JPS63307900A

JPS63307900A - 抗ＬＣＡ結合性ヒトα−フェトプロテインモノクロ−ナル抗体

Info

Publication number: JPS63307900A
Application number: JP62141559A
Authority: JP
Inventors: Yutaka Aoyanagi; 青柳　豊; Yasushi Suzuki; 康史鈴木; Fumio Kimura; 文男木村; Naohisa Koizumi; 小泉　直久; Kenji Yoshida; 健治吉田; Shunzo Fukatsu; 深津　俊三
Original assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Current assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Priority date: 1987-06-08
Filing date: 1987-06-08
Publication date: 1988-12-15

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、ＬＣ＾（レンズ豆レクチン、蓮ｃｕｌｉｎａ
ｒｉｓ　７、以下ＬＣＡと称す、）結合性Ｑ−７ｘドブ
ロチイン（α−Ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ以下＾ＦＰと称
す）と特異的に反応するモノクローナル抗体、及びその
抗体を産生するハイブリドーマに関する。

（従来の技術）八ＦＰは、１９５６年ベルゲストランド（Ｂｅｒｇｓｔ
ｒａｎｄ）らにより胎児血清中に存在することが明らか
にされた蛋白成分である。１９６３年アベレ７（Δｂｅ
ｌｅｖ）らが腹水肝癌移植のマウス血中に、又１９６４
年タタリノフ（Ｔａｔａｒｉｎｏｖ）はヒト肝細胞癌患
者の血中に、それぞれ八ＦＰが存在することを報告した
。それ以来、血清中のＡＦＰの測定は肝細胞癌の免疫血
清学的な診断法として、かなＩ）信頼度の高いことが立
証され、広（臨床的に用いられるようになった。

（発明が解決しようとする問題点）臨床面では、　１９７０年代に八ＦＰのラジオイムノア
ッセイ法が開発されるに及んで、従来の寒天ゲル内沈降
法では八ＦＰの存在が証明されにくかった疾患、例えば
肝炎、肝硬変などにもＡＦＰが認められるようになり、
さらに正常成人血清中にもわずか（２０ｎｇ／ｌ１１１
以下）ではあるが存在することが知られるようになった
。、このように初期の肝細胞癌に特異的なマーカーとし
てのＡＦＰの意義は若干薄らいだ。

特に、肝疾患において現在ＡＦＰ値を測定することによ
り、良性肝疾患と肝細胞癌とを区別することは困難であ
り、臨床上問題となっている。

（問題点を解決するための手段）本発明者中の青柳、屯田らは、肝炎、肝硬変時に産生さ
れる八ＦＰと、肝細胞癌時に産生される八ＦＰどの違い
を、ＬＣＡに対する反応性より検討を加え、肝炎、肝硬
変より肝細胞癌へと移行するに従い、ＬＣ＾結合性を示
すＡＦＰの割合が増加することを認めた。

このＬＣＡとの結合性の差が、下図に示すようにアスパ
ラギン（八ｓｎ）結合ＧｌｃＮＡｃに存在するＦｕｃｏ
ｓｅの有無に起因することを認めた。その知見からＬＣ
＾結合性＾ＦＰを定量することにより、良性肝疾患と肝
細胞癌の識別が可能であることを見出だしている。

従来、ＬＣ＾結合性八Ｆへの定量法としてはＬＣＡを用
いた交差免疫親和電気泳動法（織田敏次他、肝臓２２，
１５５９−１５６７．１９８１）やＬＣＡと抗＾ＦＰモ
ノクローナル抗体を共存させた抑制酵素抗体法（青柳豊
、ＢＩＯｍｅｄｉｃａ　２，７７−８３−１９８７）が
知られているが、これらの方法はいずれも操作が煩雑で
あり、実用的な方法とは言えない。

ヒＹ由−へＦＰのＬＣ八へ合即ち、ＬＣＡが結合するＡＦＰの糖鎖は、７コース（Ｆ
ｕｃｏｓｅ）が存在する。

（本Ｃｏｎｃａｎａｖａｌ　ｉｎ＾非結合性＾ＦＰの場
合、Ｃ１ｃＮＡｃが存在）そこで本発明者らは、ＬＣ＾結合性ＡＦＰに対し特異的
に反応するモノクローナル抗体が作成できれば、良性肝
疾患と肝細胞癌とを識別するすぐれた検査方法が確立で
きると考え、研究を進め、本発明を完成した。

