TW201403068A - 黑色素瘤的診斷套組 - Google Patents
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Abstract
製成與通常所用之市售抗體比較,品質安定的抗GPC3及抗SPARC單株抗體,並提供使用該等單株抗體而再現性高之黑色素瘤的診斷套組。具體而言,提供一種惡性黑色瘤(黑色素瘤)的診斷套組,其包含下列組成物:(1)包含選自mAb2C11、mAb2E11、mAb2H10、mAb3E3、mAb3E10、mAb3E11、mAb4F5、mAb5E5、mAb7C8、mAb7G6、mAb10A4及mAbU3E所構成之群組之1種以上抗GPC3單株抗體的組成物,其中該等抗GPC3單株抗體係由選自於2012年4月23日分別以受託編號NITE P-1326、NITE P-1327、NITE BP-01328、NITE P-1329、NITE BP-01330、NITE BP-01331、NITE P-1332、NITE P-1333、NITE P-1334、NITE P-1335、NITE P-1336及NITE BP-01337寄存於NPMD之純系名2C11、2E11、2H10、3E3、3E10、3E11、4F5、5E5、7C8、7G6、10A4及U3E所構成之群組之1種以上之融合瘤所生產者;及(2)包含選自mAbS2F9、mAbS14A7、mAbS14C12、mAbS19B1、mAbS20D10、mAbS23C10、mAbS23E9及mAbS25H9所構成之群組之1種以上之抗SPARC單株抗體的組成物,其中該等抗SPARC單株抗體係由選自於2012年4月23日分別以受託編號NITE BP-01338、NITE P-1339、NITE P-1340、NITE P-1341、NITE P-1342、NITE BP-01343、NITE P-1344及NITE BP-01345寄存於NPMD之純系名S2F9、S14A7、S14C12、S19B1、S20D10、S23C10、S23E9及S25H9所構成之群組中之1種以上之融合瘤所生產者。
Description
本發明係關於惡性黑色瘤(黑色素瘤(melanoma))的新穎診斷套組,惡性黑色瘤(黑色素瘤)的檢測方法,及使用於該診斷套組的新穎單株抗體。
黑色素瘤係被稱為惡性黑色瘤之皮膚癌的一種。皮膚癌雖有許多種類,但黑色素瘤為惡性度非常高的皮膚癌。存在於構成皮膚之細胞中並產生黑色素(melanin)的細胞被稱為黑色素細胞(melanocyte),該細胞發生癌化者即為黑色素瘤。
在日本黑色素瘤的發生數,估計人口每10萬人中約為1.5至2人,推測每年約有1500人至2000人發生黑色素瘤。據報導在歐美人口每10萬人有10多人以上的發生數;澳洲人口每10萬人有20多人以上的發生數,為世界上發生數最高的地區。因此,歐美及澳洲的人,尤其是白色人種,對於黑色素瘤頗為關心,留意黑色素瘤的發生。又,不論在外國,還是在日本,均觀察到黑色素瘤的發生有年年増加的傾向。有項調査報告在日本,此種疾病所造成之每年死亡人數高達約450人。
黑色素瘤雖然發生於各個年齡層的人,不過在40歳以上發生率變得特別高,於60歳至70歳時發生率最高。雖然小孩的發生率非常少,然而並非全然不會發生,最近在20至30歳之年輕人中發生有變多的傾向。在性別方面,沒有哪一種性別有特別偏多的傾向,男女均會發生。在日本人中,黑色素瘤容易發生的部位以足底(腳掌)為最多,約佔3成。足或指甲部分較多,為日本人的特徵。此外,與歐美人同樣地,在身體、手、足、臉、頭等任何部位之皮膚均會發生。
另一方面,血清腫瘤標記(marker)之測定,不僅對於黑色素瘤之診斷,對於術後病例之再發的早期發現,及進行期病例之治療效果的判定亦甚為重要。就黑色素瘤之腫瘤標記而言,先前已知血清之LDH或5-S-半胱胺酸左旋多巴(5-S-cysteinyldopa(5-S-CD))的有用性,最近更報導S-100 β蛋白及黑色素瘤抑制活性(melanoma inhibitory activity(MIA))可做為更靈敏之標記。
在日本就既存之腫瘤標記而言,主要係使用5-S-CD,然而此等先前所使用之腫瘤標記,若非在所謂StageIV期之進展中者,則不呈現陽性,就黑色素瘤之早期診斷,或術後再發之早期發現方面,因「有用性受限」而得不到。
本發明人等進行有關以GPC3(蛋白多糖3(glypican-3))及SPARC(被分泌之蛋白質,酸性,富含半胱胺酸(Secreted protein,acidic rich in cysteine);別名:骨結
合素(osteonectin)或BM-40)做為腫瘤標記之有用性的研究,先前報導GPC3及GPC3與SPARC之組合在做為黑色素瘤之腫瘤標記上有用(專利文獻1及2)。
然而,就專利文獻1所記載之使用對於GPC3之抗體的方法而言,黑色素瘤患者之陽性率為約40%,就專利文獻2所記載之將對於GPC3之抗體與對於SPARC之抗體組合而使用的方法而言,黑色素瘤患者之陽性率亦為約60%,在檢測靈敏度方面尚有改善之空間。
再者,由於此等腫瘤標記之檢測所通常使用之市售抗體的品質不安定,所以再現性低亦成為問題。
又,在本說明書及圖式,尤其實施例中,係將藉由本發明所提供之新穎單株抗體稱為「新穎抗體」,將使用該新穎抗體之本發明之方法稱為「新穎方法」。另一方面,將現在通常所用之市售抗GPC3抗體及抗SPARC抗體稱為「市售抗體」。再者,將先前既存之作為腫瘤標記使用之血清LDH或5-S-CD稱為「先前之腫瘤標記」或「既存腫瘤標記」。又,將使用此等先前(既存)腫瘤標記之方法稱為「先前方法」。
[專利文獻1]國際公開WO2005/039380號公報
[專利文獻2]國際公開WO2006/043362號公報
本發明之一目的係為了實現黑色素瘤之早期診斷,意圖將使用抗GPC3抗體或抗SPARC抗體之診斷套組高靈敏度化。
本發明之進一步目的係製成與市售之抗GPC3抗體及抗SPARC抗體(市售抗體)相較,品質安定之抗GPC3單株抗體及抗SPARC單株抗體,並提供使用此等單株抗體之再現性高的診斷套組。
本發明係鑑於上述課題,提供用於檢測在黑色素瘤之早期診斷上有用之腫瘤標記即GPC3及SPARC之新穎單株抗體,以及使用該新穎抗體之黑色素瘤之診斷套組,及黑色素瘤之檢測方法。
亦即,本發明係提供以下各項:[1]:一種惡性黑色瘤(黑色素瘤)之診斷套組,其包含下列組成物:(1)包含選自mAb2C11、mAb2E11、mAb2H10、mAb3E3、mAb3E10、mAb3E11、mAb4F5、mAb5E5、mAb7C8、mAb7G6、mAb10A4及mAbU3E所構成之群組之1種以上抗GPC3單株抗體的組成物,其中該等抗GPC3單株抗體係由選自於2012年4月23日分別以受託編號NITE P-1326、NITE P-1327、NITE BP-01328、NITE P-1329、NITE BP-01330、NITE BP-01331、NITE P-1332、NITE P-1333、NITE P-1334、
NITE P-1335、NITE P-1336及NITE BP-01337寄存於日本國獨立行政法人製品評價技術基盤機構(NITE)專利微生物寄存中心(NPMD)之純系名2C11、2E11、2H10、3E3、3E10、3E11、4F5、5E5、7C8、7G6、10A4及U3E所構成之群組之1種以上融合瘤所生產者;及(2)包含選自mAbS2F9、mAbS14A7、mAbS14C12、mAbS19B1、mAbS20D10、mAbS23C10、mAbS23E9及mAbS25H9所構成之群組之1種以上抗SPARC單株抗體的組成物,其中該等抗SPARC單株抗體係由選自於2012年4月23日分別以受託編號NITE BP-01338、NITE P-1339、NITE P-1340、NITE P-1341、NITE P-1342、NITE BP-01343、NITE P-1344及NITE BP-01345寄存於NPMD之純系名S2F9、S14A7、S14C12、S19B1、S20D10、S23C10、S23E9及S25H9所構成之群組之1種以上融合瘤所生產者;[2]:如[1]所記載之診斷套組,其中抗GPC3單株抗體係選自mAb2C11、mAb10A4、mAbU3E、mAb2H10、mAb3E3、mAb3E10及mAb3E11所構成之群組之1種以上抗體;抗SPARC單株抗體係選自mAbS2F9、mAbS14C12、mAbS23C10、mAbS23E9及mAbS25H9所構成之群組之1種以上抗體;[3]:如[1]或[2]所記載之診斷套組,其中抗GPC3單株抗體係選自mAbU3E、mAb2H10、mAb3E10、mAb3E11及mAb3E3所構成之群組之1種以上抗體;抗SPARC單株抗體係選自mAbS23C10、mAbS2F9、mAbS25H9及mAbS23E9所構成之
群組之1種以上抗體;[4]:如[1]至[3]之任一項所記載之診斷套組,其係以ELISA套組之形式提供;[5]:如[4]所記載之診斷套組,其係以三明治式ELISA套組之形式提供;[6]:如[5]所記載之診斷套組,其中使用抗GPC3單株抗體之三明治式ELISA法中之捕獲抗體係選自mAb2C11、mAb2E11、mAb2H10、mAb3E3、mAb3E10、mAb3E11、mAb4F5、mAb5E5、mAb7C8、mAb7G6、mAb10A4及mAbU3E所構成之群組,而且檢測抗體係選自mAb2C11、mAb2E11、mAb2H10、mAb3E3、mAb3E10、mAb3E11、mAb4F5、mAb5E5、mAb7C8、mAb7G6、mAb10A4及mAbU3E所構成之群組之1種以上抗體,但是任一者均與捕獲抗體相異;使用抗SPARC單株抗體之三明治式ELISA法中之捕獲抗體係選自mAbS2F9、mAbS14A7、mAbS14C12、mAbS19B1、mAbS20D10、mAbS23C10、mAbS23E9及mAbS25H9所構成之群組,而且檢測抗體係選自mAbS2F9、mAbS14A7、mAbS14C12、mAbS19B1、mAbS20D10、mAbS23C10、mAbS23E9及mAbS25H9所構成之群組之1種以上抗體,但是任一者均與捕獲抗體相異;[7]:如[5]或[6]所記載之診斷套組,其中使用抗GPC3單株抗體之三明治式ELISA法中之捕獲抗體係選自mAb2C11、mAb10A4、mAbU3E及mAb3E11所構成之群組,而且檢測抗體係選自mAb2H10、mAb3E3及mAb3E10所構成之群組
