CN112763707A - 检测抗体与细胞结合的方法、试剂盒及应用 - Google Patents

检测抗体与细胞结合的方法、试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体而言，提供了一种检测抗体与细胞结合的方法、试剂盒及应用。本发明提供的方法，悬浮的待检测细胞依次与待检测抗体和荧光二抗结合，然后利用多功能微孔板检测仪检测待检测细胞的荧光强度值，根据荧光强度值确定待检测抗体与待检测细胞的亲和力。该检测方法对细胞的表面抗原无破坏，能够准确、灵敏、稳定的检测抗体与细胞表面抗原表位的结合；同时克服了FACS方法无法实现高通量的缺点。该方法既可用于细胞表面抗原表达的检测，又可用于抗体与细胞相互作用的检测。

Description

检测抗体与细胞结合的方法、试剂盒及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种检测抗体与细胞结合的方法、试剂盒及应用。
背景技术
目前检测抗体与细胞结合的方法主要有放射免疫测定(Radioimmune assay，RIA)、免疫印迹(Western blotting，WB)、流式细胞术(Fluorescence-activated cellsorter analysis，FACS)、细胞酶联免疫吸附测定(Cell-based enzyme linkedimmunosorbent assay，Cell-ELISA)等。
放射免疫测定(radioimmunoassay，RIA)是利用放射性核素的测量方法与免疫反应的基本原理相结合的一种放射性核素体外检测法。该方法具备灵敏度高、特异性强、精确度佳及样品用量少等优点，广泛应用于测定具有抗原性的蛋白质、酶和多肽激素。然而也存在着如下缺点：试剂的半衰期短，费用较高，需要用闪烁计数仪等专用的检测设备；放射性核素对人体存在着一定潜在的危害性；试验废物处理困难；放射性核素标记有时会改变某些生物物质的生理活性。
免疫印迹(Western blotting，WB)是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中一种常用实验方法。通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色，并且通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。WB法的主要优点在于能够从生物组织的粗提物或部分纯化的粗提物中检测和识别几种特异的蛋白质。将蛋白质转移到一张合适的印迹膜上(或者直接)，随后用和灵敏检测系统相偶联的抗体来识别结合在膜上的一种或几种蛋白质。该技术的灵敏度能达到标准的固相放射免疫分析的水平而又无需像免疫沉淀法那样必须对靶蛋白进行放射性标记。然而也存在着如下缺点：不能直接检测活细胞表面的抗原表达；需要提取蛋白进行表达检测，但在提取过程中容易造成蛋白失活和构象变化；处理后的蛋白不仅包括膜蛋白，还有其他胞质蛋白，抗体非特异结合会增加，造成假阳性率增大。
基于细胞的酶联免疫吸附测定(Cell-Based enzyme linked immunosorbentassay，Cell-ELISA)是一种将ELISA法延伸应用于细胞抗原检测的定性蛋白检测技术。细胞直接在微孔板里培养包被，待检测时，不需裂解细胞便可直接测量微孔板里的蛋白变化。在一个96孔酶联板上，便能检测目标细胞蛋白经刺激或抑制作用后的表现。由于省去抽提蛋白和裂解细胞的步骤，样本的损失也能降到最低，比起其他普通的ELISA测定方法，这项全新的ELISA技术能更快速、更方便地一次检测大量的细胞内蛋白。该方法特别适用于抗原位于细胞膜上而相应抗原的特性又不十分清楚或抗原难于纯化等情况。然而也存在着如下缺点：细胞需要固定，但是细胞固定后细胞会脱水变轻，很难离心下来，因而此法仅适用于贴壁细胞，不太适用于悬浮细胞。然而也存在着如下缺点：Cell-ELISA需要固定细胞，破坏抗原表位，假阴性和假阳性率较高；检测借助于辣根过氧化物酶(HRP)的级联放大作用，假阴性和假阳性率较高，重复性不好；干扰因素较多，尤其是受温度和时间影响较大。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种检测抗体与细胞结合的方法，以缓解现有技术中检测方法或破坏抗原表位，假阴性和假阳性过高，或辣根过氧化物酶使用中被有些细胞破碎释放出的氧化性物质干扰，或不能实现高通量检测的技术问题。
