KR0162020B1

KR0162020B1 - 폴리클론항체를 포함하는 aids 바이러스 진단시약

Info

Publication number: KR0162020B1
Application number: KR1019950029206A
Authority: KR
Inventors: 이영익; 손미진; 이기순
Original assignee: 김은영; 한국과학기술연구원
Priority date: 1995-09-06
Filing date: 1995-09-06
Publication date: 1998-11-16
Also published as: KR970015748A

Abstract

본 발명은 폴리클론 항체를 포함하는 AIDS 바이러스 진단시약에 관한 것으로, 좀더 상세하게는 엘리자방법으로 AIDS 바이러스를 진단함에 있어서 하나의 폴리클론항체와 하나의 단일클론항체를 사용하는 진단시약에 관한 것이다.

Description

폴리클론항체를 포함하는 AIDS 바이러스 진단시약

제1도는 HIV-1 항원단백질 p-24를 생산할 수 있는 플라스미드 pYCMp-24의 제조과정.

제2도는 정제된 p-24 단백질의 정제 단계별 순도를 검정하기 위한 SDS-폴리아크릴 아미드젤 전기영동 결과를 나타낸 것.

제3도는 정제된 모노클로날 항체의 민감도 검정을 위한 HIV-1 바이러스 용균액과의 웨스턴 블롯팅 결과.

제4도는 간접 엘리자(ELISA) 법을 이용한 선택된 모노클로날 항체 끼리의 에피토프 경쟁정도를 나타낸 결과.

제5도는 한단계 진단법을 이용하여 HIV-1 용균액과 p-24항원을 검정한 기준곡선이다.

본 발명은 폴리클론 항체를 포함하는 AIDS 바이러스 진단시약에 관한 것으로, 구체적으로는 엘리자법으로 AIDS 바이러스를 진단함에 있어 하나의 폴리클론항체와 하나의 단일클론항체를 사용하는 진단시약에 관한 것이다.

후천성면역결핍증(AIDS)은 HIV-1 바이러스에 의해 일어나는 질병으로, 급속히 전파되고 있다. 질병에 대한 심각성이나 전파경로등은 상세히 기술하지 않더라도 널리 알려져 있다.

질병의 전파를 방지하기 위하여 혈액원등으로 기증되는 다량의 혈액시료에 대하여 HIV-1 항원의 존재여부를 진단한 후 양성반응을 나타내는 혈액시료는 파기하도록 되어 있다.(Backer et al., Lancet, Ⅱ, 1213, 1987). AIDS 전파 방지를 위한 혈액시료 검사에 있어서 항체가 형성되기 전의 AIDS 감염 초기까지 진단하기 위하여 또는 AIDS 치료시 HIV-1 바이러스의 감소여부를 측정하기 위하여서는 HIV-1 바이러스의 존재를 확인하는 방법이 필요하다.

이와같이 HIV-1 바이러스의 존재를 확인하는 방법에는 HIV-1 바이러스의 유전정보를 이용하는 PCR 방법(Ou et al., Science, 239, 295, 1988 )이 개발되었으나, 동위원소를 사용하기 때문에 안전성의 문제가 있고, 또한 많은 시료에 대하여 적용하기에는 경제적으로도 부담이 되는 문제점이 있다.

이외에 정제된 항원을 이용하여 항체를 확인하는 엘리자법은 특이성이나 민감도 면에서 뛰어나므로 계속 사용되고 있으나, 항체가 형성되기 전의 AIDS 감염시점 또는 치료시 HIV-1 바이러스의 감소여부는 측정하기 어려운 문제점이 있다.

이에 본 발명자들은 상기 문제점들을 해결하기 위하여 HIV 바이러스의 항원중 면역성이 높고, 그 부위가 보존되어 있는 항원 p-24(이하 p-24로 약함)을 사용하여 HIV-1 바이러스의 존재를 확인하는 방법을 개발하였다.

