CN103245787B - 一种肝癌衍生生长因子检测试剂盒的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种肝癌衍生生长因子检测试剂盒的制备方法，包括构建肝癌衍生生长因子HDGF蛋白的表达载体；表达HDGF蛋白原核细胞；产生抗HDGF抗体并纯化；制备时间分辨荧光试剂盒。肝癌衍生生长因子检测试剂盒包括兔抗HDGF多克隆抗体及用镧族金属元素Eu标记的鼠抗HDGF单克隆抗体，其中，鼠抗HDGF单克隆抗体作为二抗。采用本发明的肝癌衍生生长因子检测试剂盒的制备方法，制备简便、操作流程短，检测重复性好、灵敏度高、无放射性。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测用的试剂盒的制备方法，尤其涉及一种用于肝癌衍生生长因子HDGF检测的检测试剂盒的制备方法。
背景技术
肝癌衍生生长因子HDGF具有促进细胞增殖、分化，组织器官生长发育，损伤后组织修复等功能，参与体内多种生理病理过程。HDGF能促进胎肝细胞增殖，参与胎肝发育过程中肝细胞生长发育调控。在大鼠颈动脉气囊扩张损伤模型中，损伤后的动脉新生内膜及肌层HDGF表达明显增高，HDGF参与血管损伤后新生内膜形成中血管平滑肌细胞的增殖与迁移反应。
我们研究胃上皮细胞癌HDGF表达时发现，HDGF核标记指数HDGF-LI在胃癌前病变，如肠上皮化生和不典型增生，发展过程中逐渐增加，如肠上皮化生和不典型增生。胃癌早期继续增加，在进展期胃癌表达水平更高，提示HDGF参与胃癌的形成。胃癌UICCI期患者HDGF-LI低于UICCII、III、IV期患者，无淋巴转移NO患者HDGF-LI低于淋巴结转移N1、N2、N3患者，浸润黏膜及粘膜下层肿瘤相对于侵袭浆膜层肿瘤HDGF-LI低，提示HDGF表达水平与胃癌分期、胃癌淋巴结转移及侵袭深度相关。HDGF与肿瘤发生、发展有关，在肿瘤组织中表达增加，HDGF与肿瘤患者预后相关，有望成为肿瘤诊断新的分子标志物及潜在治疗靶点。
HDGF现有检测方法主要有免疫组化和ELISA法，但是免疫组化是半定量的蛋白检测方法，且检测过程繁琐；而ELISA法的检测灵敏度和重复性均较差。
有鉴于此，制备一种检测过程简单，灵敏度高、重复性好的肝癌衍生生长因子检测试剂盒成为提高HDGF检测质量和效率的一项重要研究课题。
发明内容
本发明的目的是针对现有的免疫组化和ELISA法检测过程繁琐，灵敏度不高，重复性较差的问题，提供一种肝癌衍生生长因子检测试剂盒的制备方法。
本发明的提供了一种肝癌衍生生长因子检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
a)构建肝癌衍生生长因子HDGF蛋白的表达载体，用聚合酶链式反应技术直接从体外培养细胞株中将HDGF克隆至pET28表达载体；
b)表达HDGF蛋白原核细胞，用His金属镍IDA螯合树脂柱纯化HDGF蛋白，用Thrombin酶切除His-tag标签，得到HDGF蛋白；
c)产生抗HDGF抗体并纯化，将已切除标签的HDGF作为抗原免疫大白兔和大鼠，产生HDGF抗体，收集血清，用硫酸铵沉淀、透析、protein-A-Sepharose亲和柱纯化兔抗HDGF多克隆抗体和鼠抗HDGF单克隆抗体；