本发明的第二目的在于提供检测抗体与细胞结合的试剂盒，该试剂盒可以快速、准确、高通量检测抗体与细胞的亲和力。
本发明的第三目的在于提供上述检测方法或试剂盒的应用。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种检测抗体与细胞结合的方法，悬浮的待检测细胞依次与待检测抗体和荧光二抗结合，然后利用多功能微孔板检测仪检测待检测细胞的荧光强度值，根据荧光强度值确定待检测抗体与待检测细胞的亲和力。
进一步地，荧光二抗的荧光标记物包括Eu、Tb、XL665、青色素或量子点；
优选地，待检测细胞经封闭后再与待检测抗体孵育结合；
优选地，所述封闭用的物质包括BSA或脱脂奶粉，优选为BSA，进一步优选为1-3w/v％BSA；
优选地，所述封闭的条件为：2-8℃反应0.4-1h。
进一步地，所述结合的反应中悬浮的待检测细胞的密度为1.5×103-2.5×103个/μL。
进一步地，荧光二抗的用量为62.5ng/mL-1μg/mL。
进一步地，多功能微孔板检测仪检测前，待检测细胞的体积浓缩倍数为3-3.5。
进一步地，待检测细胞与待检测抗体的孵育结合条件包括：2-8℃反应0.4-1h。
进一步地，待检测细胞与待检测抗体孵育后，与荧光二抗孵育结合的条件包括：2-8℃反应0.4-1h。
进一步地，所述结合的反应和所述多功能微孔板检测仪检测荧光强度值均独立地在微孔板中进行，优选为96孔微孔板，进一步优选为96孔V型微孔板。
一种检测抗体与细胞结合的试剂盒，包括荧光二抗，以及缓冲液、封闭液或微孔板中的至少一种；
所述荧光二抗的荧光标记物包括Eu、Tb、XL665、青色素或量子点。
上述检测方法或试剂盒在如下a)-c)中的应用：
a)比较两个或多个待检测抗体与同一细胞的亲和力大小；
b)比较两个或多个待检测细胞与同一抗体的亲和力大小；
c)检测细胞表面抗原的表达。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供一种检测抗体与细胞结合的方法，包括：悬浮的待检测细胞依次与待检测抗体和荧光二抗结合，然后利用多功能微孔板检测仪检测待检测细胞的荧光强度值，根据荧光强度值确定待检测抗体与待检测细胞的亲和力。该检测方法中待检测细胞无需固定，避免了对细胞的表面抗原无破坏，能够准确、灵敏、稳定的检测抗体与细胞表面抗原表位的结合；该方法将待检测细胞采用多功能微孔板检测仪检测，可以大批量检测，同时克服了FACS方法无法实现高通量的缺点；此外，该方法也避免了大型昂贵专业仪器的使用，也不会对人体和环境产生危害，极大地降低了检测成本。本发明提供的检测方法既可用于细胞表面抗原表达的检测，又可用于抗体与细胞相互作用的检测。
本发明提供检测抗体与细胞结合的试剂盒，该试剂盒包括荧光二抗，以及缓冲液、封闭液或微孔板中的至少一种，其中，荧光二抗的荧光标记物包括Eu、Tb、XL665、青色素或量子点。该试剂盒应用本发明提供的检测方法进行检测，可以快速、准确、高通量检测抗体与细胞的亲和力。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例4中PE荧光二抗和APC荧光二抗的检测结果，其中，A为PE荧光二抗，B为APC荧光二抗；
图2为实施例5中不同细胞铺板密度的检测结果；
图3A为实施例6中XL665荧光二抗和APC荧光二抗的检测结果；
图3B为实施例6中XL665荧光二抗和Eu荧光二抗的检测结果；
图4A为实施例7中不同稀释比例APC荧光二抗的检测结果；
图4B为实施例7中不同稀释比例Eu荧光二抗的检测结果；
图4C为实施例7中不同稀释比例XL665荧光二抗的检测结果；
图5为实施例8中不同上样体系的检测结果；
图6为实施例9中不同检测方法灵敏度的比较结果，A为FACS法，B为本发明的检测方法。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
