitud social y médica de este problema se necesita solo reconocer que casi 10 millones de americanos sufren lesiones de cabeza anualmente, alrededor del 20% suficientemente serias como para causar daños al cerebro.

Otra causa del daño del CNS puede ser la anoxia o la isquemia. La encefalopatía anóxica-isquémica es una condición desastrosa frecuente y común, causada por la carencia de oxígeno al cerebro, que resulta de una hipotensión o falla respiratoria. La apoplejía isquémica aguda causa daño neuronal y es la mayor causa de impedimento neurológico en la sociedad occidental. La asfixia perinatal puede estar igualmente asociada con daños del CNS. Hasta la fecha, la evaluación clínica, electroencefalográfica y neuroradiológica, junto con los estudios del flujo de sangre cerebral son los métodos más fácilmente disponibles. Sin embargo una evaluación temprana y esmerada de la severidad del daño del cerebro después de un evento hipóxico-isquémico, se mantiene como uno de los problemas más difíciles en el cuidado neonatal.

Para la detección de la invasión del CNS en los niños leucémicos los procedimientos de diagnóstico actuales incluyen la punción lumbar, el fondo de ojo y la imagen del cerebro (Raichle, 1998). Sin embargo, estos métodos de diagnóstico solo permiten la detección del daño del CNS en una etapa más avanzada mientras que el daño del CNS ya en curso en las etapas tempranas no puede ser encontrado por estos métodos. Por lo tanto, existe una necesidad de métodos de diagnóstico adicionales que permitan una detección temprana del daño del CNS.

Un número de marcadores neurológicos han resultado disponibles recientemente los cuales reflejan las condiciones del sistema nervioso central, que se relacionan con la muerte de la célula, el crecimiento axónico/re-inducción, la inflamación y/o la disfunción de la barrera sangre-cerebro. La proteína tau asociada a microtúbulos existe en diferentes isoformas, de las cuales de 4 a 6 son encontradas en el cerebro de un adulto pero solamente 1 isoforma es detectada en el cerebro fetal. La diversidad de las isoformas es generada a partir de un único gen en el cromosoma humano 17 por medio del empalme alterno mRNA (Himmler, 1989; Goedert y otros, 1989; Andreadis y otros, 1992). La característica más notable de la proteína tau, como se deduce de la clonación molecular, es un alargamiento de 31 o 32 aminoácidos, que ocurren en la parte carboxílica-terminal de la molécula, la cual puede ser repetida 3 o 4 veces. Una diversidad adicional es generada a través de inserciones de una longitud de 29 o 58 aminoácidos en la parte NH_{2} terminal de las moléculas tau (Goedert y otros, 1989). In vivo la tau promueve el ensamble del microtúbulo y la estabilidad en el compartimiento axonal de la neuronas por interacciones que involucran su dominio de enlace del microtúbulo el cual está localizado en la región de repetición de la tau (255-381) (Lewis y otros, 1988). En circunstancias normales el cerebro de un adulto contiene 2 - 3 moles de fosfato por mol de tau (Selden y Pollard, 1983; Ksiezak-Reding y otros, 1992). La fosforilación de diferentes sitios en las tau normales como ha sido estudiado en ratas y humanos es dependiente del estado de desarrollo (Lee y otros, 1991; Bramblett y otros, 1993; Goedert y otros, 1993). Las variantes de tau de 60, 64 y 68 kDa que surgen como una consecuencia de la fosforilación han sido detectadas en las áreas del cerebro que muestran marañas neurofibrilares (Delacourte y otros, 1990; Goedert y otros, 1992; Flament y Delacourte, 1990; Greenberg y Davies, 1990). Estos cerebros contienen 6-8 moles de fosfato por mol de tau (Ksiezak-Reding y otros, 1992). En la tau aislada a partir de los filamentos helicoidales apareados, la fosforilación puede ocurrir en varias posiciones (Iqbal y otros, 1989; Lee y otros, 1991; Hasegawa y otros, 1992). La detección de la tau normalmente y anormalmente fosforilada en los extractos del cerebro es hecha por medio de anticuerpos (Mab Alz50: Ghanbari y otros, 1990; Mab Ab423: Harrington y otros, 1991; Mab AT120: Vandermeeren y otros, 1993; Mab AT180; Mab AT270: Solicitud Internacional publicada bajo el número WO 95/17429 y Mab AT8: Solicitud Internacional publicada bajo el número WO 93/08302) o por medio del cambio en el peso molecular (Flament y Delacourte, 1990), o además por medio de ensayo funcional (Bramblett y otros, 1992). Una combinación de anticuerpos monoclonales, cada una reconociendo epitopos específicos de tau, ha sido usada para detectar la presencia de tau normalmente y anormalmente fosforilada en CSF (Van de Voorde y otros, 1995). La tau ha sido usada como un marcador para discriminar la demencia con propiedades esqueleto celulares alteradas tales como la enfermedad de Alzheimer a partir de sujetos en edad normal o a partir de pacientes con otros tipos de demencia.

Objetivos de la invención

Es un objetivo de la presente invención proporcionar

1.: un método para la detección in vitro y/o cuantificación del daño del CNS en un individuo antes que dicho daño del CNS sea detectable por los métodos de diagnóstico estándares basados en la imagen del cerebro, la punción lumbar o el fondo de ojo, dicho daño del CNS siendo causado por un tumor primario del cerebro, benigno o maligno, metástasis del cerebro, quistes derivados de parásitos, hematoma subdural y/o hidrocefalia, por invasión o metástasis del CNS, por organismos, por anoxia o isquemia, por un agente químico el cual es una terapia génica, productos farmacéuticos, quimioterapia o exposición a compuestos químicos, por agentes físicos o por una combinación de estos mecanismos, dicho método comprendiendo el paso de determinar el nivel de tau en una muestra de CSF a partir de dicho individuo y comparándola con el nivel de tau en una muestra de CSF a partir de individuos saludables de control, donde un nivel de tau por encima del valor límite, determinado en base a un nivel de tau en una muestra de CSF a partir de individuos saludables de control, es una indicación de que el individuo presenta daño cerebral.

Es un objetivo más específico de la presente invención proporcionar un método para la detección temprana y/o cuantificación del daño del CNS en un individuo, dicho daño del CNS siendo causado por lesiones que ocupan espacio del CNS, por invasión o metástasis del CNS, por organismos, por anoxia o isquemia, por agentes químicos, por agentes físicos, o por una combinación de estos mecanismos.

Es un objetivo más específico de la presente invención proporcionar un método para la detección temprana y/o cuantificación del daño del CNS en un individuo, dicho daño del CNS siendo causado por un tumor primario del cerebro, benigno o maligno, metástasis del cerebro o un hematoma subdural.

