JPWO2009022632A1 - 新規肝癌マーカー - Google Patents
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Abstract
Description
Nakamura H. et al., JBC 269: 25143-25149 (1994) Nakamura H. et.al., Clin.Chim. Acta. 183: 273-284 (1989) Everett A.D. et al., J.Clin.Invest. 105: 567-575 (2000) Oliver J.A. et. al., J.Clin.Invest. 102: 1208-1210(1998)
本明細書において、ヒトHDGFは、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するものを意味する。
本発明肝癌検査方法につき、以下詳述する。
慢性肝疾患患者の中で、特に肝癌に進展しているかどうかの診断に用いることが出来る。ウイルス性肝炎、或いは肝硬変に罹患している患者においては、その進行の最終段階として、癌化を挙げることが出来る。慢性肝疾患を患っている患者が、現在自身の病状でどのステージに属するのかを知ることは、患者の精神状態或いは治療への意欲を考える上で重要である。
血液中のHDGF量を測定することにより、慢性肝疾患患者における肝癌の診断を行うことが出来る。即ち、ELISAキットおよびウエスタンブロッテイング法のための各種試薬を含めたキット組成物を提供することができる。特に、キット中には、HDGFに対する抗体を含む。キットには抗体の他に、BSAなどのアルブミン、2次抗体 、酵素の基質(標識として酵素を使用した場合)などが含まれる。例えば、認識抗体がビオチン標識抗体であれば、該測定キットには2次抗体としてペルオキシダーゼ標識アビジンを含み得る。また、該ペルオキシダーゼに対する基質等を含む肝癌診断キットが提供できる。
実施例1
HDGFのELISA測定システムの構築
モノクローナル抗体用抗原および標準品のためのHDGFの作製
まず、ヒトHDGF遺伝子は既に公知になっており、配列番号2に記載されている。常法に従ってクローニングを行った。即ち、ヒトKidney cDNAライブラリーを使ってHDGF遺伝子の開始コドンからストップコドンまでをPCR法で増幅した。Forward プライマーの5‘末端にはNdeIサイトを、Reverseプライマーの3’末端にはXhoIサイトを付加した。PCR産物をpCR-Bluntベクターにクローニングして、DNA配列を確認してHDGF cDNAを得た。
常法に従い、マウスに免疫し、目的の抗体を産生するハイブリドーマを選別した。
即ち、抗原溶液を等量のComplete Freund adjuvantと混合してエマルジョンを作製し免疫した。免疫は2週間おきに行い、5回まで免疫を行った。
HDGF抗原溶液をComplete Freund adjuvantと混合してエマルジョンを作製し,ウサギの背部皮内に1mLずつ多点免疫した。
HDGF ELISAはモノクローナル抗体OPM11617を0.1M NaCO3に5μg/mLに希釈し、各ウェルに固相化し、0.1%BSA/PBSでブロッキングした。1st Bufferに0.1%BSA/PBS/0.05% Tween-20を用い、あらかじめ96ウェルに入れた。標準HDGFの希釈は20mg/mLのBSA/PBSを用いて、20ng/mlから2倍で7段階希釈した各濃度標準品とBlankを検量線用とした。標準品及び検体を50μLをウェルに加え、一昼夜室温で反応させた。ウェルを洗浄後、0.1%BSA/PBS/0.05%Tween-20で40,000倍に希釈したC端抗体を100μL加えて、室温で2時間反応させた。更にプレートを洗浄し、10,000倍希釈したHRP標識アビジンを各ウェルに加え、室温で2時間反応させた。そして、プレートを洗浄してTMB溶液を加え、室温で10分間反応させた後、2N硫酸で停止させた。吸光度は450に設定して測定を行った。測定方法の手順を図1に示す。
慢性肝疾患患者血清中のHDGFの測定
肝癌(61人)、C型ウイルス性肝炎(61人)、B型ウイルス性肝炎(9人)、肝硬変(55人)、急性肝炎(3人)各患者の空腹時に採血し、血漿中のHDGF値を上記確立したELISAシステムを用いて測定した。その結果、肝癌血漿中にHDGFが有意に高値になることが分かった(図3、表1)。
Claims (6)
- 配列番号1に示すアミノ酸からなるヒトHDGF認識抗体と結合するヒトHDGF由来ポリペプチドである血中肝癌マーカー。
- 肝癌に罹患しているかどうかを検査する方法であって、被験者から採血する工程、及び、前記血液サンプルから請求項1記載の肝癌マーカーを検知する工程を含むことを特徴とする検査方法。
- 請求項2記載の検知工程が、免疫測定法によるものである検査方法。
- 請求項3記載の免疫測定法がELISAである検査方法。
- 請求項3記載の被験者が慢性肝疾患患者である検査方法。
- 少なくとも請求項1記載のマーカーを特異的に認識する抗体を構成要素として含む肝癌診断キット。
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