JPWO2009022632A1

JPWO2009022632A1 - 新規肝癌マーカー

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Publication number: JPWO2009022632A1
Application number: JP2009528108A
Authority: JP
Inventors: 秀次中村; 洋一藪内; 安一大本; 豊樹森; 正宏村口; 圭子大神; 房子岩田; 香村田
Original assignee: Hyogo College of Medicine; Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Hyogo College of Medicine; Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2007-08-10
Filing date: 2008-08-07
Publication date: 2010-11-18
Anticipated expiration: 2028-08-07
Also published as: EP2187216A4; EP2187216B1; US20110281284A1; WO2009022632A1; JP5553603B2; KR20100040964A; CN101796415B; EP2187216A1; ES2392312T3; CN101796415A

Abstract

本発明は、慢性肝疾患患者の血液中のHDGFを測定することにより、肝癌かどうかを診断する。または、該診断のための測定キットを提供する。

Description

本発明は、肝癌の腫瘍マーカー、肝癌の検査ないし診断方法に関する。また、本発明は、血液中のHDGF由来ポリペプチドを測定するための肝癌診断キットに関する。

肝癌由来増殖因子HDGFは、肝癌細胞株であるHuH-7の培養上清中から単離されたもので、すでにクローニングも完了しており、遺伝子配列が明らかになっている（非特許文献１）。また、その局在部位としては、核画分に存在し、肝癌細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、および血管内皮細胞に対して増殖促進効果を有することが知られている(非特許文献2-4)。また、HDGFは神経細胞においても核画分に局在しており、HDGFという名前とは裏腹に生体内に広く分布している。また、その栄養因子的作用から、神経疾患に対する治療・診断の可能性も考えられている。
Nakamura H. et al., JBC 269: 25143-25149 (1994) Nakamura H. et.al., Clin.Chim. Acta. 183: 273-284 (1989) Everett A.D. et al., J.Clin.Invest. 105: 567-575 (2000) Oliver J.A. et. al., J.Clin.Invest. 102: 1208-1210(1998)

本発明は、肝癌の簡便な検査ないし診断方法並びにその肝癌を診断するために必要な肝癌診断キットを提供することを目的とする。

本発明は、HDGFに対する抗体を作製し、これを基にHDGFの測定方法を構築した。また、当該測定方法により血液中においてHDGFが存在することを突き止め、特に慢性肝疾患を有する肝癌患者において有意に高値を示すことを見出した。

本発明は、肝癌患者の診断方法および診断用キットを提供する。

項1．配列番号1に示すアミノ酸からなるヒトHDGF認識抗体と結合するヒトHDGF由来ポリペプチドである血中肝癌マーカー。

項２．肝癌に罹患しているかどうかを検査する方法であって、被験者から採血する工程、及び、前記血液サンプルから請求項１記載の肝癌マーカーを検知する工程を含むことを特徴とする検査方法。

項３．項２記載の検知工程が、免疫測定法によるものである検査方法。

項４．項３記載の免疫測定法がELISAである検査方法。

項５．項３記載の被験者が慢性肝疾患患者である検査方法。

項６．少なくとも項１記載のマーカーを特異的に認識する抗体を構成要素として含む肝癌診断キット。

本発明により、慢性肝疾患患者における血液中のHDGFを測定することにより、肝癌の診断を行うことが可能になった。更に、肝癌診断キットの提供をも可能にした。

HDGF ELISA測定方法の手順を示す。 HDGFの標準曲線を示す図である。検出範囲は0.31〜20ng/mlである。各肝疾患患者の血液中のHDGF量（Plasma HDGF）を示したものである。

なお、HCCは肝癌、CHCはC型肝炎、CHBはB型肝炎、LCは肝硬変の各患者を示す。

肝疾患は、肝癌、B型ウイルス性肝炎、C型ウイルス性肝炎、肝硬変など種々の疾患が存在するが、肝細胞自体ダメージを受けるために、肝細胞内容物を血液中において測定することにより、肝臓疾患の可能性を判定できる可能性がある。例えばＧＯＴ、ＧＰＴはいずれも肝細胞の中で活動する酵素であり、肝炎などにより肝細胞が破壊されると血液中にＧＯＴ、ＧＰＴが漏れ出すため、血中のＧＯＴ、ＧＰＴは、肝臓の障害の程度を知るための指標として用いられている。このＧＯＴ、ＧＰＴは、急性肝炎、慢性肝炎などの肝細胞が破壊される疾患においては有力な指標であるが、肝細胞の破壊が重要でない肝癌の指標にはならない。