之1種以上抗體;使用抗SPARC單株抗體之三明治式ELISA法中之捕獲抗體係選自mAbS2F9、mAbS14C12及mAbS23C10所構成之群組,而且檢測抗體係選自mAbS2F9、mAbS23C10、mAbS23E9及mAbS25H9所構成之群組之1種以上抗體,但是任一者均與捕獲抗體相異;[8]:如[5]至[7]任一項所記載之診斷套組,其中使用抗GPC3單株抗體之三明治式ELISA法中之捕獲抗體為mAbU3E或mAb3E11;使用抗SPARC單株抗體之三明治式ELISA法中之捕獲抗體為mAbS23C10或mAbS2F9;[9]:如[5]至[8]任一項所記載之診斷套組,其中使用抗GPC3單株抗體之三明治式ELISA法中之捕獲抗體係mAbU3E或mAb3E11之任一者,而且檢測抗體係選自mAb2H10、mAb3E10及mAb3E3所構成之群組之1種以上抗體;使用抗SPARC單株抗體之三明治式ELISA法中之捕獲抗體係mAbS2F9或mAbS23C10之任一者,而且檢測抗體係選自mAbS2F9、mAbS23C10、mAbS25H9及mAbS23E9所構成之群組之1種以上抗體,但是任一者均與捕獲抗體相異;[10]:如[1]至[9]任一項所記載之診斷套組,其係針對受驗者之血液、血清或血漿樣本而使用;[11]:如[10]所記載之診斷套組,其中受驗者為白色人種;[12]:一種惡性黑色瘤(黑色素瘤)的檢測方法,其包含使下列組成物與來自受驗者之樣本接觸:(1)如[1]所記載之包含選自mAb2C11、mAb2E11、mAb2H10、mAb3E3、mAb3E10、mAb3E11、mAb4F5、mAb5E5、mAb7C8、
mAb7G6、mAb10A4及mAbU3E所構成之群組之1種以上抗GPC3單株抗體的組成物,及(2)如[1]所記載之包含選自mAbS2F9、mAbS14A7、mAbS14C12、mAbS19B1、mAbS20D10、mAbS23C10、mAbS23E9及mAbS25H9所構成之群組之1種以上抗SPARC單株抗體的組成物;[13]:如[12]所記載之檢測方法,其中該樣本為受驗者之血液、血清或血漿;[14]:如[13]所記載之檢測方法,其中該受驗者為白色人種;[15]:如[12]至[14]任一項所記載之檢測方法,其係藉由ELISA法來進行;[16]:如[12]所記載之檢測方法,其係藉由免疫染色法來進行;[17]:一種抗GPC3單株抗體,其係選自如[1]所記載之mAb2C11、mAb2E11、mAb2H10、mAb3E3、mAb3E10、mAb3E11、mAb4F5、mAb5E5、mAb7C8、mAb7G6、mAb10A4及mAbU3E所構成之群組;[18]:如[17]所記載之抗GPC3單株抗體,其係選自mAb2H10、mAb3E10、mAb3E11、mAbU3E及mAb3E3所構成之群組;[19]:一種抗SPARC單株抗體,其係選自如[1]所記載之mAbS2F9、mAbS14A7、mAbS14C12、mAbS19B1、mAbS20D10、mAbS23C10、mAbS23E9及mAbS25H9所構成之群組;
[20]:如[19]所記載之抗SPARC單株抗體,其係選自mAbS2F9、mAbS23C10、mAbS25H9及mAbS23E9所構成之群組;[21]:一種融合瘤,其係選自如[1]所記載之於2012年4月23日分別以受託編號NITE P-1326、NITE P-1327、NITE BP-01328、NITE P-1329、NITE BP-01330、NITE BP-01331、NITE P-1332、NITE P-1333、NITE P-1334、NITE P-1335、NITE P-1336及NITE BP-01337寄存在NPMD之純系名2C11、2E11、2H10、3E3、3E10、3E11、4F5、5E5、7C8、7G6、10A4及U3E所構成之群組;[22]:如[21]所記載之融合瘤,其係選自純系名2H10、3E10、3E11、U3E及3E3所構成之群組;[23]:一種融合瘤,其係選自如[1]所記載之於2012年4月23日分別以受託編號NITE BP-01338、NITE P-1339、NITE P-1340、NITE P-1341、NITE P-1342、NITE BP-01343、NITE P-1344及NITE BP-01345寄存在NPMD之純系名S2F9、S14A7、S14C12、S19B1、S20D10、S23C10、S23E9及S25H9所構成之群組;以及[24]:如[23]所記載之融合瘤,其係選自純系名S2F9、S23C10、S25H9及S23E9所構成之群組。
在本說明書中,如表10中之摘要說明,本發明所提供之融合瘤中,純系(括弧內編號均為日本國內受託編號):2C11(NITE P-1326)、2E11(NITE P-1327)、4F5(NITE
P-1332)、5E5(NITE P-1333)、7C8(NITE P-1334)、7G6(NITE P-1335)、10A4(NITE P-1336)、S14A7(NITE P-1339)、S14C12(NITE P-1340)、S19B1(NITE P-1341)及S20D10(NITE P-1342)係於2012年4月23日,以日本國內寄存方式寄存在在日本國獨立行政法人製品評價技術基盤機構(NITE)專利微生物寄存中心(NPMD),於日本國內之寄存仍繼續中。另一方面,關於純系(括弧內編號均為日本國內受託編號):2H10(NITE BP-01328)、3E10(NITE BP-01330)、3E11(NITE BP-01331)、U3E(NITE BP-01337)、S2F9(NITE BP-01338)、S23C10(NITE BP-01343)及S25H9(NITE BP-01345)均於2012年4月23日,以日本國內寄存方式寄存在NPMD後,於2013年4月1日,根據布達佩斯條約進行轉至國際寄存的移管申請,於2013年6月7日獲頒國際寄存之受託證。再者,關於純系3E3(日本國內受託編號NITE P-1329)及S23E9(日本國內受託編號NITE P-1344),任一項均於2012年4月23日,以日本國內寄存方式寄存於NPMD後,於2013年6月12日,根據布達佩斯條約進行轉至國際寄存的移管申請,不過在本申請案之國際申請日仍未獲頒發有關國際寄存之受託證。關於此2純系,預定於存活試驗合格後,分別可獲頒有關國際寄存之受託證,並賦予NITE BP-01329及NITE BP-01344之國際受託編號。
本發明所製成之包含新穎單株抗體之組合的黑色素瘤之診斷套組,例如,以三明治式ELISA套組之
形式提供之情況,通常具有比將抗GPC3、SPARC所使用之市售抗體組合時高的靈敏度。使用本發明之單株抗體的黑色素瘤之診斷套組及黑色素瘤之檢測方法,在早期之黑色素瘤之診斷上陽性率非常高,對於早期進行黑色素瘤之正確診斷而言非常有用。再者,本發明所製成之單株抗體,在黑色素瘤之診斷‧檢測上幾乎可排除偽陽性,係屬特異性高者。
再者,若藉由本發明,可進行黑色素瘤與其他皮膚疾病之鑑別診斷。又,本發明之新穎抗體,與市售抗體相較,呈現優良的檢測靈敏度。再者,若藉由本發明,不論是在全部黑色素瘤,還是在ALM(末端黑子型黑色素瘤)、SSM(表在擴大型黑色素瘤)之診斷上,均比先前藉由LDH或5-S-CD之診斷更為優良。更進一步而言,不管黑色素瘤之進展階段為何,均可用本發明之方法進行黑色素瘤之診斷;以LDH檢査等先前方法無法判定之早期病例,亦可用本發明之方法診斷。尤其,根治之可能性幾乎高達100%之0至1期,藉由本發明之方法可得到優良之診斷結果。
第1圖為精製抗SPARC單株抗體的ELISA數據。
第2圖為精製抗GPC3單株抗體的ELISA數據。
第3圖為關於抗GPC3單株抗體之三明治式ELISA所用之抗體組合的檢討結果。
第4圖為關於抗SPARC單株抗體之三明治式ELISA所用之抗體組合的檢討結果。
第5圖展示在使用mAbU3E做為捕獲抗體之情況,血清GPC3之三明治式ELISA的結果。
第6圖展示在使用mAbS23C10做為捕獲抗體之情況,血清SPARC之三明治式ELISA的結果。
第7圖(a)及(b)為藉由以使用新穎抗體之三明治式ELISA檢測100名日本人健康人之血清中之GPC3、SPAPRC值而設定的截止值。
第8圖(a)及(b)為日本人黑色素瘤以外皮膚科疾病22例之GPC3、SPARC值。
第9圖(a)及(b)為日本人黑色素瘤以外皮膚科疾病患者(n=22)及日本人黑色素瘤患者(n=56)之GPC3值及SPARC值之分布。
第10圖(a)及(b)為黑色素瘤各病型之GPC3及SPARC陽性率。
第11圖(a)及(b)為黑色素瘤各病期之GPC3及SPARC陽性率。
第12圖(a)及(b)為使用GPC3檢測用之市售抗體的三明治式ELISA之性能(依病型、病期分類)。
第13圖(a)及(b)為藉由先前腫瘤標記LDH‧5-S-CD檢査之黑色素瘤檢測靈敏度(依病型分類)。
第14圖(a)及(b)為藉由先前腫瘤標記LDH‧5-S-CD檢査之黑色素瘤檢測靈敏度(依病期分類)。
第15圖(a)至(d)為澳洲人黑色素瘤患者之GPC3及SPARC之陽性率。
第16圖(a)及(b)為澳洲人健康者(n=11)及澳洲人黑色素瘤患者(n=28)之GPC3值及SPARC值之分布。
以下,針對本發明之具體態樣加以說明;首先說明本發明所使用之新穎抗GPC3單株抗體及抗SPARC單株抗體。
