ES2455216T3

ES2455216T3 - Procedimiento diagnóstico

Info

Publication number: ES2455216T3
Application number: ES09709860.2T
Authority: ES
Inventors: Lisbeth Johnsen; Kaj Blennow; Tormod Fladby
Original assignee: Medinnova AS
Current assignee: Medinnova AS
Priority date: 2008-02-15
Filing date: 2009-02-13
Publication date: 2014-04-15
Anticipated expiration: 2029-02-13
Also published as: US20180067127A9; US20170307632A1; WO2009100953A2; US10281477B2; DK2245463T3; PL2245463T3; US20210109114A1; WO2009100953A3; EP2245463B1; EP2245463A2; GB0802851D0; US20110124010A1; US20190204343A1; US9625474B2

Abstract

Un procedimiento de detección de la presencia, o seguimiento de la gravedad, de una afección que se caracteriza por la presencia de fragmentos de una proteína marcadora en el cerebro de un paciente en el que la afección es: Enfermedad de Alzheimer, Enfermedad de Parkinson, Esclerosis Múltiple, Demencia Frontotemporal, Esclerosis Amiotrófica Lateral, o demencia con cuerpos de Lewy, y el procedimiento comprende las etapas de: (i) proveerse de una muestra de líquido cefalorraquídeo o de sangre que se obtiene del paciente; (ii) clasificar una pluralidad de células de la muestra y seleccionar los macrófagos activados con el fin de proporcionar una muestra enriquecida que comprende macrófagos activados; y (iii) detectar la presencia de la proteína marcadora o fragmentos de la misma que están en los macrófagos de la muestra enriquecida y que estaban en los macrófagos del paciente, comparando los niveles de la proteína marcadora y/o de los fragmentos de la misma con un nivel de referencia, siendo el nivel de referencia un promedio de los niveles de la proteína marcadora y/o de los fragmentos de la misma que hay en los macrófagos obtenidos del líquido cefalorraquídeo o de la sangre de una pluralidad de individuos sin la afección y que estaban en los macrófagos de la pluralidad de individuos, de forma que el nivel de la proteína marcadora y/o de los fragmentos de la misma es anormal si existe una diferencia estadísticamente significativa respecto al nivel de referencia y donde los niveles anormales de la proteína marcadora y/o de los fragmentos de la misma en los macrófagos son indicativos de la presencia o de la gravedad de la afección en el paciente. y en el que: la afección es la Enfermedad de Alzheimer y la proteína marcadora es el péptido Ab; la afección es la Enfermedad de Parkinson y la proteína marcadora es la ubiquitina; la afección es la Esclerosis Múltiple y la proteína marcadora es la proteína básica de mielina; la afección es la Demencia Frontotemporal y la proteína marcadora es la proteína tau; la afección es la Esclerosis Amiotrófica Lateral y la proteína marcadora es la proteína tau; o la afección es la Enfermedad de Parkinson, la demencia con cuerpos de Lewy o la Enfermedad de Alzheimer y la proteína marcadora es al alfa-sinucleína.

Description

Procedimiento diagnóstico

5 Campo de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para detectar la presencia o para el seguimiento de la gravedad de una afección caracterizada por la presencia de fragmentos de una proteína marcadora en el cerebro de un paciente.

Antecedente

La enfermedad de Alzheimer (EA) es con mucho la enfermedad más frecuente que produce demencia, y los mecanismos de acumulación de amiloide similares a los de la EA están implicados también en las dos siguientes

15 causas más comunes, la vascular (EVa) y la demencia con cuerpos de Lewy (DCL). La EA tiene un curso prolongado desde el momento del diagnóstico y produce un deterioro también en la salud de los cuidadores [1,2]. En un sistema de gestión de atención médica, la EA también es una gran carga para el sistema público de salud [3], el impacto económico ya se estima mayor en ciertos casos que el del cáncer, apoplejía y enfermedad cardíaca [4, 5]. La prevalencia de la EA aumenta desde un10 % por encima de los 65 años de edad, al 50 % entre los mayores de 85 [6. 7] y puede cuadruplicarse en 2050 debido a las tasas de incidencia que aumentan exponencialmente con la edad [8] y un número mayor de ancianos [9].

Hoy día, parece que estamos a punto de obtener una terapia contra la progresión de la enfermedad de Alzheimer (EA) [10]. Lo que incrementará drásticamente la importancia de un diagnóstico precoz preciso, y cambiará el foco de

25 las investigaciones en dirección a la comprensión del proceso de inducción de la enfermedad EA.

La caracterización de pacientes con Disfunción Cognitiva Ligera (DCL) [11] y el criterio de investigación propuesto recientemente para la EA [12] ayudan a identificar un grupo de pacientes que tienen un aumento del riesgo de tener demencia progresiva [13]. Se sabe que el inicio de la EA y la progresión están ligados a la producción de PPA (proteína precursora de amiloide) en el sistema nervioso central (SNC); el metabolismo de la PPA en proteína Aβ42 por la β- y γ-secretasa; y la acumulación de la proteína Aβ42 en placas de amiloide [14, 15]. A continuación se produce la agregación de tau, el mal ensamblaje de microtúbulos y la degeneración neurofibrilar [10, 16, 17], posiblemente como resultado de la interacción con la Aβ42 [18- 20]. El desarrollo de la enfermedad está fuertemente influenciado por la disposición genética [21, 22], pero probablemente también por factores epigenéticos y factores de

35 riesgo adquiridos como la enfermedad cerebrovascular [23] y mecanismos proteómicos [24] e inmunológicos [25]. La concentración de Aβ42 en el líquido cefalorraquídeo (LCR) refleja niveles parenquimáticos que aumentan con la edad por encima de los 50 [26]. Sin embargo, la concentración de Aβ42 en el LCR se reduce en pacientes que desarrollan EA [27, 28] probablemente debido a la acumulación en placas de amiloide [29].

Se desconoce la duración del periodo de tiempo desde el inicio de la EA al desarrollo de la demencia en pacientes individuales. Las pruebas de las autopsias realizadas en pacientes que han muerto por causas no relacionadas sugieren que puede haber daños iniciales limitados parecidos a los de la EA décadas antes [30], pero la evolución natural de estas lesiones se desconoce. Una fase preclínica extensa desde el inicio de la enfermedad hasta la demencia clínica nos puede dar un gran margen de tiempo para la terapia.

45 La demencia está precedida por una disfunción cognitiva ligera (DCL) [11, 13, 31]. En este estadio, algunos pacientes tienen un aumento del riesgo de progresión a demencia (tasa de conversión anual del 6-25 % [13]), aunque otros pueden tener una afección que se limita a DCL durante varios años. Las pruebas del escáner indican que un subgrupo de pacientes con DCL tiene acumulación cerebral de amiloide [32, 34]. Esta prueba apoya los resultados de los estudios con marcadores del LCR, en los que se tiende a encontrar bajos niveles del precursor de amiloide Aβ42 en el LCR, relacionados con la deposición de amiloide cerebral, en subgrupos con DCL que posteriormente progresan a demencia por Alzheimer. Muchos de estos pacientes satisfacen los nuevos criterios de investigación de la EA [12]. Como se ha descrito anteriormente, la neuropsicología, la proteómica del LCR y el neuroescáner han contribuido a la comprensión de la DCL. La inducción de la enfermedad se produce más

55 temprano, y se puede solapar un periodo de latencia con el estadio DCL, de forma que la enfermedad es detectable.

Sin embargo, todavía no hay medios fiables para detectar los estadios tempranos de EA, incluso cuando estos periodos tempranos se vuelven valorables clínicamente por implementación de terapias de modificación de la enfermedad [35]. Esto es significativo porque, en estadios más tardíos, el daño generalizado causado por la EA es más probable que sea irreversible [16]. Por lo tanto, la detección temprana de EA es importante para tratarla eficazmente.

Fiala M. y col. [39] amplían esta información en un estudio en el que los monocitos (células positivas CD68) obtenidas de muestras de sangre de pacientes con EA e individuos control se diferenciaban en macrófagos y luego

65 se exponían a proteína Aβ in vitro. La proteína Aβ se conjugaba con un marcador visible y las células se examinaban por fluorescencia o microscopía confocal con el fin de determinar la ingesta de proteína Aβ. El estudio indica que los macrófagos derivados de pacientes con EA eran ineficaces en la fagocitosis de la proteína Aβ en comparación con los controles. Sin embargo, la estrategia seguida en este estudio es bastante laboriosa y no deja claro en qué estadio del desarrollo de EA se produciría un resultado positivo con esta técnica.

5 Otras afecciones patológicas del sistema nervioso central que se han caracterizado por la presencia de fragmentos de una proteína marcadora del cerebro incluyen la Enfermedad de Parkinson, la Esclerosis Múltiple, la Demencia Frontotemporal y la Esclerosis Amiotrófica Lateral. En cada uno de estos casos es deseable el pronóstico precoz de la afección.

10 Por lo tanto, la presente invención busca el alivio de uno o más de los problemas anteriores y proporciona un procedimiento mejorado para detectar la presencia o para hacer el seguimiento de la gravedad de una afección caracterizada por la presencia de fragmentos de una proteína marcadora en el cerebro de un paciente.