本発明者らは、ＬＣ＾結合性ヒト＾ＦＰを特異的に認識
するモノクローナル抗体を見出し、またこのモノクロー
ナル抗体を産生ずるハイブリドーマを創成した。さらに
、このモノクローナル抗体の特異的な反応性を利用すれ
ばＬＣ＾結合性ヒト八Ｆへの量を直接に且つ正確に測定
し得ることを見出した。

モノクローナル　　　びその製造法Ａ、抗原の単離、精製抗原に用いるＬＣ＾結合性ヒト八Ｆへの単離、精製は原
発性肝細胞癌患者血清および腹水から、抗＾ＦＰ抗体結
合セファロースカラム及びレンズマメレクチンセフ７０
−スカラムを使用することにより行なわれた（実施例１
参照）。

Ｂ、ＬＣ＾結合性ヒト八Ｆへによるマウスの免疫雄ＢＡ
ＬＢ／ｃｖウスを用いるが、他の系（ａｔｒａｉｎｓ）
のマウスを使用することもできる。その際、免疫計画及
びＬＣ＾結合性ヒト八Ｆへの濃度は十分な量の抗原刺激
を受けたリンパ球が形成されるよう選ばれるべきである
０例えばマウスに少量のＬＣ＾結合性ヒト八Ｆへで成る
間隔で腹腔に数回免疫の後、さらに数回静脈に投与した
。最終免疫の数日後に融合の為に肺臓細胞を取り出す。

Ｃ０細胞融合肺臓を無菌的に取り出し、それから単細胞！！濁液を調
製する。それらの肺臓細胞を適当なラインからのマウス
骨髄腫細胞と適当な融合促進剤の使用により細胞融合さ
せる。膵臓細胞対骨髄腫細胞の好ましい比率は約２０：
１〜約２：１の範囲である。

約１０８個の膵臓細胞について０．５〜１．５社の融合
媒体の使用が適当である。

細胞融合に用いる骨髄腫細胞は多く知られているが、本
発明では、Ｐ３−Ｘ６３−＾ｇ８−Ｕｌ細胞（以下Ｐ３
−Ｕｌと称す、）　（Ｙｅｌｔｏｎ、　Ｄｚ　Ｅｅｔ　
　ａｌ、、　　Ｃｕｒｒｅｎｔ　　Ｔｏｐｉｃｓ　　ｉ
ｎ　　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　　ａｎｄＩｓｍｕｎ
ｏｌｏｇｙ　８Ｌ　　１　（１９〕８）参照）を用いた
。

好ましい融合促進剤としては、例えば、平均分子量が１
０００〜４０００のポリエチレングリコールを有利に使
用できるが、この分野で知られている他の融合促進剤を
使用することもできる。

Ｄ、融合した抗体産生細胞のスクリーニングハイブリド
ーマの増殖を認めたウェルについて培養上清のＬＣ＾結
合性八Ｆへと特異的に反応するモノクローナ）Ｉ＜抗体
の有無を酵素免疫測定法で測定した。（ＢＵＬＬ、　Ｗ
ＯＲＬＤ　ＨＥＡＬＴＨ０ＲＧＡＮ　Ｖｏ１５３，５５
−５８．１９７６参照、）Ｅ、目的の抗体を産生するハイブリドーマのクローン化目的の抗体を産生するハイブリドーマを適当な方法（例
えば限界希釈法）でり。−ン化すると、抗体は２つの異
なった方法で産生される。その第１の方法によれぽハイ
ブリドーマを一定時間適当な培地で培養することにより
その培養上清から、そのハイブリドーマの産生ずるモノ
クローナル抗体を得ることができる。第２の方法によれ
ばハイブリドーマは同質遺伝子又は半同質遺伝子を持つ
マウスの腹腔に注射することができる。一定時間後の宿
主動物の血液中及び腹水中より、そのハイブリドーマの
産生するモノクローナル抗体を得ることかで答る。