在本發明中所使用之抗GPC3單株抗體係由為小鼠脾臓細胞與小鼠骨髓瘤(myeloma)之融合細胞的融合瘤(純系名)2C11、2E11、2H10、3E3、3E10、3E11、4F5、5E5、7C8、7G6、10A4或U3E所生產之抗GPC3單株抗體。該等融合瘤於平成24年(2012年)4月23日寄存在日本國獨立行政法人製品評價技術基盤機構(NITE)專利微生物寄存中心(NPMD)(本說明書及申請專利範圍中僅稱之為NPMD),且分別被賦予受託編號NITE P-1326、NITE P-1327、NITE BP-01328、NITE P-1329(在國際申請日後,預定被賦予國際受託編號NITE BP-01329)、NITE BP-01330、NITE BP-01331、NITE P-1332、NITE P-1333、NITE P-1334、NITE P-1335、NITE P-1336及NITE BP-01337。再者,關於日本國內寄存、國際寄存之詳細情形,請參照上述段落[0016]及下述表10。
另一方面,在本發明中所使用之抗SPARC單株抗體係由為小鼠脾臓細胞與小鼠骨髓瘤之融合細胞的
融合瘤(純系名)S2F9、S14A7、S14C12、S19B1、S20D10、S23C10、S23E9或S25H9所生產之抗SPARC單株抗體。該等融合瘤係於平成24年(2012年)4月23日寄存在NPMD,且分別被賦予受託編號NITE BP-01338、NITE P-1339、NITE P-1340、NITE P-1341、NITE P-1342、NITE BP-01343、NITE P-1344(國際申請日後,預定賦予國際受託編號NITE BP-01344)及NITE BP-01345。再者,關於日本國內寄存、國際寄存之詳細,參照上述段落[0016]及下述表10。
在本說明書及專利請求之範圍中,上述融合瘤有時僅以各個之純系名來稱呼。另一方面,由上述融合瘤所生產之各個單株抗體,係在生產其之融合瘤之純系名前面加上單株抗體之簡稱「mAb」來表示。
亦即,將由分別以受託編號NITE P-1326、NITE P-1327、NITE BP-01328、NITE P-1329、NITE BP-01330、NITE BP-01331、NITE P-1332、NITE P-1333、NITE P-1334、NITE P-1335、NITE P-1336及NITE BP-01337寄存在NPMD之純系名稱為2C11、2E11、2H10、3E3、3E10、3E11、4F5、5E5、7C8、7G6、10A4及U3E之融合瘤所生產的抗GPC3單株抗體,分別稱為mAb2C11、mAb2E11、mAb2H10、mAb3E3、mAb3E10、mAb3E11、mAb4F5、mAb5E5、mAb7C8、mAb7G6、mAb10A4及mAbU3E;將由分別以受託編號NITE BP-01338、NITE P-1339、NITE P-1340、NITE P-1341、NITE P-1342、NITE BP-01343、NITE P-1344及NITE BP-01345寄存在NPMD之純系名稱為S2F9、S14A7、
S14C12、S19B1、S20D10、S23C10、S23E9及S25H9之融合瘤生產的抗SPARC單株抗體,分別稱為mAbS2F9、mAbS14A7、mAbS14C12、mAbS19B1、mAbS20D10、mAbS23C10、mAbS23E9及mAbS25H9。但是,在實施例及圖式中,為了簡略化,亦可從各單株抗體之上述名稱刪去「mAb」,只以生產各單株抗體之融合瘤之純系名之上述名稱來特指各單株抗體。
再者,在本說明書及申請專利範圍中,當總稱上述mAb2C11、mAb2E11、mAb2H10、mAb3E3、mAb3E10、mAb3E11、mAb4F5、mAb5E5、mAb7C8、mAb7G6、mAb10A4及mAbU3E時,稱為抗GPC3單株抗體或抗GPC3mAb,亦有只稱為抗GPC3抗體的情形。同樣地,當總稱上述mAbS2F9、mAbS14A7、mAbS14C12、mAbS19B1、mAbS20D10、mAbS23C10、mAbS23E9及mAbS25H9時,稱為抗SPARC單株抗體或抗SPARCmAb,亦有只稱為抗SPARC抗體的情形。
在本說明書及申請專利範圍中,抗GPC3單株抗體及抗SPARC單株抗體,亦包含其之各者的片段、以及嵌合抗體及人源化抗體等修飾抗體及變異抗體。就抗體之片段而言,可列舉F(ab’)2片段、Fab’片段。此等片段、修飾抗體及變異抗體,亦與原抗GPC3單株抗體或抗SPARC單株抗體同樣地,為分別具有對GPC3或SPARC蛋白質的特異性者。此等可藉由本技術領域人士周知的手段‧方法製造。
繼而,針對本發明中所使用之抗GPC3單株抗體及抗SPARC單株抗體的取得方法加以說明。
取得抗GPC3單株抗體時所使用之人類GPC3蛋白質的胺基酸序列為公知,例如在GenBank之蛋白質資料庫中以登錄編號NP_004475登錄者,本技術領域人士可容易地取得。另一方面,取得抗SPARC單株抗體時所用之人類SPARC蛋白質的胺基酸序列為公知,例如在GenBank之蛋白質資料庫中以登錄編號NM_003118登錄者,本技術領域人士可容易地取得。
本發明之抗GPC3單株抗體及抗SPARC單株抗體,可藉由例如,將小鼠等哺乳動物分別以GPC3蛋白質或其片段,或SPARC蛋白質或其片段免疫,然後使免疫動物之脾臓細胞與骨髓瘤(myeloma)融合,製成融合瘤,並培養該等融合瘤而得到。另一方面,亦可使用其他本技術領域人士所周知的方法,例如,基因重組法、化學合成法等,製造該單株抗體。再者,用於本發明之單株抗體,以能識別GPC3或SPARC之任何抗原決定部位(epitope)的抗體為佳。
具體而言,如後述之實施例所記載,為了製作對於GPC3及SPARC之單株抗體,將GPC3蛋白質或SPARC蛋白質與為弗氏不完全佐劑(Freund’s incomplete adjuvant)或人工佐劑之TiterMax GOLD(TiterMAX)混合,製作乳液,用其使BALB/c小鼠之鼠蹊部淋巴節或足墊免疫,進行多次免疫。最終免疫後,取出脾臓,使用PEG1500
(Roche)使脾臓B細胞與骨髓瘤進行細胞融合。在HAT(Invitrogen)存在下之RPMI1640培養基中,進行2週融合瘤的選擇培養,選擇融合細胞。再者,將分泌於培養上清液之抗體,以被覆有GPC3或SPARC之ELISA進行篩選,選擇產生抗體的融合瘤。將該融合瘤以本技術領域人士所周知之培養條件培養,可得到本發明之抗GPC3單株抗體及抗SPARC單株抗體。再者,所得到之單株抗體,可如以下之方式精製。
將培養產生目的抗體之融合瘤所得到之培養上清液或融合瘤接種於BALB/c或裸小鼠之腹腔,從數週後所得到之腹水精製單株抗體。抗體之精製,可藉由使用結合有蛋白質A之瓊脂糖凝膠(Protein A conjugated sepharose)(GE healthcare)或結合有蛋白質G之瓊脂糖凝膠(GE healthcare)的親和精製法來進行。或者,亦可藉由抗原管柱來精製,其中該抗原管柱係將GPC3或SPARC固定於經CNBr活化之瓊脂糖凝膠4B(CNBr-activated sepharose 4B)(GE healthcare)等配體偶合(ligand coupling)載劑而製成。
繼而,詳細地說明本發明之具體態樣。
本發明,在第一態樣中,提供上述[1]所記載之惡性黑色瘤(黑色素瘤)的診斷套組。該診斷套組必須包含:(1)包含選自mAb2C11、mAb2E11、mAb2H10、mAb3E3、mAb3E10、mAb3E11、mAb4F5、mAb5E5、mAb7C8、mAb7G6、mAb10A4及mAbU3E所構成之群組之1種以上抗GPC3單株抗體的組成物(以下亦稱為組成物(1))、及(2)包含選自mAbS2F9、
mAbS14A7、mAbS14C12、mAbS19B1、mAbS20D10、mAbS23C10、mAbS23E9及mAbS25H9所構成之群組之1種以上抗SPARC單株抗體的組成物(以下亦稱為組成物(2))。本發明之套組,除上述組成物(1)及組成物(2)之外,亦可適當地包含,例如,樣本採取工具、標識、反應容器、檢測用試藥(例如,二次抗體、顯色試藥、緩衝液等)等。具體而言,例如,本發明之套組亦可包含三明治式法、競爭法、直接吸附法等ELISA所必要之試藥,或進行西方轉漬(western blotting)法等分析所必要之試藥。一般而言,套組中附有操作說明書。
本發明之套組中所包含之組成物(1)及組成物(2),必須為分別包含選自mAb2C11、mAb2E11、mAb2H10、mAb3E3、mAb3E10、mAb3E11、mAb4F5、mAb5E5、mAb7C8、mAb7G6、mAb10A4及mAbU3E所構成之群組之1種以上的抗GPC3單株抗體者,及選自mAbS2F9、mAbS14A7、mAbS14C12、mAbS19B1、mAbS20D10、mAbS23C10、mAbS23E9及mAbS25H9所構成之群組之1種以上的抗SPARC單株抗體者。各組成物中所含之抗GPC3單株抗體或抗SPARC單株抗體可分別為1種,或為2種以上。含有2種以上單株抗體,可使本發明的診斷套組的靈敏度、特異性、精度提高。
在本發明之套組中,上述組成物(1)及組成物(2)所含之抗GPC3單株抗體及抗SPARC單株抗體可為經標識者。各種標識為本技術領域人士所周知,可適當地選
用。就標識而言,可列舉如:生物素、地高辛(digoxigenin)(DIG)、吖啶鎓酯(acridinium ester)、閃光物質(flashlight)等化學物質、辣根過氧化酶(horseradish peroxidase)(HRP)、ALP、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶等酵素、FITC、若丹明(Rhodamine)、Cy3、Cy5、德州紅(Texas Red)、Alexa Fluor類、BODIP Y類、IRDye類、MFP類、量子點(Quantum Dot)類、AMCA、別藻藍蛋白(Allophycocyanin)、BMP、Cy2、Cy3.5、Cy5.5、DTAF、DyLight 547、DyLight 647、FluoroNanogold、藻紅素(Phycoerythrin)、藻藍素(Phycocyanin)、R-PE、皂草素(Saporin)、TRITC等螢光標識、60mm Microbead等珠粒、MagCellect Ferrofluid(登錄商標)等磁性珠粒、125I等放射性標識、金粒子、瓊脂糖(agarose)等標識。
