CN101046476A - 特异性识别τ的抗体的用途,及包含该抗体的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及特异性识别τ的抗体的用途，及包含该抗体的试剂盒。本发明提供了新颖的个体CNS损伤的早期诊断方法，所述CNS损伤是由CNS的占位性损害、CNS的病灶侵袭或转移、病原体、缺氧或缺血、化学因素、物理因素、或这些机理联合导致的。这种新方法包括测定和/或量化所述个体τ水平并将其与对照健康个体τ水平进行比较的步骤。

Description

特异性识别τ的抗体的用途，及包含该抗体的试剂盒
本申请是申请日为1999年9月7日的中国专利申请99812850.3“作为早期CNS损伤标记物的τ”的分案申请。
技术领域
本发明涉及CNS损伤领域。本发明涉及通过τ的检测和/或量化，实现CNS损伤的早期诊断的新方法。
背景技术
中枢神经系统损伤(CNS损伤)是由各种诱因导致的，其中有不同的疾病过程、物理或化学因素、缺氧和缺血。疾病过程包括占位性损害、不同恶性肿瘤导致的脑侵袭或转移和/或多种病原体感染。
CNS肿瘤可能是局部原发的(原发性肿瘤)，或者可能是播散到CNS的(转移瘤)。原发性肿瘤是由神经胶质细胞(星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、成胶质细胞瘤)、室管膜细胞(室管膜瘤)或支持组织(脑脊膜瘤、神经鞘瘤、脉络丛乳头状瘤)产生的。在儿童期，肿瘤是由更多的原始细胞(成神经管细胞瘤、成神经细胞瘤、脊索瘤)引起的。恶性星形细胞瘤或成胶质细胞瘤是20岁以上成人原发性肿瘤的最常见类型。良性和恶性原发性CNS肿瘤都能产生神经病学损害。
白血病是儿童最常见的癌症。在过去的二十年间，在常规单独应用强化化学疗法或联合治疗(放射疗法和化学疗法)的基础上，白血病儿童的存活率已有显著增加。最近据估计，10年总存活率约为75％。随着白血病儿童存活人数不断增加，关于可能对中枢神经系统导致损伤的抗癌化学疗法和/或放射疗法的长期效果已经引起关注，对该CNS损伤的早期量化测定的需要也在不断增加。
细菌性脑膜炎可以被定义为响应于软膜珠网膜的细菌感染和软膜蛛网膜包裹的脑脊液以及脑室内脑脊液的炎症。细菌性脑膜炎的发生率每年每100000人为4.6～10例。嗜血流感杆菌是最常见的原因，其次是萘瑟氏脑膜炎球菌和肺炎链球菌。一旦发展为细菌性脑膜炎，其特异性特征包括颅内压升高、血脑屏障瓦解、脑水肿和脑血流改变。脑膜炎持续时间越长，治疗的有效性越低，则发生并发症和神经病学后遗症的机会越大。大约10％的细菌性脑膜炎婴儿和儿童将留下持续性一侧或双侧感觉性听力丧失的后遗症。大约30％的细菌性脑膜炎儿童以后将证明患有轻微的学习能力缺陷(Wilson等，1991)。
病毒也能够以各种方式影响中枢神经系统，导致各不相同的病毒性脑膜炎、病毒性脑炎、脊髓炎和由慢性病毒感染引起的CNS疾病。其它可能导致CNS损伤的病况是诸如药物、化学疗法或接触化合物等化学因素，以及物理因素。头部外伤在工业化国家常见，影响到很多患者的基本生活。为了领会这个问题在医学和社会上的重要性，仅需对下列事实有清楚的认识：每年几乎有一千万美国人的头部受伤，其中约20％严重到足以导致脑损伤的程度。CNS损伤的另一种原因可以是缺氧或缺血。缺氧-缺血性脑病是常见的经常引起严重后果的疾病，由脑缺乏氧供应所致，后者是由低血压或呼吸衰竭引起的。急性缺血性中风导致神经元损伤，是西方社会神经病学残障的主要原因。围产期窒息可能也与CNS损伤有关。迄今，临床、脑动电流描记法和神经系放射学的评价以及脑血流研究是最容易获得的方法。不过，发生低氧-缺血后，脑损伤严重性的早期与准确评价仍然是新生儿护理最困难的问题之一。
为了检测白血病儿童的CNS侵袭，目前的诊断程序包括腰椎穿刺、眼底镜和脑成像(Raichle，1998)。不过，这些诊断方法仅允许检测更严重阶段的CNS损伤，已经存在并持续发展的早期CNS损伤可能被这些方法所遗漏。因此，需要能够进行CNS损伤早期检测的其他诊断方法。
最近已经可以获得大量神经病学上的标记物，它们可以反映中枢神经系统有关细胞死亡、轴突生长/再诱导、炎症和/或血脑屏障机能障碍的病况。与微管有关的τ蛋白以不同的亚型存在，其中在成人脑中发现了4～6种，但是在胎儿脑中仅发现了1种亚型。亚型的多样性是由位于人17号染色体上单基因的交替性mRNA剪接所产生的(Himmler，1989；Goedert等，1989；Andreadis等，1992)。从分子克隆推断，τ蛋白最突出的特征是31或32个氨基酸的伸长，这发生在分子的羧基末端部分，并且可以重复3或4次。其他的多样性是通过29或58个氨基酸长度单位插入τ分子NH2末端部分所产生的(Goedert等，1989)。在体内通过与位于τ重复区(255-381)的微管结合域的相互作用，τ促进神经元轴突腔隙内的微管聚合和稳定性(Lewis等，1988)。在正常环境中，成人的脑每摩尔τ含有2-3摩尔磷酸盐(Selden和Pollard，1983；Ksiezak-Reding等，1992)。根据对大鼠和人所进行的研究，在正常τ中不同部位的磷酸化作用取决于发育状态(Lee等，1991；Bramblett等，1993；Goedert等，1993)。