Es otro objetivo más específico de la presente invención proporcionar un método para la detección temprana y/o cuantificación del daño del CNS en un individuo, dicho daño del CNS siendo causado por invasión del CNS por leucemia, linfoma o cáncer de mama.

Es otro objetivo más específico de la presente invención proporcionar un método para la detección temprana y/o cuantificación del daño del CNS en un individuo, dicho daño del CNS siendo causado por bacterias o virus que causan encefalitis o meningitis.

Es otro objetivo más específico de la presente invención proporcionar un método para la detección temprana y/o cuantificación del daño del CNS en un individuo, dicho daño del CNS siendo causado por apoplejía, por infarto cerebral, por hemorragia cerebral, por trombosis, por asfixia perinatal, por la enfermedad de Binswanger o por vasculitis.

Es otro objetivo más específico de la presente invención proporcionar un método para la detección temprana y/o cuantificación del daño del CNS en un individuo, dicho daño del CNS siendo causado por quimioterapia.

Es otro objetivo más específico de la presente invención proporcionar un método para la detección temprana y/o cuantificación del daño del CNS en un individuo, dicho daño del CNS siendo causado por trauma, apoplejía, radiación o presión intracraneal.

Es otro objetivo de la presente invención proporcionar un método para la detección temprana y/o cuantificación del daño del CNS en un individuo, dicho daño del CNS siendo causado por lesiones que ocupan espacio del CNS, por invasión o metástasis del CNS, por organismos, por anoxia o isquemia, por agentes químicos, por agentes físicos, o por una combinación de estos mecanismos para evaluar el efecto del tratamiento sobre dicho daño del CNS.

Es otro objetivo de la presente invención proporcionar un método para examinar sistemáticamente o monitorear el efecto de compuestos que previenen o tratan el daño del CNS.

Se considera que todos los objetivos de la presente invención son cumplidos por las realizaciones tal y como se establece a continuación.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se relaciona con un método para la detección temprana y/o cuantificación del daño del CNS en un individuo, dicho daño del CNS siendo causado por lesiones que ocupan espacio del CNS, por invasión del CNS, por organismos, por anoxia o isquemia, por agentes químicos, por agentes físicos, o por una combinación de estos mecanismos. Este método comprende el paso de determinar y/o cuantificar el nivel de tau en un individuo y compararlo con el nivel de tau en individuos saludables de control.

La presente invención se relaciona con el hallazgo sorprendente que los niveles tau en las muestras de CSF de los niños con leucemia están incrementados comparado con los valores límite superiores de los individuos saludables. Estos niveles de tau incrementados son una indicación de la invasión latente del sistema nervioso central y del daño del CNS ya en curso mucho antes que este daño del CNS pueda ser medido por los procedimientos de diagnóstico actuales. También en individuos que han sufrido lesiones que ocupan espacio del CNS, invasión o metástasis del CNS, isquemia, apoplejía o meningitis, niveles incrementados de tau fueron observados en una etapa temprana. De acuerdo a esto, la tau puede ser usada como un marcador específico para la detección temprana del daño del CNS provocado por la invasión del CNS por leucemia y en general, como un marcador específico para la detección temprana del daño del CNS provocado por agentes que dañan el CNS tales como lesión que ocupa espacio del CNS, invasión o metástasis del CNS, organismos, anoxia o isquemia, agentes químicos, agentes físicos, o una combinación de estos mecanismos.

El sistema nervioso central (CNS) es aquella parte del sistema nervioso la cual, en los vertebrados, consiste del cerebro y la médula espinal, a la cual los impulsos sensoriales son transmitidos y desde la cual se distribuyen los impulsos motores, y la cual supervisa y coordina la actividad del sistema nervioso central entero.

El término "daño del CNS" se refiere a cualquier condición del CNS la cual está asociada con un malfuncionamiento neuronal y que es provocado por un agente de inducción específico o un agente dañino. Más específicamente, el daño del CNS se refiere a procesos de enfermedades que incluyen pero no están limitados a las lesiones que ocupan espacio del CNS, invasión o metástasis del CNS y/u organismos. Las lesiones que ocupan espacio pueden ser, por ejemplo, tumores primarios del cerebro, benignos o malignos, metástasis del cerebro, quistes derivados de parásitos tales como Taenia solium o Echinococcus granulosus, hidrocefalia y/o hematoma subdural. La invasión o metástasis del CNS puede ser provocada por malignidades tales como leucemia, linfoma, cáncer de mama, cáncer de pulmón, melanoma y/o malignidades gastrointestinales u otros tipos de cáncer. Los organismos que pueden infectar el CNS y causar daño del CNS incluyen pero no están limitados a priones, virus, bacterias o parásitos. Las bacterias y los virus que infectan el CNS pueden provocar meningitis, encefalitis, neuroaids o neuroborreliosis.

Ellos incluyen pero no están limitados a la Neisseria meningitidis, H. influenzae, S. pneumoniae, Herpes simplex meningoencefalitis y Herpes simplex gluteolis. El daño del CNS puede también ser provocado por anoxia o isquemia durante la anestesia, asfixia perinatal, ahogamiento, asma, apoplejía, infarto cerebral, trombosis, hemorragia cerebral, envenenamiento con CO, enfermedad de Binswanger y/o vasculitis. Agentes químicos que provocan el daño del CNS incluyen pero no están limitados a terapia génica, productos farmacéuticos, quimioterapia y exposición a compuestos químicos. El daño del CNS puede también ser provocado por agentes físicos tales como trauma, radiación, hipotermia, hipertermia, presión intracraneal o apoplejía. Es también posible que más de uno de los agentes provocadores antes mencionados sean responsables del daño del CNS.

La presente invención por lo tanto proporciona un método para la detección temprana y/o la cuantificación de dicho daño del CNS determinando el valor de tau. "Detección temprana y/o cuantificación del daño del CNS" significa que el daño del CNS está determinado por un método que permite que éste sea detectado antes de que éste fuera detectable por los métodos actuales.

El término "tau" tal y como es referido en la presente solicitud puede ser cualquier forma de tau, incluyendo cualquier estado de fosforilación. El nivel de tau es determinado cualitativamente y/o cuantitativamente como una medida del grado del daño del CNS. La tau puede ser detectada in vitro así como in vivo.