再者本發明之套組中所含之組成物(1)及組成物(2),除抗GPC3單株抗體或抗SPARC單株抗體之外,可視需要含有緩衝液、培養基成分、賦形劑、添加劑、及載劑等各種物質。
本發明之套組中所包含之組成物(1)及組成物(2)中所含之可視期望予以標識之抗GPC3單株抗體或抗SPARC單株抗體的濃度,無特別限定,可依照套組之形式等而適宜選擇。例如,單株抗體在組成物中可以約0.1至10μg/ml之濃度使用。
從對抗原之特異性,或黑色素瘤之檢測靈敏度的觀點言之,本發明之套組中所包含之組成物(1)中所
含之抗GPC3單株抗體以係選自mAb2C11、mAb10A4、mAbU3E、mAb2H10、mAb3E3、mAb3E10及mAb3E11所構成之群組的1種以上抗體為較佳,組成物(2)中所含之抗SPARC單株抗體以係選自mAbS2F9、mAbS14C12、mAbS23C10、mAbS23E9及mAbS25H9所構成之群組的1種以上抗體為較佳。
抗GPC3單株抗體以係選自mAbU3E、mAb2H10、mAb3E10、mAb3E11及mAb3E3所構成之群組的1種以上抗體為更佳。又,抗SPARC單株抗體以係選自mAbS23C10、mAbS2F9、mAbS25H9及mAbS23E9所構成之群組的1種以上抗體為更佳。
就在本發明之套組中所採用之診斷‧檢測方法而言,可列舉如:三明治式ELISA法等ELISA法、免疫轉漬(immunoblotting)法、放射性免疫分析(RIA)法、免疫沈降法、使用蛋白質陣列之方法、使用流式細胞儀(flow cytometer)之方法、化學發光酵素免疫測定法(CLEIA)、生物發光酵素免疫測定法(BLEIA)、使用可藉由毛細管現象輸液之展開器材(免疫測定用試驗片)的測定法、免疫層析法、免疫染色法、凝集法等。
在本發明中,診斷套組較佳以ELISA套組之形態提供,更佳以三明治式ELISA套組之形式提供。ELISA套組不需特殊的設備等即可迅速且容易地進行抗原抗體反應。三明治式ELISA套組,雖必須使用能在相異抗原決定部位(epitope)識別同一蛋白質之2種抗體,不過使
用捕獲抗體及檢測抗體二種抗體檢測同一白質在性質上,特異性非常高而為特佳。
具體而言,例如,在三明治式ELISA中,準備抗原識別部位相異之2種抗體,使其中之一抗體(捕獲抗體)吸附於培養盤。使樣本與培養盤接觸而進行反應,然後與抗原識別部位相異之另一抗體(檢測抗體)反應,藉由標識之使用等檢測該檢測抗體的結合。檢測抗體之結合的檢測,例如如實施例所記載,將檢測抗體生物素化,並添加生物素化檢測抗體後,將(鏈酶)抗生蛋白(streptavidin)及辣根過氧化酶(horseradish peroxidase)等酵素複合體添加於培養盤中。繼而添加藉由酵素來顯色之基質以進行顯色反應後,藉由分光光度計測定顯色強度,可進行樣本中之GPC3及SPARC的檢測或測定。就與檢測抗體結合之標識而言,雖以生物素為代表,然而亦可使用其他標識,或直接與酵素結合。
在本發明的診斷套組係以三明治式ELISA之形式提供的情況,以下述為較佳:使用抗GPC3單株抗體之三明治式ELISA法中之捕獲抗體係選自mAb2C11、mAb2E11、mAb2H10、mAb3E3、mAb3E10、mAb3E11、mAb4F5、mAb5E5、mAb7C8、mAb7G6、mAb10A4及mAbU3E所構成之群組,而且檢測抗體係選自mAb2C11、mAb2E11、mAb2H10、mAb3E3、mAb3E10、mAb3E11、mAb4F5、mAb5E5、mAb7C8、mAb7G6、mAb10A4及mAbU3E所構成之群組的一種以上抗體,但是任一者均與捕獲抗體相異;使用抗
SPARC單株抗體之三明治式ELISA法中之捕獲抗體係選自mAbS2F9、mAbS14A7、mAbS14C12、mAbS19B1、mAbS20D10、mAbS23C10、mAbS23E9及mAbS25H9所構成之群組,而且檢測抗體係選自mAbS2F9、mAbS14A7、mAbS14C12、mAbS19B1、mAbS20D10、mAbS23C10、mAbS23E9及mAbS25H9所構成之群組的一種以上抗體,但是任一者均與捕獲抗體相異。再者,關於檢測抗體,可使用1種mAb,亦可使用混合2種以上mAb而成之雞尾酒式混液。
在將本發明的診斷套組以三明治式ELISA之形式提供的情況,從特異性或檢測靈敏度之觀點而言,以使用抗GPC3單株抗體之三明治式ELISA法中之捕獲抗體係選自mAb2C11、mAb10A4、mAbU3E及mAb3E11所構成之群組,而且檢測抗體係選自mAb2H10、mAb3E3及mAb3E10所構成之群組的一種以上抗體,使用抗SPARC單株抗體之三明治式ELISA法中之捕獲抗體係選自mAbS2F9、mAbS14C12及mAbS23C10所構成之群組,而且檢測抗體係選自mAbS2F9、mAbS23C10、mAbS23E9及mAbS25H9所構成之群組的一種以上抗體,但任一者均與捕獲抗體相異為更佳;以使用抗GPC3單株抗體之三明治式ELISA法中之捕獲抗體係mAbU3E或mAb3E11,使用抗SPARC單株抗體之三明治式ELISA法中之捕獲抗體係mAbS23C10或mAbS2F9為進一步更佳。
再者,在本發明的診斷套組中,以下述者
為特佳:使用抗GPC3單株抗體之三明治式ELISA法中之捕獲抗體為mAbU3E或mAb3E11之任一者,而且檢測抗體為選自mAb2H10、mAb3E10及mAb3E3所構成之群組的一種以上抗體;使用抗SPARC單株抗體之三明治式ELISA法中之捕獲抗體為mAbS2F9或mAbS23C10之任一項,而且檢測抗體為選自mAbS2F9、mAbS23C10、mAbS25H9及mAbS23E9所構成之群組的一種以上抗體,但是任一項均與捕獲抗體相異。
藉由本發明的診斷套組分析之樣本,無特別限定,只要有含有GPC3蛋白質及/或SPARC蛋白質之可能性,任何樣本皆可。樣本係以受驗者之血液、血清或血漿樣本為較佳。
又,受驗者亦無特別限定,可為日本人、澳洲人等歐美人,以及世界中任何地域的受驗者,不過從陽性率之觀點而言,以澳洲人等白色人種為特佳。
藉由使用本發明的診斷套組,可特異地且高陽性率地進行黑色素瘤的早期診斷。
本發明在第二態樣中,提供一種惡性黑色瘤(黑色素瘤)之檢測方法,其包含將在上述[12]中所記載,並在上述第一態樣中詳細說明之包含抗GPC3單株抗體的組成物(組成物(1))及包含抗SPARC單株抗體的組成物(組成物(2)),與來自受驗者之樣本接觸。
本發明之檢測方法,藉由使樣本與包含抗GPC3單株抗體的組成物(組成物(1))接觸,及使樣本與包含
抗SPARC單株抗體的組成物(組成物(2))接觸,可檢測樣本中SPARC及GPC3之存在或其量。樣本中之SPARC及/或GPC3的存在為受驗者罹患惡性黑色瘤(黑色素瘤)的指標。
樣本與組成物(1)及組成物(2)之接觸,只要根據該技術領域中通常施行之方法進行即可,無特別限定。本發明之檢測方法以在活體外進行為較佳。
存在於樣本中之GPC3蛋白質及/或SPARC蛋白質,與本發明之抗GPC3單株抗體及/或抗SPARC單株抗體之結合的檢測,可藉由本技術領域人士所周知之任何方法進行,詳細而言,可列舉上述第一態樣中所記載之檢測手段。又,本發明之檢測方法中所使用之組成物(1)及組成物(2)中所包含之抗GPC3單株抗體及抗SPARC單株抗體均可為視抗原抗體反應之檢測手段而予以適當標識者。標識可為本技術領域人士所周知之任一者,詳細而言,可列舉上述第一態樣中所記載之標識。
例如,為了藉由本發明之檢測方法檢測樣本中之GPC3及/或SPARC之存在或其量,只要使樣本與組成物(1)及組成物(2)中所包含之抗GPC3單株抗體及抗SPARC單株抗體反應,並檢測為反應生成物之複合體即可。藉由預先使酵素、放射性物質、螢光物質等標識與抗體結合,可檢測出為反應生成物之複合體。具體而言,藉由例如三明治式法、競爭法、直接吸附法等ELISA,凝集法,或西方轉漬法等公知檢測‧測定法檢測GPC3及/或SPARC的存在或量,可得到用於診斷受驗者是否罹患惡性
黑色瘤(黑色素瘤)的指標。
又,用於檢測之反應可在孔(well)等之液相中進行,或在固定有抗GPC3單株抗體或抗SPARC單株抗體之固相支持體上進行。此種情況,藉由與使用未罹患黑色素瘤之正常樣本、或判定係黑色素瘤之樣本所預先製作的標準值比較,可判定所測定之值是否為黑色素瘤陽性。又,在檢測之時,以測定多名黑色素瘤患者及健康人之血清中的GPC3及SPARC量來設定截止值(cut off value)為較佳。
供應於本發明之檢測方法的樣本,無特別限定,可為任何樣本,然而以從有罹患黑色素瘤之虞之受驗者所得到之血液、唾液或尿等體液、或者皮膚組織切片等為較佳,以受驗者之血液、血清或血漿為特佳。
例如,以皮膚組織切片做為樣本的情況,依照常法,針對所製作之臓器的組織切片,使用分別含於本發明之組成物(1)及組成物(2)的抗GPC3單株抗體及抗SPARC單株抗體進行免疫染色,藉由是否看見GPC3及SPARC的表現,可進行惡性黑色瘤(黑色素瘤)的檢測。
另一方面,以受驗者之血液、血清或血漿等體液做為樣本的情況,例如樣本分別與本發明之組成物(1)及組成物(2)所包含之抗GPC3單株抗體及抗SPARC單株抗體接觸後,可使用螢光物質或發光物質、酵素等標識,檢測可能存在於樣本中之GPC3及/或SPARC與抗體之特異性結合。
適用本發明之檢測方法的受驗者亦無特別限定,可為日本人、澳洲人等歐美人以及世界中任何地域的受驗者,然而從陽性率之觀點而言,以澳洲人等白色人種為特佳。
如上述,本發明之檢測方法中,存在於樣本中之GPC3蛋白質及/或SPARC蛋白質與本發明之抗GPC3單株抗體及/或抗SPARC單株抗體之結合的檢測,可依照本技術領域中所周知之任何方法進行,詳細而言,可列舉上述第一態樣中所記載的檢測手段。
