JP2003125766A

JP2003125766A - 抗５−メチル−２’−デオキシシチジン抗体および５−メチル−２’−デオキシシチジンの測定法

Info

Publication number: JP2003125766A
Application number: JP2001326705A
Authority: JP
Inventors: Yasuhiro Kagawa; 康浩香川; Kazuaki Watanabe; 和明渡辺
Original assignee: National Space Development Agency of Japan; Toray Research Center Inc; Japan Space Forum
Current assignee: National Space Development Agency of Japan; Toray Research Center Inc; Japan Space Forum
Priority date: 2001-10-24
Filing date: 2001-10-24
Publication date: 2003-05-07

Abstract

(57)【要約】【課題】 5-メチル-2'-デオキシシチジンに対する特異
性の高い抗体、そのような抗体を産生するハイブリドー
マの効率的な作製方法を提供すること、および、5-メチ
ル-2'-デオキシシチジンを含むメチル化DNAに対する特
異的かつ高感度の直接競合酵素免疫法を提供すること。【解決手段】ミエローマ細胞と脾臓細胞との融合を電
気融合法によって行なうことを特徴とする5-メチル-2'-
デオキシシチジンに対する特異性の高い抗体を産生する
ハイブリドーマ作製方法、それによって作成されたハイ
ブリドーマ。および、前記5-メチル-2'-デオキシシチジ
ンに対する特異性の高い抗体またはそのフラグメントを
使用することを特徴とする、メチル化DNAの直接競合酵
素免疫測定法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は5-メチル-2'-デオキ
シシチジンに対する特異性の高い抗体を産生し得るハイ
ブリドーマの効率的な作製方法に関する。また、本発明
は5-メチル-2'-デオキシシチジンに対する抗体、および
そのフラグメントに関する。本発明はさらに前記抗体も
しくはフラグメントを用いたメチル化DNAを検出するた
めの免疫化学的測定法に関する。

【０００２】

【従来の技術】シトシンのC-5位におけるDNAメチル化は
脊椎動物、植物、いくつかの真菌類における様々なエピ
ジェネティックス現象に関与する分子機構である。DNA
メチル化は哺乳類の正常な発生に必須であり、遺伝子発
現調節、X染色体不活性化、ゲノムインプリンティン
グ、内在性レトロウイルス不活性化などに重要な役割を
果たしている。通常、個体の染色体DNAメチル化パター
ンは安定であるが、哺乳類の個体発生において２回、着
床後の初期発生時と生殖系列発生時に、染色体全般にわ
たる大規模なDNAメチル化パターンの再構築が起こる。
また腫瘍形成と異常なDNAメチル化パターンは深い相関
関係がある。これらの調節機構は興味深いがその多くは
不明であった。DNAメチル化分野の研究の進展を阻んで
きた一因としてこの現象を簡便に検出し、さらにそのメ
チル化割合を測定する手法の欠如が大きかった。

【０００３】メチル化DNAの検出および／または定量の
ためにこれまで用いられてきた手法にはDNAメチル化酵
素を用いる方法と抗体を用いる方法がある。酵素を用い
る方法は配列既知の遺伝子のみに有用であり、染色体上
のメチル化部位を直接検出することはできない。一方抗
体を用いる方法は染色体上のメチル化部位を直接検出で
きるが、直接競合阻害ELISA法によりメチル化割合を簡
便に測定できる抗体は得られていなかった。免疫化学測
定法は抗体が抗原を特異的に認識する抗原抗体反応に基
づいて抗原の検出を行う方法であり、その優れた精度、
簡便性、迅速性、経済性から近年注目を集めている。免
疫化学的測定法においては非常に多種の標識法、例えば
酵素、放射性トレーサー、化学発光、蛍光、金属原子、
ゾル、安定遊離基、ラテックス、バクテリオファージが
適用されてきた。

【０００４】免疫測定法の内でも酵素を使用する酵素免
疫測定法は特に優れたものとして広く使用されるに至っ
た。酵素免疫測定法についての優れた論評がTijssen P,
"Practice and theory of enzyme immunoassays" in L
aboratory techniques in biochemistry and molecular
biology, Elsevier Amsterdam New York, Oxford ISBN
0-7204-4200-1(1990)により提供されている。一般に酵
素免疫測定法は競合法と非競合法に大別され、さらに競
合法は間接法と直接法に分けられる。直接法はステップ
数が少なく、簡便であり、メチル化DNAに対する競合酵
素免疫測定法として必要性が高かったにもかかわらず、
直接競合酵素免疫測定（直接競合ELISA）のための適切
な抗体はもとより、酵素標識体も得られていなかった。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、5-メチル-
2'-デオキシシチジンに結合する特異性の高い抗体もし
くはそのフラグメント（断片）を提供することを目的と
する。本発明は、また5-メチル-2'-デオキシシチジンに
対する特異性の高い抗体を産生するハイブリドーマを効
率的に作製する方法を提供することを目的とする。本発
明はさらに、5-メチル-2'-デオキシシチジンに対する特
異性の高い抗体およびそのフラグメントを使用すること
を含む5-メチル-2'-デオキシシチジンの免疫化学的測定
法を提供することを目的とする。特に本発明は、前記抗
体およびそのフラグメントを使用することを含む5-メチ
ル-2'-デオキシシチジンの直接競合阻害ELISAを提供す
ることを目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは脾臓細胞と
ミエローマ細胞との細胞融合を電気融合法によって行な
うことにより、5-メチル-2'-デオキシシチジンに対して
特異性の極めて高い抗体を効率よく作製することができ
ることを見出した。また、5-メチル-2'-デオキシシチジ
ンに対して特異性の極めて高いこの抗体とアルカリフォ
スファターゼ標識ハプテンを組み合わせることにより5-
メチル-2'-デオキシシチジンの免疫測定法、特に5-メチ
ル-2'-デオキシシチジンの直接競合酵素免疫測定法（直
接競合阻害ELISA法）を完成した。さらにこのことはメ
チル化DNAの免疫測定法、特にメチル化DNAの直接競合阻
害ELISA法を開発し得ることを示している。すなわち、
本発明は、脾臓細胞とミエローマ細胞との細胞融合を電
気融合法によって行なうことを特徴とする、5-メチル-
2'-デオキシシチジンに対して特異的な抗体を産生する
ハイブリドーマの作製方法、および、そのようにして作
成されたハイブリドーマ並びにそのハイブリドーマの産
生する抗体である。特に、本発明は、受託番号FERM P-1
8269で特定されるハイブリドーマおよびそのバイブリド
ーマが産生する、式（Ｉ）で示される5-メチル-2'-デオ
キシシチジンおよびこれを含むDNAに対する特異性の極
めて高い抗体である。また、本発明は、前記ハイブリド
ーマを培養することによる、5-メチル-2'-デオキシシチ
ジンおよびこれを含むDNAに対する特異性の極めて高い
抗体の製造方法である。更に、本発明は、前記抗体また
はそのフラグメントを使用することを特徴とする、5-メ
チル-2'-デオキシシチジンの免疫化学測定法、特に直接
競合酵素免疫測定法である。