一种检测抗体与细胞结合的方法，悬浮的待检测细胞依次与待检测抗体和荧光二抗结合，然后利用多功能微孔板检测仪检测待检测细胞的荧光强度值，根据荧光强度值确定待检测抗体与待检测细胞的亲和力。
该检测方法避免了固定细胞的操作，对细胞的表面抗原无破坏，能够准确、灵敏、稳定的检测抗体与细胞表面抗原表位的结合；该方法利用多功能微孔板检测仪进行检测，同时克服了FACS方法无法实现高通量的缺点；此外，该方法也避免了大型昂贵专业仪器的使用，也不会对人体和环境产生危害，极大地降低了检测成本。本发明提供的检测方法既可用于细胞表面抗原表达的检测，又可用于抗体与细胞相互作用的检测。
需要说明的是，在一定范围内，抗体与细胞结合的多少与荧光强度值是呈正相关的，也就是说，荧光强度值越高，说明抗体与细胞的亲和力越强。
在优选地实施方式中，荧光二抗的荧光标记物包括Eu、Tb、XL665、青色素或量子点。本发明通过对荧光二抗的标记物的特定限定，保证了荧光稳定性，提高了检测灵敏度。Eu或Tb是铕(Eu)或钛(Tb)的穴状化合物，在这个穴状化合物里，Eu或Tb被永久地嵌合在一个笼子里，结构非常稳定。XL665实际就是别藻蓝蛋白(APC)，分子量为10KD，区别于一般的APC，XL665是将APC的亚基藕联在一起，使其不能解离，稳定性更好。Eu、Tb、XL665优选为Cisbio公司的产品。
青色素包括Cy2、Cy3、Cy5和Cy7。量子点是一种纳米级别的半导体，通过对这种纳米半导体材料施加一定的电场或光压，它们便会发出特定频率的光，而发出的光的频率会随着这种半导体的尺寸的改变而变化，因而通过调节这种纳米半导体的尺寸就可以控制其发出的光的颜色。
在优选地实施方式中，待检测细胞经封闭后再与待检测抗体孵育结合，封闭用的物质优选为BSA或脱脂奶粉等，再优选为BSA，进一步优选为1-3w/v％BSA，封闭的条件为：2-8℃反应0.4-1h。待检测细胞在与待检测抗体孵育结合前，对待检测细胞进行封闭，可以有效降低假阳性。封闭的具体操作优选为在待检测细胞中添加含有1-3w/v％BSA的PBS溶液，2-8℃反应0.4-1h。
在优选地实施方式中，结合的反应中悬浮的待检测细胞的密度为1.5×103-2.5×103个/μL。发明人在研发中发现待检测细胞的密度对检测下限以及读值窗口的大小具有显著影响，当密度为1.5×103-2.5×103个/μL时，效果较好。过低，检测下限会升高，灵敏度降低；过高，细胞数量过大，影响孵育结合反应的进行。需要说明的是，待检测细胞的密度典型但非限制性的为1.5×103个/μL、1.7×103个/μL、2×103个/μL或2.5×103个/μL。
在优选地实施方式中，荧光二抗的用量为62.5ng/ml-1μg/mL。发明人在研发中发现荧光二抗的用量对荧光的稳定性，检测的灵敏度以及检测窗口的大小都有显著的影响，当荧光二抗的用量为62.5ng/ml-1μg/mL时，检测效果最好。
在优选地实施方式中，结合反应后重悬细胞用于后续的多功能微孔板检测仪检测，重悬后待检测细胞的体积浓缩倍数为3-3.5。发明人在研发中发现适合的检测上样体系对检测的灵敏度和检测窗口的大小具有显著的影响，将反应体系在检测前浓缩为原来的3-3.5倍，检测效果较好。
在优选地实施方式中，待检测细胞与待检测抗体的孵育结合条件包括：2-8℃反应0.4-1h。
在优选地实施方式中，待检测细胞与待检测抗体孵育后，与荧光二抗孵育结合的条件包括：2-8℃反应0.4-1h。
在优选地实施方式中，结合的反应和多功能微孔板检测仪检测荧光强度值均独立地在微孔板中进行，优选为96孔微孔板，进一步优选为96孔V型微孔板。
在优选地实施方式中，检测抗体与细胞结合的方法具体流程为：
(a)抗体稀释：用含1-3w/v％BSA的PBS将待检测抗体按照梯度稀释稀释成若干个浓度，另设阴性对照；
(b)细胞计数并铺板：将待检测细胞离心250g，5min后弃去上清，用1-3w/v％BSA的PBS调整细胞密度为1.5×103-2.5×103个/μL，按100μL/孔均分到96孔V型板中；
(c)用100μl/孔1-3w/v％BSA的PBS封闭待检测细胞，2-8℃孵育0.4-1h；
(d)将(a)中稀释好的抗体分别加入到(c)中待检测细胞中，100μl/孔，2-8℃孵育0.4-1h；