在上述第一態樣中所記載之檢測手段之中,由於ELISA法無需特殊設備,可迅速且容易地進行GPC3蛋白質及/或SPARC蛋白質之存在或量的檢測,故而以使用該法為較佳。在ELISA法之中,以如上述之三明治式ELISA法為特佳。
在本發明之檢測方法中,其他較佳檢測手段例如有免疫染色法。免疫染色法可藉由本技術領域人士所周知之方法進行。
在本發明之檢測方法中所使用之較佳抗GPC3單株抗體及抗SPARC單株抗體的具體例係如上述第一態樣中所記載者。
本發明之檢測方法,除可為了得到診斷是否罹患黑色素瘤的指標而使用外,亦可為了得到黑色素瘤之治療效果的指標而經時地進行。
在本發明在第三態樣中,提供適合使用於
上述第一態樣之診斷套組及第二態樣之檢測方法的抗GPC3單株抗體及抗SPARC單株抗體,其中該抗GPC3單株抗體係選自mAb2C11、mAb2E11、mAb2H10、mAb3E3、mAb3E10、mAb3E11、mAb4F5、mAb5E5、mAb7C8、mAb7G6、mAb10A4及mAbU3E所構成之群組;抗SPARC單株抗體係選自mAbS2F9、mAbS14A7、mAbS14C12、mAbS19B1、mAbS20D10、mAbS23C10、mAbS23E9及mAbS25H9所構成之群組。
以抗GPC3單株抗體係選自mAb2H10、mAb3E10、mAb3E11、mAbU3E及mAb3E3所構成之群組,抗SPARC單株抗體係選自mAbS2F9、mAbS23C10、mAbS25H9及mAbS23E9所構成之群組為特佳。
如上述,本發明之抗GPC3單株抗體及抗SPARC單株抗體亦包含各者之片段、以及嵌合抗體及人源化抗體等修飾抗體及變異抗體。就抗體之片段而言,可列舉F(ab’)2片段、Fab片段。此等片段、修飾抗體及變異抗體,亦與原抗GPC3單株抗體或抗SPARC單株抗體同樣地,為分別係對於GPC3或SPARC蛋白質具有特異性者。此等可藉由本技術領域所周知之手段‧方法製造。
本發明在第四態樣中,提供生產上述第三態樣之單株抗體之融合瘤,該融合瘤係選自分別以受託編號NITE P-1326、NITE P-1327、NITE BP-01328、NITE P-1329、NITE BP-01330、NITE BP-01331、NITE P-1332、NITE P-1333、NITE P-1334、NITE P-1335、NITE P-1336及
NITE BP-01337寄存於NPMD之純系名2C11、2E11、2H10、3E3、3E10、3E11、4F5、5E5、7C8、7G6、10A4及U3E所構成之群組;及選自分別以受託編號NITE BP-01338、NITE P-1339、NITE P-1340、NITE P-1341、NITE P-1342、NITE BP-01343、NITE P-1344及NITE BP-01345寄存於NPMD之純系名S2F9、S14A7、S14C12、S19B1、S20D10、S23C10、S23E9及S25H9所構成之群組。
特佳為提供選自純系名2H10、3E10、3E11、U3E及3E3所構成之群組的融合瘤;及選自純系名S2F9、S23C10、S25H9及S23E9所構成之群組的融合瘤。
以下,列舉實施例,進一步說明本發明,然而本發明不限定於此等實施例。
本發明係以令使用先前已知之抗GPC3抗體或抗SPARC抗體的黑色素瘤診斷套組進一步高靈敏度化為目的,而實施新穎單株抗體之製作。具體而言,如以下之詳細說明,建立20個純系之融合瘤,進行抗體精製。以精製之抗體為基礎構築三明治式ELISA,使用日本人黑色素瘤患者血清(10名)及澳洲人黑色素瘤患者血清(10名),實施檢證實驗。其結果,若藉由所使用之單株抗體的組合,黑色素瘤患者達到100%或接近100%之極高陽性率。
再者,使用日本人健康人血清(100名)、日本人黑色素瘤以外皮膚科疾病患者血清(22名)、日本人黑色素瘤患者血清(56名)及澳洲人健康人血清(11名)、澳洲
人黑色素瘤患者血清(28名)實施追加之檢證實驗。關於日本人黑色素瘤,藉由新穎法GPC3/SPARC組合之診斷,無遠端轉移之第0至3期黑色素瘤的診斷,尤其根治可能性高之第0至1期的診斷,比先前藉由腫瘤標記、LDH、5-S-CD的診斷優良。又,顯示在與黑色素瘤以外皮膚科疾病患者之鑑別上亦有用。對於澳洲人黑色素瘤,亦顯示極高之陽性率:GPC3陽性率為82.1%、SPARC陽性率為67.9%。
實施例中,使用以下之簡稱。
GPC3:蛋白多糖(glypican-3)
SPARC:分泌之蛋白質、酸性、富含半胱胺酸(secreted protein,acidic rich in cysteine)
LDH:乳酸脫氫酵素(lactate dehydrogenase)
5-S-CD:5-S-半胱胺酸左旋多巴(5-S-cysteinyladopa)
ALM:肢端雀斑樣痣黑色素瘤(acral lentiginous melanoma)
SSM:表淺散布型黑色素瘤(superficial spreading melanoma)
LMM:惡性雀斑樣痣黑色素瘤(lentigo maligna melanoma)
NN:結節型黑色素瘤(nodular melanoma)
再者,在實施例中,「室溫」意指約10至35℃。
將10μg之重組GPC3(R & D systems,GenBank登錄編
號NP_004475)或SPARC(Haematologic Technollgies Inc.,GenBank登錄編號NM_003118)於100μL之PBS中調整,使用乳液注射器(emulsion syringe)使其與人工佐劑TiterMax(登錄商標)(TiterMax USA Inc.)混合,形成免疫抗原。
將GPC3蛋白質或SPARC蛋白質及佐劑之混合乳液接種於BALB/c小鼠之鼠蹊部淋巴節周邊、腹腔、足墊。每2週只用蛋白質進行多次免疫,共進行3次,同時從尾静脈採取少量血,並用ELISA測定血清抗體價。在細胞融合之3日前,以10μg之GPC3蛋白質或SPARC蛋白質進行最後免疫。抗GPC3抗體製作或抗SPARC抗體製作各用5隻BALB/c小鼠(8週齡雌鼠,SPF飼育)。
將調整至0.1μg/mL之GPC3蛋白質或SPARC蛋白質在96孔ELISA培養盤(96 well Nunc Maxisorp plate(Nunc))上固定化後,添加在PBS中之4%Block Ace(DS Pharma Biomedical股份有限公司)(200μL/孔),進行封阻。於室溫培育1小時以上,使用PBS-0.05%Tween20(PBST)洗淨。將經免疫之小鼠之血清稀釋100至10000倍,以50μL/孔之量添加在上述ELISA培養盤中,於室溫培育2小時。用PBST洗淨後,添加結合有HRP之山羊抗小鼠IgG(H+L)(Jackson
ImmunoResearch laboratories,Inc.),並培育2小時。以PBST洗淨,並將水分充分除去後,每孔添加50μL之TMB基質,使其顯色。
覆蓋0.18M硫酸,以使顯色反應停止。藉由培養盤解析儀(plate reader)(Bio-Rad,model 550)測定於450nm之吸光度並進行解析。
將已藉由ELISA確認血清抗體價上升之小鼠用於細胞融合。
在本步驟中,依據目的使用以下述之組成所構成之4種調整培養基:1)無血清培養基:RPMI1640(Sigma)+青黴素-鏈黴素-麩醯胺酸;2)HAT選擇培養基:HAT(次黃嘌呤‧胸苷‧胺基蝶呤)+10%胎牛血清+青黴素-鏈黴素-麩醯胺酸+BM Condimed H1(Roche)+RPMI1640;3)HT選擇培養基:HT(次黃嘌呤‧胸苷)+10%胎牛血清+青黴素-鏈黴素-麩醯胺酸+BM-Condimed H1(Roche)+RPMI1640;4)融合瘤培養用培養基:10%胎牛血清+青黴素-鏈黴素-麩醯胺酸+BM-Condimed MEM+NAEE+丙酮酸鈉溶液+RPMI1640。
再者,關於此等培養基成分,於以下詳細地說明。
‧HAT(invitrogen),商品名:HAT補充物(50X),組成:5mM次黃嘌呤鈉、20μM胸苷、0.8mM胺基蝶呤;以50倍稀釋使用。
‧HT(Invitrogen),商品名:HT補充物(100X),組成:10mM次黃嘌呤鈉、1.6mM胸苷;以100倍稀釋使用。
‧BM Condimed H1(Roche):已公開之主要組成:PMA刺激小鼠淋巴瘤細胞系之上清液,及1mM草醯乙酸,200nM胰島素,1ng/ml hIL-6,10nM PMA,15% FBS;以最終濃度10%添加使用。
‧青黴素-鏈黴素-麩醯胺酸(Invitrogen),商品名:青黴素-鏈黴素-麩醯胺酸(100×),濃度:10,000單位/ml青黴素,10,000μg/ml鏈黴素,29.2mg/ml L-麩醯胺酸;以100倍稀釋使用。
‧NEAA(Invitrogen),商品名:MEM非必需胺基酸溶液(100×),組成:10mM甘胺酸,10mM L-丙胺酸,10mM L-天冬醯胺酸,10mM L-天冬胺酸,10Mm-麩胺酸,10mM L-脯胺酸,10mM L-絲胺酸;以100倍稀釋使用。
‧丙酮酸鈉溶液(Invitrogen),商品名:丙酮酸鈉溶液100mM(100×),濃度100mM;以100倍稀釋使用。
將BALB/c小鼠於最後免疫後3日以內,取出脾臓,在磨砂載玻片之粗面上均質化,並將細胞浮游液以尼龍網布過濾。
將經離心洗淨之脾細胞再懸浮於20mL之無血清培養基中,以血球計算盤計算總細胞數。將脾臓融合
成員之骨髓瘤細胞株Sp2/O-Ag.14(小鼠骨髓瘤細胞株Sp2/O-Ag.14係從RIKEN細胞銀行取得)離心洗淨,懸浮於無血清培養基中,並計算細胞數。
使脾細胞與骨髓瘤之細胞比成為5:1之方式混合,並離心洗淨。用移液管將1mL之50%PEG 1500溶液(於37℃保溫)在攪拌下以2分鐘緩慢地添加至細胞混合顆粒中。
在攪拌下以1分鐘緩慢地添加1mL之無血清培養基(於37℃保溫),進行2次。然後將7mL之無血清培養基(37℃)在攪拌下以3分鐘緩慢地添加。將結束融合操作之細胞懸浮液,以1,000rpm,於室溫離心洗淨5分鐘。以使脾細胞之細胞數成為2.5×105細胞/100μL之方式將融合瘤懸浮於培養基中,在96孔培養盤中每1孔添加100μL之細胞懸浮液。於37℃,5% CO2培育器中培養。培養18小時後,添加HAT選擇培養基並培養2週。