【０００７】

【化１】 (Ｉ)

【０００８】

【発明の実施の形態】本発明は5-メチル-2'-デオキシシ
チジンに対して極めて特異性の高い抗体、その抗体を産
生するハイブリドーマの作製方法およびそのハブリドー
マ、この抗体と適切に標識されたハプテン、例えばアル
カリフォスファターゼ標識ハプテンを組み合わせること
を特徴とする5-メチル-2'-デオキシシチジンに対する直
接競合酵素免疫測定法である。以下、本発明において使
用しえる抗原、ハイブリドーマおよび抗体の作製方法、
および免疫化学的測定法について説明するが、これらの
調製および測定は当業者には公知の方法、例えば続生化
学実験講座、免疫生化学研究法（日本生化学会編）等に
記載された一般的方法に従って行うことができる。

【０００９】5-メチルシチジンと高分子化合物との結合
体の作製本発明の抗体を作製する場合は、5-メチルシチジンは適
当な高分子化合物に結合させて免疫用抗原として使用す
ることが好ましい。好ましい高分子化合物の例として
は、スカシ貝のへモシアニン（以下「ＫＬＨ」と言
う）、卵白アルブミン（以下、「ＯＶＡ」と言う）、ウ
シ血清アルブミン（以下「ＢＳＡ」と言う）、ウサギ血
清アルブミン（以下「ＲＳＡ」と言う）などがある。Ｋ
ＬＨおよびＢＳＡが特に好ましい。5-メチルシチジンと
高分子化合物との結合は、例えば、Erlangerらによって
記載された公知の方法（Proc. Natl. Acad. Sci., 52,
68-74(1964)）によって行うことができる。この方法で
は、5-メチルシチジンを過ヨウ素酸で酸化し、生成した
アルデヒド基とキャリアータンパクのアミノ基をpH9付
近で反応させる。次に水素化ホウ素ナトリウムで還元し
た後、純水を外液として透析し免疫源とする。

【００１０】一方サクシニレートを保護基とする以下の
方法でも合成できる。例えば、5-メチル2'-デオキシシ
チジンの４−アミノ基をアセチル化により保護してから
リボース環の5'−水酸基を無水コハク酸でサクシニル化
した後、４−アミノ基のアセチル基を脱保護してハプテ
ンとする。得られたハプテンをKLH、OVA、BSA等のキャ
リアータンパク質に結合させて免疫源とすることができ
る。また、上記と同様の方法により、酵素等の標識物質
を5-メチルシチジンに結合させたものを、免疫学的測定
方法において使用することができる。標識物質の例とし
ては、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリフォスフ
ァターゼ等の酵素、フルオレセインイソシアネート、ロ
ーダミン等の蛍光物質、³²Ｐ、¹²⁵Ｉ等の放射性物質、
化学発光物質などが挙げられる。

【００１１】モノクローナル抗体の作製前述したような5-メチルシチジンと高分子化合物との結
合体を使用して、以下のような方法により本発明のモノ
クローナル抗体を作製することができる。一般に、モノ
クローナル抗体の作製は以下のような工程を含む。（a）免疫用抗原として使用する5-メチルシチジンと高
分子化合物との結合体を作製する工程、（b）動物へ免
疫する工程、（c）血液を採取、アッセイ、及び抗体産
生細胞を調製する工程、（d）ミエローマを調製する工
程、（e）抗体産生細胞とミエローマとの細胞融合とハ
イブリドーマの選択的培養を行なう工程、（f）目的と
する抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングと
細胞クローニングを行なう工程、（g）ハイブリドーマ
の培養または動物へのハイブリドーマの移植によるモノ
クローナル抗体の調製を行なう工程、（h）調製された
モノクローナル抗体の反応性を測定する工程。モノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマを作製するための
方法は、例えば、ハイブリドーマテクニックス（Hybr
idoma Techniques），コールドスプリングハーバー
ラボラトリーズ（Cold Spring Harbor Laboratory，198
0年版）、細胞組織化学（山下修二ら、日本組織細胞化
学会編；学際企画、1986年）に記載されている。

【００１２】以下、上記工程についてより詳しく説明す
る。工程（ａ）、（ｂ）において、5-メチルシチジンと
高分子化合物との結合体を使用して、慣用化された方法
により本発明の抗体を動物体内に生じさせることができ
る。この目的は例えば、5-メチルシチジン−ＫＬＨ結合
体をリン酸ナトリウム緩衝液に溶解し、フロイント完全
アジュバント又は不完全アジュバント、あるいはミョウ
バン等の補助剤と混合したものを、免疫用抗原として動
物を免疫することによって達成され得る。免疫される動
物としては当該分野で常用されるものをいずれも使用で
き、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等が
含まれる。免疫の際の投与法は、皮下注射、腹腔内注
射、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射のいずれでもよ
いが、皮下注射または腹腔内注射が好ましい。免疫は1
回又は適当な間隔で、好ましくは１週間ないし5週間の
問隔で複数回行うことができる。次に免疫化した動物か
ら血液を採取し、そこから分離した血清を用い、5-メチ
ル-2'-デオキシシチジンと反応するポリクローナル抗体
の存在を評価することができる。なお、上記工程は5-メ
チル-2'-デオキシシチジンに対する抗血清またはポリク
ローナル抗体を得るためにも利用できる。抗血清として
使用する場合は、前述の免疫化した動物からの血清自体
を利用することができる。更に必要に応じて当業者に知
られた一般的な方法に従って、上記抗血清から抗体画分
を精製分離してポリクローナル抗体として使用すること
ができる。