15 Buddenhagen y col., (1987. J Neurol, 234, 257-258), amplían la información sobre la fagocitosis de partículas de látex por los monocitos obtenidos de pacientes con Esclerosis Múltiple. Kim y col (2006. Exp Mol Med, 38(4), 333347) revisan el papel de la microglía en trastornos neurodegenerativos incluyendo la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson y la esclerosis múltiple. Informa que la proteína amiloide-beta recluta e induce la actividad fagocítica de la microglía. Oe y col (2006. Rapid Comm Mass Spectr, 20, 3723-3735) amplían la información sobre

20 técnicas para cuantificar los niveles de péptidos amiloide-beta en el líquido cefalorraquídeo. Los ensayos llevados a cabo por estos autores no determinan el nivel de proteína Aβ en los macrófagos de los pacientes.

Liu y col (2005. Brain 128, 1778-1789) amplían la información en un estudio en el que se observó que la Aβ42 exógena era fagocitada por las células de la microglía de una manera dependiente de CD14. El estudio se llevó a

25 cabo analizando las células de la microglía cultivadas in vitro y luego tratando las células con fAβ42 biotinilada. Este estudio también incluye el análisis inmunohistoquímico del tejido cerebral de pacientes que padecían enfermedad de Alzheimer y sujetos control. Jung y col (1999. Neurobiol, 20, 249-257) amplían la información sobre la inmunorreactividad de la superficie celular a AβPP en la circulación periférica o en monocitos sanguíneos.

30 Sumario de la Invención

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para detectar la presencia o para el seguimiento de la gravedad, de una afección caracterizada por la presencia de fragmentos de un marcador en el cerebro de un paciente que comprende las etapas de:

(i) proveerse una muestra de sangre o líquido cefalorraquídeo que se obtiene del paciente en que la muestra comprende macrófagos activados;

(ii) clasificar una pluralidad de células en la muestra y seleccionar los macrófagos activados con el fin de 40 proporcionar una muestra enriquecida que comprenda los macrófagos activados; y

(iii) detectar la presencia de la proteína marcadora o fragmentos de la misma que están en los macrófagos de la muestra enriquecida y que estaban en los macrófagos del paciente, comparando los niveles de la proteína marcadora y/o los fragmentos de la misma con un nivel de referencia, siendo el nivel de referencia una media de 45 los niveles de la proteína marcadora y/o los fragmentos de la misma en los macrófagos obtenidos del líquido cefalorraquídeo o la sangre de una pluralidad de individuos sin la afección y que estaban en los macrófagos de la pluralidad de individuos, de forma que los niveles de la proteína marcadora y/o los fragmentos de la misma son anormales si hay una diferencia estadísticamente significativa con el nivel de referencia y de tal manera que el nivel anormal de la proteína marcadora y/o los fragmentos de la misma en los macrófagos, indican la presencia o

50 la gravedad de la afección en el paciente,

y en el que la afección es la Enfermedad de Alzheimer y la proteína marcadora es el péptido Aβ; la afección es la Enfermedad de Parkinson y la proteína marcadora es ubiquitina; la afección es la Esclerosis Múltiple y la proteína marcadora es la proteína básica de mielina; la afección es la Demencia Frontotemporal y la proteína marcadora es la

55 proteína tau; o la afección es la Enfermedad de Parkinson, la demencia con cuerpos de Lewy o la Enfermedad de Alzheimer y la proteína marcadora es la alfa-sinucleína.

Ventajosamente, la presencia de niveles anormales de la proteína marcadora y/o los fragmentos de la misma son una reducción en los niveles en comparación con el nivel de referencia, un aumento de los niveles en comparación

60 con el nivel de referencia, o la ausencia de la proteína marcadora y/o los fragmentos de la misma. En particular, cuando la afección es la Enfermedad de Alzheimer, la Enfermedad de Parkinson, la Demencia Frontotemporal, la Esclerosis Amiotrófica Lateral o la demencia de cuerpos de Lewy, los niveles de proteína marcadora están reducidos

o ausentes. Cuando la afección es Esclerosis Múltiple, los niveles de proteína marcadora están aumentados.

65 De manera alternativa, la presencia de niveles anormales de la proteína marcadora y/o fragmentos de la misma es la presencia de un patrón anormal de los fragmentos de la proteína marcadora.

Preferentemente dichos macrófagos presentan los marcadores de superficie CD14 y/o CD16.

5 De manera conveniente, la etapa de clasificación comprende el uso de clasificación de células activadas por fluorescencia o extracción magnética.

Preferentemente, la etapa (iii) comprende la lísis de los macrófagos y la inmunoprecipitación de la proteína marcadora y/o los fragmentos de la misma.

De manera ventajosa, la etapa (iii) comprende la detección de la proteína marcadora y/o fragmentos de la misma utilizando espectrometría de masas, preferentemente espectrometría de masas de ionización/desorción mediante láser asistida por matriz con analizador de tiempo de vuelo.

15 De manera alternativa, la etapa (iii) comprende la detección de la proteína marcadora y/o fragmentos de la misma utilizando HPLC de fluorescencia, HPLC-UV, sistemas de luminiscencia o de estreptavidina/biotina.

De manera conveniente, la etapa (iii) comprende: poner en contacto la proteína marcadora con un anticuerpo diana capaz de unirse con la proteína marcadora; poner en contacto el anticuerpo diana con un anticuerpo secundario capaz de unirse al anticuerpo diana o a la proteína marcadora; y detectando la presencia del anticuerpo secundario.

Preferentemente, el anticuerpo secundario comprende una marca detectable y la etapa (iii) comprende la detección de la marca detectable.

25 De manera ventajosa, la marca detectable es un ácido nucleico marcador y la etapa (iii) comprende la detección del ácido nucleico marcador utilizando una reacción de amplificación del ácido nucleico.

De manera conveniente, el procedimiento comprende además la etapa de detección de al menos un marcador adicional de la afección, en el que la presencia de dicho marcador adicional y la presencia de niveles anormales de la proteína marcadora y/o fragmentos de la misma en los macrófagos o la microglía indican la presencia de la afección en el paciente.

Preferentemente, la afección es la Enfermedad de Alzheimer y dicho al menos un marcador adicional de la Enfermedad de Alzheimer es la presencia de niveles anormales de Aβ42, Tau, Fosfo-Tau, relación Abeta42/

35 Abeta40, o combinaciones de los mismos, en una muestra de líquido cefalorraquídeo obtenida del paciente, o en un perfil ARN de sangre o del LCR obtenido del paciente.

De manera ventajosa, los niveles anormales del marcador adicional en una muestra de LCR obtenida de un paciente son: una concentración de proteína Aβ42 menor de 550 pg/ml; una concentración de Fosfo-Tau de más de 85 pg/ml;

o ([Aβ42] / [Aβ40]) x 10 menor de 1.

De manera conveniente, la afección es la Enfermedad de Alzheimer y la proteína marcadora es un péptido Aβ y el péptido Aβ comprende una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos un 70 %, preferentemente de al menos un 80 %, más preferentemente al menos de un 90 %, más preferentemente al menos de un 95 %, más

45 preferentemente al menos del 99 %, más preferentemente al menos del 100 % con la secuencia SEC ID Nº 1.

De manera alternativa, la afección es la Enfermedad de Parkinson y la proteína marcadora es la ubiquitina y la secuencia de la proteína ubiquitina comprende una secuencia que es idéntica en al menos un 70 %, preferentemente en al menos un 80 %, más preferentemente en al menos un 90 %, más preferentemente en al menos un 95 %, más preferentemente en al menos un 99 %, más preferentemente en al menos el 100 % con la SEC ID Nº 2.

De manera alternativa, la afección es la Esclerosis Múltiple y la proteína marcadora es la proteína básica de mielina y la secuencia de la proteína básica de mielina comprende una secuencia que tiene una identidad de secuencia de

55 al menos un 70 %, preferentemente al menos un 80 %, más preferentemente al menos un 90 %, más preferentemente al menos un 95 %, más preferentemente al menos un 99 %, más preferentemente al menos el 100 % con la SEC ID Nº 3.

De manera alternativa, la afección es la Demencia Frontotemporal o la Esclerosis Amiotrófica Lateral y la proteína marcadora es la proteína tau y la secuencia de la proteína tau comprende una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos un 70 %, preferentemente de al menos un 80 %, más preferentemente de al menos un 90 %, más preferentemente de al menos un 95 %, más preferentemente de al menos un 99 %, más preferentemente de al menos el 100 % con la SEC ID Nº 4.

65 De manera alternativa, la afección es la Enfermedad de Parkinson, la demencia con cuerpos de Lewy o la Enfermedad de Alzheimer y la proteína marcadora es la proteína alfa-sinucleína y la secuencia de la proteína alfasinucleína comprende una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos un 70 %, preferentemente de al menos un 80 %, más preferentemente de al menos un 90 %, más preferentemente de al menos un 95 %, más preferentemente de al menos un 99 %, más preferentemente de al menos el 100 % con la SEC ID Nº 5.

5 De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, el procedimiento de la invención utiliza un kit que comprende

un reactivo de unión específico de diana capaz de unirse a la proteína marcadora;

un reactivo de unión específico de macrófagos capaz de unirse específicamente a los macrófagos.

De manera conveniente, el kit comprende además un reactivo de unión secundario capaz de unirse al reactivo de unión específico diana o la proteína marcadora, en el que el reactivo de unión específico secundario está acoplado a un marcador.

15 Preferentemente, el marcador es una molécula de ácido nucleico marcadora.

De manera ventajosa, uno, ambos o todos los reactivos de unión específicos de diana, reactivo de unión específico de macrófago y opcionalmente el reactivo de unión secundario son anticuerpos o fragmentos de unión a antígenos de los mismos.

De manera conveniente, el reactivo de unión específico de macrófagos está unido a una perla magnética.

Preferentemente, el kit comprende además un agente de lísis celular.