ＨＤＧＦは、核画分に存在し、細胞が破壊されて初めて血液中に放出されると予測されるため、ＧＯＴ、ＧＰＴと同様なマーカーであると予測されるが、意外にもＧＯＴ、ＧＰＴとは異なり肝癌の特異的なマーカーとなることを本発明者が見出した。

肝癌マーカー
本明細書において、ヒトHDGFは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するものを意味する。

ヒトHDGF認識抗体は、ヒトHDGFを認識する限り、HDGFが分解されて生じた部分ペプチドを認識する抗体を包含する。抗体はモノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよく、抗原と結合できる限り抗体のフラグメントであってもよい。抗体のフラグメントとして、scFv、Fab、F(ab)₂、Fvなどが挙げられる。

本明細書において、「ヒトHDGF由来ポリペプチド」には、ヒトHDGF自体を含むだけでなく、ヒトHDGFが生体内でメチル化、アミド化、アセチル化などの修飾を受けたものや、ヒトHDGFが酵素的又は化学的に分解（特に加水分解）を受けて短くなったポリペプチドであって、抗ヒトHDGF抗体により認識可能な（エピトープを含む）ポリペプチドが広く含まれる。

本発明の肝癌マーカーは、ヒトHDGF由来ポリペプチドを包含する。ヒトHDGF由来ポリペプチドは、肝癌患者の血液中で高値を示す。肝癌マーカーを測定するためのサンプルは、血液、血漿、血清を含む。

本発明の肝癌マーカーは、従来から知られている他の肝癌マーカー、例えば、胎児期に肝およびヨークザックにおいて産生される蛋白で、肝細胞癌患者の約80％にて上昇が認められるAFP（α-フェトプロテイン）との組み合わせにより、より精度の高い癌マーカーとしての利用が期待できる。

検査方法
本発明肝癌検査方法につき、以下詳述する。

本検査方法は採血と肝癌マーカーの検知の２つの工程から構成されている。先ず、測定試料は血液であり、血清の状態でも血漿の状態でもいずれでも良い。また、採血に特に制限はないが、好適には空腹時が望ましい。

肝癌マーカーの検知ないし測定方法としては、特に制限はなく、血液中に存在するHDGF由来ポリペプチドを測定できる方法であれば特に制限はない。汎用されている生化学的手法、特に免疫学的原理を利用した手法を好適な例として挙げることができる。例えば、ELISA,ウエスタンブロッテイング法および、ラジオイムノアッセイ法（RIA）などの測定対象物に対する抗体を利用した手法を好適な例として挙げることができる。更に、抗体を使用する場合であれば、モノクローナル抗体および、ポリクローナル抗体のいずれでもよい。或いは、アプタマーのような核酸由来成分で測定対象物に対して親和性を有する分子を使用することができる。さらに、サンプル中に夾雑物質が混在している場合は目的分子をまず精製するか夾雑物質の影響を無くする程度まで純度を上げた後、測定に供することができる。例えば、精製手法としては、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニテイークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、各種電気泳動、硫安沈殿、有機溶媒による沈殿法、等電点沈殿法などを状況に従い使用できるが、もちろん一例として挙げたのであり、精製方法としてはこれらの方法に限定されるものではない。

ELISA測定方法は、HDGF測定用ELISAキットの作製の場合、直接法およびサンドイッチ法いずれでも良く、常法に従い測定を行うことができる。また、この場合モノクローナル抗体を用いてもポリクローナル抗体を用いてもいずれでも良い。例えば、サンドイッチ法の場合であれば、通常96穴プレートに対して、一次抗体（抗HDGF抗体）をプレートに固相化しておき、生体由来試料（血液、血清、或いは血漿）或いは、必要に応じて、適当な緩衝液に希釈したものを添加し一定時間抗体と接触させることにより結合させる。その後、適当な緩衝液で洗浄を行った後、標識２次抗体（標識抗HDGF抗体）を反応させる。例えば、標識体がビオチンであればアビジン（或いはストレプトアビジン）標識ペルオキシダーゼを反応させ、適当な反応基質（例えばTBM）を作用させることにより発色させる。一定時間後、所定の波長この場合であれば450 nmで測定することにより、比色定量を行う。アビジン標識抗体にペルオキシダーゼ（HRP）やアルカリホスファターゼ、酸ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼおよびチロシナーゼ標識などが考えられる。基質としては、市販で一般に使用されているものであれば特に制限はない。