【００１３】工程（ｃ）における抗体産生細胞はリンパ
球であり、これは一般には脾臓、胸腺、リンパ節、末梢
血液又はこれらの組み合わせから得ることができるが脾
細胞が最も一般的に用いられる。従って、最終免疫後、
抗体産生が確認されたマウスより抗体産生細胞が存在す
る部位、例えば脾臓を摘出し、脾細胞を調製する。工程
（ｄ）で用いるミエローマ細胞としては、特に限定され
ず、ハイブリドーマ作製のために一般的に使用する細胞
を利用することができる。そのような細胞には、Balb/C
マウス由来ミエローマ細胞株のP3／X63-Ag 8（X63）（N
ature，256，495-497（1975））、P3／X63-Ag 8．U1（P
3U1）（Current Topics．in Microbiology and lmmunol
ogy，81, 1-7（1987））、P3／NSI-1-Ag 4-1（NS-1）
（Eur．J．Immunol．，6，511-519（1976））、Sp 2／O
-Ag 14（Sp 2／O）（Nature,276，269-270（1978））、
FO（J．Immuno．Meth．，35, 1-21（1980））、MPC-1
1、X63.653、S194等のミエローマ株化細胞、あるいはラ
ット由来の210．RCY3．Ag 1．2．3．（Y3）（Nature, 2
77，131-133,（1979））が含まれるが、これらに限定さ
れない。上述した株化細胞をウシ胎児血清を含むダルベ
ッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）またはイスコフ改変
ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）で継代培養し、融合当日に
約３x10³個以上の細胞数を確保することが好ましい。

【００１４】工程（ｅ）において細胞融合は、一般に
は、例えばミルスタイン(Milstein)らの方法（Methods
in Enzymology，73，3（1981））等に準じて行われる。
現在最も一般的に行われているのはポリエチレングリコ
ール（PEG）を用いる方法(PEG法)である。ＰＥＧ法につ
いては、例えば、細胞組織化学、山下修二ら（上述）に
記載されている。しかしながら、本発明においては、電
気処理による方法（電気融合法）を採用することが特に
好ましい（大河内悦子ら、実験医学 5.1315-19、198
7）。電気融合法を用いることによって、5-メチル-2'-
デオキシシチジンに対する特異性および親和性の高い抗
体を産生するハイブリドーマを効率的に作成することが
できる。融合の際の細胞の使用比率は一般的に使用され
る値でよく、例えばミエローマ細胞に対して脾細胞を３
倍から１０倍程度用いればよい。電気融合は例えば以下
のようにして行なうことができる。まず、最初にミエロ
ーマ細胞と脾臓細胞の混合液に弱い電圧をかけ誘電電気
泳動を起して細胞同士を接触させる（いわゆるパールチ
ェーンを形成させる）。この時の電圧は好ましくは10〜
80Ｖ/cm、より好ましくは20〜50Ｖ/cm、通電時間は好ま
しくは１〜20秒、より好ましくは３〜10秒である。次
に、その状態で高電圧パルスをかけ、その衝撃により接
触した細胞同士を融合させる。この時の電圧は好ましく
は１〜５kV/cm、より好ましくは２〜4kV/cm、パルス幅
は好ましくは10〜100μ秒、より好ましくは20〜50μ秒
である。

【００１５】抗体分泌能および増殖能を獲得したハイブ
リドーマ群は一般的方法に従って選択することができ
る。例えば、ミエローマ細胞株としてヒポキサンチング
アニジンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損株を使
用した場合、例えば上述のＤＭＥＭやＩＭＤＭにヒポキ
サンチン・アミノプテリン・チミジンを添加して調製し
たＨＡＴ培地の使用により行うことができる。

【００１６】工程（ｆ）において、選択されたハイブリ
ドーマ群を含む培養上清の一部をとり、例えば後述する
ELISA法により、5-メチル-2'-デオキシシチジンに対す
る抗体活性を測定する。さらに、測定により5-メチル-
2'-デオキシシチジンに反応する抗体を産生することが
判明したハイブリドーマの細胞クローニングを行う。こ
の細胞クローニング法としては、限界希釈により1ウェ
ルに1個のハイブリドーマが含まれるように希釈する方
法「限界希釈法」；軟寒天培地上に撒きコロニーをとる
方法；マイクロマニピュレーターによって1個の細胞を
取り出す方法；セルソーターによって1個の細胞を分離
する「ソータークローン法」等が挙げられる。限界希釈
法が簡単でありよく用いられる。抗体価の認められたウ
ェルについて、例えば限界希釈法によりクローニングを
1〜4回繰り返して安定して抗体価の得られたものを、本
発明の抗5-メチル-2'-デオキシシチジンモノクローナル
抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。本発明のハ
イブリドーマは通常用いられる一般的な培地、例えば、
10％ウシ胎児血清（FCS）を含むＤＭＥＭまたはＩＭＤ
Ｍ等によって培養することができる。本発明のハイブリ
ドーマの培養は、例えば二酸化炭素濃度５〜７％程度及
び３７℃（１００％湿度の恒温器中）で培養することが
好ましい。