(e)离心去上清后，加入1-3w/v％BSA的PBS 200μl/孔，再次250g离心5min，小心去上清；
(f)用1-3w/v％BSA的PBS配制荧光二抗，按100μl/孔加入对应的96孔板中，2-8℃孵育0.4-1h；
(g)用PBS 30μl/孔重悬，多功能微孔板检测仪检测。
可以理解的是，在本发明中对于抗体和细胞之间亲和力完全未知的情况中，可以先将待检测抗体稀释成不同梯度，与待检测细胞进行孵育检测，初步判断出二者的亲和力，再根据实验结果调整二者的比例，实现准确检测。
一种检测抗体与细胞结合的试剂盒，包括荧光二抗，以及缓冲液、封闭液或微孔板中的至少一种，其中，荧光二抗的荧光标记物包括Eu、Tb、XL665、青色素或量子点。该试剂盒应用本发明提供的检测方法进行检测，可以快速、准确、高通量检测抗体与细胞的亲和力。
本发明提供的检测抗体与细胞结合的方法或试剂盒可应用于如下a)-c)中的应用：
a)比较两个或多个待检测抗体与同一细胞的亲和力大小；
b)比较两个或多个待检测细胞与同一抗体的亲和力大小；
c)检测细胞表面抗原的表达。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1检测抗体与细胞结合的方法
(a)抗体稀释：用含1w/v％BSA的PBS将待检测抗体按照梯度稀释稀释成若干个浓度，另设阴性对照；
(b)细胞计数并铺板：将待检测细胞离心250g，5min后弃去上清，用3w/v％BSA的PBS调整细胞密度为1.5×103个/μL，按100μL/孔均分到96孔V型板中；
(c)用100μL/孔1w/v％BSA的PBS封闭待检测细胞，2-8℃孵育1h；
(d)将(a)中稀释好的抗体分别加入到(c)中待检测细胞中，100μl/孔，2-8℃孵育0.4h；
(e)离心去上清后，加入3w/v％BSA的PBS 200μl/孔，再次250g离心5min，小心去上清；
(f)用1w/v％BSA的PBS配制荧光二抗(终浓度为62.5ng/ml)，按100μl/孔加入对应的96孔板中，2-8度孵育1h；
(g)用PBS 30μl/孔重悬，多功能微孔板检测仪检测。
实施例2检测抗体与细胞结合的方法
(a)抗体稀释：用含3w/v％BSA的PBS将待检测抗体按照梯度稀释稀释成若干个浓度，另设阴性对照；
(b)细胞计数并铺板：将待检测细胞离心250g，5min后弃去上清，用1w/v％BSA的PBS调整细胞密度为2.5×103个/μL，按100μL/孔均分到96孔V型板中；
(c)用100μL/孔3w/v％BSA的PBS封闭待检测细胞，2-8℃孵育0.4h；
(d)将(a)中稀释好的抗体分别加入到(c)中待检测细胞中，100μl/孔，2-8℃孵育1h；
(e)离心去上清后，加入1w/v％BSA的PBS 200μl/孔，再次250g离心5min，小心去上清；
(f)用3w/v％BSA的PBS配制荧光二抗(1μg/mL)，按100μl/孔加入对应的96孔板中，2-8度孵育0.4h；
(g)用PBS 30μl/孔重悬，多功能微孔板检测仪检测。
实施例3检测抗体与细胞结合的方法
(a)抗体稀释：用含2w/v％BSA的PBS将待检测抗体按照梯度稀释稀释成若干个浓度，另设阴性对照；
(b)细胞计数并铺板：将待检测细胞离心250g，5min后弃去上清，用3w/v％BSA的PBS调整细胞密度为2×103个/μL，按100μL/孔均分到96孔V型板中；
(c)用100μL/孔3w/v％BSA的PBS封闭待检测细胞，2-8℃孵育0.5h；
(d)将(a)中稀释好的抗体分别加入到(c)中待检测细胞中，100μl/孔，2-8℃孵育0.5h；
(e)离心去上清后，加入3w/v％BSA的PBS 200μl/孔，再次250g离心5min，小心去上清；
(f)用3w/v％BSA的PBS配制荧光二抗(终浓度为62.5ng/ml)，按100μl/孔加入对应的96孔板中，2-8度孵育0.5h；
(g)用PBS 30μl/孔重悬，多功能微孔板检测仪检测。
实施例4检测方法的初探