在显示神经原纤维缠结的脑区已经检测到由磷酸化作用所产生的60、64和68kDa的τ变异体(Delacourte等，1990；Goedert等，1992；Flament和Delacourte，1990；Greenberg和Davies，1990)。这些脑每摩尔τ含有6-8摩尔磷酸盐(Ksiezak-Reding等，1992)。在从成对螺旋丝分离的τ中，磷酸化作用能够发生在数个位置(Iqbal等，1989；Lee等，1991；Hasegawa等，1992)。脑提取物中正常和异常磷酸化τ的检测是通过抗体进行的(Mab Alz50：Ghanbari等，1990；Mab Ab423：Harrington等，1991；Mab AT120：Vandermeeren等，1993；MabAT180；Mab AT270：国际申请公报WO 95/17429和Mab AT8：国际申请公报WO 93/08302)，或者是通过分子量的变化进行的(Flament和Delacourte，1990)，或者是通过功能测定进行的(Bramblett等，1992)。各自识别特异性τ表位的单克隆抗体的组合已经用于检测CSF中正常和异常磷酸化τ的存在(Van de Voorde等，1995)。作为标记物，τ已经用于区别伴有细胞骨架性质改变的痴呆，例如阿尔茨海默病，与正常老化受验者或其它类型痴呆患者。
发明内容
本发明的目的是提供个体CNS损伤的早期检测和/或量化方法，所述CNS损伤是由CNS的占位性损害、CNS的病灶侵袭或转移、病原体、缺氧或缺血、化学因素、物理因素、或这些机理联合导致的。
本发明更为具体的目的是提供个体CNS损伤的早期检测和/或量化方法，所述CNS损伤是由良性或恶性原发性脑肿瘤、脑转移瘤、或硬膜下血肿所致。
本发明另一个更为具体的目的是提供个体CNS损伤的早期检测和/或量化方法，所述CNS损伤是由白血病、淋巴瘤或乳腺癌的CNS侵袭导致的。
本发明另一个更为具体的目的是提供个体CNS损伤的早期检测和/或量化方法，所述CNS损伤是由细菌或病毒所致脑炎或脑膜炎导致的。
本发明另一个更为具体的目的是提供个体CNS损伤的早期检测和/或量化方法，所述CNS损伤是由中风、脑梗塞、脑出血、血栓形成、围产期窒息、宾斯旺格氏病或结节性脉管炎导致。
本发明另一个更为具体的目的是提供个体CNS损伤的早期检测和/或量化方法，所述CNS损伤是由化学疗法所导致的。
本发明另一个更为具体的目的是提供个体CNS损伤的早期检测和/或量化方法，所述CNS损伤是由创伤、中风、颅内压或辐射导致。
本发明的另一个目的是提供个体CNS损伤的早期检测和/或量化方法，所述CNS损伤是由CNS的占位性损害、CNS的病灶侵袭或转移、病原体、缺氧或缺血、化学因素、物理因素、或这些机理联合所致，目的是为了评价对所述CNS损伤的治疗效果。
本发明的另一个目的是提供用于个体CNS损伤的早期诊断的试剂盒，所述CNS损伤是由CNS的占位性损害、CNS侵袭、病原体、缺氧或缺血、化学因素、物理因素、或这些机理联合所致。
本发明另一个更为具体的目的是提供用于个体CNS损伤的早期诊断的试剂盒，所述CNS损伤是由良性或恶性原发性脑肿瘤、脑转移瘤、或硬膜下血肿所致。
本发明另一个更为具体的目的是提供用于个体CNS损伤的早期诊断的试剂盒，所述CNS损伤是由白血病、淋巴瘤或乳腺癌的CNS侵袭导致的。
本发明另一个更为具体的目的是提供用于个体CNS损伤的早期诊断的试剂盒，所述CNS损伤是由细菌或病毒所致脑炎或脑膜炎导致的。
本发明另一个更为具体的目的是提供用于个体CNS损伤的早期诊断的试剂盒，所述CNS损伤是由中风、脑梗塞、脑出血、血栓形成、围产期窒息、宾斯旺格氏病或结节性脉管炎导致的。
本发明另一个更为具体的目的是提供用于个体CNS损伤的早期诊断的试剂盒，所述CNS损伤是由化学疗法所导致的。
本发明另一个更为具体的目的是提供用于个体CNS损伤的早期诊断的试剂盒，所述CNS损伤是由创伤、中风、颅内压或辐射所致。
本发明的另一个目的是提供筛选或监测预防或治疗CNS损伤的化合物效果的方法。
本发明的所有目的据信可通过下列实施方案得以满足。
本发明涉及个体CNS损伤的早期检测和/或量化方法，所述CNS损伤是由CNS的占位性损害、CNS侵袭、病原体、缺氧或缺血、化学因素、物理因素、或这些机理联合所致。该方法包括检测和/或量化个体τ水平并将其与健康对照个体τ水平进行比较的步骤。
本发明涉及这样的惊人发现，来自白血病儿童的CSF样本τ水平高出健康个体值的上限。这些升高的τ水平是潜在中枢神经系统侵袭和已经存在并持续发展的CNS损伤的指征，该CNS损伤在此后很长时间才能用目前的诊断方法检测到。同样，在患有CNS占位性损害、CNS病灶侵袭或转移、缺血、中风或脑膜炎的个体中，在早期阶段就可观察到τ水平升高。因此，τ可以作为非特异性标记物，用于由白血病CNS侵袭导致的CNS损伤的早期检测，一般来说作为非特异性标记物，用于由CNS损伤剂导致的CNS损伤的早期检测，例如CNS的占位性损害、CNS病灶侵袭或转移、病原体、缺氧或缺血、化学因素、物理因素、或这些机理的组合。
中枢神经系统(CNS)是神经系统的一部分，在脊椎动物中，它包括脑和脊髓，感觉脉冲传递到CNS，又从中发出运动脉冲，CNS指导和协调整个神经系统的活动。