d)制备时间分辨荧光试剂盒，在固相上结合兔抗HDGF多克隆抗体，鼠抗HDGF单克隆抗体作为二抗，镧族金属元素Eu络合生物素形成复合物并标记二抗。
优选的，肝癌衍生生长因子检测试剂盒包括兔抗HDGF多克隆抗体及用镧族金属元素Eu标记的鼠抗HDGF单克隆抗体，其中，鼠抗HDGF单克隆抗体作为二抗；肝癌衍生生长因子检测试剂盒用于肝癌衍生生长因子HDGF的检测；肝癌衍生生长因子检测试剂盒的检测成分为患者血液或者血浆成分。
优选地，肝癌衍生生长因子检测试剂盒中用镧族金属元素Eu标记的鼠抗HDGF单克隆抗体是通过下述方法制备的：
a)构建肝癌衍生生长因子HDGF蛋白的表达载体；
b)表达HDGF蛋白原核细胞并纯化HDGF蛋白；
c)产生鼠抗HDGF单克隆抗体并纯化；
d)用镧族金属元素Eu络合生物素形成的复合物标记二抗。
优选地，其中步骤d)采用稀释缓冲液稀释所述鼠抗HDGF单克隆抗体并涂布于固相上，35～39℃孵育2h，孵育后，用洗涤缓冲液洗涤所述固相表面数次；生物素与镧族金属离子Eu的盐溶液混合，形成荧光性络合部分；用所述稀释缓冲液稀释络合的结合物后涂布于所述固相上，35～39℃孵育2h，孵育后，用所述洗涤缓冲液洗涤所述固相表面数次。
优选地，肝癌衍生生长因子检测试剂盒的制备方法中步骤d)将用含NaCL的磷酸盐缓冲液稀释一抗溶液并将其涂布到固相上，2～6℃孵育20h以上，将所述一抗固定到所述固相上；用洗涤缓冲液洗涤涂布了所述一抗的所述固相表面；洗涤后将所述固相保存于-20℃，直至需要进行测定之前；预先用稀释缓冲液对血液样本进行稀释，涂布于所述固相上，35～39℃孵育2h，孵育后，用所述洗涤缓冲液洗涤所述固相表面数次，接着用所述稀释缓冲液稀释的所述鼠抗HDGF单克隆抗体涂布于所述固相上，35～39℃孵育2h，孵育后，用所述洗涤缓冲液洗涤所述固相表面数次；生物素与镧族金属离子Eu的盐溶液混合，形成荧光性络合部分；用所述稀释缓冲液稀释络合的结合物后涂布于所述固相上，35～39℃孵育2h，孵育后，用所述洗涤缓冲液洗涤所述固相表面数次；将所述镧族金属元素Eu络合生物素形成的复合物进行固相或液相的时间分辨荧光测定；测定条件为延迟时间为0.2～0.3ms，窗口时间为0.2～0.6ms，闪烁速度为0.5～1.5ms，激发波长为337.1nm测定波长为615nm。
优选地，肝癌衍生生长因子检测试剂盒制备中采用的稀释缓冲液为三羟甲基氨基甲烷Tris和HCL构成的弱碱性缓冲液，即Tris-HCL，pH为7.5～8.0，浓度为0.025～0.075M。
优选地，稀释缓冲液还包括牛血清白蛋白BSA和NaCL，其中，所述BSA的浓度为0.15％～0.25％，所述NaCL的浓度为0.6％～1.2％；所述稀释缓冲液的稀释倍数，即体液样本与缓冲液比例为1∶5～1∶15。
优选地，肝癌衍生生长因子检测试剂盒制备中采用的洗涤缓冲液为由Tris和HCL构成弱碱性缓冲液，即Tris-HCL，含有非离子表面活化剂，该非离子表面活化剂为聚氧乙烯山梨糖醇酐酸酯。
本发明的其它方面，所述技术领域的人员可根据现有技术得知。
本发明的测定原理：利用聚合酶链式反应技术直接从体外培养的细胞株中将HDGF序列克隆至原核表达载体，通过大肠杆菌表达HDGF重组蛋白，对重组蛋白进行过柱和蛋白标签切除处理后获得高纯度的HDGF蛋白。再将该HDGF蛋白免疫大白兔及大鼠，获得抗HDGF特异性的抗血清，进行ProteinA亲和层析获得高纯度、高活性的HDGF兔多克隆抗体和HDGF鼠单克隆抗体。在固相上包被兔抗HDGF多克隆抗体，鼠抗HDGF单克隆抗体作为二抗，镧族金属元素络合生物素形成复合物标记二抗，制备时间分辨荧光试剂盒。