首先按照实施例3中的实验步骤，选择抗人Tigit靶点鼠单抗X(自产)与稳转Tigit的CHO-Tigit细胞的结合作为测试对象，对方法可行性进行了初步验证，其中，待检抗体稀释成初始浓度31.6μg/ml，3.16倍梯度稀释，共11个浓度。在A和B两个试验中分别使用PE标签荧光二抗(母液200μg/mL，Biolegend，Cat#405307)和APC(母液1mg/mL，AAT Bioquest，Cat#16743)标签荧光二抗。考虑到酶标仪检测灵敏度可能会低于流式细胞仪，因而在试验中，加大了荧光二抗的用量，稀释度由1:400提高至1:200。结果如图1所示，用多功能微孔板检测仪可以检测出抗体与CHO-Tigit细胞的结合，并且荧光强度呈现浓度依赖。
A图中，使用PE二抗，检测下限大致在41.15ng/ml，最大荧光读值为39870，同型对照组荧光读值为3988，窗口范围大约为5.17倍。
B图中，使用APC二抗的结果与PE二抗结果类似，检测下限大致在123.46ng/ml，最大荧光读值为2487861，同型对照组荧光读值为481278，窗口约为5.16倍。
APC荧光二抗虽然整体读值高于PE荧光二抗，但是阴性对照本底荧光值也很高，所以二者窗口并无明显差异。
实施例5细胞铺板密度优化
初步的试验确认了用多功能微孔板检测仪检测细胞抗体结合的可行性，接下来对试验条件进行优化，进一步增大窗口和灵敏度。图2展示了以不同细胞密度接种(稳转表达PD1的CHO-PD1细胞(自产))所得到的抗人PD1抗体Y结合情况，荧光二抗使用APC标签荧光二抗(母液0.2mg/mL，工作浓度500ng/mL，Biolegend，Cat#409306)。图2中X轴上的1-11数字编码分别对应不同抗体浓度(31.6μg/ml、10μg/ml、3.16μg/ml、1μg/ml、0.316μg/ml、0.1μg/ml、0.0316μg/ml、0.01μg/ml、0.00316μg/ml、0.001μg/ml、0μg/ml)，数字12对应10μg/mlIsotype Control。
试验一共做了6个细胞铺板密度，分别是2×105个/孔、1×105个/孔、5×104个/孔、2.5×104个/孔、1×104个/孔、5×103个/孔。
从图2中可以看到，不同铺板密度的对照组本底荧光值相近，大致为12509-13624。铺板密度由高到底各组的抗体结合最大荧光值分别为127665、94551、73777、48772、37448和31227，读值窗口分别为9.38倍、7.49倍、5.9倍、3.61倍、2.83倍、2.37倍，抗体检测下限分别为0.01μg/ml、0.0316μg/ml、0.1μg/ml、0.1μg/ml、0.1μg/ml、0.1μg/ml。以2×105个/孔铺板时，抗体结合荧光强度最大，读值窗口最大，检测下限在6个铺板密度里最低。综上，铺板密度2×105个/孔为最优条件。
实施例6荧光二抗的选择
在初步验证阶段检测抗人Tigit鼠单抗X(自产)结合时，同时做了PE和APC两种荧光二抗，从结果看APC组的荧光读值显著高于PE组，但是两种荧光二抗的检测窗口近似，分别是5.17倍和5.16倍。本实施例尝试寻找更加合适的荧光二抗，这个荧光二抗应该满足如下的条件：a)荧光读值较高，但本底较低；b)检测灵敏度高；c)荧光稳定不易淬灭。
尝试将均相时间分辨荧光(HTRF)技术中的供体Eu和受体XL665荧光分子用于抗体-细胞结合检测试验。从cisbio公司购买了藕联有Eu或XL665的二抗，测试这两个荧光二抗是否会比普通APC和PE荧光二抗更好。
本实施例首先比较了XL665荧光二抗和APC荧光二抗。结果如图3A所示，APC组的荧光读值最大值为564139，抗体检测下限为10ng/ml，检测窗口范围约为76.13倍。而XL665组的荧光读值最大值为818634，抗体检测下限为3.16ng/ml，检测窗口范围为42倍。XL665荧光二抗虽然检测窗口略低，但是最大读值更高，并且抗体检测下限可达3.16ng/ml，比普通APC荧光二抗更灵敏。