25 De manera ventajosa el reactivo de unión específico de macrófagos es capaz de unirse a los marcadores celulares CD14 o CD16.

Convenientemente, el kit comprende una pluralidad de reactivos de unión específicos de diana, cada uno capaz de unirse a diferentes proteínas marcadoras.

Preferentemente, la proteína o cada proteína marcadora se selecciona de entre un grupo que consiste en proteína α-beta, ubiquitina, proteína básica de mielina, proteína tau y proteína α-sinucleína.

De acuerdo con un aspecto más de la presente invención, se proporciona el uso de un kit que detecta la presencia,

35 o el hace el seguimiento de la gravedad, de una afección caracterizada por la presencia de fragmentos de una proteína marcadora en el cerebro de un paciente, a partir de una muestra obtenida del paciente.

Esta divulgación se refiere a una estrategia de diagnóstico y seguimiento de enfermedades del sistema nervioso central (SNC). La estrategia de la presente invención estudia las células inmunitarias, tales como los macrófagos/ microglía, en las muestras de, por ejemplo, líquido cefalorraquídeo (LCR) y sangre, y mide los niveles anormales o la ausencia de péptidos o proteínas intracelulares específicos de enfermedad. La activación del sistema macrófago/microglía y la fagocitosis de péptidos/proteínas específicos de enfermedad proporciona una herramienta de diagnóstico nueva y hace posible el progreso y eficacia de las intervenciones terapéuticas que se van a evaluar.

45 Sin el deseo de quedar ligado por teoría alguna, se cree que la invención funciona debido a mecanismos fisiológicos y moleculares que no se describirán con respecto al ejemplo específico de la Enfermedad de Alzheimer. Se cree que la evolución natural de la patología de Alzheimer conlleva un periodo preclínico extenso. El papel del sistema inmunitario es extremadamente interesante en esta conexión. Se sabe que la inmunización de un individuo con péptidos Aβ desencadena la fagocitosis [36], y que esto puede mejorar la acumulación de amiloide en ratones transgénicos con EA (posiblemente también en seres humanos con EA, pero un intento clínico se terminó después de que los pacientes desarrollaran encefalomielitis [37]). La actividad inmune también puede estar implicada en la evolución natural de la patología del amiloide, es decir, el nivel continuo de actividad fagocítica puede contribuir a la carga de la placa con el tiempo. Apoyando esto, hay pruebas de que los macrófagos circulan desde la médula ósea hasta el SNC en la afección patológica y contribuyen a la disminución de placa en ratones EA [38]. También hay

55 pruebas de que la fagocitosis reducida de Aβ por los macrófagos en pacientes con EA in vitro [39]. Por tanto se cree que la presente invención opera por medición de la falta de actividad fagocítica de los macrófagos y/o la microglía in vivo y utiliza esto con fines diagnósticos.

Realizaciones de la presente invención utilizan IP-MS (espectrometría de masas de inmunoprecipitación) para hacer posible el seguimiento de la actividad fagocítica de los macrófagos/monocitos in vivo. Esto abre nuevos territorios para el seguimiento de la fagocitosis de la Aβ en pacientes con predisposición a EA sea genéticamente o con fallo de memoria subjetivo.

El mismo principio se puede utilizar también para estudiar otros grupos de enfermedad. La detección en macrófagos 65 de una proteína biomarcadora específica (distinta de los péptidos Aβ) que está implicada en el mecanismo de otra

enfermedad se utiliza para el diagnóstico precoz y el seguimiento de otra enfermedad. Se describirán a continuación algunos ejemplos específicos.

1. El progreso de la Esclerosis Múltiple (EM) implica la pérdida de la capa de mielina que aísla los axones. La

5 activación inmune y la fagocitosis están implicadas en el proceso de desmielinización. Un marcador específico de la enfermedad importante es por tanto la proteína básica de mielina (PBM).

2.: En la enfermedad de Parkinson, se encuentra ubiquitina acumulada en los cuerpos de inclusión específicos de la enfermedad llamados cuerpos de Lewy. La ubiquitina es una proteína pequeña reguladora que se conserva altamente que está implicada en el control de la estabilidad, función y localización intracelular de una amplia variedad de proteínas. La identificación de las acumulaciones anormales de la proteína ubiquitina dentro de las células que son marcadoras de Enfermedad de Parkinson se revisan, por tanto, en una de las realizaciones de la presente invención.

3.: La alfa-sinucleína es una proteína que se encuentra principalmente en el tejido neural, donde se ve principalmente en los terminales presinápticos. La proteína puede agregarse para formar fibrillas insolubles en

15 condiciones patológicas, caracterizadas por cuerpos de Lewy, tal como en el Parkinson y en la demencia con cuerpos de Lewy. Una variante de la alfa-sinucleína fragmentada también se encuentra en placas de amiloide en la Enfermedad de Alzheimer.

4. Las proteínas tau son proteínas asociadas al microtúbulo que son abundantes en las neuronas que tienen como función principal modular la estabilidad de los microtúbulos axonales. Varios agregados de tau también están implicados en las enfermedades tales como la Esclerosis Amiotrófica Lateral (EAL), EA, Parkinson y demencia frontotemporal.

Los ejemplos mencionados anteriormente ilustran la importancia de las proteínas marcadoras específicas (1-4) de enfermedad que como es sabido se acumulan (2-4) en las enfermedades neurodegenerativas. Por tanto, con el fin

25 de efectuar un diagnóstico precoz y supervisar el progreso de estas enfermedades, se sigue la misma estrategia general que se describa en el presente documento en relación a la Enfermedad de Alzheimer, excepto que se utiliza un panel alternativo de anticuerpos (que son específicos para la proteína que caracteriza la enfermedad, y fragmentos de la proteína) para extraer la proteína de interés en la etapa de inmnoprecipitación.

Se tiene que entender que en las afecciones enumeradas en 2-4 anteriormente, los macrófagos fagocitan una proteína marcadora a niveles anormalmente bajos y por eso los niveles anormalmente bajos de la proteína marcadora en los macrófagos de un individuo son indicativos de la afección. Con respecto a la proteína marcadora PBM de la Esclerosis Múltiple se cree que se fagocita a niveles anormalmente altos por parte de los macrófagos y por tanto la detección de niveles anormalmente altos de la proteína marcadora es indicativa de Esclerosis Múltiple

35 en el paciente.

En esta especificación, la expresión “controlando la presencia o midiendo la gravedad” de una afección incluye diagnosticar la afección pero también incluye la evaluación del progreso de la afección después del diagnóstico inicial, la supervisión de la respuesta de la afección al tratamiento, y el establecimiento de la extensión de una afección de un paciente (es decir, la estadificación).

En esta especificación, el término “macrófago” incluye el término “microglía”. Normalmente, el término “macrófago” es utilizado cuando la célula está en el LCR y el término “microglía” se utiliza cuando la célula está en el SNC.

45 En esta especificación el porcentaje “identidad” entre dos secuencias se determina utilizando el algoritmo BLASTP versión 2.2.2 (Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schäffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, WebbMiller, y David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database searchprograms", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402) utilizando los parámetros por defecto. En particular, se puede acceder al algoritmo BLAST en internet utilizando la URL http://www.ncbi.nim.nih.gov/blast/.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un diagrama de flujo de los monocitos del LCR de un paciente diagnosticado con una DCL sin EA (panel superior) y un diagrama de flujo de un donante de sangre (panel inferior). La población celular dentro de

55 un círculo son los macrófagos /microglía activados.

La Figura 2 es un gráfico que muestra la distribución relativa de los macrófagos activados y no activados de pacientes con 1: enfermedad de Alzheimer (EA), 2: Esclerosis Múltiple (EM), 3: sin enfermedad del SNC, 4: DCL sin EA y 5: 7-10 días después de un ictus.

La Figura 3 muestra los espectros IP-MS de fragmentos del péptido Aβ en muestras de LCR de pacientes. Los dos espectros superiores son de pacientes con EA, N=10 (F=8), Media de edad= 68,9, nº C16+ ∼ 1.894 células. Los dos espectros inferiores son de pacientes con EM, N=3 (F=2), Media de edad= 45, nº C16+ ∼ 773 células.

65 La Figura 4 muestra los espectros IP-MS de fragmentos del péptido Aβ de muestras de LCR de individuos. Los espectros son de individuos sin enfermedad del SNC, N=13 (F=8), Media de edad= 36,15, nº C16+ ∼ 4.792 células.

La Figura 5 muestra los espectros IP-MS de los fragmentos del péptido Aβ en muestras de LCR de pacientes. 5 Los dos espectros superiores son de pacientes con DCL pero sin EA, N=5 (F=3), Media de edad=71,4, nº C16+ ∼

1.082 células. Los dos espectros inferiores son de pacientes de 7-10 días después de un ictus, N=5(F=0), Media de edad=67, nº C16+ en LCR ∼ 2.930, nº C16+ en la sangre ∼ 3.748 células.

La Figura 6 muestra los espectros de IP-MS de masas de los péptidos Aβ con los extremos N y C truncados 10 inmunoprecipitados a partir del LCR.

La Figura 7 muestra los espectros IP-MS de fragmentos del péptido Aβ de muestras de sangre periférica de pacientes 7-10 días después de un ictus (CD16++ espectro superior y CD16 -espectro inferior).

15 La Figura 8 es un diagrama esquemático de un kit de acuerdo con una realización de la presente divulgación, en utilización.

La Figura 9 es un diagrama de flujo que muestra las etapas de la producción de anticuerpos para su uso en un kit de acuerdo con una de las realizaciones de la presente invención.