Ｆ、抗体の精製マウス腹水から硫安塩析、プロティンＡ−セファロース
を使用したアフィニティークロマトグラフィー等により
、モノクローナル抗体を精製する。

モノクローナル抗体の製造の一般的解説としてＪ。

ＩｍｍｕｎｏｌｏＭｅｔｈｏｄ、　３９．２８５−３０
８（１９８０）を参照することができる。

実施例Ｉ　　ＬＣＡ結合性＾ＦＰの精製方法原発性肝細
胞癌患者血清５００１１を抗＾ＦＰ抗体結合セファロー
スカラム（１００ｍｌ）にチャージし、０．１５８のＮ
ａＣＩを含む１０ｍＭ燐酸ハッ７７−　（ｐＨ７、Ｏ）
で充分洗浄した後（２８０ｒｕｓにおける吸光度が０．
０１以下になるのを確かめる）、５Ｍ塩酸グアニジン溶
液３００ｍ　ｌで吸着された八ＦＰを溶出する。溶出さ
れた分画を限外濾過により３０ａ　ｌまで濃縮した。濃
縮液をＤＥＡＥ−セフ７デツクス＾−５０（７ｒルマシ
ア製）３０ｍｌにチャージし、０．０９Ｍ燐酸バッフ　
７−（ｐＨ７，０）（グラジェント溶出でＮａＣｌ濃度
が０〜０．５８）でクロマトグラフィーを行なう、　２
ＢＯｎ−における吸光度でモニタリングすることにより
ＡＦＰ分画を得た。免疫電気泳動、ＳＯＳポリアクリル
アミド電気泳動、旧ＳＣ電気泳動により単一性を確認し
た。

この精製へＦＰをＬＣ＾セファ０−ス（ファルマシア製
）５０ｍｌにチャージし、トリスバッファー（ｐＨ７，
０）（１ａ＋Ｍ　ＣａイオンｔＭｎイオンを含む、４℃
）で洗浄し、ＬＣ八へ結合性ＡＦＰ分画を得た。　０．
３Ｍα−メチル−Ｄ−グルコシド溶液１５０ｍ１で溶出
することによりＬＣ＾結合性ＡＦＰ分画を得た。各々凍
結乾燥を行ない淡茶色の粉末を得た。　ＬＣ＾結合性八
Ｆへ（以下＾ＦＰ−ＬＣ＾−Ｒと称す）が７Ｉ１１８、
ＬＣ＾非結合性ＡＦＰ（以下ＡＦＰ−ＬＣＡ−ＮＲと称
す）が３１１Ｉｇ得られた。

免疫電気泳動、ＳＯＳポリアクリルアミド電気泳動、Ｄ
ｉｓｃ電気泳動及びＬＣ＾を用いた交差免疫親和電気泳
動に上り、純度を確認した。

実施例２　モノクローナル抗体の作成（１）免疫ＬＣ八へ合性＾ＦＰの１　ａ＋ｇ／ｍ／（ＰＢＳ）を１
−とＦｒｅｕｎｄ　Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ａｄｊｕｖａｎ
ｔ（以下ＦＣ＾と称す）１ｍｌを混合しｗａｔｅｒ　ｉ
ｎ　ｏｉｌ状にし、抗原−ＦＣ＾エマルジョンを作製し
た。６週令のＢＡＬＢ／ｃマウスを用い、初回免疫は、
抗原ＦＣ＾−エマルジａ　ンノ１００．ｕｌ＋（５０ａ
ｇＡＦＰ相当）を腹腔内投与した。２次免疫以後は、初
回免疫から１週間間隔で抗原−ＦＣ＾エマルジａンの１
０μｍ（５μｇＡＦＰ）を腹腔内投与した。初回免疫か
ら、１＋月以上経過したマウスに、　ＡＦＰ−ＬＣ＾−
Ｒ・５０μｓ／ｍ１）（ＰＢＳ）の１００μＮ（５μｇ
ＡＦＰ）を尾静脈より最終免疫を行った。

（２）」■金最終免疫の３〜４日後の肝細胞１ｘｔｏ”個とＰ３Ｕ１
細胞１×１０７個を４３％ポリエチレングリコール（１
７，５％ジメチルスル７オキシド含む）を用い、細胞融
合を行い、９６穴平底プレートに分注し、１１八Ｔ培地
（ヒボキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む
１０％牛脂児血清入りＲＰＭＩ−１６４０）で３７℃、
５％ＣＯ２下で培養した。