术语“CNS损伤”指任何与神经元机能障碍有关的、由特殊的诱发剂或损伤剂导致的CNS病况。更具体地，CNS损伤指这样的疾病过程，包括但不限于CNS的占位性损害、CNS病灶侵袭或转移和/或病原体感染。占位性损害例如可以是良性或恶性原发性脑肿瘤、脑转移瘤、来自寄生虫，例如猪肉绦虫或细粒棘球绦虫的包囊、脑积水和/或硬膜下血肿。CNS病灶侵袭或转移可以是由恶性肿瘤导致的，例如白血病、淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、黑色素瘤和/或胃肠恶性肿瘤或其它类型的癌症。可以感染CNS并导致CNS损伤的病原体包括但不限于朊病毒、病毒、细菌或寄生虫。感染CNS的细菌和病毒可以导致脑膜炎、脑炎、neuroaids或神经包柔螺旋体病。它们包括但不限于脑膜炎奈瑟氏菌、嗜血流感杆菌、肺炎链球菌、脑膜脑炎单纯疱疹病毒和gluteolis单纯疱疹病毒。CNS损伤也可以是在麻醉、围产期窒息、淹溺、哮喘、中风、脑梗塞、血栓形成、脑出血、一氧化碳中毒、宾斯旺格氏病和/或结节性脉管炎期间发生缺氧或缺血导致的。导致CNS损伤的化学因素包括但不限于基因疗法、药物、化学疗法和接触化合物。CNS损伤也可以是由物理因素导致的，例如创伤、辐射、体温过低、体温过高、颅内压或中风。也有可能是一种以上上述致病因素引起CNS损伤。
因此，本发明提供通过测定τ水平早期检测和/或量化所述CNS损伤的方法。“CNS损伤的早期检测和/或量化”指，在用目前方法可以检测之前，可以应用另一种方法测定CNS损伤。
本申请所指术语“τ”可以是任意形式的τ，包括任意状态的磷酸化作用。定性或定量测定τ水平，作为CNS损伤程度的量度。τ可以在体外以及体内进行检测。
个体CNS损伤的早期体外检测方法包括以下步骤，从所述个体获得样本，检测和/或量化所述样本中的τ水平，将其与健康对照个体样本中的τ水平比较。术语“样本”指任意来源的生物材料，例如体液、毛发、上皮细胞、外周血或任意其它包含τ蛋白的样本。在一个优选实施方案中，通过患者体液样本中的τ水平分析，可以体外检测和/或量化τ。术语“体液”指所有存在于人体内的液体，包括但不限于血液、淋巴、尿液和脑脊液(CSF)。在本发明更具体的实施方案中，采用患者的脑脊液样本检测和/或量化τ。在本发明另一种具体实施方案中，采用患者血液衍生物样本检测和/或量化τ。血液样本可以包括取自患者的全血样本。更优选地，血液样本包括血浆样本或血清样本。
τ可以通过任意已知方法加以检测和/或量化，包括但不限于利用抗体、分子量改变(Flament和Delacourte，1990)，或者通过功能测定法(Bramblett等，1992)。在优选的实施方案中，τ可以通过免疫测定法加以检测，该测定法包括至少以下步骤：
-从患者处获得样本；和
-在适合于产生抗原-抗体复合物的条件下，使所述样本与识别τ的单克隆抗体(第一抗体或俘获抗体)接触；和
-检测所述抗体与所述样本的免疫结合。
有利的是，用于本发明的单克隆抗体在适合的载体上处于固定状态。或者，利用本领域技术人员已知的任意其它免疫测定形式，也可以将该方法付诸实施。
然后，抗原的检测方法可以这样进行，使由抗原和识别τ的第一抗体所形成的所述抗原-抗体复合物与下列物质共同接触：
a)第二抗体(或检测抗体)
*它可以是识别τ-第一抗体复合物表位、但不识别单独的第一抗体的单克隆抗体，或者
*它可以是识别τ-第一抗体复合物表位、但不识别单独的第一抗体的多克隆抗体，所述多克隆抗体优选利用固定的τ或τ-第一抗体复合物通过免疫亲和色谱法加以纯化；
b)用于特异性标记所述第二抗体或者与之偶联的标记物，所述标记物是本领域技术人员已知的任何可能的标记物；
c)适当的缓冲溶液，用于进行第一抗体与样本之间、第二抗体与τ-第一抗体复合物之间和/或被结合的第二抗体与标记物之间的免疫反应；和
d)与识别τ抗体具有反应性的纯化蛋白质或合成肽，出于标准化目的也是可能的。
有利的是，第二抗体本身携带标记物或者携带直接或间接与标记物偶联的基团。
术语“表位”指抗原-抗体复合物中特异性地被抗体结合部位结合的部分。表位可以通过本领域已知的任何技术加以检测，或者可以通过本领域已知的各种计算机预测模型加以预测。
本发明中“识别”、“与......反应”、“免疫结合”或“生成抗原-抗体复合物”的表述被解释为在所有符合抗体和抗原的免疫性质的条件下发生抗原与抗体之间的结合。
任何特异性地识别τ的单克隆或多克隆抗体都可用于τ的检测。特异性地识别正常和/或异常磷酸化τ的抗体包括Alz50(Ghanbari等，1990)、Ab423(Harrington等，1991)、AT8(国际申请公报WO93/08302)、AT120(Vandermeeren等，1993)、AT180与AT270(国际申请公报WO 95/17429)和AT100(国际申请公报WO 96/04309)。不过也可以使用其它本领域已知的特异性识别τ的抗体。
个体CNS损伤的体外早期检测和/或量化方法也可用于评价对所述个体CNS损伤的某些治疗的效果。可能影响CNS状态的可行的治疗包括但不限于药物治疗、化学疗法、物理疗法，包括放射疗法和基因疗法。