El método para la detección temprana in vitro del daño del CNS en un individuo comprende los pasos de obtener una muestra de dicho individuo, determinar y/o cuantificar el nivel de tau en dicha muestra y compararlo con el nivel de tau en una muestra de individuos saludables de control. El término "muestra" se refiere a cualquier fuente de material biológico, por ejemplo fluidos corporales, pelo, células epiteliales, sangre periférica o cualquier otra muestra comprendiendo la proteína tau. En una realización preferida, la tau puede ser detectada y/o cuantificada in vitro por análisis del nivel de tau en la muestra de fluido corporal del paciente. El término "fluido corporal" se refiere a todos los fluidos que están presentes en el cuerpo humano incluyendo pero no limitado a la sangre, linfa, orina y fluido cerebroespinal (CSF). En una realización más específica de la presente invención la tau es detectada y/o cuantificada en una muestra de fluido cerebroespinal tomada del paciente. En otra realización específica de la invención la tau es detectada y/o cuantificada en una muestra de los derivados de la sangre del paciente. La muestra de sangre puede incluir la muestra completa tal y como es tomada de paciente. Más preferiblemente la muestra de sangre incluye una muestra de plasma o una muestra de suero.

La tau puede ser detectada y/o cuantificada por cualquier método conocido, incluyendo pero no limitado al uso de anticuerpos, el cambio de peso molecular (Flament y Delacourte, 1990), o por ensayos funcionales (Bramblett y otros, 1992). En una realización preferida la tau puede ser detectada por inmunoensayo comprendiendo al menos los pasos siguientes:

- obtener una muestra del paciente; y

- poner dicha muestra en contacto con un anticuerpo monoclonal (anticuerpo primario o anticuerpo de captura) que reconoce la tau, siendo adecuado bajo determinadas condiciones para producir un complejo antígeno-anticuerpo; y

- detectar el enlace inmunológico de dicho anticuerpo a dicha muestra.

Ventajosamente, el anticuerpo monoclonal usado en la invención está en un estado inmovilizado o en un soporte adecuado. Alternativamente, el presente proceso puede ser puesto en práctica usando cualquier otro formato de inmunoensayo conocido por la persona experta en el arte.

El proceso para la detección del antígeno puede entonces ser conducido poniendo juntos dicho complejo antígeno-anticuerpo formado por el antígeno y el anticuerpo primario que reconoce la tau con:

a): un anticuerpo secundario (o anticuerpo detector)

\bullet: el cual puede ser un anticuerpo monoclonal que reconoce un epitope del complejo anticuerpo primario-tau pero que no reconoce el anticuerpo primario solo, o

\bullet: el cual puede ser un anticuerpo policlonal que reconoce un epitope del complejo anticuerpo primario-tau pero que no reconoce el anticuerpo primario solo, con dicho anticuerpo policlonal siendo preferiblemente purificado por cromatografía de inmunoafinidad usando la tau inmovilizada o el complejo anticuerpo primario-tau.

b): un marcador tanto para la identificación o el acoplamiento específico con dicho segundo anticuerpo secundario, siendo dicho marcador cualquier marcador posible conocido por la persona experta en el arte;

c): soluciones buffer salinas apropiadas para llevar a cabo la reacción inmunológica entre el anticuerpo primario y la muestra, entre el anticuerpo secundario y el complejo anticuerpo primario-tau y/o entre el anticuerpo secundario de enlace y el marcador, y,

d): posiblemente también, para propósitos de estandarización, una proteína purificada o péptido sintético reactivo con anticuerpos que reconocen la tau.

Ventajosamente, el anticuerpo secundario por sí mismo porta un marcador o un grupo para el acople directo o indirecto con un marcador.

El término "epitope" se refiere a aquella porción del complejo antígeno-anticuerpo que está específicamente enlazado por un sitio de combinación-anticuerpo. Los epitopes pueden ser determinados por cualquiera de las técnicas conocidas en el arte o puede ser pronosticado por una variedad de modelos de predicción por computadora conocidos en el arte.

La expresión "reconocer", "reaccionar con", "enlace inmunológico" o "producir un complejo antígeno-anticuerpo" como es usado en la presente invención es para ser interpretado que el enlace entre el antígeno y el anticuerpo ocurre bajo todas las condiciones que conciernen a las propiedades inmunológicas del anticuerpo y el antígeno.

Cualquier anticuerpo monoclonal o policlonal que reconoce específicamente la tau puede ser usado para la detección de la tau. Anticuerpos que reconocen específicamente la tau normalmente y/o anormalmente fosforilada incluyen Alz50 (Ghanbari y otros, 1990), Ab423 (Harrington y otros, 1991), AT8 (Solicitud Internacional publicada bajo el número WO 93/08302), AT120 (Vandermeeren y otros, 1993); AT180 y AT270 (Solicitud Internacional publicada bajo el número WO 95/17429) y AT100 (Solicitud Internacional publicada bajo el número WO 96/04309). Pero también otros anticuerpos conocidos en el arte que reconocen específicamente la tau pueden ser usados.

El método para la detección temprana in vitro y/o la cuantificación del daño del CNS en un individuo puede también ser usado para evaluar el efecto de un cierto tratamiento sobre el daño del CNS en dicho individuo. Posibles tratamientos que pudieran influir en el estado del CNS incluyen pero no están limitados a tratamientos con fármacos, quimioterapia, terapia física, incluyendo radioterapia y terapia génica.

El método para la detección temprana in vivo y/o la cuantificación del daño del CNS en un individuo comprende los pasos de determinar y/o cuantificar el nivel de tau en dicho individuo y compararlo con el nivel de tau en individuos saludables de control. En una realización preferida, la tau puede ser detectada in vivo por una imagen in vivo. La tau puede ser visualizada in situ por métodos no invasivos incluyendo pero no limitados a métodos de imagen del cerebro descrito por Arbit y otros (1995), Tamada y otros (1995), Wakabayashi y otros (1995), Huang y otros (1996), Sandrock y otros (1996), Mariani y otros (1997). Estos métodos de imagen in vivo pueden permitir la localización y visualización de la tau, por ejemplo, por el uso de anticuerpos marcados que reconocen la tau.

La tau puede también ser usada como un marcador específico para la representación in vivo para evaluar el efecto de un cierto tratamiento sobre el daño del CNS en un individuo. Posibles tratamientos que pudieran influenciar el estado del CNS incluye pero no están limitados a tratamientos con fármacos, quimioterapia, terapia física, incluyendo radioterapia y terapia génica.

Cualquier kit que proporcione una herramienta para la detección de la tau puede ser usado para el diagnóstico del daño del CNS antes mencionado.