2週之選擇培養後,於顯微鏡下觀察活細胞(細胞融合陽性聚落),回收100μL之陽性聚落的培養上清液,進行固定有抗原之ELISA。在陽性聚落多,個別地回收培養上清液困難之情況,則進行應用實驗計畫法(詳細而言,「單純系抗體實驗操作入門(1991年發行)」安東民衛、千葉丈講談社Scientific)之培養上清液的取樣方式。
實驗操作法係進行與上述[1-3]所記載之「使用ELISA之血清抗體價的測定」同樣之操作。培養上清液以原液使用。
將已確認產生抗體之融合瘤從96孔培養盤移至24孔培養盤,用選擇培養基培養至細胞半融合為止。為了在HT中馴化,將細胞移至HT選擇培養基,於HT選擇培養基中馴化。將在24孔中所培養之融合細胞培養至半融合為止。若在HT培養基中充分増殖,則從24孔培養盤移至6孔培養盤,並移至融合瘤培養基中,進行約7日馴化。培養至融合瘤在通常之RPMI1640中安定地増殖後,使用限數稀釋法(limiting dilution)並選殖増殖快速且抗體產生量多之純系。
將從所選擇之被選殖融合瘤產生之抗SPARC單株抗體之ELISA結果示於第1圖中。同樣地,將從所選擇之被選殖融合瘤產生之抗GPC3單株抗體之ELISA結果示於第2圖中。
在所得到之融合瘤的純系中,將抗GPC3抗體產生能力高之純系,即2C11、2E11、2H10、3E3、3E10、3E11、4F5、5E5、7C8、7G6、10A4及U3E,分別以受託編號NITE P-1326、NITE P-1327、NITE BP-01328、NITE P-1329、NITE BP-01330、NITE BP-01331、NITE P-1332、
NITE P-1333、NITE P-1334、NITE P-1335、NITE P-1336及NITE BP-01337寄存在日本國獨立行政法人製品評價技術基盤機構(NITE)專利微生物寄存中心(NPMD)中。關於寄存之詳細情形,請參照段落[0016](寄存之說明)及表10。
又,在所得到之融合瘤的純系中,將抗SPARC抗體產生能力高之純系,即S2F9、S14A7、S14C12、S19B1、S20D10、S23C10、S23E9及S25H9,分別以受託編號NITE BP-01338、NITE P-1339、NITE P-1340、NITE P-1341、NITE P-1342、NITE BP-01343、NITE P-1344及NITE BP-01345寄存在獨立行政法人製品評價技術基盤機構(NITE)專利微生物寄存中心(NPMD)中。關於寄存之詳細情形,請參照段落[0016](寄存之說明)及表10。
將產生目的抗體之融合瘤接種於BALB/c或裸小鼠的腹腔,培養數週後所得到之腹水,或產生目的抗體之融合瘤,從所得到之培養上清液精製單株抗體。
對BALB/c小鼠(9-10週齡)照射3.5Gy之X射線,3日後對腹腔注射0.2ml之姥鮫烷(pristane),並飼養7至10日。回收於培養中所增加之融合瘤,用5ml之無血清培養基離心洗淨2次。用RPMI調製細胞懸浮液,並將1×106細胞接種於小鼠之腹腔。7至10日後,將18G之注射針刺入腹腔,將腹水回收於離心管中。將腹水以1200rpm離心5分鐘,
分離紅血球。收集上清液,於-20℃凍結保存至進行抗體精製之操作為止。
抗體之精製,係藉由使用結合有蛋白質A之瓊脂糖凝膠(GE healthcare)或結合有蛋白質G之瓊脂糖凝膠(GE healthcare)的親和精製法來進行。再者,就其他方法而言,亦可藉由抗原管柱來精製,其中該抗原管柱係將GPC3或SPARC固定於經CNBr活化之瓊脂糖凝膠4B(CNBr-activated sepharose 4B)(GE healthcare)等配體偶合載劑而製成。
具體而言,來自腹水之抗體的精製係將腹水以PBS適當地稀釋至約(1/2~1/5),藉由蛋白質A-瓊脂糖凝膠精製。就洗淨緩衝液而言係使用PBS,就溶出緩衝液而言,係使用0.1M甘胺酸-HCl pH2.8。
來自融合瘤之培養上清液之抗體的精製如下述進行:以250mL至1L培養基大量培養融合瘤,回收培養基,為了防止管柱之劣化,將其以0.2微米之過濾器過濾。令培養基流過充填有蛋白質A之管柱,使抗體吸附。以10倍管柱體積以上之PBS洗淨後,使用0.1M甘胺酸-HCl(pH2.7)將抗體酸溶出,立即將1M Tris-HCl pH8添加於溶出液,中和pH。
適用於三明治式ELISA之抗體(捕獲抗體‧檢測抗體)
組合的檢討
將捕獲抗體(抗GPC3抗體中的1種)於PBS(pH7.4)中調整為1μg/mL,以每1孔50μL之量塗覆於96孔Nunc Maxisorp ELISA培養盤(Nunc)上,於室溫培育1小時以上。使用4%block Ace(DS Pharma Biomedical股份有限公司)(4g/100mL PBS)或1%BSA(1g BSA/100mLPBS),於室溫封阻1小時。以每孔50μL之量添加患者血漿或血清以0.4% Block Ace(-DS Pharma Biomedical股份有限公司)稀釋3倍以上而得之檢體樣本、或黑色素瘤細胞之培養上清原液,並於室溫培育2小時。藉由添加有0.05%Tween20之PBS(PBST)洗淨3次後,添加50μL之生物素化檢測抗體(抗GPC3抗體中之1種),並於室溫培育1小時,其中該生物素化檢測抗體預先以0.4% Block Ace調整成1μg/mL。抗體之生物素化係使用EZ-link NHS-生物素試劑(Thermo Scientific)來進行。以PBST洗淨3次後,以每孔50μL之量添加接合有辣根過氧化酶之鏈黴抗生蛋白,並於室溫培育30分鐘,其中該接合有辣根過氧化酶之鏈黴抗生蛋白預先以0.4% Block Ace稀釋5000倍而成為1mg/mL。以PBST洗淨3次後,添加TMB基質溶液(Thermo Scientific)使其顯色,再添加50μL之0.18M硫酸,使顯色反應停止。藉由培養盤解析儀(Bio-Rad,model 550)測定於450nm之吸光度,進行解析。
將GPC3之三明治式ELISA的結果示於第3圖及表1。就關於GPC3之捕獲抗體而言,以mAb2C11、mAb10A4、mAbU3E及mAb3E11為優,就檢測抗體而言,以mAb2H10、mAb3E10、mAb3E3為優。
又,將捕獲抗體固定為mAbU3E,使用mAb2H10、mAb3E10、mAb3E3之任一者做為檢測抗體,進行日本人、澳洲人黑色素瘤患者樣本的檢測。將結果示於第5圖及表3之左側。將mAbU3E及mAb3E3組合而使用之情況,澳洲人之黑色素瘤的陽性率為100%。又,對於健康者,陽性率均為0%,特異性高。
使用抗SPARC抗體之三明治式ELISA,係以與上述抗GPC3抗體同樣之條件,以三明治式ELISA檢測來自黑色素瘤患者血液‧血漿或黑色素瘤細胞培養上清液之SPARC。
將SPARC之三明治式ELISA的結果示於第4圖及表2。就針對SPARC之捕獲抗體而言,以mAbS2F9、mAbS14C12、mAbS23C10為優,就檢測抗體而言,以mAbS2F9、mAbS25H9、mAbS23E9及mAbS23C10為優。
又,將捕獲抗體固定為mAbS23C10,使用mAbS2F9、mAbS25H9、mAbS23E9之任一者做為檢測抗體,進行日本人、澳洲人黑色素瘤患者樣本的檢測。將結果示於第6圖及表3之右側。將mAbS23C10與mAbS2F9或
mAbS25H9組合而使用之情況,澳洲人之黑色素瘤的陽性率為100%。又,對於健康人,任一項檢測之陽性率均為0%,特異性高。
將上述[2-1]及[2-2]之GPC3的三明治式ELISA與SPARC的三明治式ELISA組合,使用日本人黑色素瘤患者、澳洲人黑色素瘤患者、日本人健康人之樣本進行檢測。
使用mAbU3E做為對於GPC3之捕獲抗體;使用mAb2H10、mAb3E10、mAb3E3之任一者做為檢測抗體。
另一方面,使用mAbS23C10做為對於SPARC之捕獲抗體;使用mAbS2F9、mAbS25H9、mAbS23E9之任一者做為檢測抗體。
將結果示於表4至6中。將GPC3之三明治式ELISA與SPARC之三明治式ELISA組合的情況,澳洲人黑色素瘤患者之陽性率非常高,達90%至100%,日本人黑色素瘤患者之陽性率亦提高,達30%至80%。又,對於日本人健康人,任一項檢測之陽性率均為0%,特異性高。
表3係彙整以三明治式ELISA檢測GPC3或SPARC之結果之表。
表4至6係彙整以三明治式ELISA組合檢測GPC3與SPARC之結果之表。
日本人健康者樣本係使用健康檢查‧外來診察中所採取血液之剩餘檢體。臨床背景之內部資料:無癌、糖尿病、青光眼之過去病史,平均年齡50.2歳,男女比為50/50,使用100個檢體之血清。澳洲人健康者,係使用男女比3/8,平均年齡56.0歳之血清。
日本人黑色素瘤患者:使用病型或病期確定之患者56人,男女比26/30,平均年齡64.1歳之血清。黑色素瘤以外之皮膚科疾病患者22人:使用男女比11/11,平均年齡60.55歳之血清。澳洲人之黑色素瘤患者28人:使用男女比20/8,平均年齡56.3歳之血清。
BALB/c小鼠,在接種融合瘤7日前施行3.5Gy之放射線照射,3日後將姥鮫烷接種於腹腔。接種1×105個以上之融合瘤,於1至2週後回收腹水。將回收之腹水離心(15000rpm/30分鐘),除去不溶性粒子後,使用0.45μm孔徑(pore size)之注射式過濾器(Nunc),進行過濾。為了從腹水精製抗體,進行親和層析,該親和層析係使用充填有蛋
白質G瓊脂糖凝膠(GE healthcare)之管柱。將腹水以PBS稀釋5倍,流過蛋白質G管柱,使抗體吸附。為了將非特異性吸附之夾雜物除去,以PBS將管柱洗淨,使用0.1M甘胺酸-HCl pH 2.7將抗體酸溶出。將溶出之抗體立即與1M Tris-HCl pH 8.0混合,使pH調整至中性附近。精製抗體從於280nm之紫外線吸收測定值及分子吸光係數1.4算出抗體濃度。
使用NHS-LC-生物素化試劑(Pierce)及NHS-LC-LC-生物素化試劑(Pierce),依照製造原廠之規程進行抗體之生物素化。