【００１７】（ｇ）および（ｈ）の工程において、抗体
を調製するための大量培養はフォローファイバー型の培
養装置等によって行うのが好ましい。または、同系統の
マウス（例えば、上述のＢａｌｂ／ｃ）あるいはＮｕ／
Ｎｕマウスの腹腔内でハイブリドーマを増殖させ、腹水
液より抗体を調製することも可能である。これらにより
得られた培養上清液あるいは腹水液を抗5-メチル-2'-デ
オキシシチジンモノクローナル抗体として使用すること
できるが、さらに透析、硫酸アンモニウムによる塩析、
ゲル濾過、凍結乾燥等を行い、抗体画分を集め精製する
ことにより抗5-メチル-2'-デオキシシチジンモノクロー
ナル抗体を得ることができる。さらに、精製が必要な場
合には、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィ
ニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフ
ィー（ＨＰＬＣ）などの慣用されている方法を組合わせ
ることにより実施できる。これらの抗体精製方法は当業
者にはよく知られたものである。以上のようにして得ら
れた抗5-メチル-2'-デオキシシチジンモノクローナル抗
体は、例えばELISA法などの公知の方法を使用して、サ
ブクラス、抗体価等を決定することができる。

【００１８】抗体による5-メチル-2'-デオキシシチジン
の測定 5-メチル-2'-デオキシシチジンは本発明の抗体を用い
て、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、ELISA法
（Engvall，E．，Methods in Enzymol．，70，419-439
（1980））、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、凝
集法、オクタロニー（Ouchterlony）等の、一般に抗体
の検出に使用されている種々の方法（「ハイブリドーマ
法とモノクローナル抗体」、株式会社R＆Dプラニング発
行、第30頁-第53頁、昭和57年3月5日）を使用して測定
することができる。感度、簡便性等の観点からELISA法
が好ましい。

【００１９】5-メチル-2'-デオキシシチジンの測定は、
各種の免疫化学アッセイ法、例えば各種ELISA法を用い
て行うことができる。より具体的には、例えば、以下の
（ａ）〜（ｄ）のような工程を含む間接競合阻害ELISA
法により行うことができる：（ａ）抗原（５-メチルシチジンと高分子化合物との結
合体）を担体に固相化する工程、（ｂ）抗原が吸着して
いない固相表面を抗原と無関係な物質、例えば抗原とは
無関係のタンパク質によりブロッキングする工程、
（ｃ）各種濃度の5-メチル-2'-デオキシシチジンを含む
試料及び抗体を加え、該抗体を前記固相化抗原および5-
メチル-2'-デオキシシチジンに競合的に結合させて、固
相化抗原-抗体複合体および5-メチル-2'-デオキシシチ
ジン-抗体複合体を生成させる工程、（d）固相化抗原-
抗体複合体の量を測定することにより、予め作成した検
量線から試料中の5-メチル-2'-デオキシシチジンの量を
決定する工程。

【００２０】工程（ａ）において、抗原を固相化する担
体としては、特別な制限はなく、ELISA法において常用
されるものをいずれも使用することができる。例えば、
ポリスチレン製の96穴マイクロタイタープレートを用い
ることができる。抗原を担体に固相化させるには、例え
ば、抗原を含む緩衝液を担体上に加え、単にインキュベ
ーションすればよい。緩衝液としては公知のものが使用
でき、例えば、145mM NaClを含む10mMのPBSが使用でき
る。緩衝液中の抗原の濃度は広い範囲から選択できる
が、通常0.01μg／mlから100μg／ml程度、好ましくは
0．05μg／mlから5μg／mlである。また、担体として96
ウェルのマイクロタイタープレートを使用する場合に
は、300μl／ウェル以下で20μl／ウェルから150μl／
ウェル程度が望ましい。抗原変性しない限りインキュベ
ーションの条件にも特に制限はないが、4℃程度で一晩
のインキュベーションが好ましい。なお他の5-メチル-
2'-デオキシシチジン類似化合物も上記アッセイにおい
て固相化抗原として使用することも可能である。

【００２１】工程（ｂ）におけるブロッキングは、抗原
（5-メチルシチジンと高分子化合物との結合体）を固相
化した担体において、5-メチルシチジン部分以外に後で
添加する抗体が吸着され得る部分が生じることを防ぐ目
的で行われる。ブロッキング剤として、例えば、ＢＳＡ
やスキムミルク溶液を使用できる。あるいは、ブロック
エース（「Block‐Ace」、大日本製薬、コードNo．UK-2
5B）等のブロッキング剤として市販されているものを使
用することもできる。具体的には、例えば、抗原を固相
化した部分に、ブロックエースを適量加え、約4℃で、
一晩インキュベーションした後、緩衝液で洗浄すること
によりブロッキングを行なうことができる。ここで使用
する緩衝液としては、特に制限はないが、例えば、10mM
PB(pH7.2)、0.8%(w/v)NaCl、0.02%(w/v)KCl、0.02%(v/v)T
ween20の組成のものが適している。

【００２２】次いで工程（ｃ）において、5-メチル-2'-
デオキシシチジンを含む試料と抗体を固相化抗原と接触
させ、抗体を固相化抗原及び5-メチル-2'-デオキシシチ
ジンと反応させることにより、固相化抗原-抗体複合体
及び5-メチル-2'-デオキシシチジン-抗体複合体を生成
させる。この際、抗体としては、第一抗体として本願発
明の5-メチル-2'-デオキシシチジンに対する抗体を加
え、更に第二抗体として標識酵素を結合した第一抗体に
対する抗体を順次加えて反応させる。第一抗体は緩衝液
に溶解して添加する。反応は、例えば37℃程度で約1時
間行えばよい。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、固
相化抗原に結合しなかった第一抗体を除去する。この反
応に用いる試薬としては、例えば10mM PB(pH7.2)、0.8%
(w/v)NaCl、0.02%(w/v)KClの組成のものを利用すること
ができる。