个体CNS损伤的体外早期检测和/或量化方法包括测定和/或量化所述个体τ水平并将其与健康对照个体τ水平进行比较的步骤。在优选的实施方案中，τ可以通过体内成像加以体内检测。τ可以通过非侵入性方法原位显现，包括但不限于Arbit等(1995)、Tamada等(1995)、Wakabayashi等(1995)、Huang等(1996)、Sandrock等(1996)、Mariani等(1997)描述的脑成像方法。这些体内成像方法可以实现τ的定位化和形象化，例如利用经过标记的识别τ的抗体。
τ也可以作为体内成像的非特异性标记物，用于评价对个体CNS损伤的某些治疗效果。可能影响CNS状态的可行的治疗包括但不限于药物治疗、化学疗法、物理疗法，包括放射疗法和基因疗法。
本发明进一步涉及τ作为非特异性标记物用于诊断试剂盒的制造，该试剂盒用于个体CNS损伤的早期检测，该CNS损伤是由CNS的占位性损害、CNS病灶侵袭或转移、病原体、缺氧或缺血、化学因素、物理因素、或这些机理联合所致。
本发明进一步涉及τ作为非特异性标记物用于诊断试剂盒的制造，该试剂盒用于个体CNS损伤的早期检测，该CNS损伤是由良性或恶性原发性脑肿瘤、脑转移瘤、或硬膜下血肿导致的。
本发明进一步涉及τ作为非特异性标记物用于诊断试剂盒的制造，该试剂盒用于个体CNS损伤的早期检测，该CNS损伤是由白血病、淋巴瘤或乳腺癌的CNS侵袭或转移所致。
本发明进一步涉及τ作为非特异性标记物用于诊断试剂盒的制造，该试剂盒用于个体CNS损伤的早期检测，该CNS损伤是由细菌或病毒所致。
本发明进一步涉及τ作为非特异性标记物用于诊断试剂盒的制造，该试剂盒用于个体CNS损伤的早期检测，该CNS损伤是由中风、脑梗塞、血栓形成、脑出血、围产期窒息、宾斯旺格氏病或结节性脉管炎所导致的。
本发明进一步涉及τ作为非特异性标记物用于诊断试剂盒的制造，该试剂盒用于个体CNS损伤的早期检测，该CNS损伤是由化学疗法导致的。
本发明进一步涉及τ作为非特异性标记物用于诊断试剂盒的制造，该试剂盒用于个体CNS损伤的早期检测，该CNS损伤是由创伤、中风、颅内压或辐射所导致的。
本发明进一步涉及用于个体CNS损伤的体外或体内诊断试剂盒，该CNS损伤是由CNS的占位性损害、CNS病灶侵袭或转移、病原体、缺氧或缺血、化学因素、物理因素、或这些机理联合所致。任何提供τ检测工具的试剂盒都可用于上述CNS损伤的诊断。
优选用于个体CNS损伤的体外诊断试剂盒是基于免疫测定法的，该CNS损伤是由CNS的占位性损害、CNS病灶侵袭或转移、病原体、缺氧或缺血、化学因素、物理因素、或这些机理联合所致，该试剂盒包含：
-至少一种单克隆抗体(第一抗体)，它与τ蛋白表位形成免疫复合物；
-第二抗体；
*它可以是识别τ-第一抗体复合物表位、但不识别单独的第一抗体的单克隆抗体，或者
*它可以是识别τ-第一抗体复合物表位、但不识别单独的第一抗体的多克隆抗体，所述多克隆抗体优选利用固定的τ蛋白或固定化的τ-第一抗体复合物通过免疫亲和色谱法加以纯化；
-用于特异性标记所述第二抗体或者与之偶联的标记物；
-适当的缓冲溶液，用于进行第一抗体与样本之间、第二抗体与τ-第一抗体复合物之间和/或被结合的第二抗体与标记物之间的免疫反应；
-含有一个或多个τ表位的纯化蛋白质或合成肽，出于标准化目的也是可能的。
本发明也涉及筛选或监测预防或治疗CNS损伤的化合物效果的方法，该方法包括测定τ水平并将其与对照样本τ水平进行比较的步骤。
现在将参照下列实施例阐述本发明，实施例陈述了特别有利的实施方案。不过应当注意，这些实施例是例举性的，无论如何也不能解释为限制本发明。
表1：非B-细胞ALL/NHL患者的治疗方案(EORTC 58881)
 治疗阶段   药物   剂量   途径   天数
 预阶段   泼尼松龙MTX   60mg/m2/d根据年龄而定   POIT   第1-7天第1天(LP1)，第8天(LP2)，第22天(LP3)
 方案I：诱导(37天)方案I：巩固(26天)(14天)   泼尼松龙长春新碱柔红霉素大肠埃希氏杆菌天冬酰胺酶环磷酰胺6-巯基嘌呤Ara-CMTX   60mg/m2/d20mg/m2/d10mg/m2/d5g/m2/d1.5mg/m230mg/m210000U/m21000mg/m260mg/m275mg/m2根据年龄而定   POPOPOPOIVIVIVIVPOIVIT   第8-28天第29-31天第32-34天第35-37天第8，15，22，29天第8，15，22，29天第12，15，19，22，25，29，32，35天第36，63天第36-63天第38-41，45-48，52-55，59-62天第38(LP4)，52(LP5)天
表1续
  治疗阶段   药物   剂量   途径   天数
  间歇疗法(56天)(14天)   6-巯基嘌呤MTXMTX   25mg/m25000mg/m2根据年龄而定   POIVIT   第1-56天第8，22，36，50天第9(LP6)，23(LP7)，37(LP8)，51(LP9)天
  方案II：诱导(35天)方案II：巩固(14天)(14天)   地塞米松长春新碱阿霉素大肠埃希氏杆菌天冬酰胺酶环磷酰胺6-巯基鸟嘌呤Ara-CMTX   6mg/m2/d3mg/m2/d1mg/m2/d1.5mg/m230mg/m210000U/m21000mg/m260mg/m275mg/m2根据年龄而定   POPOPOIVIVIVIVPOIVIT   第1-21天第22-35天第26-29天第8，15，22，29天第8，15，22，29天第8，11，15，18天第36天第36-49天第38-41，45-48天第38天(LP10)