本发明的有益效果在于：
1)肝癌衍生生长因子是HDGF相关蛋白质家族第一个被发现的成员，具有促进细胞增殖、分化，组织器官生长发育，损伤后组织修复等功能。HDGF广泛参与体内生理病理过程，深入研究HDGF，可以解释众多疾病的发生发展；
2)HDGF具有增加肿瘤细胞增殖和抑制肿瘤细胞凋亡的功能，HDGF表达水平与肿瘤分期、淋巴结转移及侵袭深度相关，HDGF参与与肿瘤发生、发展，在肿瘤组织中表达增加，与肿瘤患者预后相关，有望成为肿瘤诊断新的分子标志物及潜在治疗靶点。肝癌衍生生长因子(HDGF)时间分辨荧光分析法(TRFIA)检测试剂盒是研究肿瘤基因表达改变、肿瘤转移及预测肿瘤患者预后的重要手段。
附图说明
读者在参照附图阅读了本发明的具体实施方式之后，将会更清楚地了解本发明的各个方面。其中，
图1示出了依据本发明，肝癌衍生生长因子检测试剂盒的制备方法流程图；
图2示出了依据本发明，肝癌衍生生长因子检测试剂盒的制备中表达HDGF蛋白原核细胞及纯化HDGF蛋白的方法流程图；
图3示出了依据本发明，肝癌衍生生长因子检测试剂盒的制备中产生抗HDGF抗体及纯化的方法流程图。
具体实施方式
为了更清楚地理解本发明的技术内容，下面参照附图，对本发明的实施方式作进一步的详细描述。
本发明提供了一种利用时间分辨荧光分析法TRFIA检测肝癌衍生生长因子HDGF的试剂盒，包括兔抗HDGF多克隆抗体及用镧族金属元素Eu标记的鼠抗HDGF单克隆抗体，其中，鼠抗HDGF单克隆抗体作为二抗。本发明还提供了一种利用时间分辨荧光分析法TRFIA检测肝癌衍生生长因子HDGF试剂盒的制备方法。
图1示出了肝癌衍生生长因子检测试剂盒的制备方法流程图。参照图1，本发明采用的肝癌衍生生长因子检测试剂盒的制备方法，包括构建肝癌衍生生长因子HDGF蛋白的表达载体，表达HDGF蛋白原核细胞并纯化HDGF蛋白，产生抗HDGF抗体并纯化，以及制备时间分辨荧光试剂盒。
实施例1
构建肝癌衍生生长因子HDGF蛋白的表达载体。
采用聚合酶链式反应技术直接从体外培养细胞株中将HDGF克隆至pET28表达载体，在本实施例的一个方面，将1×105人胃上皮细胞癌AGS细胞离心沉淀，加入0.5mlTrizol提取总RNA，再用逆转录试剂逆转录RNA至cDNA，然后设计上游引物包含BamHI内切酶位点GGATCC，通过聚合酶链式反应技术直接将HDGF序列克隆至pET28BamHI位点，经BamHI单酶切鉴定合格后，DNA测序检验，合格即为HDGF/pET28表达载体。
在本实施例的另一方面，我们将1×107人胃上皮细胞癌AGS细胞离心沉淀，加入1.5mlTrizol提取总RNA，再用逆转录试剂逆转录RNA至cDNA，然后设计上游引物包含BamHI内切酶位点GGATCC，通过聚合酶链式反应技术直接将HDGF序列克隆至pET28BamHI位点，经BamHI单酶切鉴定合格后，DNA测序检验，合格即为HDGF/pET28表达载体。
实施例2
进行HDGF蛋白原核细胞表达及蛋白纯化。