接下来，比较XL665荧光二抗和Eu荧光二抗。在比较XL665和Eu的试验中本实施例使用了biotek H1型酶标仪的HTRF检测模块，并将数据进行归一化，更直观的展示。结果在图3B中展示。XL665组和Eu组的检测窗口范围分别为9.97倍和10.27倍，检测灵敏度XL665荧光二抗为3.16ng/ml～10ng/ml，Eu荧光二抗为3.16ng/ml～10ng/ml。在检测窗口和灵敏度方面，XL665荧光二抗和Eu荧光二抗差别并不明显，但是Eu组的背景荧光要低于XL665组。Eu组最大荧光读值为40924，同型对照组荧光读值为3986；而XL665组最大荧光读值为113022，同型对照组荧光读值为11333。背景荧光低，检测灵敏度会更高。同时Eu荧光的半衰期是毫秒级，本实施例在这个范围内延后读数时间，可进一步降低背景荧光。综上，在抗体细胞结合的荧光法检测中，用Eu荧光二抗和XL665荧光二抗可以获得更高的检测灵敏度，同时不牺牲荧光稳定性。
实施例7荧光二抗使用浓度选择
在上边的试验中，本实施例都是采用标准的1:400的二抗推荐稀释比。在确认了细胞铺板密度和荧光二抗的选择后，接下来本实施例进一步优化了荧光二抗的使用浓度。本实施例对APC荧光二抗、Eu荧光二抗、XL665荧光二抗(考虑到前边的试验中PE荧光整体读值和窗口都较小，因此本实施例在浓度梯度试验中排除了PE荧光二抗)进行了梯度稀释，结果如图4A-图4C。
图4A中，对于APC二抗，1:400稀释和1:200稀释相比最大荧光值下降了55％，抗体检测灵敏度无明显变化，在两个浓度梯度下均为31.6ng/ml。
对于Eu荧光二抗，因为其荧光更稳定，因此本实施例做了更多的浓度(从1:400到1:12800)，从图4B可以看出，稀释比为1:400、1:800和1：1600时，最大荧光值分别为40924、20292和12160，抗体检测灵敏度为3.16ng/ml，稀释比继续提高之后荧光强度显著降低，检测窗口大幅度缩小。
从图4C中可以看到，对XL665荧光二抗，稀释比1:400、1:800和1:1600的荧光值分别为113022、77850、46625，检测林敏度1:400和1:800为3.16ng/ml，1:1600为10ng/ml。
不同于Eu荧光二抗，XL665荧光二抗从1:400稀释至1:800使用，最大荧光值仅减少32％。而同样稀释一倍，Eu荧光二抗组最大荧光值减少50.5％。综合上述结果，1：400稀释度是一个较为合适的抗体稀释比例。
实施例8上样体系的优化
在检测的过程中，本实施例还尝试比较了不同体积重悬对检测结果的影响。在检测抗人PD1抗体Y与CHO-PD1细胞的结合过程中，本实施例分别采用Corning公司的不透明白板和Cisbio公司的低位不透明白板(液体覆盖孔底所需最小上样体积分别为100μl和30μl，因此本实施例在二抗洗涤后，分别用100μl和30μl PBS重悬细胞。读值结果用同型对照组的值进行归一化，得到相应的倍数值，结果如图5所示。100μl和30μl体系的窗口大小分别为9.39和40.79，检测下限30μl体系可达1ng/ml，100μl体系为3.16ng/ml。从图5结果来看，缩小到30μl体系可大大增加检测灵敏度和检测窗口。
实施例9与流式细胞术(FACS)灵敏度的比较
根据实施例3的试验条件，本实施例对本发明提供的检测方法和流式细胞术(FACS)检测抗体-细胞结合进行了对比。试验中，本发明提供的检测方法中荧光二抗选用XL665荧光二抗，流式细胞术选择APC荧光二抗。因为FACS数据是参考中位荧光值，因此荧光读值和荧光法不能直接比较。但是根据图6中的检测结果可知，如A图所示，FACS法的检测下限约为10ng/ml，B图中可看到本发明的方法的检测下限可达3.16ng/ml，由此可见，本发明提供的检测方法的灵敏度比FACS更高。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (10)

1.一种检测抗体与细胞结合的方法，其特征在于，悬浮的待检测细胞依次与待检测抗体和荧光二抗结合，然后利用多功能微孔板检测仪检测待检测细胞的荧光强度值，根据荧光强度值确定待检测抗体与待检测细胞的亲和力。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，荧光二抗的荧光标记物包括Eu、Tb、XL665、青色素或量子点；
优选地，待检测细胞经封闭后再与待检测抗体孵育结合；
优选地，所述封闭用的物质包括BSA或脱脂奶粉，优选为BSA，进一步优选为1-3w/v％BSA；