본 발명자들은 유전자재조합에 의해 제조된 p-24 항원단백질(본 발명자들의 한국특허출원 제95-4679호)을 면역원으로 생쥐에 주사하여 p-24 에피토프가 서로 다른 클론 IB2와 4C9등 7가지 단일클론항체를 얻었고, 단일클론항체중 하나, 예를 들면 1B2를 고정시킨 후, 혈액 시료와 함께 바이오틴(biotin)으로 표지된 다른 단일클론항체 예를 들면 4C9를 투여하는 방법으로 보다 민감하고 신속한 진단방법을 개발하여, 이를 한단계 진단법(one-step sandwich ELISA)이라 망명하였다(Lee et al, Mol. Cells, 3, 43, 1993). 이들 단일클론항체 4C9 1995년 7월 19일자로 한국과학기술원에 기탁되었고(수탁번호 KCTC ACL 905호), 1B2는 1995년 7월 19일자로 한국과학기술원에 기탁되었다.(수탁번호 KCTC ACL 906호)

그러나 상기한 한단계 진단법은 p-24의 에피토프가 서로 다른 클론 1B2와 4C9 등 특정한 단일클론항체를 선별하는 과정이 실험실 조건에 따라 일정하지 않으므로 일반화하기 어렵고, 진단시약을 제조하는 과정에서 각 클론을 따로따로 배양해야 하는 등 시약의 제조과정이 까다롭고 복잡하며 비경제적이라는 문제점이 있다.

이러한 문제점을 개선하기 위하여 본 발명자들은 종래의 한단계 진단법에서, 단일클론항체를 고정시킨후 혈액시료와 함께 2차로 첨가하는 단일클론항체대신 p-24에 대한 폴리클론항체를 사용하는 방법에 대하여 집중적으로 연구한 결과, 단일클론항체와 폴리클론항체를 투여하더라도 민감도에 변화가 없거나 향상되었음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 폴리클론항체를 포함하는 AIDS 진단시약은 단일클론항체대신 폴리클론항체를 사용하므로 매우 경제적이고 간편하게 제조할 수 있는 민감도가 높은 진단시약이다.

이하 본 발명에서 사용하는 시험방법을 소개한다.

1) 역가측정방법

10μg/ml 농도의 단일클론항체 100μl를 96웰 플레이트에 주입하고 37℃ 항온조에서 1시간 방치하고, 트윈 20을 0.05% 함유하는 인산완충액(pH 7.2)으로 세척한 뒤, 5% 탈지우유 0.3ml로 블럭하여 고정하였다.

웰을 트윈 함유 인산완충액으로 세척하고, 적절히 희석한 HIV-1 용균액 또는 p-24 단백질 100μl과 바이오틴으로 라벨화된 폴리클론항체 25μl를 첨가하여 1시간 방치한 후, 트윈 함유 인산완충액으로 세척하였다.

아비딘-퍼옥시다제 콘쥬게이트 100μl를 첨가하고 37℃에서 1시간 반응시킨 후, 세척하고, 3mg/ml 농도의 1, 2-페닐렌디아민(로슈사 제품) 100μl을 첨가하여 15분간 발색시킨 후, 492nm에서의 흡광도를 엘리자 판독기(Labsystem사 제품, 모델 Titrek Multiscan Plus)를 이용하여 측정하였다.

이때 아비딘-포옥시다제 콘쥬게이트는 양에서 유래된 항-생쥐 퍼옥시다제 콘쥬게이트 항체에 아비딘을 라벨화한 것이다.

2) 항체에 대한 타이터 측정

간접엘리자법(Engvall Perlmann, Immunol., 8, 871, 1971)으로 측정하였다. 즉 p-24 항원 단백질 1μg을 코팅액(0.05M 탄산소디움 완충액, pH 9.6) 1ml에 녹이고, 96웰 플레이트에 0.1ml씩 코팅하였다. 5% 탈지우유를 인산완충액에 녹인 블록액으로 고정하였다.

단일클론항체를 제조하는 세포주를 배양하여 얻은 상등액 또는 세포주를 쥐에 주사하여 얻어지는 복강액을 적절히 희석하여 100μl씩 각 웰에 접종하고, 37℃에서 2시간 반응시킨 후, 세척하였다.

양에서 유래된 항-생쥐 퍼옥시다제 콘쥬게이트 항체(Sigma Chemical Co., St. Louis 제품) 100μl와 기질용액 100μl를 순차적으로 첨가하고, 엘리자 판독기를 이용하여 492nm에서의 흡광도를 측정하였다.