（３）抜本０ム又Ｌニミ４Ａハイブリドーマの増殖を認めたウェルについて、培養上
清の抗ＡＦＰモノクローナル抗体の存在の有無を、酵素
免疫測定法で測定した。２μｇ／社（Ｐｕｓ。

ｐＨ７，１）の＾ＦＰ−ＬＣ＾−ＲとΔＦＰ−ＬＣ八−
ＮＲ及へ１％１３ＳΔ（ＰＢＳ、　ｐ１１７．１）の各
々５０μｌを、９６ウエル平底マイクロタイタープレー
トに入れ、４℃−夜放置後、ハイブリドーマの培養ＶＬ
５０μｅを加え、３７℃、３０分間、つづいてアルカリ
７オス７７ターゼ（以下＾ＬＰと称す）標識抗マウス抗
体（ＺＹＭＥＤ社）と３０分間反応後、パラニトロフェ
ニル７オス７二−）　（以下ＰＮＰＰ　ト称す）を基質
として発色させ、肉眼観察で、八ＦＰと反応していると
認められたものを、抗体産生が陽性と判定した（ＢＵＬ
Ｌ、　ＷＯＲＬＤ　ＩＩＥＡＬＴＩＩ　０ＲＧＡＮ　Ｖ
ｏ１５３゜５５〜６５１９７６）。

（４）クローニング培養上清に、抗体産生が認められたハイブリドーマは、
シングルセルマニュビレイシａン法でクロー二ングヲ行
ない、モノクローン１こなったハイブリドーマを前述の
ＥｌＡ法で再度測定し、モノクローナル抗体産生ハイブ
リドーマを確立した。

（５）モノクローナル抗体のノ産及び精製モノクローナ
ル抗体産生ハイブリドーマをシャーレ中で増殖させた後
、ブリスタン（フルトリッ千社）で前処理したＢＡＬＩ
Ｉ／ｃマウス腹腔内に移植し、得られたマウス腹水から
５０％硫安塩析或いは、プロティン＾・セフ７０−ス（
ファルマシア社りアフィニティーカラムを用いて、モノ
クローナル抗体を精製した。

実施例３　モノクローナル抗体の性質０．１，２．５及び１０μｓ／ｍ１（ＰｔｔＳ−ｐＨ７
，１）の八ＦＰ−ＬＣ＾−Ｒ及び＾ＦＰ−ＬＣ八−ＮＲ
とへ述のモノクローナル抗体を用い、前述したモノクロ
ーナル抗体のスクリーニング法に従い９発色液の０．Ｄ
４ｏ’ｎｍの吸光度をプレートリーダーで測定し、両者
の抗原に対する反応性の差を比較した。

その結果１種々の抗ＡＦＰモノクローナル抗体の中から
、目的の＾ＦＰ−ＬＣ＾・Ｒに反応し、＾ＦＰ−ＬＣ＾
−ＮＲとは反応しないモノクローナル抗体産生バイブリ
ーマを２４株得た。

（表１及び図１．２．３参照）そして、それらモノクローナル抗体のグロブリンサブク
ラスはウサギ−抗マウスイムノグロブリン（ＩｇＧ１．
Ｇ２ａ、Ｇ２ｂ及びＧ３）（ｖイルス社）及びパーオキ
シダーゼ（ＰＯＤ）で標識したヤギ抗ウサギ抗体（カッ
ベル社）を用い、ＥｌＡ法で測定した。

（表−２参照）表１　モノクローナル抗体の特異性−（１）本Ｍ４２４
は結合性へＦＰ、非結合性へＦＰ両方に反応しており、
ＬＣＡ結合性ＡＦＰ特異的でない。

表−２モノクロ一ナル抗体の抗体クラス

【図面の簡単な説明】

＠１、第２及び第３図は＾ＦＰ−ＬＣ＾−Ｒ及び八ＦＰ
−ＬＣＡ−ＮＲに対する本発明にかかわるモノクローナ
ル抗体の反応性の差を実施例２のスクリーニング法に従
い測定した結果（反応液のｏ、Ｄ４ｏｓｎｍの吸光度）
を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）ＬＣＡ結合性ヒトα−フェトプロテインと特異的
に反応するモノクローナル抗体。
（２）ＬＣＡ結合性ヒトα−フェトプロテインと特異的
に反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マ。