20 La Figura 10 muestra imágenes de microscopía confocal de un macrófago del LCR teñido para PBM intracelular, en la que la Figura 10a es una imagen fluorescente de la células y la Figura 10b es una imagen transiluminada de la misma célula.

25 La Figura 11 muestra imágenes de microscopía confocal de un macrófago del LCR teñido con anticuerpos específicos del isotipo, en la que la Figura 11a es una imagen fluorescente de la célula y la Figura 11b es una imagen transiluminada de la misma célula.

La Figura 12 muestra imágenes de microscopía confocal de un macrófago de la sangre teñido con MBP 30 intracelular, en la que la Figura 12a es una imagen fluorescente de la célula y la Figura 12b es una imagen transiluminada de la misma célula.

La Figura 13 muestra imágenes de microscopía confocal de un macrófago de la sangre teñido con un anticuerpo específico de isotipo, en la que la Figura 13a es una imagen fluorescente de la célula y la Figura 13b es la 35 imagen transiluminada de la misma célula.

La Figura 14 muestra imágenes de microscopía confocal de un macrófago de la sangre sin anticuerpos primarios contra los antígenos intracelulares, en la que la Figura 14a es una imagen fluorescente de la célula y la Figura 14b es una imagen transiluminada de la misma célula.

40 La Figura 15 muestra los gráficos de las Medias de Intensidad de Fluorescencia en LCR (a) y Sangre (b) con respecto al recuento celular.

Breve descripción de las Secuencias

45 La SEC ID Nº 1 es la secuencia aminoacídica de la proteína Aβ. La SEC ID Nº 2 es la secuencia aminoacídica de la proteína Ubiquitina (RPS27A) La SEC ID Nº 3 es la secuencia aminoacídica de la proteína básica de mielina (PBM). La SEC ID Nº 4 es la secuencia aminoacídica de la proteína Tau (MAPT).

50 La SEC ID Nº 5 es la secuencia aminoacídica de la proteína alfa-sinucleína (SNCA).

Descripción detallada

En realizaciones de la presente invención, el contenido de proteína/péptido de los macrófagos activados se utiliza

55 para el diagnóstico precoz de la EA como se va a explicar a partir de ahora. Los datos desvelados en el presente documento (véase, por ejemplo, las Figuras 3 a 5) indican que los macrófagos en la EA tienen una capacidad reducida para fagocitar la Aβ. La mayoría de los pacientes que se relacionan en el presente documento son pacientes con EA de acuerdo con el criterio de Dubois y col. [12], con DCL pero sin demencia. Esto sugiere que la fagocitosis reducida puede estar presente temprano en el desarrollo de la enfermedad.

60 Se describirá a partir de ahora una realización de la presente invención. Se obtiene una muestra de líquido cefalorraquídeo (LCR) de un paciente por punción lumbar. Los macrófagos en la muestra se tiñen con anticuerpos marcados con fluorescencia anti CD14 y anti CD16 y luego los macrófagos se retiran de la muestra seleccionando las células activadas fluorescentes.

65 Las células se seleccionan basándose en la expresión de CD14 y CD16 debido a que esto hace posible diferenciar los macrófagos activados de las células quiescentes (un aumento de la expresión de CD16 significa un estado activado). Esta técnica también evita recoger en la muestra otros tipos de células tales como las células dendríticas positivas a CD68. Esta estrategia se diferencia de la que propone Fiala y col. [39] en la que se seleccionan las células positivas a CD68.

5 Las células macrófagos resultantes se destruyen y se preparan para el análisis de proteínas. El lisado celular se mezcla con anticuerpos monoclonales capaces de unirse con los fragmentos de proteína Aβ (SEC ID Nº 1). Los anticuerpos ejemplares son 6E10, 4G8 y 11A50-B10 de Signet Laboratories, Inc. El anticuerpo 6E10 se utiliza para inmunoprecipitar los fragmentos 1-16 de proteína Aβ, el anticuerpo 4G8 inmunoprecipita los fragmentos 17-24 de Aβ

10 y el anticuerpo 11A50-B10 inmunoprecipita los fragmentos 1-40 de Aβ. En realizaciones alternativas, se puede utilizar un panel de anticuerpos diferente, específico para otros fragmentos. Los anticuerpos monoclonales se pueden acoplar también en perlas magnéticas, por ejemplo, con perlas ligadas con anticuerpos anti-IgG. Las perlas magnéticas se utilizan para extraer los fragmentos de la proteína Aβ. Los anticuerpos y perlas se eliminan posteriormente de los fragmentos de péptidos. Los fragmentos de péptidos se analizan luego con espectrometría de

15 masas MALDI-TOF y la secuencia de los fragmentos derivados de la masa molecular de cada fragmento. Los resultados se disponen cuantitativamente para indicar la cantidad relativa de cada fragmento. Cuando no se detectan fragmentos de proteína Aβ ni proteína Aβ en los macrófagos, es indicativo de que el paciente tiene EA.

Los fragmentos de Aβ que se muestran en los espectros IP-MS resultan de la degradación intracelular según el

20 carácter del sitio catalítico activo y las condiciones de la acción de las peptidasas/ proteasas intracelulares. Tales fragmentos no necesariamente corresponden con las secuencias de los fragmentos de Aβ encontrados extracelularmente en el LCR. Por tanto en algunas realizaciones, con el fin de identificar la longitud exacta de cada fragmento Aβ que se obtiene en el experimento, los péptidos se aíslan para determinar sus respectivas secuencias aminoacídicas.

25 Se aprecia que el procedimiento descrito anteriormente detecta la presencia de fragmentos de la proteína Aβ que están presentes in vivo en el paciente. El procedimiento no implica una etapa separada de exposición de los macrófagos a la proteína Aβ, in vitro, después de la extracción del paciente.

30 En algunas realizaciones, se compara el nivel de fragmentos de proteína Aβ que se detectan con el nivel detectado en un individuo control que no tiene EA. En tales realizaciones, se hace una comparación entre el nivel y el patrón de los fragmentos de proteína Aβ del paciente y los del individuo control. Cuando el nivel de fragmentos de proteína Aβ está significativamente por debajo del nivel en el individuo control, indica entonces que el paciente tiene EA. De manera similar, si el tipo de fragmentos de proteína Aβ presentes en el individuo es significativamente diferente de

35 los del individuo control, entonces es indicativo de EA en el paciente. En realizaciones alternativas, se genera un nivel de referencia de fragmentos de proteína Aβ detectando la presencia de tales fragmentos en los macrófagos del LCR en una pluralidad de individuos control que no tienen EA. El nivel y patrón de los fragmentos de proteína Aβ del paciente se compara entonces con el nivel de referencia y una reducción estadísticamente significativa en el nivel o una diferencia en el patrón de la presencia de los fragmentos es indicativa de EA.

40 En otras realizaciones, un solo paciente se examina anualmente durante un periodo de tiempo (por ejemplo, 10 años). En cada ocasión, se estudian los niveles de fragmentos de proteína Aβ en los macrófagos de una muestra de LCR del paciente como se describió anteriormente. Un cambio significativo en el nivel o el patrón de los fragmentos de proteína Aβ cada año, en particular una disminución en el nivel de los fragmentos de proteína Aβ año tras año, es

45 indicativo de la presencia de EA.

En ciertas realizaciones, se miden también marcadores de EA adicionales en el paciente, al mismo tiempo que se lleva el análisis descrito anteriormente. Tales marcadores adicionales de EA incluyen niveles anormales de Aβ42, Tau, Fosfo-tau o de la relación Aβ42/ Aβ40 de forma que (Aβ42/ Aβ40) x 10 sea menor de 1.

50 En las realizaciones descritas anteriormente, se obtiene una muestra de LCR de un paciente. Sin embargo, en realizaciones alternativas, se estudia una muestra de sangre. Tal muestra alternativa se puede utilizar porque los macrófagos circulan desde la médula ósea al SNC y por tanto los macrófagos de la sangre del paciente pueden estar expuestos a proteínas en el SNC. Por supuesto, es más fácil obtener una muestra de sangre que una muestra

55 de LCR de un paciente.

Una realización de la presente invención utiliza los siguientes criterios como base de un ensayo de diagnóstico para evaluar la enfermedad de Alzheimer en macrófagos/ microglía de un paciente: 1) cumplimiento de los criterios de enfermedad, 2) Presencia y clasificación de la población de células C16 en el LCR y la sangre por citometría de flujo,

60 3) Presencia/ ausencia de fragmentos de péptidos Aβ en los espectros de MS después de la inmunoprecipitación con anticuerpos, 4)

Procedimientos para evaluar el cumplimiento de los criterios de enfermedad El paciente se somete a una investigación clínica completa, incluyendo un estudio de la historia médica, examen físico, neurológico y psiquiátrico, exploración por ensayos de laboratorio y examen de imágenes MRI y PET del cerebro. El diagnóstico de EA se hace de acuerdo con los criterios publicados recientemente [12]. El paciente se somete a todo el examen físico y psicológico cuando se inscribe en el programa de diagnóstico en el hospital. El

5 examen incluye cuestionarios neuropsicológicos para identificar déficits cognitivos, examen neurológico, análisis genéticos, biomarcadores del LCR, métodos de imagen y perfil metabólico.