  维持   6-巯基嘌呤MTX   50mg/m2/d每周20mg/m2   POPO   总治疗持续时间＝2年
表2：B-细胞NHL患者的治疗方案(UKCCSG 9602)
 治疗阶段   药物   剂量   途径   天数
 COP(7天)***根据患者状态开始   泼尼松龙长春新碱环磷酰胺MTX氢化可的松   60mg/m2/d1mg/m2300mg/m2根据年龄而定根据年龄而定   POIVIVITIT   第1-7天第1天第1天第1天(LP1)第1天(LP1)
 COPADM1和COPADM2(5天)***根据患者状态开始   泼尼松龙长春新碱环磷酰胺阿霉素MTX氢化可的松   60mg/m2/d2mg/m2500mg/m2/d60mg/m2根据年龄而定3000mg/m2根据年龄而定   POIVIVIVITIVIT   第1-5天第1天第2-4天第2天第2(LP2)，6(LP3)天第1天第2(LP2)，6(LP3)天
表2续
  治疗阶段   药物   剂量   途径   天数
  CYM1和CYM2(6天)***根据患者状态开始   MTX氢化可的松Ara-C   根据年龄而定3000mg/m2根据年龄而定根据年龄而定100mg/m2/d   ITIVITITIV   第2天(LP4)第1天第2(LP4)，7(LP5)天第7(LP5)天第2-6天
  COPADM3(5天)   泼尼松龙长春新碱环磷酰胺阿霉素MTX氢化可的松   60mg/m2/d2mg/m2500mg/m2/d60mg/m2根据年龄而定3000mg/m2根据年龄而定   POIVIVIVITIVIT   第1-5天第1天第2-3天第2天第2天第1天第2天
IT＝膜内；IV＝静脉内；PO＝经口；LP＝腰椎穿刺；MTX＝甲氨蝶呤；Ara-C＝阿拉伯糖苷
表3：AML患者的治疗方案(EORTC 58921)
  治疗阶段   药物   剂量   途径   天数
  诱导第一次强化第二次强化第三次强化维持   Ara-CAra-C米托蒽醌VP16Ara-CAra-C米托蒽醌柔红霉素Ara-CVP166-巯基鸟嘌呤地塞米松Ara-CAra-CVP166-巯基鸟嘌呤Ara-C   100mg/m2200mg/m2/d10mg/m2/d150mg/m2/d根据年龄而定3000mg/m2/d10mg/m2/d20mg/m2/d200mg/m2/d100mg/m2/d100mg/m2/d6mg/m2/d根据年龄而定2000mg/m2/d125mg/m2/d40mg/m240mg/m2   IVIVIVIVITIVIVIVIVIVPOPOITIVIVPOSC   第1，2天第3-8天第3-5天第6-8天第1(LP1)，8(LP2)天第1-4天第5-7天第1-4天第1-4天第1-4天第1-4天第1-4天第1(LP3)，4(LP4)天第1-3天第2-5天1年4天/月
IT＝膜内；IV＝静脉内；PO＝经口；SC＝皮下；LP＝腰椎穿刺；Ara-C＝阿拉伯糖苷；VP16＝
表4：不同因素所致可能的CNS损伤患者CSF样本的τ水平
  CNS损伤的原因c   中心a   患者   年龄   性别b   τ水平(pg/ml)
  占位性损害、病灶侵袭或转移硬膜下血肿退行性寡星形细胞瘤脑转移瘤少突神经胶质瘤WHO III乳腺癌转移出血、梗塞或缺血中风-CVA多腔隙中风中风-CVA急性局限性中风蛛网膜下腔出血慢性缺氧后状态(植物状态)宾斯旺格氏病结节性脉管炎脑缺血缺血上矢状窦血栓形成 01010808080101040508051010101001 025032024031020021026004032019051014009005006023 39687048526256507250377457807141 MMFMFFFFMMFMFMFM 2633292923351504512501052482164463471250273574773
表4续
 CNS损伤的原因c   中心a   患者   年龄   性别b   τ水平(pg/ml)
 病原体隐球菌性脑膜炎神经包柔螺旋体病慢性脑膜炎，原因未知脑膜炎球菌性脑膜炎细菌性脑膜炎Neuro aids肺炎球菌性脑膜炎细菌性脑膜炎细菌性脑膜炎TBC脑膜炎细菌性脑膜炎细菌性脑膜炎病毒性脑膜炎细菌性脑膜盐病毒性脑膜炎对照肌肉无力和癔病性转化面瘫(外周神经疾病，正常CSF)紧张性(精神性)头痛精神性头痛和神经症精神性体征和症状严重癔病腰椎间盘脱垂和坐骨神经痛 05050505050505060606060606080801050505050505 033045046049059060063026027028029030037018029020041031036040042047 29163424734570251954232882492939444956484774 MMFMFFMMMMMMMFFFMFFFFM 114314145237446237111125037720378831420517028214137131220471195