Un kit preferido para el diagnóstico in vitro del daño del CNS en un individuo provocado por lesiones que ocupan espacio del CNS, por invasión o metástasis del CNS, por organismos, por anoxia o isquemia, por agentes químicos, por agentes físicos, o por una combinación de estos mecanismos está basado en un inmunoensayo y comprende:

-: al menos un anticuerpo monoclonal (anticuerpo primario) el cual forma un complejo inmunológico con un epitope de la proteína tau;

-: un anticuerpo secundario

\bullet: el cual puede ser un anticuerpo policlonal que reconoce un epitope del complejo anticuerpo primario-tau pero que no reconoce el anticuerpo primario solo, siendo dicho anticuerpo policlonal purificado preferiblemente por cromatografía de inmunoafinidad usando la proteína tau inmovilizada o el complejo anticuerpo primario-tau inmovilizado;

-: un marcador tanto para la identificación o acoplamiento específico con dicho segundo anticuerpo secundario;

-: soluciones buffer salinas apropiadas para llevar a cabo la reacción inmunológica entre el anticuerpo primario y la muestra, entre el anticuerpo secundario y el complejo anticuerpo primario-tau y/o entre el anticuerpo secundario de enlace y el marcador;

-: posiblemente, para propósitos de estandarización, una proteína purificada o péptido sintético que contiene uno o más epitopes tau.

La presente invención también se refiere a un método para examinar sistemáticamente o monitorear el efecto de los compuestos los cuales previenen o tratan el daño del CNS que comprende el paso de determinar el nivel de tau y compararlo al nivel de tau en una muestra control.

La presente invención será ahora ilustrada con referencia a los siguientes ejemplos que divulgan realizaciones particularmente ventajosas. Sin embargo, deber ser notado que estos ejemplos son ilustrativos y no pueden ser construidos para restringir la invención en ningún modo.

TABLA 1 Protocolo de tratamiento para pacientes con ALL/NHL de células no B (EORTC 58881)

1

2

TABLA 1 (continuación)

3

4

TABLA 2 Protocolo de tratamiento para pacientes con NHL de células B (UKCCSG 9602)

5

TABLA 2 (continuación)

6

TABLA 3 Protocolo de tratamiento para pacientes con AML (EORTC 58921)

7

TABLA 4

9

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 \+  \begin{minipage}[t]{150mm}  ^{a} 01: prof. P. Cras,
Hospital Univer., neurología, Antwerp, Bélgica y Dr. A. Daniels,
UIA, Laboratorio de neurobiología, Antwerp, Bélgica; 04: Dr. P.D.
Mehta, Inst. Invest. Básica, Staten Island, NY, USA; 05: Dr. A.
Ivanoiu, UCL St-Luc, Laboratorio de Neuroquímica,
Bruselas, Bélgica; 06: Prof. P.P. De Deyn, UIA, Laboratorio de
Neuroquímica, Antwerp, Bélgica; 08: Dr. C. Bancher, Lainz Hospital,
Neurología, Viena, Austria; 10: Dr. J. Wiltfang, Universidad de
Georg-August, Gerontopsiquiatría, Göttingen,
Alemania \end{minipage} \cr  \+  ^{b} F: femenino, M:
masculino\cr  \+  \begin{minipage}[t]{150mm}  ^{c} en casos
donde factores múltiples pueden contribuir al daño, solo es dado el
factor que se supone que sea más relevante.
\end{minipage} \cr}

TABLA 4 (continuación)

10

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 \+  \begin{minipage}[t]{150mm}  ^{a} 01: prof. P. Cras,
Hospital Univer., neurología, Antwerp, Bélgica y Dr. A. Daniels,
UIA, Laboratorio de neurobiología, Antwerp, Bélgica; 04: Dr. P.D.
Mehta, Inst. Invest. Básica, Staten Island, NY, USA; 05: Dr. A.
Ivanoiu, UCL St-Luc, Laboratorio de Neuroquímica,
Bruselas, Bélgica; 06: Prof. P.P. De Deyn, UIA, Laboratorio de
Neuroquímica, Antwerp, Bélgica; 08: Dr. C. Bancher, Lainz Hospital,
Neurología, Viena, Austria; 10: Dr. J. Wiltfang, Universidad de
Georg-August, Gerontopsiquiatría, Göttingen,
Alemania \end{minipage} \cr  \+  ^{b} F: femenino, M:
masculino\cr  \+  \begin{minipage}[t]{150mm}  ^{c} en casos
donde factores múltiples pueden contribuir al daño, solo es dado el
factor que se supone que sea más relevante.
\end{minipage} \cr}

TABLA 4 (continuación)

12

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 \+  \begin{minipage}[t]{155mm}  ^{a} 01: prof. P. Cras,
Hospital Univer., neurología, Antwerp, Bélgica y Dr. A. Daniels,
UIA, Laboratorio de neurobiología, Antwerp, Bélgica; 04: Dr. P.D.
Mehta, Inst. Invest. Básica, Staten Island, NY, USA; 05: Dr. A.
Ivanoiu, UCL St-Luc, Laboratorio de Neuroquímica,
Bruselas, Bélgica; 06: Prof. P.P. De Deyn, UIA, Laboratorio de
Neuroquímica, Antwerp, Bélgica; 08: Dr. C. Bancher, Lainz Hospital,
Neurología, Viena, Austria; 10: Dr. J. Wiltfang, Universidad de
Georg-August, Gerontopsiquiatría, Göttingen,
Alemania \end{minipage} \cr  \+  ^{b} F: femenino, M:
masculino\cr   \+  \begin{minipage}[t]{155mm}  ^{c} en casos
donde factores múltiples pueden contribuir al daño, solo es dado el
factor que se supone que sea más relevante.
\end{minipage} \cr}

Leyenda de las figuras

Figura 1. Los valores de tau en el diagnóstico, fueron dados antes de cualquier tratamiento: 1. Niños control; 2. AML; 3. AML-CNS+; 4. CML; 5. MDS; 6. B-NHL; 7. no-B-ALL; 8. no-B-ALL del CNS+; 9. VHR no-B-ALL.

Figura 2. Niveles de tau-CSF en siete pacientes después de una apoplejía isquémica aguda. Las muestras del CSF fueron colectadas a la entrada (día 0-1), días 2-3, días 7-8, días 21-22 (3 semanas) y día 90-110 (3 meses).

Figura 3. Los niveles de tau-CSF en el tiempo de máxima liberación con relación al tamaño del infarto medidos por escáner CT.

Ejemplos Ejemplo 1 Niveles de tau incrementados en niños con leucemia

Para evaluar la influencia de la quimioterapia en el daño neuronal, fue realizado un estudio longitudinal, incluyendo 65 niños con leucemia (edades de 2 a 16 años) sin complicación del sistema nervioso central medible, y tratados de acuerdo a procedimientos estándares. Un total de 377 muestras de CSF fueron analizadas. Antes de cada inyección, un pequeño volumen de fluido fue muestreado para análisis de laboratorio de rutina y el sobrante fue usado en nuestro estudio. Estos niños estuvieron siendo diagnosticados y luego tratados por su leucemia en el Hospital Universitario de Leuven, Bélgica. La proteína tau en el fluido cerebroespinal fue valorada usando el antígeno INNOTEST hTAU (Innogenetics, Gent, Bélgica).