图2示出了依据本发明，肝癌衍生生长因子检测试剂盒的制备中表达HDGF蛋白原核细胞及纯化HDGF蛋白的方法流程图。参照图2，将HDGF/pET28表达载体转化BL21DE3大肠杆菌，建立HDGF蛋白的原核细胞表达系统，用His金属镍IDA螯合树脂柱纯化HDGF蛋白，用Thrombin酶切除His-tag标签，得到HDGF蛋白。在本实施例的一个方面，取1ul鉴定合格的HDGF/Pet28重组质粒加至50ul感受态BL21DE3pLysS大肠杆菌，冰浴30min，42℃60min，加入500mlLB液，37℃30min，涂布LB平板，37℃培养过夜，接种2000mlLB液，37℃扩大培养2h，加入终浓度为4mM的IPTG诱导1h，离心收集细菌沉淀。
将细菌沉淀以每克湿重细菌加入1mlpH7.4，含1％Triton，0.5mg/mlLysome，1u/mlBenezonase0.05M的磷酸盐缓冲液，重悬细菌，冰浴下超声粉碎细菌，高速冷冻离心取上清，沉淀继续超声粉碎，高速冷冻离心，合并上清液。将上清上His金属镍IDA螯合树脂柱，用含5mM咪唑的pH7.4，0.05M的磷酸盐缓冲液充分洗柱，用含5％的硫柳汞检测至无蛋白流出为止，改用含10mM咪唑，300mMNacl，pH8.0，0.05M的磷酸盐缓冲液洗脱，收集流出的蛋白液，装入透析袋，2～8℃，pH8.0，0.05M的磷酸盐缓冲液透析除盐，每个6h换液1次，共3次。在透析平衡结束后，用MW10000的聚乙二醇浓缩至0.5mg/ml，取5mg重组蛋白用Thrombin酶切除N段His-tag标签，同时加入Avidin-agarose去除Thrombin蛋白，得到纯化的HDGF蛋白，该蛋白用SDS-PAGE电泳时，70ug/lane应无杂蛋白区带发现。
在本实施例的另一方面，取3ul鉴定合格的HDGF/Pet28重组质粒加至50ul感受态BL21DE30大肠杆菌，冰浴30min，42℃60min，加入500mlLB液，37℃90min，涂布LB平板，37℃培养过夜，接种4000mlLB液，37℃扩大培养8h，加入终浓度为4mM的IPTG诱导6h，离心收集细菌沉淀。
将细菌沉淀以每克湿重细菌加入5mlpH7.4，含1％Triton，0.5mg/mlLysome，1u/mlBenezonase0.05M的磷酸盐缓冲液，重悬细菌，冰浴下超声粉碎细菌，高速冷冻离心取上清，沉淀继续超声粉碎，高速冷冻离心，合并上清液。将上清上His金属镍IDA螯合树脂柱，用含5mM咪唑的pH7.4，0.05M的磷酸盐缓冲液充分洗柱，用含5％的硫柳汞检测至无蛋白流出为止，改用含10mM咪唑，300mMNacl，pH8.0，0.05M的磷酸盐缓冲液洗脱，收集流出的蛋白液，装入透析袋，8℃，pH8，0.05M的磷酸盐缓冲液透析除盐，每个6h换液1次，共6次。在透析平衡结束后，用MW30000的聚乙二醇浓缩至1.5mg/ml，取10mg重组蛋白用Thrombin酶切除N段His-tag标签，同时加入Avidin-agarose去除Thrombin蛋白，得到纯化的HDGF蛋白，该蛋白用SDS-PAGE电泳时，70ug/lane应无杂蛋白区带发现。
实施例3
产生抗HDGF抗体并纯化。
图3示出了依据本发明，肝癌衍生生长因子检测试剂盒的制备中产生抗HDGF抗体及纯化的方法流程图。参照图3，将已切除标签的HDGF作为抗原免疫大白兔和大鼠，产生HDGF抗体，收集血清，用硫酸铵沉淀、透析、protein-A-Sepharose亲和柱纯化兔抗HDGF多克隆抗体和鼠抗HDGF单克隆抗体。在本实施例的一个方面，分别取1mg的HDGF蛋白与完全福式佐剂混匀，充分乳化，接种大白兔和大鼠20余点，每个5天强化免疫1次，待3后，用0.5mgHDGF蛋白进行直接的兔静脉内注射和鼠尾静脉内注射，5天后，分离大鼠颈总动脉，剪断放血至三角烧瓶，2℃倾斜放置过夜，次日离心收集血清。