优选地，所述封闭的条件为：2-8℃反应0.4-1h。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述结合的反应中悬浮的待检测细胞的密度为1.5×103-2.5×103个/μL。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，荧光二抗的用量为62.5ng/mL-1μg/mL。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，多功能微孔板检测仪检测前，待检测细胞的体积浓缩倍数为3-3.5。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，待检测细胞与待检测抗体的孵育结合条件包括：2-8℃反应0.4-1h。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，待检测细胞与待检测抗体孵育后，与荧光二抗孵育结合的条件包括：2-8℃反应0.4-1h。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，所述结合的反应和所述多功能微孔板检测仪检测荧光强度值均独立地在微孔板中进行，优选为96孔微孔板，进一步优选为96孔V型微孔板。
9.一种检测抗体与细胞结合的试剂盒，其特征在于，包括荧光二抗，以及缓冲液、封闭液或微孔板中的至少一种；
所述荧光二抗的荧光标记物包括Eu、Tb、XL665、青色素或量子点。
10.权利要求1-8任一项所述的方法或权利要求9所述的试剂盒在如下a)-c)中的应用：
a)比较两个或多个待检测抗体与同一细胞的亲和力大小；
b)比较两个或多个待检测细胞与同一抗体的亲和力大小；
c)检测细胞表面抗原的表达。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100015638A1 (en) * 2005-03-31 2010-01-21 Susumu Uchiyama Method for production of antibody directed against cell membrane surface antigen epitope and assaying method
CN103245787A (zh) * 2012-02-01 2013-08-14 浙江大学 一种肝癌衍生生长因子检测试剂盒及其制备方法
CN108152509A (zh) * 2017-12-08 2018-06-12 广州源起健康科技有限公司 一种定量检测猪瘟病毒抗体的磁微粒荧光免疫试剂盒
US20180356411A1 (en) * 2015-06-25 2018-12-13 Hoffmann-La Roche Inc. Cell based assay for determining antibody or ligand binding and function

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100015638A1 (en) * 2005-03-31 2010-01-21 Susumu Uchiyama Method for production of antibody directed against cell membrane surface antigen epitope and assaying method
CN103245787A (zh) * 2012-02-01 2013-08-14 浙江大学 一种肝癌衍生生长因子检测试剂盒及其制备方法
US20180356411A1 (en) * 2015-06-25 2018-12-13 Hoffmann-La Roche Inc. Cell based assay for determining antibody or ligand binding and function
CN108152509A (zh) * 2017-12-08 2018-06-12 广州源起健康科技有限公司 一种定量检测猪瘟病毒抗体的磁微粒荧光免疫试剂盒

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