表4续
  CNS损伤的原因c   中心a   患者   年龄   性别b   τ水平(pg/ml)
  对照对照(有关的斯耶格伦氏病)对照(神经症)抑郁症抑郁症肌痛、肌炎肌痛、肌炎不适、疲劳颈痛、眩晕头痛抑郁症头痛、斜视会聚贝耳氏麻痹贝耳氏麻痹贝耳氏麻痹贝耳氏麻痹腕管综合征腕管综合征 0505101004040408080808060606060606 065079008010003005006011017021033031032033034035036 5240596931355039495732382273747190 FFFFMFMFMMFMFFFMM 10790201139374359819211336123990131231144190665
a01：Prof.P.Cras，University Hospital，Neurology，Antwerp，Belgium and Dr.A.Daniels，UIA，Laboratory of Neurobiology，Antwerp，Belgium；04：Dr.P.D.Mehta，Institute Basic Research，Staten Island，NY，USA；05：Dr.A.Ivanoiu，UCL St-Luc，Laboratory of Neurochemistry，Brussels，Belgium；06：Prof.P.P.De Deyn，UIA，Laboratory of Neurochemistry，Antwerp，Belgium；08：Dr.C.Bancher，Lainz Hospital，Neurology，Vienna，Austria；10：Dr.J.Wiltfang，Georg-August University，Gerontopsychiatry，Gttingen，Germany.
bF：女性；M：男性
c在多种因素引起损伤的情况下，给出唯一被假定是最相关的因素。
附图说明
图1：在接受任何治疗之前诊断时的τ水平：1、对照儿童；2、急性髓细胞白血病(AML)；3、AML-CNS+；4、慢性髓细胞白血病(CML)；5、骨髓增生异常综合征(MDS)；6、B细胞非何杰金淋巴瘤(B-NHL)；7、非B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)；8、非B-ALL CNS+；9、极高危险(VHR)非B-ALL。
图2：七名患者急性缺血性中风后的CSF-τ水平。CSF样本的采集时间为入院时(第0-1天)、第2-3天、第7-8天、第21-22天(3周)和第90-110天(3个月)。
图3：用CT扫描测量到的梗塞面积与最大释放时CSF-τ水平的关系。
具体实施方式
实施例1：白血病儿童τ水平升高
为了评价化学疗法对神经元损伤的影响，进行了如下纵深研究，该研究包括65名按照标准程序治疗的白血病儿童(2至16岁)，没有可测量的中枢神经系统病变。共分析377份CSF样本。每次注射前，采集少量液体用于常规实验室分析，剩余物用于我们的研究。这些儿童是在比利时的Leuven大学医院诊断为白血病并进行治疗的。应用INNOTEST hTAU抗原(比利时Gent Innogenetics公司)评估脑脊液中的τ蛋白。
在治疗开始前，对所有怀疑患有白血病的儿童进行腰椎穿刺，以检测可能存在的白血病细胞，这是中枢神经系统浸润的指征。此时、也就是治疗前测量的τ水平充当对照水平，以比较化学疗法诱发的τ水平改变。
我们观察到，尽管在中枢神经系统没有检测到白血病细胞，有些白血病儿童在诊断时已经具有非常高的τ水平。这些儿童构成新的脑侵袭或白血病诱发CNS损伤的危险组，该损伤用目前的诊断方法(脑成像、腰椎穿刺、眼底镜)通常不能被发现。一名证实细胞侵袭入脑的(脑脊液中有恶性细胞)白血病患者τ水平升高，进一步支持了这一点。
实施例2：白血病患者治疗前τ水平升高
1、研究对象
1996年8月～1999年6月，从比利时Leuven的Catholic大学儿童血液肿瘤科接受癌症治疗的82名儿童中采集510份CSF样本。CSF样本仅在预定用于恶性肿瘤分期或治疗的腰椎穿刺(LP)过程中进行取样。
研究了三组血液恶性肿瘤患者。最大一组由48名非B-ALL患者组成，按照EORTC方案58881进行治疗(表1)。这些儿童中，20名具有CD10(+)母细胞(或普通ALL)，其中2名患者还患有Down综合征(DS)，1名患者患有Brachmann-de Lange综合征；6名患者具有普通的B-母细胞，2名患者具有普通的T-母细胞，2名患者具有原B-母细胞，9名患者具有前B-母细胞，9名患者具有T-母细胞。42名儿童患有白血病，6名患者患有II期(1名)、III期(4名)或IV期(1名)非何杰金淋巴瘤。一名患者具有明显的CNS浸润(CNS+)，这是根据CSF中恶性细胞研究方案定义的。五名患者根据该方案定义的标准被认为是高危(VHR)患者，(2名患者为t(9；22)，3名患者具有皮质激素类耐药性)。因为第一部分诱导治疗类似于其它患者，因此按照诱导化学疗法进行分析。28名非B-ALL患者可以在治疗期间纵深随访。