将收集的血清用2倍预冷的0.01M，pH7.4PBS稀释，在不断搅拌的同时缓慢加入等体积的饱和(NH4)2SO4，4℃放置30min，离心弃上清，沉淀用1倍原体积的PBS复容后，再分别用1/2体积的饱和(NH4)2SO4重复沉淀1次，最后沉淀用2mlPBS复容，装入透析袋，2℃对0.01M，pH7.4PBS透析除盐，每隔6h换液1次，共3次，在透析平衡结束后，蛋白液13000rpm4℃离心15min，取上清液，加至0.01M，pH7.4PBS平衡的ProteinA-Sepharose柱，流速0.5ml/min，流尽后，用0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液充分洗柱至无蛋白流出为止，改用0.1M，pH2.8甘氨酸盐酸缓冲液洗脱结合的IgG，合并洗脱液，2℃，pH7.4，0.01M的磷酸盐缓冲液透析除盐，每隔6h换液1次，共3次，用MW10000的聚乙二醇浓缩至0.5mg/ml，分装，-20℃储存。
在本实施例的另一方面，分别取1mg的HDGF蛋白与完全福式佐剂混匀，充分乳化，接种大白兔和大鼠20余点，每个12天强化免疫1次，待4后，用1.5mgHDGF蛋白进行直接的兔静脉内注射和鼠尾静脉内注射，7天后，分离大鼠颈总动脉，剪断放血至三角烧瓶，8℃倾斜放置过夜，次日离心收集血清。
将收集的血清用6倍预冷的0.01M，pH7.4PB稀释，在不断搅拌的同时缓慢加入等体积的饱和(NH4)2SO4，4℃放置30min，离心弃上清，沉淀用1倍原体积的PBS复容后，再分别用1/2体积的饱和(NH4)2SO4重复沉淀1次，最后沉淀用3mlPBS复容，装入透析袋，8℃对0.01M，pH7.4PBS透析除盐，每隔6h换液1次，共9次，在透析平衡结束后，蛋白液13000rpm4℃离心15min，取上清液，加至0.01M，pH7.4PBS平衡的ProteinA-Sepharose柱，流速0.5ml/min，流尽后，用0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液充分洗柱至无蛋白流出为止，改用0.1M，pH2.8甘氨酸盐酸缓冲液洗脱结合的IgG，合并洗脱液，8℃，pH7.4、0.01M的磷酸盐缓冲液透析除盐，每隔6h换液1次，共6次，用MW30000的聚乙二醇浓缩至1.5mg/ml，分装，-20℃储存。
实施例4
制备时间分辨荧光试剂盒。
在固相上结合兔抗HDGF多克隆抗体，鼠抗HDGF单克隆抗体作为二抗，镧族金属元素Eu络合生物素形成复合物并标记二抗，制备时间分辨荧光试剂盒。将用含适量NaCL的磷酸盐缓冲液稀释一抗溶液并将其涂布到固相上，采用96孔微量滴度板，2℃孵育20h以上，将一抗固定到固相。用洗涤缓冲液洗涤涂布了一抗的固相表面。洗涤后将固相保存于-20℃，直至需要进行测定之前。预先用稀释缓冲液对血液样本进行稀释。涂布于固相上，35℃孵育2h，孵育后，用洗涤缓冲液洗涤固相表面数次。接着用缓冲液稀释的鼠单克隆抗体涂布于固相上，35℃孵育2h，孵育后，用洗涤缓冲液洗涤固相表面数次。生物素与镧族金属离子Eu的盐溶液混合，形成荧光性络合部分。用稀释液稀释络合的结合物后涂布于固相上，35℃孵育2h，孵育后，用洗涤缓冲液洗涤固相表面数次。将由上述步骤得到的含镧族元素Eu的复合物进行固相或液相的时间分辨荧光测定。测定条件为延迟时间约为0.2毫秒ms，窗口时间约为0.2ms，闪烁速度flashrate约为0.5ms，激发波长为337.1nm测定波长为615nm。