다음의 비교실시에들은 본 발명자들의 논문을 통해 발표되었다(Lee et al, Mol. Cells, 3, 43, 1993).

[비교실시예 1]

HIV-1 바이러스의 표명항원인 gag-3의 아미노산 121-398 영역 p-24에 관련된 유전자를 Tac 프로모터와 연결하여 대장균에서 발현시켰다(한국특허출원 제95-4679호). LB 배지에서 배양하여 얻은 대장균 KCTC 8615P 파쇄액을 원심분리하여 inclusion body를 회수하고, 분산완충액(8M 요소, 10mM 디티오트레이톨, 1mM EDTA, 50mM 트리스-염산 완충액, pH 8.0) 30ml에 분산시켰다. 히드록실아민을 2M되도록 첨가하고, 45℃에서 4시간 처리하고, 개미산으로 pH 3.0으로 조절한 후, 투석하여 조(粗) p-24를 얻었다.

조(粗) p-24)를 분산완충액에 분산시키고, DEAE-세파로스 칼럼을 이용하여 흡차되지 않은 분획을 수집하여 농축한 뒤, 다시 세파크릴 S-200 HR 칼럼을 통과시켜 정제하였다. 12% SDS-PAGE 상에서 p-24를 확인하였다.

[비교실시예 2]

정제된 p-24를 생쥐 BALB/c에 면역시켰으나, 2주 간격으로 3회 추가접종하여 부스터시켰다. 최종 부스터한 지 3일후 생쥐로부터 추출한 췌장세포와 Sp2/0-Ag 14 마이엘로마 세포를 40% PEG를 이용하여 10:1의 비율로 융합시키고, HAT(lscove's modified Dulbecco's medium, medium NCTC-135, 20% FBS, HAT supplement;

Gibco사 제품) 배지상에서 하이브리도마 세포 15주를 선별하였다.

선별된 단일클론항체를 p-24에 대한 특성을 엘리자방법으로 비교한 결과 에피토프가 서로 다른 7주, 즉 4C9, 4C8, 4E5, 2A11, 3E1, 1B2, 5E4을 구분하였다.

[비교실시예 3]

10μl/ml 농도의 단일클론항체 1B2 0.1ml를 96웰 플리이트에 코팅하고, 바이오틴으로 라벨화한 단일클론항체 4C9 25μl와 HIV-1 용균액(Labsystems사 제품) 또는 p-24 단백질을 단계별로 희석하여 100μl를 혼합하여 웰에 첨가하였을 대, 민감도는 HIV-1 용균액 150pg/ml, p-24 40pg/ml까지 검정이 가능하였다.

본 발명의 진단방법으로 HIV-1 용균액 60pg/ml, p-24 20pg/ml까지 검정이 가능하였으며, 민감도도 99.1%로 상승하였다. 이상에서 일반적인 모노클론항체와 폴리클론항체를 사용할 수 있음을 확인하였다.

이하 본 발명의 상세한 내용을 실시예를 통해 설명한다. 그러나 본 발명의 개념이 실시예에만 국한되는 것은 아니다.

[실시예 1]

[폴리클론항체를 준비하는 방법]

비교실시예 1에서 제조한 p-24 400μg/0.2ml과 완전 adjuvant(BRL사 제품) 0.2ml을 혼합하여 10주된 토끼에 주사한 후, 2주 간격으로 p-24 0.5mg/0.3ml과 불완전 adjuvant(BRL사 제품) 0.3ml을 혼합하여 3회 부스터하였다. 그후 채혈하여 면역성을 간접엘리자법으로 확인한 후, 목동맥으로부터 전채혈하였다.

혈청을 40% 황산암모늄으로 침전시키고, 투석한 뒤, DEAE-affi-gel-blue 컬럼(Bio-Rad사 제품)을 이용하여 폴리클론항체를 정제하였다.

[실시예 2]

[바이오틴화된 항체의 제조]

2mg/ml 농도의 실시예 1의 항체를 0.1M 탄산소디움 완충액(pH 8.0)을 이용하여 투석하고, 디메틸포름아미드에 녹아있는 바이오틴-NHS(BRL사 제품) 500μg을 첨가하고, 실온에서 2시간 반응하였다. 인산완충액으로 투석하고, 세파덱스 G-25 칼럼을 통과시켜 바이오틴화된 항체를 정제하였다.