【００２３】次いで第二抗体を添加する。例えば第一抗
体としてマウスモノクローナル抗体を用いる場合、酵素
（例えば、ペルオキシダーゼまたはアルカリホスファタ
ーゼ等）を結合した抗マウス−ヤギ抗体を用いるのが適
当である。担体に結合した第一抗体に約500〜10000倍、
好ましくは最終吸光度が4以下、より好ましくは0.5〜3.
0となるように希釈した第二抗体を反応させる。希釈に
は緩衝液を用いる。限定されるわけではないが、反応は
約37℃で約1時間行い、反応後、緩衝液で洗浄する。以
上の反応により、第二抗体が第一抗体に結合する。ま
た、標識した第一抗体を用いてもよく、その場合、第二
抗体は不要である。

【００２４】次いで工程（ｄ）において担体に結合した
第二抗体の標識物質と反応する発色基質溶液を加え、吸
光度を測定することによって検量線から5-メチル-2'-デ
オキシシチジンの量を算出することができる。第二抗体
に結合する酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合
には、例えば、過酸化水素、並びに3,3',5,5'-テトラメ
チルベンジジンまたはο-フェニレンジアミン（以下
「ＯＰＤ」という）を含む発色基質溶液を使用すること
ができる。反応は、例えば、発色基質溶液を加え約２５
℃で約２０分間インキュベーションすることによって行
なうことができ、その後、２Ｎの硫酸を加えることによ
り酵素反応を停止させてよい。ＯＰＤを使用する場合は
492nmの吸光度を測定し、3,3',5,5'-テトラメチルベン
ジジンを使用する場合450nmの吸光度を測定することに
よって、5-メチル-2'-デオキシシチジンの量を算出する
ことができる。

【００２５】一方、第二抗体に結合する酵素としてアル
カリホスファターゼを使用する場合には、例えばp-ニト
ロフェニルリン酸を基質として発色させ、２ＮのＮａＯ
Ｈを加えて酵素反応を止め、４１５ｎｍでの吸光度を測
定する方法が適している。5-メチル-2'-デオキシシチジ
ンを添加しない反応溶液の吸光度に対して、5-メチル-
2'-デオキシシチジンを添加して抗体と反応させた溶液
の吸光度の減少率を阻害率として計算する。既知の濃度
の5-メチル-2'-デオキシシチジンを添加した反応液の阻
害率により予め作成しておいた検量線を用いて、試料中
の5-メチル-2'-デオキシシチジンの濃度を算出できる。

【００２６】また、本発明のモノクローナル抗体は、例
えば以下に述べるような（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、
直接競合阻害ELISA法において使用することができる。
（ａ）本発明のモノクローナル抗体を、担体に固相化す
る工程、（ｂ）抗体が固相化されていない担体表面を抗
原と無関係な物質、例えば抗原と無関係なタンパク質に
より、ブロッキングする工程、（ｃ）各種濃度の5-メチ
ル-2'-デオキシシチジンを含む試料、及び、5-メチルシ
チジンと酵素を結合させた酵素結合ハプテンを担体に固
相化した抗体と反応させる工程、（ｄ）固相化抗体-酵
素結合ハプテン複合体の量を測定することにより、あら
かじめ作成した、検量線から試料中の5-メチル-2'-デオ
キシシチジンの量を決定する工程。

【００２７】工程（ａ）においてモノクローナル抗体を
固相化する担体としては、特別な制限はなくELISA法に
おいて常用されるものを用いることができ、例えば、96
ウェルのマイクロタイタープレートが挙げられる。モノ
クローナル抗体の固相化は、例えばモノクローナル抗体
を含む緩衝液を担体上にのせ、インキュベーションする
ことによって行うことができる。緩衝液の組成・濃度は
前述の間接競合阻害ELISA法と同様でよい。工程（ｂ）
におけるブロッキングは、抗体を固相化した担体におい
て、後に添加する試料中の5-メチル-2'-デオキシシチジ
ンおよび酵素結合ハプテンが抗原抗体反応とは無関係に
吸着される部分が生じることを防ぐ目的で行われる。ブ
ロッキング剤及びその方法は、前述の間接競合阻害ELIS
A法と同様のものを使用できる。

【００２８】工程（ｃ）において用いる酵素結合ハプテ
ンの調製は５-メチルシチジンを酵素に結合する方法で
あれば、特に制限はなく、いかなる方法で行ってもよ
い。調製した酵素結合ハプテンは5-メチル-2'-デオキシ
シチジンを含む試料と混合する。なお、酵素等の標識物
質に結合させるハプテンとしては、間接競合阻害ELISA
法における固相化抗原の場合と同様に、抗体作製に使用
した5-メチルシチジンのみならず、他の5-メチル-2'-デ
オキシシチジン類似化合物も酵素に結合させるハプテン
として使用可能である。この工程において、5-メチル-
2'-デオキシシチジンを含む試料及び酵素結合ハプテン
を抗体固相化担体に接触させ、5-メチル-2'-デオキシシ
チジンと酵素結合ハプテンとの競合阻害反応により、こ
れらと固相化担体との複合体を生成させる。5-メチル-
2'-デオキシシチジンを含む試料は適当な緩衝液で希釈
して使用するのが好ましい。反応時間は、例えば室温に
て、およそ１時間でよい。反応終了後、緩衝液で担体を
洗浄し、固相化抗体と結合しなかった酵素結合ハプテン
を除去する。洗浄は、例えばPBSを使用することができ
る。

【００２９】さらに工程（ｄ）において酵素結合ハプテ
ンの酵素に反応する発色基質溶液を前述の間接競合阻害
ELISA法と同様に加え、吸光度を測定することにより、
検量線から5-メチル-2'-デオキシシチジンの量を算出す
ることができる。本発明の抗体は、上述したような直接
競合阻害ELISA法で5-メチル-2'-デオキシシチジンの量
を0.1〜100μｇ／ｍｌの範囲で測定できる（実施例３、
図1を参照せよ）。

【００３０】以下、実施例によって本発明を具体的に説
明するが、これらは本発明の技術的範囲を制限するため
のものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容
易に本発明に修飾、変更を加えることができることは言
うまでもなく、それらは本発明の技術的範囲に含まれ
る。