Para todos los niños sospechosos de tener leucemia, fue realizada una punción lumbar antes de comenzar el tratamiento para detectar la posible presencia de células de leucemia, indicativas de la invasión del sistema nervioso central. El nivel de tau medido en ese momento, y por lo tanto antes del tratamiento, serviría como el nivel de control para comparar los cambios inducidos por la quimioterapia en los niveles de tau.

Observamos que algunos niños con leucemia tenían ya muy altos niveles de tau en el diagnóstico a pesar del hecho que no fueron detectadas células de leucemia en el sistema nervioso central. Estos niños constituyen un nuevo grupo de riesgo teniendo daños del CNS inducido por la leucemia o la invasión del cerebro, los cuales no pueden ser siempre encontrados usando los procedimientos diagnósticos actuales (imagen del cerebro, punción lumbar, fondo de ojo). Esto fue además soportado por los niveles de tau incrementados vistos en un paciente que tiene leucemia con invasión celular comprobada en el cerebro (células malignas en el fluido cerebroespinal).

Ejemplo 2 Niveles de tau incrementados en pacientes con leucemia antes del tratamiento 1. Individuos

Entre Agosto de 1996 y Junio de 1999, 510 muestras de CSF fueron tomadas de 82 niños siendo tratados por cáncer en el Departamento de Hemato-oncología pediátrica de la Universidad Católica de Leuven, Bélgica. Muestras de CSF fueron solamente tomadas en el curso de las punciones lumbares programadas (LPs) para la estadificación o el tratamiento de la malignidad.

Tres grupos de pacientes con malignidades hematológicas fueron estudiados. El grupo mayor consistió de 48 pacientes con no-B-ALL, tratados de acuerdo al protocolo EORTC 58881 (tabla 1). De estos niños, 20 tenían blastos CD10(+)(o ALL común), de los cuales dos pacientes tenían también síndrome Down (DS) y 1 paciente tenía el síndrome de Brachmann-de Lange; 6 pacientes tenían blastos de células-B comunes, 2 pacientes tenían blastos de células-T comunes, 2 pacientes tenían blastos de células-pro-B, 9 pacientes tenían blastos de células-pre-B, y 9 pacientes tenían blastos de células-T. Cuarenta y dos niños tenían leucemia, 6 pacientes tenían el linfoma no-Hodgkin estado II (1 paciente), Estado III (4 pacientes) o Estado IV (1 paciente). Un paciente tenía complicaciones evidentes del CNS (CNS+), definidas de acuerdo al protocolo de estudio con células malignas en el CSF. Cinco pacientes fueron considerados como pacientes de muy alto riesgo (VHR) de acuerdo al criterio definido en el protocolo (2 pacientes con t(9; 22) y 3 pacientes con resistencia corticoide). Como la primera parte del tratamiento de inducción fue similar al de otros pacientes, estos fueron incluidos en el análisis de acuerdo a la quimioterapia de inducción. Veintiocho de los pacientes dentro de los no-B-ALL podían ser seguidos longitudinalmente durante su período de tratamiento.

Un segundo grupo de pacientes incluyó 10 pacientes con linfoma no-Hodgkin de células-B, tratados de acuerdo al protocolo NHL del grupo de Cáncer en Niños del Reino Unido (UKCCSG 9602) (tabla 2). Cinco pacientes tenían linfomas de células-B, 3 pacientes tenían linfoma de Burkitt, y 2 pacientes tenían linfoma anaplástico de célula grande (ALCL). Todos los pacientes fueron tratados con el mismo protocolo, excepto un paciente el cual tenía leucemia de célula-B. Seis de estos pacientes fueron estudiados longitudinalmente. Un tercer grupo de pacientes consistió de 9 niños con Leucemia del Mieloide Aguda-mielodisplasia (AML - MDS), de los cuales 2 pacientes tenían complicaciones del CNS y dos pacientes tenían el síndrome Down. Hubo 3 pacientes con M0, y 1 paciente con cada uno de los fenotipo M1, M2, M5a o M7. Dos pacientes tenían MDS, de los cuales uno había desarrollado AML y fue tratado con quimioterapia. Todos estos pacientes, excepto un paciente con MDS, fueron tratados de acuerdo al protocolo EORTC 58921 (tabla 3) y 7 pacientes fueron seguidos longitudinalmente.

Los otros pacientes consistieron de un grupo heterogéneo de niños (n=9) en los cuales por razones clínicas fue llevada a cabo una LP. Este grupo incluye 3 niños con meduloblastoma (estadificación), 2 niños con rabdomiosarcoma (estadificación), 1 niño con histiocitosis de células de Langerhans (LCH, estadificación), ganglioglioma (estadificación), germinoma (estadificación), y retinoblastoma con metástasis de CNS (estadificación y seguimiento). El grupo de control consistió de 4 niños de los cuales el CSF fue tomado como parte del control de rutina para posibles infecciones virales o bacterianas, pero con resultados negativos. Un paciente con un retinoblastoma localizado (estadificación) y uno examinado por linfohistiocitosis hemofagocítica familiar (HLH) fueron también incluidos en el grupo de control. Los parientes más cercanos de los pacientes dieron el consentimiento informado vía oral para la participación en el estudio.

2. Métodos

Muestreo del licor. Fueron realizadas punciones lumbares justamente antes de la administración IT de los terapéuticos. Cinco ml de CSF fueron colectados en diferentes tubos de polipropileno. Una muestra fue centrifugada inmediatamente a 1500 rpm por 2 minutos para eliminar las células y otro material insoluble. El sobre nadante fue almacenado a -70ºC para análisis subsecuentes. El número de ciclos congelación /descongelación fue restringido al mínimo.

Medición de la tau en el CSF. Todos los análisis bioquímicos para la detección de la tau-CSF fueron hechos sin conocimiento del diagnóstico clínico. Los factores que potencialmente pueden traer confusión, tales como el número de ciclos congelación /descongelación, tipo de recipiente, y volumen de la muestra por ensayo fueron estandarizados para el estudio del protocolo completo. Los niveles de tau-CSF fueron determinados usando un ELISA de doble fase (Antígeno INNOTEST hTAU, Innogenetics, Gent, Bélgica), que midió la tau total (ambos la tau normal y la hiperfosforilada). Las muestras fueron analizadas primeramente solas, al tiempo de cada LP. Después de eso, todas las muestras derivadas de un paciente fueron analizadas en una inmunoplaca. El coeficiente de correlación entre los resultados de la primera y segunda aproximación para un juego de 104 muestras fue 0.091 (95% CI: 0.856 - 0.933). Los incrementos de tau-CSF descritos en el papel fueron excluidos por ser incrementos generales de proteínas en el licor.