[실시예 3]

비교실시예 3에서의 방법중 2차로 첨가하는 항체로 실시예 2에서 준비한 바이오틴화된 폴리클론항체를 첨가하였다.

HIV-1 용균액 60pg/ml, p-24 20pg/ml까지 검정이 가능하였다.

[실시예 4]

고정하는 모노클론항체로 1B2 대신에 AC9, 4C8, 4E5, 2A11, 3E1, 5E4로 대체하여 실시예 3을 실시하였다.

HIV-4 용균액 60pg/ml, p-24 20pg/ml까지 검정이 가능하였다.

[실시예 5]

p-24 항원을 적절히 희석하여 실시예 3의 방법으로 진단할 수 있는 희석배율을 측정하였다.

최종역가(end point titer)는 1:800,000이었으며, 시판제품의 경우에는 1:400

,000이었다.

[실시예 6]

HIV 항체 음성인 인체혈청 220 건에 대하여 실시예 3의 방법으로 진단하였다. 218건은 음성이었고, 2건만이 양성으로 반응되어, 실시예 3의 방법에 대한 민감도는 99.1이었다.

상시 실시예에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 폴리클론항체를 포함하는 AIDS 진단시약을 사용하는 경우, HIV-1 용균액 60pg/ml, p-24 20pg/ml까지 검정이 가능하여으며, 민감도가 99.1%이었다.

이는 종래의 단일크론항체만을 포함하는 AIDS 진단시약을 사용하는 경우 HIV-1 용균액 150pg/ml, P-24 40pg/ml까지 검정이 가능하였던 것과 비교하여 보면 검정가능범위가 200% 이상 정밀하여졌음을 알 수 있다.

따라서 AIDS 감염 초기 항체가 형성되기전 미량으로 존재하는 AIDS 바이러스를 진단하거나 또는 AIDS치료시 감소되어 미량으로 존재하는 AIDS 바이러스를 정밀하게 진단할 수가 있게 되었다.

또한 본 발명의 AIDS 진단시약은 모노클론항체대신 폴리클론항체를 사용함으로서, 진단시약의 제조시 특정한 단일클론항체를 선별하고 까다로운 과정과, 각 클론을 따로따로 배양하는 과정이 생략되므로 매우 간단하고 경제적으로 진단시약을 제조할 수 있는 우수한 효과를 가지고 있다.

다시 말하자면 본 발명의 폴리클론항체를 포함하는 AIDS 진단시약은 종래 방법보다 훨씬 미량의 AIDS 바이러스를 진단할 수 있으며, 민감도가 높으며, 또한 한단계진단방법으로 간단하고 빠르고 정확하게 AIDS 바이러스 존재를 확인할 수 있을 뿐만아니라, 특정한 단일클론항체를 사용하는 대신 폴리클론항체를 사용함으로써 간단하고 경제적으로 제조할 수 있는 뛰어난 효과를 나타내고 있다.

Claims

폴리클론항체와 모노클론항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 AIDS 바이러스 진단시약.
제1항에 있어서, 폴리클론항체와 모노클론항체를 이용하여 한단계 진단법으로 진단하는 것을 특징으로 하는 AIDS 바이러스 진단시약.
제1항에 있어서, 폴리클론항체와 모노클론항체를 이용하여 일반적인 엘리자법으로 진단하는 것을 특징으로 하는 AIDS 바이러스 진단시약.
제1항에 있어서, 모노클론항체는 p-24에 대한 모노클론항체이고, 폴리클론항체는 p-24에 대한 일반적인 폴리클론항체인 것을 특징으로 하는 AIDS 바이러스 진단시약.
제4항에 있어서, 모노클론항체는 4C9, 4C8, 4E5, 2A11, 3E1, 1B2, 5E4 등의 세포주로부터 생산된 모노클론 항체인 것을 특징으로 하는 AIDS 바이러스 진단시약.
제1항에 있어서, 폴리클론항체는 바이오틴화된 것을 특징으로 하는 AIDS 바이러스 진단시약.