【００３１】

【実施例】実施例１．抗体の作製（１）免疫用抗原の作製先ず5-メチルシチジンとＫＬＨとの結合体を以下のよう
にErlangerらの方法により作製した。5-メチルシチジン
6.6mgを0.1M過ヨウ素酸0.5mlに溶解し、室温20分反応さ
せた。1Mエチレングリコール0.03mlを加え反応を停止さ
せた。反応液をKLH 20mg/2ml蒸留水に添加し5% K₂CO₃約
0.1mlでpH9〜9.5に調節した。45分間撹拌した後水素化
ホウ素ナトリウム15mgを添加した後18時間静置した。1M
ギ酸0.5mlで反応を停止させた後1MアンモニアでpHを8.5
に調節した。純水を外液として二晩透析し免疫源とし
た。このようにして得られた5-メチルシチジン-ＫＬＨ
結合体を免疫用抗原として用いた。

【００３２】（２）スクリーニング用抗原の作製スクリーニング用抗原として（１）と同様の方法により
5-メチルシチジン-BSA結合体を得た。

【００３３】（３）免疫感作免疫用抗原として（１）において得られた5-メチルシチ
ジン-ＫＬＨ結合体について、それぞれマウスに免疫を
おこなった。免疫用抗原100μgをPBS 100μlに溶解し、
等量のフロイント完全アジュバントと混合した後、Balb
/cマウスに接種した。１７日後にフロイント不完全アジ
ュバントを用いて調製した免疫用抗原を前記と同様の操
作によりマウスに追加免疫をおこなった。また、４１日
後にはPBSに溶解した免疫抗原をマウスに追加免疫し
た。このマウスから血清を調製した。

【００３４】（４）抗血清による測定（３）で調製した抗血清の力価を（２）で調製したスク
リーニング用抗原を用いた間接競合阻害ELISA法によっ
て評価した。まず、（２）で調製した5-メチルシチジン
-BSA結合体の溶液（0.1μg/ml）を100μl/ウェルにて９
６ウェルプレートにコーティングした。洗浄の後、４倍
に希釈したブロックエース（「Block Ace」：大日本製
薬、コードNo.UK-25B）でブロッキングし、各種濃度の5
-メチル-2'-デオキシシチジンあるいはその類似化合物
を含むPBS溶液50μlおよび希釈抗血清50μlをウェルに
入れ、３７℃にて1時間反応させた。反応終了後、0.05
％ Tween20-PBSにて1回洗浄の後、PBSを用いて5000倍希
釈したペルオキシダーゼ結合抗マウスIgGヤギ抗体（Cap
pel社製）を100μlずつ各ウェルに添加し、３７℃にて1
時間反応させた。さらに反応終了後、0.05%Tween20-PBS
にて2回洗浄し、0.4mg/mlのＯＰＤ、及び0.04%過酸化水
素を含む0.05Mリン酸クエン酸緩衝液(pH4.5)を100μlず
つ各ウェルに入れ、室温にて20分間放置し、発色させた。
反応後、2N硫酸100μlを各ウェルに加え、反応を停止さ
せた後、490nmの吸光度を測定した。

【００３５】（５）ハイブリドーマ細胞の作製（４）の結果に基づき血清中の抗5-メチル-2'-デオキシ
シチジン抗体の活性が高くなったマウスの脾臓細胞と、
マウスミエローマ細胞（Ｐ３Ｕ１）とを以下の手順に従
って、電気融合法にて細胞融合させた。ｉ）脾臓細胞の
調製前記の通り免疫したマウスから脾臓を無菌的に摘出
し、脾臓細胞懸濁液を調製した。摘出した脾臓はRPMI培
地中で脂肪を取り除いた後、注射器で培地を注入し細胞
をほぐした。脾臓の両端をはさみで切り落とし中の細胞
を軽くたたくようにして脾臓から培地中に取り出した。
培地中の細胞を良くほぐしてからステンレスメッシュを
通し脾臓細胞懸濁液とした。

【００３６】ii）細胞融合マウス２匹当たりミエローマ細胞、P3X63Ag8U.1を約10⁸
個用意した。i)で調製した脾臓細胞（10⁸細胞/ml）1ｍ
ｌとミエローマ細胞（2x10⁷細胞/ml）1ｍｌを24ウェル
プレート中で混合した。該混合液の細胞を細胞融合装置
（ＳＳＨ-２、島津製）にて電気的に融合させた。ま
ず、電圧40Ｖで10秒間通電し、細胞を接触させてパール
チェーンを形成させた。次に、電圧2.3kV/cm、パルス幅
40μ秒の高電圧パルスをかけて細胞を融合させた。得ら
れた融合細胞をＦＢＳを１０％含むHAT培地に懸濁し
た。該細胞懸濁液を９６穴プレート（Nunc製）に１ウェ
ルあたり0.1ｍｌずつ分注した。HAT培地にはメルカプト
エタノール5x10^-5M、1mMピルビン酸を予め添加しておい
た。該細胞懸濁液が分注された９６穴プレートを５％CO
₂存在下、37℃で10日間培養した。出現したコロニーを
順次継代し細胞の選択に必要な量の培養上清を得た。

【００３７】iii)融合細胞の選択とクローニング前記の操作により増殖可能な融合細胞を選抜した。該融
合細胞の培養上清を用いて、ELISA法により5-メチルシ
シチジンに対する抗体が産生されていることを確認し
た。まず5-メチル-2'-デオキシシチジン-OVAコンジュゲ
ートを140mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na₂HPO₄および1.8mM
KH₂PO₄（ｐＨ7.4）を含有する溶液（以下、PBS溶液と
記す。）で、２μg/mlとなるように希釈し、コーティン
グ液を調製した。該コーティング液をポリスチレン製の9
6穴マイクロタイタープレートに、1ウェルあたり50μlず
つ分注した後、4℃で一晩保温した。コーティング液を除
去した後、各ウェルに300μlのPBS溶液を添加し、ウェル
内部を洗浄した。次にPBS溶液を除去した各ウェルにブロ
ッキング溶液(ブロックエース。大日本製薬製)を1ウェル
あたり200μl添加した後、室温で2時間保温してブロッキ
ングを行った。