GPC3檢測用三明治式ELISA,係將捕獲抗體mAbU3E、mAb3E11各調整為5μg/mL,在96孔maxisorp培養盤之每1孔中添加50μL,使其吸附。為了防止非特異性吸附,以1至2%Block Ace(DS Pharma Biomedical)封阻。將50μL之經0.1%Block Ace稀釋2至4倍之測定血清樣本添加於以捕獲抗體被覆之ELISA培養盤中,於4℃培育12小時以上。用含有0.05% Tween 20之PBS洗淨後,在每1孔中添加50μL之經生物素標識之檢測抗體雞尾酒
混液(包含mAb2H10、mAb3E3、mAb3E10),並於室溫培育2小時以上。用含有0.05% Tween 20之PBS洗淨後,添加抗生蛋白-辣根過氧化酶,於室溫培育30分鐘後,用含有0.05% Tween 20之PBS洗淨。添加TMB基質溶液使其顯色,充分進行顯色反應後,添加50μL之0.18M硫酸,使反應停止。使用多培養盤解析儀(Multiplate reader)(BioRad)測定於450nm之吸光度而定量化。
對捕獲抗體使用抗-人型GPC3單株抗體1G12(Biomosic),對檢測抗體使用抗-GPC3多株抗體(# AF2119,R & D systems)。ELISA之實驗操作,係與上述之新穎方法同樣方式進行。
捕獲抗體係使用mAbS2F9,檢測抗體係使用包含生物素化mAbS23C10、mAbS23E9及mAbS25H9之檢測抗體雞尾酒混液。ELISA之實驗操作係以與GPC3同樣之方式進行。
為了決定使用新穎抗體之ELISA的GPC3、SPARC之截止值,進行100名日本人健康者之血清之ELISA(第7圖)。於第7圖(a)中展示GPC3之定量結果,於第7圖(b)中展示SPARC之定量結果。從100名健康者之GPC3、SPARC之血清中濃度平均值及標準偏差算出截止值。將所決定之截止值以虛線表示在圖上。
與黑色素瘤患者比較之對照群(健康者)的內部資料,選出平均年齡50.2歳,男女比為50/50,過去無癌‧生活習慣疾病之病歷的健康者之血清並進行測定。從健康者決定之截止值為平均+1.5×SD,GPC3之截止值=19.93ng/mL,特異度為95%,偽陽性例出現5例(第7圖(a))。SPARC之截止值=274ng/mL,特異度為96%,偽陽性出現4例(第7圖(b))。
關於黑色素瘤以外之皮膚科疾病之血清GPC3、SPARC,將進行使用新穎抗體之ELISA之結果示於第8圖。GPC3及SPARC,當應用從健康者之GPC3及SPARC測定所決定之截止值時,未見到判定為陽性之病例(第8圖(a)、(b))。因此,從此等結果顯示黑色素瘤與其他皮膚科疾病之鑑別診斷可以實現。
進行日本人黑色素瘤患者56病例之血清GPC3之ELISA測定(第9圖(a))及血清SPARC之ELISA測定(第9圖(b))。就GPC3而言,在56病例中有25病例為陽性,陽性率為44.6%;就SPARC而言,在56病例中有12病例為陽性,陽性率為21.4%。使用曼-惠特尼(Mann-Whitney)U檢定,進行56名黑色素瘤患者群與22名黑色素瘤以外皮膚科疾患患者群之2群間的比較。將GPC3測定值之檢定結果示於第9圖(a)中;將SPARC之檢定結果示於第9圖(b)中。藉由檢定觀察到2群間具顯著差異,就GPC3而言,P<0.001;就SPARC而言,P=0.009。
GPC3之各病型的陽性率如下:ALM,29.6%(27病例中8例);LMM,0%(3病例中未檢測出);NM,50%(6病例中3例);SSM,72.7%(11病例中8例);黏膜型,100%(2病例中2例);分類不明病例,57.1%(7病例中4例)(第10圖(a))。將各病型的SPARC之ELISA測定結果示於第10圖(b)中。各病型之SPARC陽性率如下:ALM,22.2%(27病例中6例);LMM,33.3%(3病例中1例);NM,16.7%(6病例中1例);SSM,18.2%(11病例中2例);黏膜型,0%(2病例中0例);無法分類病例,28.6%(7病例中2例)。
在第11圖(a)中展示日本人患者56病例之各病期之GPC3陽性率,第11圖(b)展示在各病期之SPARC陽性率。GPC3陽性率如下:於第0期為50%(2病例中1例);於第1期為50%(12病例中6例);於第2期為20%(15病例中3例);於第3期為68.8%(16病例中11例);於第4期為36.4%。SPARC陽性率如下:於第0期為0%(2例中0例);於第1期為25%(12病例中3例);於第2期為26.7%(15病例中4例);於第3期為25%(16病例中4例);於第4期為9.1%(11病例中1例)。
使用26名日本人黑色素瘤患者之治療前檢體,並以使
用市售抗體之ELISA檢測此等檢體中之GPC,將結果示於第12圖。第12圖(a)係依病型別來表示,第12圖(b)係依病期別來表示。就GPC3而言,當從199名健康人(男女比99/100,平均年齡62.4歳)之平均值0.80ng/mL,標準偏差1.18所決定之截止值為1.98ng/mL時(虛線),陽性率為19.2%(26病例中5例為陽性)。若與使用新穎抗體之ELISA中的陽性率(第9圖-11)相較,新穎抗體顯然具有較優之檢測靈敏度。
第13圖(a)係將與以新穎方法所檢討之血清樣本相同之血清樣本30例的LDH測定結果依病型別來表示。LDH係使用JSCC標準化對應法測定,將超過基準值範圍(110至250IU/L)之病例判斷為陽性。依病型分類時(第13圖(a)),就ALM而言,27病例中4病例為陽性(14.8%);就LMM、NM、SSM而言,無陽性病例之檢測出(0%);就無法分類之病例而言,7病例中有3病例為陽性(42.9%);就黏膜型而言,2病例中有1病例為陽性(50%)。全部56病例中有8病例為陽性,整體之陽性率為14.3%。
將30例之黑色素瘤病例之5-S-CD測定結果示於第13圖(b)中。5-S-CD之測定係使用HPLC法,將超出基準值範圍(1.5至10nmol/L)之病例判定為陽性。就ALM而言,17病例中有6病例為陽性(35.3%);就LMM而言,
無陽性病例檢測出;就NM而言,3病例中有2例為陽性(66.7%);就SSM而言,5病例中有2例為陽性(40%);就無法分類之病例而言,2病例中有2例為陽性(100%),全部30病例之中12病例為陽性,整體之陽性率為40%。
在第14圖(a)中展現依病期別分類之日本人黑色素瘤患者56病例的LDH測定結果。第0期,2病例中未檢測出病例(0%);第1期,12病例中有1例(8.3%);第2期,15病例中有2例(13.3%);第3期,16病例中有1病例(6.3%);第4期,11病例中有4病例(36.4%)。
第14圖(b)中,將30例黑色素瘤病例之5-S-CD測定結果以病期別表示。第1期,4病例中有1例(陽性率25%);第2期,12病例中有4例(陽性率33.3%);第3期,8病例中有3例(陽性率37.5%);第4期,6病例中有4病例(陽性率66.7%)。
展現依黑色素瘤病型別彙整之結果。在日本人中多數之病型為ALM,就ALM而言,GPC3陽性率為29.6%(27病例中檢測出8病例),SPARC陽性率為22.2%(27病例中6例)。GPC3與SPARC組合之陽性率為40.7%。歐美白人之
黑色素瘤多數為SSM,就SSM而言,GPC3陽性率為72.7%(11病例中8病例),SPARC陽性率為18.2%(11病例中2例),GPC3與SPARC組合之陽性率為72.7%。在歐美白人之黑色素瘤中佔多數之SSM,比在日本人中佔多數之ALM,呈現更高靈敏度。全部56病例中,若將GPC3(44.6%)及SPARC(21.4%)之陽性率組合,則為53.6%之陽性率(56病例中30病例),將GPC3與SPARC組合之診斷方法,與以單獨腫瘤標記診斷相較,黑色素瘤之診斷成績變高。
先前方法中,以LDH測定時,對於ALM,27病例中有4例為陽性,陽性率為14.8%;以5-S-CD測定時,17病例中有6例為陽性,陽性率為35.3%。以LDH測定時,在SSM之11病例中1例也未檢測出。以5-S-CD測定時,在SSM之5病例中檢測出2例,陽性率為40%。就LDH測定而言,全部56病例中檢測出8例,陽性率為14.3%;就5-S-CD測定而言,全部30病例中檢測出12例,陽性率為40%。藉由新穎方法即GPC3‧SPARC組合之診斷,不論是全部黑色素瘤,還是ALM、SSM之診斷,均比藉由LDH、5-S-CD之診斷優良。
GPC3‧SPARC組合之陽性率:第0至1期,陽性率為50%;第2期,陽性率為40%;第3期,陽性率為75%;第4期,陽性率為45.5%。從以上之結果顯示,不論進行時期為何,均可藉由GPC3及SPARC之測定診斷黑色素瘤;再者,以LDH檢査等先前方法無法判定之早期病例,亦可以新穎方法診斷。
若將LDH檢査及5-S-CD檢査之結果依病期分類,使用LDH及5-S-CD之先前方法雖於第4期呈現診斷之效力,然而於第1期,相對於LDH陽性率為8.3%,5-S-CD陽性率為25%,新穎方法GPC3‧SPARC組合之陽性率為50%。新穎方法在早期之診斷上有效。於第2期,相對於LDH陽性率為13.3%及5-S-CD陽性率為33.3%,新穎方法之陽性率為40%;於第3期,相對於LDH陽性率為6.3%,5-S-CD陽性率為37.5%,新穎方法之陽性率為75%,新穎方法亦比既存腫瘤標記優良。藉由GPC3/SPARC組合之診斷,從不論病期為何皆可診斷黑色素瘤之觀點而言,呈現比先前方法優異的結果。在治癒可能性低之遠端轉移之第4期的診斷上,5-S-CD雖較差,然而在無遠端轉移而可根治之第0至3期之黑色素瘤的診斷上,相對於LDH為8.9%及5-S-CD為33.3%,新穎方法陽性率為55.6%,甚為優良。尤其在根治之可能性幾乎高達100%之第0至1期,
新穎方法之陽性率為50%,可得到優良之診斷結果。
表示11例澳洲人健康者之GPC3檢測結果(第15圖(a))及黑色素瘤患者28病例之GPC3檢測結果(第15圖(b))。患者群之陽性率,從來自澳洲人健康者所決定之截止值(以虛線表示;22.81ng/mL)算出澳洲人黑色素瘤患者之陽性率。健康者群中,明顯呈現高值之健康者例包含1例。黑色素瘤患者之臨床背景,病型不明(研判多為SSM),或全部為第4期,然而28病例中有23例陽性,為陽性率達82.1%之高檢測靈敏度。