第二组患者包括10名B-细胞性非何杰金淋巴瘤患者，按照英国儿童癌症小组(UKCCSG 9602)NHL方案进行治疗(表2)。5名患者患有B-细胞淋巴瘤，3名患者患有Burkitt淋巴瘤，2名患者患有退行性大细胞淋巴瘤(ALCL)。所有患者都用相同的方案治疗，但是一名B-细胞性白血病患者除外。对这些患者中的六名进行纵深研究。
第三组患者包括9名急性髓性白血病-骨髓增殖异常综合征(AML-MDS)儿童，其中2名患者有CNS浸润，2名患者患有Down综合征。有3名患者为M0表型，各有1名患者为M1、M2、M5a或M7表型。两名患者患有MDS，其中一名已经发展为AML，用化学疗法治疗。除了一名MDS患者以外，所有这些患者均按照EORTC 58921方案进行治疗(表3)，7名患者进行纵深随访。
其他患者组成混杂儿童组(n＝9)，出于临床原因进行LP。该组包括3名成神经管细胞瘤(分级中)儿童，2名横纹肌肉瘤(分级中)儿童，朗格罕细胞组织细胞增生症(LCH，分级中)、神经节神经胶质瘤(分级中)、生殖细胞瘤(分级中)和伴有CNS转移的视网膜母细胞瘤(分级中和随访)儿童各1名。对照组由4名儿童组成，采集他们的CSF，仅作为可能的病毒或细菌感染的常规控制手段之一，但具有阴性结果。1名局限性视网膜母细胞瘤(分级中)患者和1名家族性嗜红细胞淋巴组织细胞增生症(HLH)患者也包括在对照组内。患者的近亲口头同意参与研究。
2、方法
液体取样。治疗药物IT给药前进行腰椎穿刺。在不同的聚丙烯管内收集5ml CSF。一份样本立即在1500rpm下离心2分钟，以除去细胞和其它不溶物。上清液贮存在-70℃，用于随后的分析。冷冻/融化循环次数限制在最少。
CSF中τ的测量。所有CSF-τ检测的生物化学分析都在不知道临床诊断的情况下进行。可能产生混淆的因素例如冷冻/融化循环次数、受者类型和每次测定的样本体积在整个研究方案中进行标准化。利用夹心ELISA(INNOTEST hTAU抗原，比利时Gent Innogenetics有限公司)测定CSF-τ水平，即测量总τ(正常的和过度磷酸化的τ)。首先在每次LP的时候单独分析样本。然后，在一块免疫平皿上再次分析来自同一名患者的所有样本。一组104份样本的第一种和第二种方法之间的相关系数为0.901(95％可信区间：0.856-0.933)。纸面上的CSF-τ升高排除在外，因为它是液体中蛋白质的一般增加。
3、结果
首先对来自6名对照儿童的CSF样本测定τ水平的正常上限。平均CSF-τ值为106.2pg/ml(95％可信区间＝34.3-178.0)。任意截取的正常值被认为是312pg/ml(平均+3标准差)，在成人观测值的范围内(Hulstaert等，1999)。而且，我们没有发现诊断时的CSF-τ值与儿童年龄之间的相关性(Pearson r＝-0.161，可信区间95％＝-0.3914-0.08836，n＝64)，这说明年龄对CSF-τ水平没有影响。显然，可以认为病理CSF-τ值在500pg/ml以上。
对每个亚组患者在诊断时的τ水平进行分析(图1)。是否伴随Dow氏综合征的患者τ水平之间没有明显差异(没有显示)。两名具有明显CNS浸润(CNS+)的患者诊断时的CSF-τ水平在312pg/ml以上。不过，2名MDS儿童、7/28名非B-ALL儿童、符合高危标准的1/4非B-ALL患者、1/5名AML患者和2/8名B-细胞性NHL患者的τ水平在312pg/ml以上，而利用经典的诊断方法没有检测到CNS侵袭。采集CSF用于分期的三名颅内压升高的(成神经管细胞瘤)患者和一名生殖细胞瘤患者具有较高CSF-τ浓度(823，1397，1500和442pg/ml)，相形之下，一名I期星形细胞瘤患者具有正常的CSF-τ水平(97pg/ml)。一名LCH患者具有正常的CSF-τ水平，为112pg/ml。两名横纹肌肉瘤患者可以在诊断时进行分析：一名I期患者的CSF-τ水平为279pg/ml，另一名IV期患者为320pg/ml。一名视网膜细胞母瘤并有CNS浸润的患者的CSF-τ水平为1800pg/ml。
33名非B-ALL患者在诊断时的CSF-τ水平与肿瘤负荷不相关，肿瘤负荷通过白细胞计数(Pearson r＝0.04575，可信区间95％：-0.3024-0.3831)或血清LDH(Pearson r＝-0.03002，可信区间95％：-0.3696-0.3166)反映。B-NHL患者中，LDH水平与CSF-τ之间没有显著的相关性(Pearson r＝-0.3723，可信区间95％：-0.8532-0.4507)。
实施例3：使用CSF-τ作为中风导致的可能CNS损伤早期检测的标记物
1、研究对象
七名患者参加研究，3男4女，63-81岁(平均SD，70.7±7.2岁)，患有脑梗塞，收治于瑞典Gteborg Sahlgren大学医院的神经内科病房。所有患者都在中风开始后的72小时内入选研究。
2、方法
利用腰椎穿刺采集CSF样本。收集12ml，每0.5ml冷冻在-80℃下，直至分析。采集CSF样本的时间为入院时(第0-1天)、第2-3天、第7-8天、第21-22天(3周)和第90-110天(3个月)。用夹心ELISA法(INNOTEST hTAU抗原，比利时Gent Innogenetics有限公司)测定CSF-τ水平，测量总τ(正常的和过度磷酸化的τ)。