Procedimientos para evaluar la presencia y clasificación de la población de células CD16+ en el LCR y la sangre con citometría de flujo

Las células se adquieren en un Sistema de clasificación celular FACSAria y se analizan utilizando el software FACSDiva (ambos de Becton Dickinson). Las poblaciones celulares del LCR se clasifican basándose en su expresión de marcadores de superficie relevantes (CD). Las células se agrupan según sus propiedades de dispersión de la luz directa y lateral y se seleccionan positivamente por la presencia de CD45 + CD3 + CD4 + CD8

15 (caracterización de la población celular T), y CD45 + CD14 + CD16 + CD19 (Caracterización de macrófagos activados y población celular B). Con el fin de preservar intactas las células inmunes, la clasificación celular se lleva a cabo como máximo en cuatro horas tras la extracción. Las células clasificadas CD14+/CD16+ se destruyen y se mantienen congeladas a -80 ºC para análisis posteriores (análisis proteico). Además de recolectar células para los análisis proteicos, los resultados de la citometría de flujo indican la distribución de células inmunes en LCR y periférica (sangre) del paciente.

Procedimiento de preparación de las células para la inmunoprecipitación

Las poblaciones celulares en el LCR se clasificaron basándose en su expresión de marcadores de superficie

25 relevantes (CD). Las células se agruparon de acuerdo con sus propiedades de dispersión de la luz directa y lateral y se seleccionaron positivamente por la presencia de CD45 + CD3 + CD4 + CD8 (caracterización de la población celular T), y CD45 + CD14 + CD16 + CD19 (Caracterización de macrófagos activados y población celular B). Se obtuvo y se registró la población celular y el número de células de cada población (véase la Figura 2). El número de células activadas en pacientes a los 7-10 después de un ictus es alto, sugiriendo la circulación de células inmunes que se reclutan también hacia el compartimiento del LCR en gran cantidad de células. La cantidad de macrófagos activados en la EA iguala con mucho las del grupo de DCL/sin EA. El total del % de células activadas en EM es más baja que en EA; lo cual puede ser debido a que en la EM el proceso inmune implica principalmente células T.

Las células clasificadas como CD14+/CD 16 + y CD14+/CD16- de la muestra se lavaron con 400 μl de PBS y se

35 centrifugaron (4 ºC, 750 x g, 5 min). Se separó el sobrenadante y se preparó para el análisis IP-MS añadiendo 10 μl tampón RIPA para la lísis celular y se mantuvieron congeladas a -80 ºC antes del análisis proteico.

Procedimiento de inmunoprecipitación

Una alícuota (4 μg) de los anticuerpos monoclonales 6E10 (1 mg/ml, epítopo 4-9), 4G8 (1 mg/ml, epítopo 18-22), o 11A50-B10 (0,5 mg/ml, reactivo para el extremo C) (Signet Laboratories, Inc.) se añadió por separado a 50 μl de perlas magnéticas Dynabeds (IgG, oveja anti ratón) y se incubaron durante una noche en una plataforma de balanceo a + 4ºC. El anticuerpo restante que no se unió se retiró lavando dos veces con solución salina de tampón fosfato (PBS, pH 7,4). Después de añadir 1 ml de LCR a las perlas revestidas de anticuerpo, se continuó con la

45 incubación una hora adicional a + 4 ºC. Las perlas se aglomeraron durante 4 minutos utilizando un concentrador magnético de partículas (Dynal MPC) y se lavaron dos veces con PBS (pH 7,4) y dos veces con bicarbonato amónico 50 mM (pH 7,3). Después del último lavado, se eluyeron los péptidos Aβ extraídos añadiendo 20 μl de ácido fórmico (FA) al 0,5 % en agua. Tras mezclarlo con vórtice durante 2 min a temperatura ambiente, las perlas se aglomeraron utilizando el concentrador magnético de partículas y se recolectó el sobrenadante. El sobrenadante recolectado se secó en una centrífuga de vacío y se redisolvió en 5μl de FA al 0,1 % en acetonitrilo (ACN) al 20 %. Todos los disolventes que se utilizaron eran de calidad HPLC y todas las soluciones acuosas se hicieron utilizando agua desionizada 18,2 M obtenida con un sistema de purificación Millipore.

Procedimientos de evaluación de la presencia/ausencia de Aβ en los espectros de MS después de la 55 inmunoprecipitación

Se utilizó la IP-MS para aislar y determinar el contenido en péptido Aβ (señal Aβ) de los macrófagos CD14+/CD16+ clasificados por citometría de flujo. Los péptidos Aβ procesados proteolíticamente son difíciles de detectar utilizando procedimientos proteómicos de referencia debido posiblemente a que comprenden un grupo heterogéneo de péptidos truncados tanto en el extremo N como en el C, algunos en pequeña cantidad. El análisis IP-MS se ha utilizado anteriormente para obtener una señal del péptido Aβ con éxito [43] [44] (véase la Figura 6). En resumen, los péptidos Aβ se aíslan de los macrófagos destruidos utilizando anticuerpos monoclonales anti Aβ y las perlas magnéticas Dynabeads. Luego se lleva a cabo un análisis de ionización/desorción mediante láser asistida por matriz con analizador de tiempo de vuelo en una espectrometría de masas (MALDI-TOF MS) sobre los péptidos 65 inmunoprecipitados y se calcula la señal Aβ de los macrófagos. La ausencia de señal Aβ se interpreta como un

diagnóstico positivo de EA.

Metodologías alternativas

En variaciones de la metodología descrita anteriormente, se utilizaron las siguientes técnicas. 5

1.: En vez de utilizar citometría de flujo para clasificar las células, las células activadas macrófagos/ microglía se retiran utilizando extracción magnética, técnicas de flotación, u otras técnicas de extracción basadas en la afinidad o anticuerpos, por ejemplo, cromatografía, centrifugación por gradiente. De manera alternativa las células se estudian utilizando inmunohistoquímica.

2.: La inmunoprecipitación utilizando otros anticuerpos específicos para la proteína/ péptido de interés.

3.: En vez de utilizar espectrometría de masas, se emplea otra técnica para análisis cuantitativo o semicuantitativo de péptidos/ proteínas, tales como: HPLC de fluorescencia o de UV, luminiscencia, sistemas de estreptavidina/biotina, Inmunohistoquímica, entre otros.

15 Condiciones alternativas

En realizaciones alternativas se estudia una afección patológica diferente caracterizada por la presencia de fragmentos de una proteína marcadora en los cerebros de los pacientes. En cada caso es necesario identificar la afección que se estudia y la proteína correspondiente que caracteriza la afección. Afecciones ejemplares incluyen: la Enfermedad de Parkinson en la que la ubiquitina (SEC ID Nº 2) es la proteína caracterizadora; Esclerosis Múltiple en la que la proteína básica de mielina (SEC ID Nº 3) caracteriza la afección; Demencia Frontotemporal y Esclerosis Amiotrófica Lateral que se caracterizan por la proteína tau (SEC ID Nº 4); y la Enfermedad de Parkinson, demencia con cuerpos de Lewy y EA que se caracterizan por la proteína alfa-sinucleína (SEC ID Nº 5). En cada caso, el procedimiento de detección o seguimiento se lleva a cabo como se ha descrito anteriormente en relación con la EA

25 excepto en que los anticuerpos utilizados para inmunoprecipitar los péptidos de los macrófagos se sustituyen con anticuerpos que son capaces de unirse con los fragmentos de las proteínas que caracterizan la afección. Además, en el caso de la Esclerosis Múltiple, los niveles anormalmente altos de la proteína marcadora ubiquitina indican la presencia de la afección.

En algunas realizaciones, se ensayan varias de estas afecciones simultáneamente inmunoprecipitando los lisados celulares con múltiples grupos de anticuerpos, siendo cada grupo de anticuerpo específico para los fragmentos de las diferentes proteínas caracterizadoras.

En algunas realizaciones de la invención, el procedimiento de la invención utiliza un kit de diagnóstico que se

35 proporciona con el fin de posibilitar la detección de una afección patológica de la invención (es decir una afección caracterizada por la presencia de fragmentos de una proteína marcadora en el cerebro de un paciente que padece la afección). El kit es adecuado para su uso en laboratorios clínicos ordinarios puesto que se basa en una técnica ELISA/inmuno-PCR y por tanto no necesita la utilización de técnicas MALDI-TOF o IP-MS como se describe en algunas realizaciones anteriores. El kit comprende un panel de anticuerpos específicos que son específicos para un primer epítopo de la proteína marcadora. Por tanto, por ejemplo, cuando la afección patológica a detectar es la enfermedad de Alzheimer, la proteína es la proteína Abeta 42. El kit también comprende un suministro de perlas magnéticas que exponen los anticuerpos específicos de macrófagos (por ejemplo, anticuerpos específicos para marcadores celulares CD14 y CD16); un agente destructor de células tal como un tampón de Ensayo de RadioInmuno Precipitación (RIPA) que contiene Tris-HCl 25 mM pH 7,6, NaCl 150 mM, un 1 % de NP-40, un 1 % de

45 desoxicolato sódico y un 0,1 % de SDS (Pierce Biotechnology); y un anticuerpo secundario de la proteína marcadora. El anticuerpo secundario se conjuga con una molécula ADN marcadora de cadena doble.

En referencia a la Figura 8, el kit se describirá ahora en cuanto a su uso. Una muestra, tal como una muestra de sangre periférica o LCR, se obtiene de un paciente y se aíslan las células macrófagos de la muestra mezclándola con las perlas magnéticas proporcionadas en el kit. Los anticuerpos específicos expuestos por las perlas magnéticas se unen a los macrófagos en la muestra del paciente y los macrófagos y las perlas magnéticas se retiran de la muestra por medios magnéticos. Las células macrófagos se liberan de los anticuerpos específicos de macrófagos ajustando el pH de la solución y las células macrófagos 1 se destruyen con el agente destructor con el fin de liberar los contenidos celulares 2 que incluyen la proteína 3 como se muestra en la Figura 8 a.