就SPARC而言,亦同樣地從11例澳洲人決定SPARC之截止值(以虛線表示;217.54ng/mL),並算出黑色素瘤患者之SPARC陽性率(第15圖(d))。健康者群11例中,無偽陽性例(第15圖(c))。黑色素瘤患者群之陽性率,在28病例中有19例陽性,為67.9%。
將黑色素瘤患者及健康者群之測定值以散布圖示於第16圖中。若將黑色素瘤患者28名、健康者11名,使用曼-惠特尼U檢定進行2群間之比較,觀察到顯著差異,就GPC3而言,P<0.001;就SPARC而言,P<0.001。
使用本發明之單株抗體組合的黑色素瘤之診斷套組及黑色素瘤之檢測方法,由於特別可在早期進展的黑色素瘤之正確且特異性高的診斷,所以非常地有用。
Claims (24)
- 一種惡性黑色瘤(黑色素瘤)之診斷套組,其包含下列組成物:(1)包含選自mAb2C11、mAb2E11、mAb2H10、mAb3E3、mAb3E10、mAb3E11、mAb4F5、mAb5E5、mAb7C8、mAb7G6、mAb10A4及mAbU3E所構成之群組之1種以上抗GPC3單株抗體的組成物,其中該等抗GPC3單株抗體係由選自於2012年4月23日分別以受託編號NITE P-1326、NITE P-1327、NITE BP-01328、NITE P-1329、NITE BP-01330、NITE BP-01331、NITE P-1332、NITE P-1333、NITE P-1334、NITE P-1335、NITE P-1336及NITE BP-01337寄存於日本國獨立行政法人製品評價技術基盤機構(NITE)專利微生物寄存中心(NPMD)之純系名2C11、2E11、2H10、3E3、3E10、3E11、4F5、5E5、7C8、7G6、10A4及U3E所構成之群組之1種以上之融合瘤所生產者;及(2)包含選自mAbS2F9、mAbS14A7、mAbS14C12、mAbS19B1、mAbS20D10、mAbS23C10、mAbS23E9及mAbS25H9所構成之群組之1種以上抗SPARC單株抗體的組成物,其中該等抗SPARC單株抗體係由選自於2012年4月23日分別以受託編號NITE BP-01338、NITE P-1339、NITE P-1340、NITE P-1341、NITE P-1342、NITE BP-01343、NITE P-1344及NITE BP-01345寄存於NPMD之純系名S2F9、S14A7、S14C12、S19B1、S20D10、 S23C10、S23E9及S25H9所構成之群組中之1種以上之融合瘤所生產者。
- 如申請專利範圍第1項所述之診斷套組,其中抗GPC3單株抗體係選自mAb2C11、mAb10A4、mAbU3E、mAb2H10、mAb3E3、mAb3E10及mAb3E11所構成之群組之1種以上抗體;抗SPARC單株抗體係選自mAbS2F9、mAbS14C12、mAbS23C10、mAbS23E9及mAbS25H9所構成之群組之1種以上抗體。
- 如申請專利範圍第1或2項所述之診斷套組,其中抗GPC3單株抗體係選自mAbU3E、mAb2H10、mAb3E10、mAb3E11及mAb3E3所構成之群組之1種以上抗體;抗SPARC單株抗體係選自mAbS23C10、mAbS2F9、mAbS25H9及mAbS23E9所構成之群組之1種以上抗體。
- 如申請專利範圍第1至3項中任一項所述之診斷套組,其係以ELISA套組之形式提供。
- 如申請專利範圍第4項所述之診斷套組,其係以三明治式ELISA套組之形式提供。
- 如申請專利範圍第5項所述之診斷套組,其中使用抗GPC3單株抗體之三明治式ELISA法中之捕獲抗體係選自mAb2C11、mAb2E11、mAb2H10、mAb3E3、mAb3E10、mAb3E11、mAb4F5、mAb5E5、mAb7C8、mAb7G6、mAb10A4及mAbU3E所構成之群組,而且檢測抗體係選自mAb2C11、mAb2E11、mAb2H10、mAb3E3、mAb3E10、mAb3E11、mAb4F5、mAb5E5、mAb7C8、mAb7G6、mAb10A4 及mAbU3E所構成之群組之1種以上抗體,但是任一者均與捕獲抗體相異;使用抗SPARC單株抗體之三明治式ELISA法中之捕獲抗體係選自mAbS2F9、mAbS14A7、mAbS14C12、mAbS19B1、mAbS20D10、mAbS23C10、mAbS23E9及mAbS25H9所構成之群組,而且檢測抗體係選自mAbS2F9、mAbS14A7、mAbS14C12、mAbS19B1、mAbS20D10、mAbS23C10、mAbS23E9及mAbS25H9所構成之群組之1種以上抗體,但是任一者均與捕獲抗體相異。
- 如申請專利範圍第5或6項所述之診斷套組,其中使用抗GPC3單株抗體之三明治式ELISA法中之捕獲抗體係選自mAb2C11、mAb10A4、mAbU3E及mAb3E11所構成之群組,而且檢測抗體係選自mAb2H10、mAb3E3及mAb3E10所構成之群組之1種以上抗體;使用抗SPARC單株抗體之三明治式ELISA法中之捕獲抗體係選自mAbS2F9、mAbS14C12及mAbS23C10所構成之群組,而且檢測抗體係選自mAbS2F9、mAbS23C10、mAbS23E9及mAbS25H9所構成之群組之1種以上抗體,但是任一者均與捕獲抗體相異。
- 如申請專利範圍第5至7項中任一項所述之診斷套組,其中使用抗GPC3單株抗體之三明治式ELISA法中之捕獲抗體為mAbU3E或mAb3E11;使用抗SPARC單株抗體之三明治式ELISA法中之捕獲抗體為mAbS23C10或mAbS2F9。
- 如申請專利範圍第5至8項中任一項所述之診斷套組,其中使用抗GPC3單株抗體之三明治式ELISA法中之捕獲抗體係mAbU3E或mAb3E11之任一者,而且檢測抗體係選自mAb2H10、mAb3E10及mAb3E3所構成之群組之1種以上抗體;使用抗SPARC單株抗體之三明治式ELISA法中之捕獲抗體係mAbS2F9或mAbS23C10之任一者,而且檢測抗體係選自mAbS2F9、mAbS23C10、mAbS25H9及mAbS23E9所構成之群組之1種以上抗體,但是任一者均與捕獲抗體相異。
- 如申請專利範圍第1至9項中任一項所述之診斷套組,其係針對受驗者之血液、血清或血漿樣本而使用。
- 如申請專利範圍第10項所述之診斷套組,其中受驗者為白色人種。
- 一種惡性黑色瘤(黑色素瘤)之檢測方法,其包含使下列組成物與來自受驗者之樣本接觸:(1)如申請專利範圍第1項中所記載之包含選自mAb2C11、mAb2E11、mAb2H10、mAb3E3、mAb3E10、mAb3E11、mAb4F5、mAb5E5、mAb7C8、mAb7G6、mAb10A4及mAbU3E所構成之群組之1種以上抗GPC3單株抗體的組成物,及(2)如申請專利範圍第1項中所記載之包含選自mAbS2F9、mAbS14A7、mAbS14C12、mAbS19B1、mAbS20D10、mAbS23C10、mAbS23E9及mAbS25H9所構成之群組之1種以上抗SPARC單株抗體的組成物。
- 如申請專利範圍第12項所述之檢測方法,其中該樣本為受驗者之血液、血清或血漿。
- 如申請專利範圍第13項所述之檢測方法,其中該受驗者為白色人種。
- 如申請專利範圍第12至14項中任一項所述之檢測方法,其係藉由ELISA法來進行。
- 如申請專利範圍第12項所述之檢測方法,其係藉由免疫染色法來進行。
- 一種抗GPC3單株抗體,其係選自如申請專利範圍第1項中所記載之mAb2C11、mAb2E11、mAb2H10、mAb3E3、mAb3E10、mAb3E11、mAb4F5、mAb5E5、mAb7C8、mAb7G6、mAb10A4及mAbU3E所構成之群組。
- 如申請專利範圍第17項所述之抗GPC3單株抗體,其係選自mAb2H10、mAb3E10、mAb3E11、mAbU3E及mAb3E3所構成之群組。
- 一種抗SPARC單株抗體,其係選自如申請專利範圍第1項中所記載之mAbS2F9、mAbS14A7、mAbS14C12、mAbS19B1、mAbS20D10、mAbS23C10、mAbS23E9及mAbS25H9所構成之群組。
- 如申請專利範圍第19項所述之抗SPARC單株抗體,其係選自mAbS2F9、mAbS23C10、mAbS25H9及mAbS23E9所構成之群組。
- 一種融合瘤,其係選自如申請專利範圍第1項中所記載之於2012年4月23日分別以受託編號NITE P-1326、 NITE P-1327、NITE BP-01328、NITE P-1329、NITE BP-01330、NITE BP-01331、NITE P-1332、NITE P-1333、NITE P-1334、NITE P-1335、NITE P-1336及NITE BP-01337寄存在NPMD之純系名2C11、2E11、2H10、3E3、3E10、3E11、4F5、5E5、7C8、7G6、10A4及U3E所構成之群組。
- 如申請專利範圍第21項所述之融合瘤,其係選自純系名2H10、3E10、3E11、U3E及3E3所構成之群組。
- 一種融合瘤,其係選自如申請專利範圍第1項中所記載之於2012年4月23日分別以受託編號NITE BP-01338、NITE P-1339、NITE P-1340、NITE P-1341、NITE P-1342、NITE BP-01343、NITE P-1344及NITE BP-01345寄存在NPMD之純系名S2F9、S14A7、S14C12、S19B1、S20D10、S23C10、S23E9及S25H9所構成之群組。
- 如申請專利範圍第23項所述之融合瘤,其係選自純系名S2F9、S23C10、S25H9及S23E9所構成之群組。
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