在入院的第一天利用脑计算机断层扫描(CT)检查脑损伤的程度。临床上也利用修正的斯堪的纳维亚中风等级指数(SSI；斯堪的纳维亚中风研究小组，1985)在中风开始时检查患者，利用Bartel指数(BI；Mohoney和Barthel，1965)在3个月后检查病废的程度。
3、结果
CSF-τ显示在急性中风后显著升高，1-3周后达到峰值，3个月后恢复正常(图2)。根据CT扫描的测量结果，CSF-τ水平与梗塞面积之间也存在相关性(图3)。这些结果说明，CSF-τ反映神经元损伤和变性，CSF中的水平取决于损伤的神经细胞数量。该项研究中，临床数据(SSI或BI)与CSF-τ之间没有发现相关性，这可能是患者数量少的缘故。
实施例4：使用τ作为不同损伤因素导致的可能CNS损伤早期检测的标记物
1、研究对象
在8个欧洲和2个美国的有关CSF研究的大学中心进行了一项多中心研究，该研究基于在这些中心为研究目的获得的剩余CSF。患者的CSF标本包括大范围不同神经病学疾病，目的是获得关于τ标记物在各种涉及CNS的病理学中改变特异性的一般认识(表4)。
研究按照当地临床研究规程进行。如果需要的话，研究人员在研究开始前需获得另外的当地伦理学委员会或学会评论部门的许可。
2、方法
利用腰椎穿刺(LP)采集CSF样本。本研究仅包括每μl含有低于500个红细胞的CSF样本。在LP后4小时内，将CSF样本在2000g下离心10分钟，保持冷冻不融化。来自中心01的CSF样本在分析前经历额外的冷冻-融化循环。利用夹心ELISA技术(INNOTEST hTAU-抗原，Innogenetics N.V.)在各中心测量总τ浓度，包括正常的τ和成对螺旋丝-τ。
3、可能有CNS损伤的患者与神经病学对照组的CSF-τ水平比较
表4显示可能有CNS损伤的患者CSF样本中的τ水平和对照组CSF样本中的τ水平，该CNS损伤是由占位性损害、病灶侵袭或转移、出血、梗塞或缺血、或由病原体所导致的。可能受到CNS损伤的患者组的τ水平全面高于神经病学对照组(p＝0.022，两侧Mann Whitney检验)，该CNS损伤是由占位性损害、病灶侵袭或转移、出血、梗塞或缺血、或由病原体所导致的。
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Claims (14)

1、特异识别τ的抗体在制造用于个体CNS损伤的早期检测和/或量化的诊断试剂盒中的用途，其中CNS损伤是由原发性良性或恶性脑肿瘤、脑转移瘤、来自寄生虫的包囊、CNS的转移、化学因素、或这些机理联合导致的。
2、特异识别τ的抗体在制造用于个体CNS损伤的量化诊断试剂盒中的用途，其中CNS损伤是由缺氧或缺血或由物理因素导致的。
3、根据权利要求1或2的用途，其特征进一步在于CNS损伤是通过样品来检测和/或量化的，其中样品取自个体的脑脊液。
4、根据权利要求1或2的用途，其特征进一步在于其特征在于CNS损伤是通过样品来检测和/或量化的，其中样品取自个体的血液衍生物。
5、根据权利要求1、3或4中任一项的用途，其中CNS的转移是由白血病、淋巴瘤或乳腺癌引起的。
6、根据权利要求2、3或4的用途，其中缺氧或缺血是由中风、脑梗塞、脑出血、血栓形成、围产期窒息、宾斯旺格氏病或脉管炎导致的。
7、根据权利要求1、3或4中任一项的用途，其中化学因素是基因治疗、药物、化疗或暴露于化学化合物。
8、根据权利要求2、3或4中任一项的用途，其中物理因素是创伤、中风、颅内压或辐射。
9、根据权利要求1-8中任一项的用途，其中检测和/或量化CNS损伤的目的是为了评价对所述CNS损伤的某些治疗效果。
10、一种用于个体CNS损伤的早期诊断的试剂盒，其中CNS损伤是由原发性良性或恶性脑肿瘤、脑转移瘤、来自寄生虫的包囊、CNS的转移、化学因素、或这些机理联合导致，该试剂盒包含用于检测τ的工具。
11、一种用于个体CNS损伤的量化的试剂盒，其中CNS损伤是由缺氧或缺血或由物理因素导致的，该试剂盒包含用于检测τ的工具。
12、根据权利要求10或11的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒包括：
-与τ的表位形成免疫复合物的单克隆抗体(第一抗体)；
-第二抗体；
*它可以是识别τ-第一抗体复合物表位、但不识别单独的第一抗体的单克隆抗体，或者
*它可以是识别τ-第一抗体复合物表位、但不识别单独的第一抗体的多克隆抗体，所述多克隆抗体优选利用固定化的τ蛋白或固定化的τ-第一抗体复合物通过免疫亲和色谱法加以纯化；
-用于特异性标记所述第二抗体或者与之偶联的标记物；
-适当的缓冲溶液，用于进行第一抗体与待测样本之间、第二抗体与τ-第一抗体复合物之间和/或第二抗体与标记物之间的免疫反应；
-可能的情况下，为了标准化的目的，含有一个或多个τ表位的纯化蛋白质或合成肽。
13、筛选或监测预防或治疗CNS损伤的化合物效果的方法，该CNS损伤是由原发性良性或恶性脑肿瘤、脑转移瘤、来自寄生虫的包囊、CNS的转移、化学因素、或这些机理联合导致的，该方法包括测定τ水平并将其与对照样本τ水平进行比较的步骤。
14、筛选或监测预防或治疗CNS损伤的化合物效果的方法，该CNS损伤是由缺氧或缺血或由物理因素导致的，该方法包括量化τ水平的步骤。
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