【００３８】ブロッキング液を除去後、各ウェルに0.05
％ Tween20を含有するPBS溶液(以下、洗浄液と記す。)30
0μl添加し、ウェル内部を洗浄した。洗浄液を除去した
後、前記融合細胞の培養上清を１ウェルあたり50μｌ添
加し、室温で１時間保温した。該抗原抗体反応液を除去
した後、１ウェルあたり300μｌの洗浄液を添加し、ウ
ェル内部を洗浄する。次いで、ペルオキシダーゼで標識
した抗マウスIgG(Cappel社製)を１ウェルあたり50μｌ
添加し、室温で１時間保温した。抗マウスＩｇＧ溶液を
除去し、１ウェルあたり300μｌの洗浄液を添加し、ウ
ェル内部を洗浄した。前記操作をさらに２回繰りかえ
し、洗浄液を除去した後、ペルオキシダーゼの基質オル
トフェニレンジアミン／過酸化水素水溶液（OPDA 10mg/
25ml：30％H₂O₂ 2μl/25ml）を１ウェルあたり100μｌ
添加し、マイクロタイタープレートをアルミホイルで被
覆し、室温で２０分間保温した。保温の後、２Ｎ硫酸
を１ウェルあたり50μｌ添加し、ペルオキシダーゼ反応
を停止した。各ウェルの発色を分光光度計（Bio-Rad、M
odel 3550 microplate reader）を用いて、490nmおよび
595nmの吸光度を測定し、両者の差を算出した（以下、
Δ490-595nmと記す。）。融合細胞の培養上清を種々の
倍率で希釈した溶液を用いて上記のELISA法を行い、同
一希釈率で大きいΔ490-595nmを示す融合細胞を選抜し
た。これにより5-メチル-2'-デオキシシチジンに対して
高い親和性を示す融合細胞を得た。上記のようにして得
られた融合細胞クローンに対して限界希釈法によるクロ
ーニングを行ってモノクローナルハイブリドーマクロー
ンを得た。このようにして得られた、クローンの一つで
ある、クローン1D8は平成１３年３月２２日に経済産業
省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所（現、独
立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センタ
ー）に寄託され、受託番号FERM P-18269が与えられてい
る。

【００３９】実施例２．ハイブリドーマ1D8が産生する
抗体のL鎖およびH鎖の可変領域ハイブリドーマ1D8よりmRNAを調製し、cDNA合成、PCRを
経てL鎖のV領域（可変領域）（VL）およびH鎖のV領域
（VH）の遺伝子を得た。この二つの遺伝子を(Gly-Gly-G
ly-Ser)３配列を持つリンカーでつなげてscFv遺伝子と
しファージミドpCANTAB 5Eに挿入し、大腸菌TG1株に感
染させた。ファージレスキュー、パニングを経て免疫源
である5-メチルシチジン-OVAコンジュゲートに親和性を
持つM13ファージを得た。このファージの表面に表現さ
れているscFv遺伝子の配列を確認した。この結果よりH
鎖V領域、L鎖V領域の塩基配列および、各領域に対応す
るアミノ酸配列が決定された。H鎖V領域、L鎖V領域のア
ミノ酸配列をそれぞれ配列番号１および配列番号２とし
て配列表に記載した。

【００４０】実施例３．直接競合阻害ELISA法よる5-メ
チル-2'-デオキシシチジンの測定（１）5-メチルシチジンとALPとの結合体作製 5-メチルシチジン8.85mgを0.1M過ヨウ素酸0.691mlに溶
解し、室温20分反応させた。1Mエチレングリコール0.04
mlを加え反応を停止させた。反応液をALP 2.5mg/0.25ml
蒸留水に添加し5％ K₂CO₃約0.1mlでpH９〜9.5に調節し
た。45分間撹拌し、水素化ホウ素ナトリウム20.7mgを添
加した後18時間静置した。1Mギ酸0.4mlで反応を停止さ
せた後1MアンモニアでpHを8.5に調節した。純水を外液
として二晩透析し精製ALP結合5-メチルシチジンを得
た。

【００４１】（２）直接競合阻害ELISA 実施例１（５）で得られたハイブリドーマ細胞（1D8）
をマウスの腹腔に移植し、１０〜１５日後に得られた腹
水を採取し、硫安分画法によりモノクローナル抗体を精
製した。この操作によって、抗5-メチル-2'-デオキシシ
チジン抗体1D8を用いて以下の試験法にて5-メチル-2'-
デオキシシチジンを測定した。モノクローナル抗体溶液
（1D8抗体10μg／ml）を100μl/ウェルで９６ウェルプ
レートに加え、４℃で一晩静置し、翌日４倍希釈したブ
ロックエースでブロッキングした後、5-メチル-2'-デオ
キシシチジン及び実施例6で作製した適度に希釈されたA
LP結合5-メチルシシチジンを含むPBS溶液を50μl/ウェ
ル加え、３７℃１時間静置した。反応終了後、0.05％ T
ween20-PBSにて2回洗浄の後、2mg/mlの4-ニトロフェニ
ルリン酸を含む緩衝液（0.15M グリシン-NaOH緩衝液（p
H10.3）,1mM MgCl₂, 0.1mM ZnCl₂, 0.25g/l OVA）を100
μlずつ各ウェルにいれ室温にて30分間放置し、発色さ
せた。反応後、1N NaOH 100μlを各ウェルに加え、反応
を停止させた後、405nmの吸光度を測定した。結果を図
１に示す。直接競合阻害ELISA法においても、5-メチル-
2'-デオキシシチジンを測定することができ、その好ま
しい測定範囲は5-メチル-2'-デオキシシチジン約0.1μg
/ml〜約100μg/mlであることが分かった。