在本实施例的另一方面，将用含适量NaCL的磷酸盐缓冲液稀释一抗溶液并将其涂布到固相上，采用96孔微量滴度板，6℃孵育20h以上，将一抗固定到固相。用洗涤缓冲液洗涤涂布了一抗的固相表面。洗涤后将固相保存于-20℃，直至需要进行测定之前。预先用稀释缓冲液对血液样本进行稀释。涂布于固相上，39℃孵育2h，孵育后，用洗涤缓冲液洗涤固相表面数次。接着用缓冲液稀释的鼠单克隆抗体涂布于固相上，39℃孵育2h，孵育后，用洗涤缓冲液洗涤固相表面数次。生物素与镧族金属离子Eu的盐溶液混合，形成荧光性络合部分。用稀释液稀释络合的结合物后涂布于固相上，39℃孵育2h，孵育后，用洗涤缓冲液洗涤固相表面数次。将由上述步骤得到的含镧族元素Eu的复合物进行固相或液相的时间分辨荧光测定。测定条件为延迟时间约为0.3毫秒ms，窗口时间约为0.6ms，闪烁速度flashrate约为1.5ms，激发波长为337.1nm测定波长为615nm。
因此，籍由本发明涉及的肝癌衍生生长因子检测试剂盒及其制备方法，可以有效解决其它检测方法检测过程繁琐，检测灵敏度和重复性差的问题，制备简便，操作流程短，检测重复性好、灵敏度高，无放射性。
上文中描述了本发明的具体实施方式。但是，在本领域中的普通技术人员能够理解，不偏离本发明的精神和范围的情况下，还可以对本发明的具体实施方式作各种变更和替换。这些变更和替换都落在本发明权利要求书限定的范围内。
Claims (8)
1.一种肝癌衍生生长因子检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a)构建肝癌衍生生长因子HDGF蛋白的表达载体，用聚合酶链式反应技术直接从体外培养细胞株中将HDGF克隆至pET28表达载体；
b)表达HDGF蛋白原核细胞，用His金属镍IDA螯合树脂柱纯化HDGF蛋白，用Thrombin酶切除His-tag标签，得到HDGF蛋白；
c)产生抗HDGF抗体并纯化，将已切除标签的HDGF作为抗原免疫大白兔和大鼠，产生HDGF抗体，收集血清，用硫酸铵沉淀、透析、protein-A-Sepharose亲和柱纯化兔抗HDGF多克隆抗体和鼠抗HDGF单克隆抗体；
d)制备时间分辨荧光试剂盒，在固相上结合兔抗HDGF多克隆抗体，鼠抗HDGF单克隆抗体作为二抗，镧族金属元素Eu络合生物素形成复合物并标记二抗。
2.如权利要求1所述的一种肝癌衍生生长因子检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述肝癌衍生生长因子检测试剂盒包括兔抗HDGF多克隆抗体及用镧族金属元素Eu标记的鼠抗HDGF单克隆抗体，其中，鼠抗HDGF单克隆抗体作为二抗；所述肝癌衍生生长因子检测试剂盒用于肝癌衍生生长因子HDGF的检测；所述肝癌衍生生长因子检测试剂盒的检测成分为患者血液或者血浆成分。