3. Resultados

Los niveles del límite superior normal para la tau fueron primeramente determinados en muestras de CSF de los 6 niños controles. El valor de tau-CSF medio fue 106.2 pg/ml (95%CI = 34.3-178.0). El valor normal límite arbitrario fue considerado como 312 pg/ml (medio + 3 SD), el cual está en el rango de valores observados en adultos (Hulstaert y otros, 1999). Además, no encontramos una correlación entre los valores de tau-CSF en el diagnóstico y la edad de los niños (Pearson r = -0.161, Cl95% = -0.3914 - 0.08836, n=64), sugiriendo que la edad no tiene influencia en los niveles de tau-CSF. Los valores de tau-CSF claramente patológicos pueden ser considerados por encima de 500 pg/ml.

Los niveles de tau en el diagnóstico fueron analizados para cada subgrupo de pacientes (Fig.1). No hubo diferencia obvia para los niveles de tau en pacientes con y sin síndrome de Down (no mostrado). Los dos pacientes con invasión evidente del CNS (CNS+) tenían niveles de tau-CSF en el diagnóstico superiores a 312 pg/ml. Sin embargo, los 2 niños con MDS, 7/28 de los niños con no-B-ALL, 1/4 de los pacientes con no-B-ALL con criterios de riesgo muy altos, 1/5 de los pacientes con AML, y 2/8 de los pacientes con NHL de células-B tenían un nivel de tau superior a 312 pg/ml, mientras que usando los procedimientos de diagnóstico clásicos, la invasión del CNS no fue detectada. Tres pacientes con elevada presión intracraneal (meduloblastoma), y un paciente con germinoma, del cual el CSF fue tomado para estadificación, tuvo altas concentraciones de tau-CSF (823, 1397, 1500 y 442 pg/ml), en contraste a un paciente con astrocitoma de grado I el que tuvo un nivel de tau-CSF normal (97 pg/ml). Un paciente con LCH tuvo un nivel tau-CSF normal de 112 pg/ml. Dos pacientes con rabdomiosarcoma podían ser analizados en el diagnóstico: un paciente con enfermedad en estado I tuvo un nivel de tau-CSF de 279 pg/ml, el otro paciente con enfermedad en estado IV tuvo un nivel de 320 pg/ml. Un paciente con retinoblastoma y complicaciones del CNS tuvo un nivel de tau-CSF de 1800 pg/ml.

Para 33 pacientes con no-B-ALL, los niveles de tau-CSF en el diagnóstico no correlacionaron con la carga del tumor, como fue reflejado por el conteo de las células blancas de la sangre (Pearson r = 0.04575, CD95%: -0.3024 - 0.3831) o suero LDH (Pearson r = -0.03002, CI95%: -0.3696 - 0.3166). En pacientes con B-NHL, no hubo una correlación significativa entre el nivel de LDH y de tau-CSF (Pearson r = -0.3723, CD95%: -0.8532 - 0.4507).

Ejemplo 3 Uso de la tau-CSF como un marcador para la detección temprana de posible daño del CNS causado por apoplejía 1. Individuos

Siete pacientes, 3 hombres y 4 mujeres, de 63-81 años (media SD, 70.7 \pm 7.2 años) con infarto cerebral admitidos en la Unidad de neurología del Hospital Universitario de Sahlgren, Göteborg, Suecia, fueron incorporados en el estudio. Todos los pacientes fueron incluidos dentro de las 72 h del ataque de apoplejía.

2. Métodos

Las muestras de CSF fueron colectadas usando punción lumbar. 12 ml fueron colectados y congelados en 0.5 ml alícuotas a -80ºC hasta el análisis. Las muestras de CSF fueron colectadas a la entrada (día 0-1), día 2-3, día 7-8, día 21-22 (3 semanas) y día 90-110 (3 meses). Los niveles de tau-CSF fueron determinados usando un ELISA de doble fase (Antígeno INNOTEST hTAU, Innogenetics, Gent, Bélgica), que midió la tau total (ambas normal e hiperfosforilada).

La extensión del daño cerebral fue examinado con tomografía computarizada (CT) del cerebro durante el primer día de admisión. La clínica de los pacientes fue también examinada usando el Índice de Escala de Apoplejía Escandinavo (SSI; Grupo de Estudio de apoplejía Escandinava, 1985) en el ataque de apoplejía y 3 meses después para el grado de discapacidad con el Índice Bartel (BI; Mohoney y Barthel, 1965).

3. Resultados

Las tau-CSF mostraron un marcado incremento después de la apoplejía aguda, con un pico después de 1-3 semanas y regreso a la normalidad después de 3 meses (Fig. 2). Hubo también una correlación entre los niveles de tau-CSF y el tamaño del infarto tal y como fue medido por el escáner CT (Fig. 3). Estos resultados indican que la tau-CSF refleja daño neuronal y degeneración y el nivel en el CSF depende de la cantidad de las células nerviosas dañadas. En este estudio no se encontró correlación entre el dato clínico (SSI o BI) y la tau-CSF, probablemente debido al reducido número de pacientes.

Ejemplo 4 Uso de la tau como marcador para la detección temprana de posible daño del CNS causados por agentes dañinos diferentes 1. Individuos

Un estudio multicentral fue llevado a cabo en 8 centros universitarios europeos y 2 norteamericanos involucrados en la investigación del CSF, basado en CSF residual archivado en los centros para propósitos de investigación. Las muestras de CSF de pacientes con un amplio rango de diferentes condiciones neurológicas fueron incluidas con vistas a dar una idea general acerca de la especificidad de los cambios del marcador tau en una variedad de patologías que involucran el CNS. Los controles neurológicos consistieron en individuos sin daños obvios del CNS (tabla 4).

El estudio fue conducido de acuerdo con las regulaciones de investigación clínica local. Si fuera requerido, una aprobación del Comité Ético o Buró de Revisión Institucional adicional local era obtenida por el investigador antes de comenzar el estudio.

2. Métodos

Las muestras de CSF fueron colectadas usando punción lumbar (LP). Solo muestras CSF que contenían menos de 500 células de sangre roja por \mul fueron incluidas en el estudio. Las muestras de CSF fueron centrifugadas a 2000 g por 10 minutos dentro de las 4 horas posteriores a la LP y conservadas congeladas sin descongelar las muestras del CSF del centro 01 que habían experimentado un ciclo adicional de congelación /descongelación antes del análisis. La concentración de la tau total comprendiendo la tau normal y la tau de filamentos helicoidales apareados fue medida en los centros usando una técnica ELISA de doble fase (Antígeno INNOTEST hTAU, Innogenetics N.V.).