55 También se proporciona en el kit de diagnóstico de un soporte sólido 4 sobre el que se inmovilizan una pluralidad de anticuerpos diana 5, 6 que son específicos para la proteína marcadora 3.

Como se muestra en la Figura 8 b, los contenidos 2, 3 de la células macrófago destruida 1 se ponen entonces en contacto con el soporte sólido 4 de forma que el primer epítopo de la proteína marcadora 3 se une con el anticuerpo diana 5.

En referencia a la Figura 8 c, el soporte sólido 4 se pone en contacto con un anticuerpo secundario 7 que se conjuga con una molécula de ADN marcadora de cadena doble 8. El anticuerpo secundario 7 es específico del segundo

65 epítopo de la proteína marcadora 3 de forma que el segundo anticuerpo 2 se inmoviliza sobre el soporte sólido 4 donde está presente la proteína marcadora 3.

Luego se lavan las proteínas no unidas y los anticuerpos secundarios no unidos y se eliminan (véase la Figura 8 d).

En referencia a la Figura 8 e, el soporte sólido 4 lavado se somete entonces a una PCR en tiempo real que funde la

5 molécula de ADN marcadora 8 y amplifica el número de copias (véase la Figura 8 f) con el fin de identificar el número de copias de la molécula de ADN marcadora. El número de copias de la molécula de ADN marcadora 8 tras un número predeterminado de ciclos de amplificación de la PCR es indicativo del número de moléculas de ADN de inicio. Además, hay una relación de uno a uno entre el número de moléculas de ADN de inicio y el número de proteínas marcadoras unidas. Por lo tanto, esta técnica inmuno-PCR proporciona una indicación precisa del número de moléculas de proteína marcadora en la muestra del paciente.

En consecuencia, tales kits de diagnóstico permiten un procedimiento inmunológico simple que se puede utilizar en laboratorios clínicos de referencia que están en todos los hospitales, clínicas privadas y laboratorios comerciales con el fin de analizar muestras de pacientes de acuerdo con la presente invención. El uso del kit de la divulgación no

15 necesita el uso de instrumentos de laboratorio caros o avanzados y utilizando una técnica de detección inmuno-PCR se asegura una alta sensibilidad.

Los anticuerpos diana del kit de diagnóstico pueden ser anticuerpos que ya se conocen en la técnica que son capaces de unirse a la proteína marcadora tales como los anticuerpos 6E10, 4G8, y 11A50-B10 descritos anteriormente. Sin embargo se pueden identificar más anticuerpos como se explica en el diagrama de flujo de la figura 9 en relación a los anticuerpos de la proteína Abeta. El proceso comienza con la obtención de una muestra adecuada del paciente por extracción de una muestra de líquido cefalorraquídeo por punción lumbar (cuadro 9). Posteriormente, se extraen los macrófagos de la muestra uniéndolos a los anticuerpos por los marcadores celulares adecuados (por ejemplo CD14 y CD16) en la muestra del paciente y clasificando las células por FACS (véase

25 cuadro 10). Los macrófagos aislados entonces se cultivan (cuadro 11) y se les estimula la fagocitosis desafiándolos con proteína Abeta in vitro (cuadro 12). Se proporcionan más datos de esta etapa en el “amiloid-beta stress test” de Fiala y col [39]. Los macrófagos cultivados entonces se destruyen y se extraen los fragmentos digeridos de proteína Abeta y se inmunoprecipitan (cuadro 13).

En este estadio del procedimiento, los fragmentos de Abeta pueden, por sí mismos, utilizarse para inmunizar animales huésped (tales como conejos) con el fin de producir anticuerpos específicos para los fragmentos de proteína Abeta a pequeña escala (cuadro 14). Sin embargo para la producción de anticuerpos a gran escala, el procedimiento continúa con la identificación de los fragmentos de proteína Abeta digeridos utilizando espectrometría de masas en tándem (por ejemplo electrospray-Q-TOF o MALDI-TOF (cuadro 15)). Una vez que se han identificado

35 las secuencias de los fragmentos de proteína Abeta, se sintetizan los fragmentos, por ejemplo por expresión recombinante en una célula huésped tal como E. coli (cuadro 16). Los fragmentos de proteína Abeta sintetizados se utilizan entonces para inmunizar animales huésped (normalmente conejos) (cuadro 17) que a su vez producen los anticuerpos (cuadro 18). Loa anticuerpos se pueden obtener de los animales huésped e incluirse en los kits de diagnóstico, pero preferentemente, se producen células productoras de anticuerpos monoclonales, como se conoce en la técnica (por ejemplo, por producción en células de hibridoma). De manera alternativa, los anticuerpos, o al menos sus regiones determinantes de complementariedad, se secuencian y se expresan de manera recombinante. Cualquiera que sea el procedimiento de producción de anticuerpos seleccionado, los anticuerpos se purifican y se incluyen en el kit de diagnóstico (cuadro 19).

45 En algunas variaciones de los kits de diagnóstico descritos anteriormente, se proporciona una pluralidad de paneles en el kit. Por ejemplo, en una variante, el kit comprende anticuerpos diana primarios que son específicos para un primer epítopo de la proteína Abeta y anticuerpos diana secundarios que son específicos para un tercer epítopo de la proteína Abeta. En más realizaciones, una pluralidad de paneles de anticuerpos se proporcionan en el kit y los anticuerpos son específicos para proteínas marcadoras que corresponden a más de una afección patológica. Por ejemplo, en una variante particular, se proporciona un panel de anticuerpos que son específicos para la proteína Abeta (la proteína marcadora para la enfermedad de Alzheimer) y se proporciona un panel de anticuerpos específicos para Esclerosis Múltiple (en la que la proteína básica de mielina es la proteína marcadora). En estas variantes, se prefiere que los diferentes paneles de anticuerpos secundarios, cada uno específico para una proteína marcadora respectiva y cada uno se conjuga a una diferente molécula de ADN marcadora, se proporcionen de

55 manera tal que la señal para la detección de cada proteína marcadora sea distinguible.

En las realizaciones descritas anteriormente del kit de diagnóstico, la marca detectable es una molécula de ADN marcadora. Sin embargo, en otras realizaciones, se utiliza una marca detectable diferente. Por ejemplo, la marca detectable puede ser un fluoróforo, una microperla de látex o una partícula de oro. Tales marcas detectables alternativas son útiles cuando el kit se proporciona solamente para proporcionar un resultado cualitativo más que un resultado cuantitativo.

En algunas realizaciones alternativas del kit, no se proporciona un agente destructor, como tal. En vez de eso, las células se destruyen mecánicamente, por ejemplo por centrifugación, antes del aislamiento de los macrófagos.

65 También se tiene que apreciar que los kits de diagnóstico de la presente divulgación no están limitados a kits que comprenden anticuerpos. En realizaciones alternativas, los anticuerpos del kit se remplazan con otros reactivos de unión tal como fragmentos de unión antigénicos (por ejemplo, fragmentos F(ab’)2 o fragmentos Fab) o una secuencia de polinucleótidos. Normalmente tales otros reactivos de unión tienen afinidades de unión para su diana comparable a la de los anticuerpos teniendo una afinidad de unión de menos de 100 nm en una solución acuosa tamponada a un

5 pH entre 4 y 8.

Ejemplos

Ejemplo 1: Selección pacientes

Los pacientes eran ambulatorios u hospitalizados y se reclutaron en la Nevroklinikken del Hospital Universitario Akershus. Se llevó a cabo la punción lumbar según el procedimiento planeado. Los grupos de pacientes se dividieron según los siguientes diagnósticos: 1) enfermedad de Alzheimer probable (EA) diagnosticados según los criterios NINCS-ADRA [12]; 2) probable esclerosis múltiple (EM) diagnosticada según los criterios McDonald; 3) Sin

15 enfermedad del sistema nervioso central (por ejemplo, ME, y otros pacientes con una investigación totalmente negativa de enfermedad “orgánica”); 4) disfunción cognitiva ligera (DCL)/sin EA; y 5) pacientes 7-10 días después de un ictus.

Ejemplo 2: Toma de muestras por punción lumbar/sangre

La punción lumbar se llevó a cabo de forma rutinaria en conexión con el diagnóstico entre las 9:00 y las 13:30 h. El LCR se obtuvo de los pacientes por medio de punción lumbar entre las vértebras L4 y L5 con los pacientes en posición horizontal. La piel de la región lumbar se lavó con torundas estériles de algodón y clorhexidina al 5 %. El neurólogo acudía a realizar la punción lumbar. Se utilizaron agujas desechables finas (Becton Dickinson 20GA 3,5

25 IN 0,9x90 mm). La muestra para el análisis de citología de flujo se recolectó como muestra final, con un total de 2 ml (∼ 40 gotas) de LCR. La muestra de sangre (en EDTA o heparina) se tomó inmediatamente antes o a continuación de la punción lumbar.

Las células se adquirieron en un Sistema de Clasificación Celular FACSAria y se analizaron utilizando el software FACSDiva (ambos de Becton Dickinson) en un máximo de cuatro horas tras la toma de muestras por punción/ extracción de sangre.