3.如权利要求2所述的肝癌衍生生长因子检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述用镧族金属元素Eu标记的鼠抗HDGF单克隆抗体是通过下述方法制备的：
a)构建所述肝癌衍生生长因子HDGF蛋白的表达载体；
b)表达所述HDGF蛋白原核细胞并纯化所述HDGF蛋白；
c)产生所述鼠抗HDGF单克隆抗体并纯化；
d)用镧族金属元素Eu络合生物素形成的复合物标记所述二抗。
4.如权利要求3所述的肝癌衍生生长因子检测试剂盒的制备方法，其特征在于，其中步骤d)采用稀释缓冲液稀释所述鼠抗HDGF单克隆抗体并涂布于固相上，35～39℃孵育2h，孵育后，用洗涤缓冲液洗涤所述固相表面数次；生物素与镧族金属离子Eu的盐溶液混合，形成荧光性络合部分；用所述稀释缓冲
液稀释络合的结合物后涂布于所述固相上，35～39℃孵育2h，孵育后，用所述洗涤缓冲液洗涤所述固相表面数次。
5.如权利要求1所述的肝癌衍生生长因子检测试剂盒的制备方法，其特征在于，其中步骤d)将用含NaCL的磷酸盐缓冲液稀释一抗溶液并将其涂布到固相上，2～6℃孵育20h以上，将所述一抗固定到所述固相上；用洗涤缓冲液洗涤涂布了所述一抗的所述固相表面；洗涤后将所述固相保存于-20℃，直至需要进行测定之前；预先用稀释缓冲液对血液样本进行稀释，涂布于所述固相上，35～39℃孵育2h，孵育后，用所述洗涤缓冲液洗涤所述固相表面数次，接着用所述稀释缓冲液稀释的所述鼠抗HDGF单克隆抗体涂布于所述固相上，35～39℃孵育2h，孵育后，用所述洗涤缓冲液洗涤所述固相表面数次；生物素与镧族金属离子Eu的盐溶液混合，形成荧光性络合部分；用所述稀释缓冲液稀释络合的结合物后涂布于所述固相上，35～39℃孵育2h，孵育后，用所述洗涤缓冲液洗涤所述固相表面数次；将所述镧系金属元素Eu络合生物素形成的复合物进行固相或液相的时间分辨荧光测定；测定条件为延迟时间为0.2～0.3ms，窗口时间为0.2～0.6ms，闪烁速度为0.5～1.5ms，激发波长为337.1nm测定波长为615nm。
6.如权利要求1所述的肝癌衍生生长因子检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述肝癌衍生生长因子检测试剂盒制备中采用的稀释缓冲液为三羟甲基氨基甲烷Tris和HCL构成的弱碱性缓冲液，即Tris-HCL，pH为7.5～8.0，浓度为0.025～0.075M。
7.如权利要求6所述的肝癌衍生生长因子检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述稀释缓冲液还包括牛血清白蛋白BSA和NaCL，其中，所述BSA的浓度为0.15％～0.25％，所述NaCL的浓度为0.6％～1.2％；所述稀释缓冲液的稀释倍数，即体液样本与缓冲液比例为1∶5～1∶15。
8.如权利要求1所述的肝癌衍生生长因子检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述肝癌衍生生长因子检测试剂盒制备中采用的洗涤缓冲液为由Tris和HCL构成弱碱性缓冲液，即Tris-HCL，含有非离子表面活化剂，该非离子表面活化剂为聚氧乙烯山梨糖醇酐酸酯。
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