3. Niveles de tau-CSF en pacientes con posible daño del CNS comparado a los niveles de la tau-CSF en sujetos de control neurológicos

Los niveles tau en las muestras CSF de pacientes con posible daños del CNS provocado por lesiones que ocupan espacio, por invasión o metástasis, por sangramiento, infarto o isquemia o por organismos y niveles tau en muestras CSF de sujetos control son mostradas en la tabla. El grupo de pacientes que posiblemente habían contraído daño del CNS por lesiones que ocupan espacio, por invasión o metástasis, por sangramiento, por infarto o isquemia; o por organismos mostraron un nivel de tau total más alto que los pacientes de control neurológico (p = 0.022, prueba bilateral Mann Whitney).

Referencias

Andreadis A., Brown W., Kosik K. (1992) Structure and novel exons of the human tau gene. (Estructura y nuevos exones del gen tau humano). Biochem. 31: 10626-10633.

Arbit E., Cheung N. K., Yeh S. D., Daghighian F., Shang J.J., Cordon-Cardo C., Pentlow K., Canete A., Finn R., Larson S.M. (1995) Quantitative studies of monoclonal antibody targeting to disialogangliosid GD2 in human brain tumours (Estudios cuantitativos de anticuerpos monoclonales diana para la disialogangliosida GD2 en tumores cerebrales humanos). Eur. J. Nucl. Med. 22:419-426.

Bramblett G., Trojanowski J., Lee V. (1992) Regions with abundant neurofibrillary pathology in human brain exhibit a selective reduction in levels of binding-competent tau and accumulation of abnormal tau isoforms (A68 proteins) (Regiones con abundante patología neurofibrilar en el cerebro humano que exhiben una reducción selectiva en los niveles de la tau de enlace-competente y acumulación de isoformas tau anormales (proteínas A68)). Lab Invest. 66: 212-222.

Bramblett G., Goedert M., Jakes R., Merrick S., Trojanowski J., Lee V. (1993) The abnormal phosphorylation of tau at Ser396 in Alzheimer's disease recapitulates phosphorylation during development and contributes to reduced microtubule binding. (La fosforilación normal de tau en Ser396 en enfermedades de Alzeimer recapitula la fosforilación durante el desarrollo y contribuye a reducir el enlace de microtúbulos). Neuron. 10:1089-1099.

Delacourte A., Flament S., Dibe E., Hublau P., Sablonniere B., Hemon B., Sherrer V., Defossez A. (1990) Pathological proteins Tau64 and 69 are specifically expressed in the somatodendritic domain of the degenerating cortical neurons during Alzheimer's disease (Las proteínas patológicas Tau64 y 69 están específicamente expresadas en el campo somatodendrítico de la degeneración de las neuronas corticales durante la enfermedad de Alzheimer). Acta Neuropathol. 80: 111-117.

Flament S., Delacourte A. (1990) Tau Marker? (Marcador Tau?). Nature 346: 6279.

Ghanbari H., Kozuk T., Miller B., Riesing S. (1990) A sandwich enzyme immunoassay for detecting and measuring Alzheimer's disease-associated proteins in human brain tissue (Un inmunoensayo enzimático de doble fase para detectar y medir las proteínas asociadas-enfermedad de Alzheimer en tejido del cerebro humano.) J: Clin. Laboratory Anal. 4: 189-192.

Goedert M., Spillantini M., Jakes R., Rutherford D., Crowther R. (1989) Multiple isoforms of human microtubule-associated protein tau: sequences and localisation in neurofibrillary tangles of Alzheimer's disease (Isoformas múltiples de la proteína tau asociada a micortúbulo humano: secuencias y localización en marañas neurofibrilares de la enfermedad de Alzheimer.) Neuron. 3: 519-526.

Goedert M., Cohen E., Jakes R., Cohen P. (1992) p42 Map kinase phosphorylation sites in microtubule-associated protein tau one dephosphorylated by protein phosphatase 2Al: Implications for Alzheimer's disease (Sitios de fosforilación de la cinasa p42 Map en la proteína tau asocidada a microtúbulos defosforilada mediante la fosfatasa de proteína 2Al: implicaciones para la enfermedad de Alzheimer.) FEBS Lett. 312: 95-99.

Goedert M., Jakes R., Crowther R., Six J., Lübke U., Vandermeeren M., Cras P., Trojanowski J. Q., Lee V. (1993) The abnormal phosphorylation of tau protein at serine 202 in Alzheimer's disease recapitulates phosphorylation during development (La fosforilación anormal de la proteína tau en la serina 202 en enfermedades de Alzheimer recapitula la fosforilación durante el desarrollo). Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 90: 5066-5070.

Greenberg S., Davies P. (1990) A preparation of Alzheimer paired helical filaments that displays distinct tau proteins by polyacrilamide gel electrophoresis (Una preparación de filamentos helicoidales apareados de Alzheimer que exhiben proteínas tau distintivas por electroforesis en gel de poliacrilamida). Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 87: 5827-5831.

Harrington C., Mukaetova E., Hills R., Edwards P., Montejo de Garcini E., Novak M., Wischik C. (1991) Measurement of distinct immunochemical presentations of tau protein in Alzheimer's disease. (Medidas de las presentaciones inmunoquímicas distintivas de la proteína tau en la enfermedad de Alzheimer). Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 88: 5842-5846.

Hasegawa M., Morishima-Kawashima M., Takio K., Suzuki M., Titani K., Ihara Y. (1992) Protein sequence and mass spectrometric analyses of tau in Alzheimer's disease brain (Secuencia de proteína y análisis de espectrometría en masa de tau en cerebro de la enfermedad de Alzheimer). J. Biol. Chem 267: 17047- 17054.

Himmler A. (1989) Structure of the bovine tau gene: alternatively spliced transcripts (Estructura del gen tau bovino: transcripciones alternativamente empalmadas). Mol. Cell. Biol. 9(4):1389-96.

Huang Q., He G., Lan Q., Li X., Qian Z. Chen J. Lu Z., Du Z. (1996) Target imaging diagnosis of human brain glioma. Clinical analysis of 40 cases (Diagnóstico de imagen resultante del glioma del cerebro humano. Análisis clínico de 40 casos). Nucl. Med. Commun. 17:311-316.

Hulstaert F., Blennow K., Ivanoiu A., Schoonderwaldt H. C., Riemenschneider M., De Deyn P.P., Bancher C., Cras P., Wiltfang J., Metha P. D., Iqbal K., Pottel H., Vanmechelen E., Vanderstichele H. (1999) Improved discrimination of AD patients using \beta-amyloid_{(1-42)} and tau levels in CSF (Discriminación mejorada de pacientes AD usando \beta-amiloide_{(1-42)} y niveles tau en CFS). Neurology 52: 1555-1562.

Iqbal K., Grundke- Iqbal I., Smith A., George L., Tung Y., Zaidi T. (1989) Identification and localisation of a Tau peptide to paired helical filaments of Alzheimer's disease. (Identificación y localización de un péptido tau para los filamentos helicoidales apareados de la enfermedad de Alzheimer). Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 86: 5646-5650.