Ejemplo 3: Preparación y análisis del LCR/ muestras de sangre para la citometría de flujo

35 Se aglomeraron 2 ml de LCR y/o 4 ml de sangre (4 ºC, 400 x g, 10 min). Se eliminó el sobrenadante y los aglomerados de células restantes se lavaron una vez en tampón de tinción (Becton Dickinson, San José, CA). Los aglomerados celulares se diluyeron en 1 – 2 ml de tampón de tinción y se centrifugaron a 4 ºC, 400 x g, 10 min. Se eliminó el sobrenadante y la muestra se transfirió a un tubo de flujo. La muestra estaba teñida con un panel de anticuerpos marcados con fluorescencia (2,5 μl de CD4-FITC y CD19-FITC, 2,0 μl de CD8-PE, CD16-PE y CD45-PerCP, 1,5 μl de CD3-APC y CD-14-APC todos de Becton Dickinson). Las muestras se incubaron en un refrigerador durante 15-20 minutos antes de añadir 3 – 4 gotas de solución FACSFlow, se mezcló y quedó listo para el análisis de citometría de flujo.

Ejemplo 4: Análisis de citometría de flujo y clasificación celular

45 Las poblaciones celulares del LCR se clasificaron basándose en su expresión de marcadores de superficie relevantes (CD). Las células se agruparon según las propiedades de dispersión de luz directa y lateral y se seleccionaron positivamente por la presencia de CD45 + CD3 + CD4 + CD8 (caracterización de población de células T), y CD45 + CD14 + CD 16 + CD 19 (caracterización de macrófagos activados y población de células B). Se obtuvo y se registró la población celular y el número de células en cada población (véase la Figura 2). El número de células activadas en los pacientes de 7-10 días después de un ictus era alto, sugiriendo la circulación de células inmunes reclutadas también hacia el compartimento del LCR de una gran cantidad de células. El número de macrófagos activados en EA igualaba con mucho las del grupo con DCL/sin EA. El total del % de células activadas en EM es menor que en EA; que puede ser debido a que el proceso inmune en la EM implica principalmente células T.

55 0092 La muestra de células clasificadas CD14+/CD16+ y CD14+/CD16 - se lavaron con 400 μl de PBS y se centrifugó (4 ºC, 750 x g, 5 min). Se eliminó el sobrenadante y se preparó para el análisis IP-MS añadiendo 10 μl del tampón RIPA para la lísis de las células y se mantuvo congelada a -80 ºC antes del análisis proteico.

Ejemplo 5: Agrupamiento de los pacientes según el diagnóstico

Las células clasificadas se agruparon juntas según el diagnóstico, antes del análisis IP-MALDI-TOF-MS, en los siguientes grupos.

65 1) Pacientes de Alzheimer: N=10 (F=8), Media de edad= 68,9, nº C16+ ∼ 1.894 células.

2) Pacientes con EM: N=3 (F=2), Media de edad= 45, nº C16+ ∼ 773 células. 3) Sin enfermedad del SNC: N=13 (F=8), Media de edad= 36,15, nº C16+ ∼ 4.792 células. 4) DCL/ sin Alzheimer: N=5 (F=3), Media de edad= 71,4, nº C16+ ∼ 1.082 células. 5) 7 – 10 días después de un ictus: N=5 (F=0), Media de edad= 67, nº C16+ en el LCR ∼ 2.930, nº C16+ en la

5 sangre ∼ 3.748 células.

Ejemplo 6: Inmunoprecipitación – Ionización/desorción mediante láser asistida por matriz con analizador de tiempo de vuelo en una espectrometría de flujo

10 Las muestras se inmunoprecipitaron como se describió anteriormente. Las muestras MALDI se prepararon con el procedimiento de siembra en capa. En resumen, se creó una siembra en capa en una sonda de muestras de acero inoxidable MALDI-TOF MS (Bruker Daltonics Inc.) depositando 0,5 μl (1 g/l) de ácido alfa-ciano-4-cinámico (CHCA, Fluka) disuelto en ACN. Se añadió un microlitro de CHCA saturado (15 g/l) en ácido trifluoroacético al 0,1 % en ACN / agua (1:1 v/v) hasta un volumen igual al de los péptidos disueltos y se mezclaron. Un microlitro de la matriz/

15 solución de péptidos se añadió a la sonda y la muestra se dejó secar completamente al aire. Las mediciones de la MALDI-TOF MS se realizaron utilizando un instrumento AUTOFLEX (Bruker Daltonics, Inc.) operando en modo reflectante a un voltaje de aceleración de 19 kV. Los espectros representan una media de 900 disparos y se registraron hasta 4600 Ca. Los espectros se calibraron utilizando una calibración interna (m/z 1.826,8, 2.068,0, 4.130,0, y 4.328,2) y cada muestra se analizó por duplicado. Todos los espectros de masas se analizaron utilizando

20 el Flexanalisis de Bruker Daltonics 2.4, restando la línea base y luego alisados con un filtro de Savitsky-Golay de 5 puntos. Los resultados se muestran en las Figuras 3 a 5, con dos espectros de masas por muestra.

Los resultados utilizando IP-MS que se comunican en el presente documento muestran que los fragmentos de péptido Aβ se pueden medir en los subgrupos de macrófagos activados / microglía, y las diferencias de contenido

25 del péptido Aβ están relacionadas con el tipo de enfermedad incluso aunque las células activadas macrófagos / microglía estén presentes en una cantidad normal. Además, los resultados muestran fragmentos de péptido Aβ en macrófagos / microglía en todos los grupos control y de pacientes (el grupo EM, el grupo sin enfermedad del SNC y el grupo de 7-10 días después de un ictus) excepto en los pacientes con EA, que no muestran una señal detectable en los espectros de masas de Aβ (Figuras 3 a 5).

30 Estos resultados muestran que a pesar de haber una enfermedad cerebral grave diseminada, el sistema macrófagos/ microglía en los pacientes con EA no está significativamente activado al compararse con pacientes con enfermedad cerebral no orgánica y pacientes después de un ictus (compárese los grupos 1, 3 y 5 en las Figuras 2 a 5). Además, al contrario que todos los otros grupos de pacientes, las células activadas macrófagos / microglía no

35 contienen fragmentos de péptido Aβ lo que indica que su capacidad de fagocitar péptidos Aβ está incapacitada o totalmente ausente.

El contenido de péptido Aβ en los macrófagos en los individuos sin EA no corresponde con el patrón normal de degradación de la proteína Aβ en el LCR que se produce por la escisión de APP por proteasas amiloidogénicas, β y

40 γ - secretasa (véase Figura 6). Los diferentes patrones de degradación vistos en macrófagos del LCR y la sangre (véase Figuras 3 a 5) pueden resultar de la proteólisis de la proteína Aβ dentro de los macrófagos. Los resultados desvelados en el presente documento están basados en 62 pacientes (véase la Figura 2).

Ejemplo 7: Ultraestructura (Filtración/SEM)

45 El análisis de barrido con microscopio electrónico (SEM) de los macrófagos clasificados CD14+/CD16+ se utiliza como un complemento de la citometría de flujo, la IP-MS y otras técnicas, con el fin de obtener una imagen global de la morfología de los macrófagos activados con respecto a los macrófagos no activados. Los agentes infecciosos putativos, otras células y residuos en el LCR se visualizan con esta técnica.

50 El LCR sin procesar, y las soluciones celulares clasificadas (seleccionadas de acuerdo con las propiedades CD14+/CD16+ y CD14+/CD16 -) que contienen macrófagos activados y no activados, se aplican en la superficie de un filtro de policarbonato 0,6 nm (Nucleopore, Inc.), ajustado a un aparato hermético (Gislaved, Suecia), se filtran al vacío e inmediatamente se recubren con una capa espesa de 40 Å de oro ionizado para SEM. Se lleva a cabo el

55 SEM utilizando un Sem Philips de Alta Resolución (515). La morfología de estas células significa que tienen un estado fagocítico activo.

Ejemplo 8

60 Los procedimientos de los Ejemplos 1 a 4 y 6 se repitieron con respecto a las muestras de sangre periférica obtenida de un paciente 7- 10 días después de un ictus. Sin embargo no hubo agrupamiento de pacientes. Los espectros IP-MS se generaron con el fin de detectar la presencia de fragmentos de péptido Aβ . Los espectros se muestran en la Figura 7.

65 El espectro superior muestra células CD16++ de sangre periférica. El número de células CD16++ era 137. Los picos que se muestran en el espectro parecen idénticos a los resultados mostrados en el espectro inferior de la Figura 5 (aunque la muestra se extrajo de un paciente diferente). El espectro inferior de la Figura 7 muestra las células CD16 de sangre periférica de un paciente sin patología Aβ. El número de células CD16 - de la sangre era ∼ 35.000.

5 Este ejemplo demuestra que las muestras de la sangre de un paciente se puede analizar con el fin de evaluar la fagocitosis de los péptidos Aβ por los macrófagos.

Ejemplo 9: Tinción intracelular de los macrófagos del paciente con probable Esclerosis Múltiple con anticuerpos anti proteína básica de mielina (PBM)

10 Se pretrataron aproximadamente 4,5 ml de líquido cefalorraquídeo y 4,5 ml de sangre periférica de un paciente con probable Esclerosis Múltiple de acuerdo con el Ejemplo 3 antes de teñir las células con anticuerpos de superficie CD14-APC. A continuación las células se fijaron y se permeabilizaron con un reactivo basado en formaldehído/ saponina (IntraPrep) del coulter Beckman. Las células del LCR y la sangre es dividieron en 3 alícuotas cada una y

15 se tiñeron intracelularmente con dos anticuerpos anti proteína básica de mielina (PBM) diferentes de Epitomics (UniProtID P02686) y de Sigma (que corresponden a los restos 102-116 de la PBM humana). Se utilizó como control un anticuerpo no específico del epítopo específico (IgG de conejo) de Epitomics. Además, se incluyó una muestra con solo tinción CD14-APC. Se utilizó un anticuerpo secundario (de cabra anti IgG de conejo) de Invitrogen, marcado con fluorescencia con AlexaFluor488, para detectar la unión del anticuerpo primario al antígeno.