また、免疫学的測定方法として、他にはウエスタンブロッテイング法を使用することもできる。本法は、電気泳動例えばSDS-PAGE、PAGE、等電点電気泳動或いはろ紙電気泳動などを代表とする電気泳動法を行った後、例えばニトロセルロース膜、PVDF膜など転写可能な膜に転写し、測定対象分子に対する一次抗体で処理後、色素粒子などの標識抗体を結合させた2次抗体を使用し、或いは酵素標識の場合は処理後基質処理を行うことにより可視化させることが可能である。標識抗体としては、ビオチン標識抗体、これに対してアビジン又はストレプトアビジン、或いは、２次抗体にペルオキシダーゼ（HRP）やアルカリホスファターゼ、酸ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼおよびチロシナーゼ標識などが挙げられる。基質としては、市販で一般に使用されているものであれば特に制限はない。

また、測定に用いる抗体の取得に関しては、常法に従い取得することができる。例えば、ポリクローナル抗体を作製する場合は、ウサギ、ヒツジ、モルモット、ニワトリのような温血動物に、上記目的抗原（ヒトHDGFまたはその部分ペプチドないし部分ポリペプチド）を通常、フロイントの完全アジュバントと混和して調製した乳化物を、複数回免疫し、得られる抗血清を常法に従い取得することが可能である。また、ニワトリの場合には、上記免疫抗原を複数回免疫して、該ニワトリが産卵する鶏卵にIgYを産生させ、そして該鶏卵の卵黄より、常法に従いIgYを取得することができる。

また、抗体はモノクローナル抗体として取得することもできる。該モノクローナル抗体は、例えば上記免疫抗原をフロイントの完全アジュバントとともにマウスに複数回免疫し、抗体を産生させるとともに、例えば細胞融合法などの常法に従い、得られる抗体産生細胞を分離し、該細胞の培養により取得することができる。このようにして得られた抗体は、さらに必要に応じて硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニテイークロマトグラフィー等の常法に従ってさらに精製することが可能である。

診断対象となる疾患及び被験者
慢性肝疾患患者の中で、特に肝癌に進展しているかどうかの診断に用いることが出来る。ウイルス性肝炎、或いは肝硬変に罹患している患者においては、その進行の最終段階として、癌化を挙げることが出来る。慢性肝疾患を患っている患者が、現在自身の病状でどのステージに属するのかを知ることは、患者の精神状態或いは治療への意欲を考える上で重要である。

診断キット
血液中のHDGF量を測定することにより、慢性肝疾患患者における肝癌の診断を行うことが出来る。即ち、ELISAキットおよびウエスタンブロッテイング法のための各種試薬を含めたキット組成物を提供することができる。特に、キット中には、HDGFに対する抗体を含む。キットには抗体の他に、BSAなどのアルブミン、２次抗体、酵素の基質（標識として酵素を使用した場合）などが含まれる。例えば、認識抗体がビオチン標識抗体であれば、該測定キットには２次抗体としてペルオキシダーゼ標識アビジンを含み得る。また、該ペルオキシダーゼに対する基質等を含む肝癌診断キットが提供できる。

以下本発明の内容を具体的に実施例で示すが、本発明内容は、以下の実施例に限定されるものではない。
実施例１
HDGFのELISA測定システムの構築
モノクローナル抗体用抗原および標準品のためのHDGFの作製
まず、ヒトHDGF遺伝子は既に公知になっており、配列番号2に記載されている。常法に従ってクローニングを行った。即ち、ヒトKidney ｃDNAライブラリーを使ってHDGF遺伝子の開始コドンからストップコドンまでをPCR法で増幅した。Forward プライマーの5‘末端にはNdeIサイトを、Reverseプライマーの3’末端にはXhoIサイトを付加した。PCR産物をｐCR-Bluntベクターにクローニングして、DNA配列を確認してHDGF cDNAを得た。

次いで、pSecTag2 ベクターに本HDGFcDNA及びHisTagリンカーをインサートし、発現ベクター（ｐSecTag2HDGF）を作製した。更に、得られた発現ベクター（ｐSecTag2A-HDGF）をCHO−K1 細胞に導入し、Zeocin添加培地で限界希釈培養することにより、耐性クローンを作製した。また、培養上清中にHDGFの存在を確認した。

その後、HDGF高産生クローン(CHO/HDGFクローン4)を大量培養し、培養上清を集め、抗原用HDGFの精製を行った。

つまり、Ni Resin カラムクロマトグラフィー、Heparin-SepharoseカラムクロマトグラフィーおよびResource Q カラムHPLCにより精製を行い免疫原および標準品とした。

マウスモノクロナール抗体の作製
常法に従い、マウスに免疫し、目的の抗体を産生するハイブリドーマを選別した。
即ち、抗原溶液を等量のComplete Freund adjuvantと混合してエマルジョンを作製し免疫した。免疫は2週間おきに行い、5回まで免疫を行った。