【００４２】実施例４．ハイブリドーマクローン1D8が
産生するモノクローナル抗体の評価本発明のモノクローナルについて実施例２と同様の方法
を用いて5-メチル-2'-デオキシシチジンおよび他の類似
化合物に対する反応性について調べた。その結果を表１
に示す。本発明のモノクローナル抗体は、他の類似化合
物である5-メチルシチジンとは13％、5-メチルシトシン
とは15％の交差反応性を示したが、2-デオキシシチジン
には反応性しなかった。（表１）。

【００４３】

【表１】

【００４４】

【発明の効果】本発明により、5-メチル-2'-デオキシシ
チジンに対する特異性の高い抗体およびその抗体を産生
するハイブリドーマの作製方法が提供される。本発明に
よって提供される抗体の一つは、上述したような直接競
合阻害ELISA法で5-メチル-2'-デオキシシチジンの量を
約0.1〜約100μg/mlの範囲で測定できる。また、本発明
の抗体は他の類似化合物である5-メチルシチジンとは13
％、5-メチルシトシンとは15％の交差反応性を示し得る
が、2-デオキシシチジンには結合しない。従って、本発
明により、5-メチル-2'-デオキシシチジンを極めて特異
的に検出し得る免疫化学測定系、特に直接競合阻害ELIS
A法によるアッセイ系を組むことができるようになる。
さらにこのことはメチル化DNAに対する免疫化学測定
系、特に直接競合阻害ELISA法を開発し得ることを示し
ている。

【００４５】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Japan Space Forum TORAY Research Center, Inc. National Space Development Agency of Japan <120> Anti 5-methyl-2'-deoxycytidine antibodies and the method for determination of 5-methyl-2'-deoxycytidine DNA <130> Y1I0211 <140> <141> <160> 2 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 121 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gln Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile Lys Tyr Thr Pro Phe Leu 50 55 60 Glu Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Asn Tyr Tyr Tyr Gly Ser Gly Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 111 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Pro Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg 85 90 95 Glu Leu Thr Arg Ser Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明のモノクローナル抗体1D8の直
接競合阻害ELISA法による5-メチル-2'-デオキシシチジ
ンの測定を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者香川康浩東京都中央区日本橋室町３丁目１番８号株式会社東レリサーチセンター内 (72)発明者渡辺和明東京都中央区日本橋室町３丁目１番８号株式会社東レリサーチセンター内Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA53 CA01 DA20 GA05 HA15 4B064 AG27 CA20 CC24 DA13 4B065 AA91X AA91Y AB05 AC14 BA08 CA25 CA46 4H045 AA11 AA30 BA10 CA40 DA76 EA50 FA72 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】脾臓細胞とミエローマ細胞との細胞融合
を電気融合法によって行なうことを特徴とする、5-メチ
ル-2'-デオキシシチジンに対する抗体を産生するハイブ
リドーマの作製方法。
【請求項２】電気融合法が脾臓細胞とミエローマ細胞
との混合物に10V/cm〜80V/cmの電圧を１〜20秒間かける
工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】電気融合法が脾臓細胞とミエローマ細胞
との混合物に電圧1kV/cm〜5kV/cm、パルス幅10〜100μ
秒間の高電圧パルスをかける工程を含む、請求項１に記
載の方法。
【請求項４】 H鎖可変領域が配列番号１に記載したア
ミノ酸配列を含む、5-メチル-2'-デオキシシチジンに対
する抗体。
【請求項５】 L鎖可変領域が配列番号２に記載したア
ミノ酸配列を含む、5-メチル-2'-デオキシシチジンに対
する抗体。
【請求項６】 H鎖可変領域が配列番号１に記載したア
ミノ酸配列を含み、L鎖可変領域が配列番号２に記載し
たアミノ酸配列を含む、5-メチル-2'-デオキシシチジン
に対する抗体。
【請求項７】請求項４〜６のいずれか１項に記載の抗
体のフラグメントであって、5-メチル-2'-デオキシシチ
ジンに結合し得る抗体フラグメント。
【請求項８】請求項７に記載の抗体フラグメントをコ
ードする核酸分子。
【請求項９】 5-メチル-2'-デオキシシチジンに対する
抗体をコードする核酸であって、配列番号１に記載した
アミノ酸配列をコードする核酸配列を含む前記核酸分
子。
【請求項１０】 5-メチル-2'-デオキシシチジンに対す
る抗体をコードする核酸であって、配列番号２に記載し
たアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む前記核酸分
子。
【請求項１１】 5-メチル-2'-デオキシシチジンに対す
る抗体をコードする核酸であって、配列番号１および配
列番号２に記載したアミノ酸配列をコードする核酸配列
を含む前記核酸分子。
【請求項１２】受託番号FERM P-18269で特定されるハ
イブリドーマ。
【請求項１３】請求項１２に記載のハイブリドーマが
産生する抗体。
【請求項１４】請求項１３に記載の抗体のフラグメン
ト。
【請求項１５】請求項１〜３のいずれか１項に記載の
方法によって作成されるハイブリドーマが産生する、5-
メチル-2'-デオキシシチジンに対する抗体。
【請求項１６】請求項１〜３のいずれか１項に記載の
方法によって作製されるハイブリドーマを培養し、前記
ハイブリドーマの培養上清から抗体を回収することを特
徴とする、5-メチル-2'-デオキシシチジンに対する抗体
の製造方法。
【請求項１７】請求項１２に記載のハイブリドーマを
培養し、前記ハイブリドーマの培養上清から抗体を回収
することを特徴とする、5-メチル-2'-デオキシシチジン
に対する抗体の製造方法。
【請求項１８】請求項４〜６若しくは請求項１３のい
ずれか１項に記載の抗体または請求項７若しくは請求項
１４に記載の抗体フラグメントを用いることを特徴とす
る、メチル化DNAの免疫化学的測定方法。
【請求項１９】直接競合阻害ELISA(Enzyme-linked im
munosorbent assay)である、請求項１８に記載の免疫化
学的測定方法。