20 Se llevó a cabo la citometría de flujo como se describe en el Ejemplo 4. Las células se clasificaron según su señal intracelular CD14+, se depositaron en un portaobjetos cubierto con polisina que atrae y se adhiere a las células. Se añadió el reactivo antidesteñido ProLong Gold (Invitrogen) a los portaobjetos (un montaje medio con DAPI), lo que le aumenta la resistencia al blanqueamiento producido por la luz y le da una tinción adicional al núcleo. Se utilizó un

25 microscopio confocal Leica para visualizar las células.

Las Figuras 10a y b muestran un macrófago del LCR teñido para visualizar la PBM intracelular. Estructuras granulares teñidas positivamente para PBM (flechas blancas).

30 Las Figuras 11a y b muestran un macrófago del LCR teñido con el anticuerpo control específico del isotipo.

Las Figuras 12a y b muestran un macrófago de la sangre teñido para ver la PMB intracelular. Estructuras granulares teñidas positivamente para PMB (flechas blancas).

35 Las Figuras 13a y b muestran un macrófago de la sangre teñido con el anticuerpo control específico de isotipo.

Las Figuras 14a y b muestran un macrófago de la sangre sin anticuerpo primario contra los antígenos intracelulares. La señal fluorescente es debida a autofluorescencia.

40 Las Figuras 15a y b muestran la Media de Intensidad Fluorescente (MIF) en el LCR (a) y sangre (b) de un paciente con sospecha de EM. Se muestra una diferencia en la MIF entre las células teñidas con PBM y las células teñidas con anticuerpo específico del isotipo y un control negativo (sin anticuerpo primario contra antígenos intracelulares) que sugiere la presencia de unión anti PBM dando una señal AlexaFluor 488 en el citómetro de flujo. Se proporcionan los datos tabulados en las Tablas 1 (LCR) y 2 (sangre periférica).

45 Tabla 1

LCR: Número de macrófagos Media IF Media geométrica IF CV

Anti PBM de conejo: 135 402 376 36,1

Control Isotipo de conejo: 104 328 292 98,9

Tabla 2

SP: Número de macrófagos Media IF Media geométrica IF CV

Anti PBM de conejo: 767 1503 1419 32,07

Control Isotipo de conejo: 1036 783 766 19,8

Control negativo: 1340 169 163 30,7

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LISTADO DE SECUENCIAS

25 <110> Medinnova AS Fladby, Tormod Johnsen, Lisbeth Blennow, Kaj

30 <120> PROCEDIMIENTO DIAGNÓSTICO

<130> LWPP58862

<150> GB0802851. 6 35 <151>

<160> 5

<170> Patentln versión 3.3 40

<210> 1

<211> 42

<212> PRT

<213> Homo sapiens 45

<400> 1

<210> 2 50 <211> 76

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2 55 5 <210> 3

<211> 304

<212> PRT

<213> Homo sapiens

10 <400> 3

<210> 4

<211> 758

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

<210> 5

<211> 140

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento de detección de la presencia, o seguimiento de la gravedad, de una afección que se

5 caracteriza por la presencia de fragmentos de una proteína marcadora en el cerebro de un paciente en el que la afección es: Enfermedad de Alzheimer, Enfermedad de Parkinson, Esclerosis Múltiple, Demencia Frontotemporal, Esclerosis Amiotrófica Lateral, o demencia con cuerpos de Lewy, y el procedimiento comprende las etapas de:

(i)

proveerse de una muestra de líquido cefalorraquídeo o de sangre que se obtiene del paciente;

(ii)

clasificar una pluralidad de células de la muestra y seleccionar los macrófagos activados con el fin de proporcionar una muestra enriquecida que comprende macrófagos activados; y

(iii) detectar la presencia de la proteína marcadora o fragmentos de la misma que están en los macrófagos de la muestra enriquecida y que estaban en los macrófagos del paciente, comparando los niveles de la proteína marcadora y/o de los fragmentos de la misma con un nivel de referencia, siendo el nivel de referencia un

15 promedio de los niveles de la proteína marcadora y/o de los fragmentos de la misma que hay en los macrófagos obtenidos del líquido cefalorraquídeo o de la sangre de una pluralidad de individuos sin la afección y que estaban en los macrófagos de la pluralidad de individuos, de forma que el nivel de la proteína marcadora y/o de los fragmentos de la misma es anormal si existe una diferencia estadísticamente significativa respecto al nivel de referencia y donde los niveles anormales de la proteína marcadora y/o de los fragmentos de la misma en los macrófagos son indicativos de la presencia o de la gravedad de la afección en el paciente.

y en el que: la afección es la Enfermedad de Alzheimer y la proteína marcadora es el péptido Aβ; la afección es la Enfermedad de Parkinson y la proteína marcadora es la ubiquitina; la afección es la Esclerosis Múltiple y la proteína marcadora es la proteína básica de mielina; la afección es la Demencia Frontotemporal y la proteína marcadora es la

25 proteína tau; la afección es la Esclerosis Amiotrófica Lateral y la proteína marcadora es la proteína tau; o la afección es la Enfermedad de Parkinson, la demencia con cuerpos de Lewy o la Enfermedad de Alzheimer y la proteína marcadora es al alfa-sinucleína.
2.

Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la presencia de niveles anormales de la proteína marcadora y/o de los fragmentos de la misma es una reducción de los niveles en comparación con el nivel de referencia, un aumento de los niveles en comparación con el nivel de referencia o la ausencia de proteína marcadora y/o de fragmentos de la misma.
3.

Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la presencia de niveles anormales de la proteína

35 marcadora y/o de los fragmentos de la misma es la presencia de un patrón anormal de los fragmentos de la proteína marcadora.
4.

Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que la etapa de clasificación comprende el uso de clasificación de células activadas por fluorescencia o de extracción magnética.
5.

Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa (iii) comprende la lísis de los macrófagos y la inmunoprecipitación de la proteína marcadora y/o de los fragmentos de la misma.

45 6. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa (iii) comprende la detección de la proteína marcadora y/o de los fragmentos de la misma utilizando espectrometría de masas, preferentemente espectrometría de masas de ionización/desorción mediante láser asistida por una matriz con analizador de tiempo de vuelo.
7.

Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la etapa (iii) comprende la detección de la proteína marcadora y/o de los fragmentos de la misma utilizando HPLC-fluorescencia, HPLC-UV, luminiscencia o sistemas de estreptavidina/biotina.
8.

Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende además la

55 etapa de detección de al menos un marcador adicional de la afección, en el que la presencia de dicho marcador adicional y/o la presencia de niveles anormales de la proteína marcadora y/o de los fragmentos de la misma en los macrófagos es indicativo de la presencia de la afección en el paciente.
9. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que la afección es la Enfermedad de Alzheimer y la proteína es el péptido Aβ y en el que el péptido Aβ comprende una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos un 70 %, preferentemente de al menos un 80 %, más preferentemente de al menos un 90 %, más preferentemente de al menos un 95 %, más preferentemente de al menos un 99 %, más preferentemente de al menos el 100 % con la SEC ID Nº 1.

65 10. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la afección es la Enfermedad de Parkinson y la proteína marcadora es la ubiquitina y en el que la secuencia de la proteína ubiquitina comprende una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos un 70 %, preferentemente de al menos un 80 %, más preferentemente de al menos un 90 %, más preferentemente de al menos un 95 %, más preferentemente de al menos un 99 %, más preferentemente de al menos el 100 % con la SEC ID Nº 2.

5 11. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en el que la afección es la Esclerosis Múltiple y la proteína marcadora es la proteína básica de mielina y en el que la secuencia de la proteína básica de mielina comprende una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos un 70 %, preferentemente de al menos un 80 %, más preferentemente de al menos un 90 %, más preferentemente de al menos un 95 %, más preferentemente de al menos un 99 %, más preferentemente de al menos el 100 % con la SEC

10 ID Nº 3.
12. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en el que la afección es la Demencia Frontotemporal o la Esclerosis Amiotrófica Lateral y la proteína marcadora es la proteína tau y en el que la secuencia de la proteína tau comprende una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos un 70

15 %, preferentemente de al menos un 80 %, más preferentemente de al menos un 90 %, más preferentemente de al menos un 95 %, más preferentemente de al menos un 99 %, más preferentemente de al menos el 100 % con la SEC ID Nº 4.
13. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en el que la afección es la

20 Enfermedad de Parkinson, demencia con cuerpos de Lewy o Enfermedad de Alzheimer y la proteína marcadora es la proteína alfa-sinucleína y en el que la secuencia de la proteína alfa-sinucleína comprende una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos un 70 %, preferentemente de al menos un 80 %, más preferentemente de al menos un 90 %, más preferentemente de al menos un 95 %, más preferentemente de al menos un 99 %, más preferentemente de al menos el 100 % con la SEC ID Nº 5.
14. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores que utiliza un kit que comprende:

un reactivo de unión específico de diana capaz de unirse a la proteína marcadora; y

30 un reactivo de unión específico de macrófagos capaz de unirse específicamente a un macrófago, y en el que el kit se utiliza sobre la muestra obtenida del paciente.