Ksiezak-Reding H., Liu W. K., Yen S. H. (1992) Brain (Cerebro) Res. 597: 209-219.

Lee V., Balin B., Otvos L., Trojanowski J. (1991) A68: a major subunit of paired helical filaments and derivatized forms of normal tau (A68: una sub-unidad importante de los filamentos helicoidales apareados y formas derivadas de la tau normal). Science 251 (4994): 675-8.

Lewis S., Wang D., Cowan N. (1988) Microtubule-associated protein MAP2 shares a microtubule binding motif with tau protein (La proteína asociada-microtúbulo MAP2 comparte una unidad de enlace de microtúbulo con la proteína Tau). Science 242: 936-939.

Mariani G., Lasku A., Pau A., Villa G., Motta C., Calcagno G., Taddei G. Z., Castellani P., Syrigos K., Dorcaratto A., Epenetos A. A., Zardi L., Viale G. A. (1997) A pilot pharmacokinetic and immunoscintigraphic study with the technetium-99m labelled monoclonal antibody BC-1 directed against oncofetal fibronectin in patients with brain tumours (Un estudio piloto inmunoescintigráfico y farmacocinético con el anticuerpo monoclonal BC-1 marcado technetium-99m dirigido contra la fibronectina oncofetal en pacientes con tumores cerebrales). Cancer 15: 2484-2489.

Mohoney F. I., Barthel D. W. (1965) Functional evaluation: The Barthel Index (Evaluación funcional: El Índice Barthel). Md. State. Med. J.24: 61-69.

Raichle M. E. (1998) Behind the scenes of functional brain imaging: A historical and physiological perspective (Detrás de la escena de la imagen del cerebro funcional: Una perspectiva fisiológica e histórica). Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95: 765-772.

Sandrock D., Verheggen R., Helwig A. T., Munz D. L. Markakis E., Emrich D. (1996) Immunoscintigraphy for the detection of brain abscesses (Inmunoescintigrafía para la detección de absesos del cerebro). Nucl. Med. Commun. 17: 311-316.

Grupo de Estudio de Apoplejía Escandinavo (1985) Multicenter trial of hemodilution in ischemic stroke: Background and study protocol (Ensayo multicentro de hemodilusión en apoplejía isquémica: Antecedentes y protocolo de estudio). Stroke 16: 373-403.

Selden S., Pollard T. (1983) Phosphorylation of microtubule-associated proteins regulates their interaction with actin filaments (La fosforilación de las proteínas asociadas a los microtúbulos regulan su interacción con filamentos de actina). J. Biol. Chem. 258(11): 7064-71.

Tamada K., Fujinaga S., Watanabe R., Yamashita R., Takeuchi Y., Osano M. (1995) Specific deposition of passively transferred monoclonal antibodies against herpes simplex virus type 1 in rat brain infected with the virus. (Deposición específica de anticuerpos monoclonales transferidos pasivamente contra el virus de herpes simplex tipo 1 en cerebro de rata infectada con el virus). Microbiol-Immunol. 39: 861-871.

Vandermeeren M., Mercken M., Vanmechelen E., Six J., Van de Voorde A., Martin J., Cras P. (1993) Detection of tau proteins in normal and Alzheimer's disease fluid with a sensitive sandwich enzyme linked assay (Detección de las proteínas tau en fluido normal y de la enfermedad de Alzheimer con un ensayo de enlace de una enzima de fase doble sensitiva) J. Neurochem. 61: 1828 - 1834.

Van de Voorde A., Vanmechelen E., Vandermeeren M., Dessaint F., Beeckman W., Cras P. (1995) Detection of tau in cerebrospinal fluid. Research Advances in Alzheimer's disease and related disorders (Detección de tau en el fluido cerebro espinal. Investigaciones Avanzadas en la enfermedad de Alzheimer y desórdenes relacionados), Ed. Ibqal, Mortimer, Winblad & Wisniewski, John Wiley & Sons Ltd.

Wakabayashi T., Yoshida J., Okada H., Sugita K., Itoh K., Tadokoro M., Ohshima M. (1995) Radioimaging of human glioma by indium-11 labelled G-22 anti-glioma monoclonal antibody (Radioimagen del glioma humano por el indio-11 marcado como anticuerpo monoclonal anti-glioma G-22). Noshuyo-Byori 12: 105-110.

Wilson J.D., Braunwald E., Isselbacher K.J., Petersdorf R.G., Martin J.B., Fauci A.S., Root R.K. (1991) Harrison's Principles of internal Medicine (Principios de Harrison de medicina interna), 12^{ma} Edición, McGraw-Hill Inc, NY, USA.

Claims

1. Un método para la detección y/o la cuantificación in vitro del daño del CNS en un individuo antes que dicho daño del CNS sea detectable por los métodos de diagnóstico estándares basados en una imagen del cerebro, punción lumbar o fondo de ojo, dicho daño del CNS siendo provocado por un tumor primario del cerebro, benigno o maligno, metástasis del cerebro, quistes derivados de parásitos, hematoma subdural y/o hidrocefalia, por invasión o metástasis del CNS, por organismos, por anoxia o isquemia, por un agente químico el cual es una terapia génica, productos farmacéuticos, quimioterapia, o exposición a compuestos químicos, por agentes físicos, o por una combinación de estos mecanismos, dicho método comprendiendo el paso de determinar el nivel de tau en una muestra de CSF de dicho individuo y compararlo con el nivel de tau en una muestra del CSF de individuos saludables de control, donde un nivel de tau por encima de un valor límite, determinado sobre la base del nivel de tau en una muestra del CSF de los individuos saludables de control, es una indicación de que el individuo tiene un daño cerebral.

2. Un método de acuerdo a la reivindicación 1 en el cual la invasión o metástasis del CNS es por leucemia, linfoma o cáncer de mama.

3. Un método de acuerdo a la reivindicación 1 en el cual el organismo es una bacteria o virus que provocan encefalitis o meningitis.

4. Un método de acuerdo a la reivindicación 1 en el cual la anoxia o isquemia es provocada por apoplejía, por infarto cerebral, por hemorragia cerebral, por trombosis, por asfixia perinatal, por la enfermedad de Binswanger o por vasculitis.

5. Un método de acuerdo a la reivindicación 1 en el cual el agente físico es un trauma, apoplejía, presión intracraneal o radiación.

6. Un método de acuerdo a las reivindicaciones 1 a 5 en el cual el daño del CNS es detectado y/o cuantificado con vistas a evaluar el efecto de un cierto tratamiento en dicho daño del CNS.

7. Un método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, además caracterizado porque el nivel de tau es determinado por el uso de un anticuerpo que reconoce la tau total.