次いで、免疫マウスから脾細胞を調製し、予め調製しておいたミエローマ細胞P3U1に対し、5：1ないし2：1になるようにP3U1を混合した。遠心分離後、細胞沈渣にPEG SOLUTIONをよく撹拌しながら加え、均一にした後静置し、遠心後、上清を捨て、沈渣を100mlのHAT添加10%FCS/RPMI1640に懸濁させ、24ウエル培養用プレート(costar)に1ml/wellずつまいて37℃、5%CO₂で培養することにより細胞融合させた。

陽性ハイブリドーマのクローニングは以下のように行った。

細胞融合の1週間から10日後、各ウエルから培養上清を取り、抗体のスクリーニングを行った。HDGF抗原を固相化した96ウエルプレート(NUNC)に培養上清を反応させ、ELISAで抗体の有無をチェックした。

腹水の作成に関しては、マウスに対して予め細胞投与の3日以上前に0.5ml/bodyのプリスタン(2,6,10,14-テトラメチルペンタデカン)を腹腔内投与しておき、ハイブリドーマ細胞を1.5mlのPBSに懸濁して0.5mlずつマウス3匹に腹腔内投与した。細胞を投与したマウスの腹部が最も大きくなった頃に腹水を採取した。

腹水からモノクローナル抗体の精製と濃度検定は、Protein-Aカラムにアプライすることにより精製し、SDS-PAGEで純度を確認した。

ウサギポリクローナル抗体の作製
HDGF抗原溶液をComplete Freund adjuvantと混合してエマルジョンを作製し，ウサギの背部皮内に1mLずつ多点免疫した。

免疫は2週間おきに行い、3回免疫の1週間後に耳朶より部分採血を行い，血清の抗体価をELISAでチェックし、更に4回免疫を行った。最終免疫1週間後に全採血を頚動脈より行い（ヘパリン採血）、遠心分離して血漿を得た。

なお、C末端ペプチドを抗原としたポリクローナル抗体の作製は、C末端ペプチド（N末端から231-240番目のアミノ酸）のN末端にCysを加えたペプチドを合成し、精製した後、KLHにカップリングさせ抗原（KLH-C-APGIRDHESL）とした。

ELISA法の確立
HDGF ELISAはモノクローナル抗体OPM11617を0.1M NaCO₃に5μg/mLに希釈し、各ウェルに固相化し、0.1％BSA/PBSでブロッキングした。1st Bufferに0.1％BSA/PBS/0.05% Tween-20を用い、あらかじめ96ウェルに入れた。標準HDGFの希釈は20mg/mLのBSA/PBSを用いて、20ng/mlから2倍で7段階希釈した各濃度標準品とBlankを検量線用とした。標準品及び検体を50μLをウェルに加え、一昼夜室温で反応させた。ウェルを洗浄後、0.1%BSA/PBS/0.05%Tween-20で40,000倍に希釈したC端抗体を100μL加えて、室温で2時間反応させた。更にプレートを洗浄し、10,000倍希釈したHRP標識アビジンを各ウェルに加え、室温で2時間反応させた。そして、プレートを洗浄してTMB溶液を加え、室温で10分間反応させた後、2N硫酸で停止させた。吸光度は450に設定して測定を行った。測定方法の手順を図１に示す。

また、HDGFの検量線を図2に示した。測定レンジは0.31ng/mlから20ng/mLで細胞培養液中のHDGFが測定可能になった。
慢性肝疾患患者血清中のHDGFの測定
肝癌(61人)、C型ウイルス性肝炎(61人)、B型ウイルス性肝炎(9人)、肝硬変(55人)、急性肝炎(3人)各患者の空腹時に採血し、血漿中のHDGF値を上記確立したELISAシステムを用いて測定した。その結果、肝癌血漿中にHDGFが有意に高値になることが分かった（図３、表１）。

Claims

配列番号1に示すアミノ酸からなるヒトHDGF認識抗体と結合するヒトHDGF由来ポリペプチドである血中肝癌マーカー。
肝癌に罹患しているかどうかを検査する方法であって、被験者から採血する工程、及び、前記血液サンプルから請求項１記載の肝癌マーカーを検知する工程を含むことを特徴とする検査方法。
請求項２記載の検知工程が、免疫測定法によるものである検査方法。
請求項３記載の免疫測定法がELISAである検査方法。
請求項３記載の被験者が慢性肝疾患患者である検査方法。
少なくとも請求項１記載のマーカーを特異的に認識する抗体を構成要素として含む肝癌診断キット。