JPH04135484A - ８―ハイドロキシ―２’―デオキシグアノシンのモノクローナル抗体及びその製造法並びにモノクローナル抗体を生産するハイブリッド細胞 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、生体より発生するＤＮＡの酸化分解物、８−
ハイドロキシ−２°−デオキシグアノシン（以下、８−
ＯＨｄＧとする）を指標として、これを免疫化学的に迅
速・微量定量することにより、酸化的ストレスを評価す
ることを可能ならしめるもので、成人病、老化、ストレ
スなどに関係する医学・薬学・衛生学などの分野におい
てきわめて有用な８−（ｌＩｌｄＧのモノクローナル抗
体及びその製造法並びにモノクローナル抗体を生産する
ハイブリッド細胞と、８−０１１＋ＩＧ定量キツＩ・並
びにアフィニティクロマＩ・グラフィー用のカラムに関
する。

（従来の技術） これまで、放射線被曝、エネルギー代謝、薬物代謝など
により生じた酸化的ストレスによるＩ）Ｎへ構成塩基の
酸化分解物の定量には、標準となる標品を用いて、薄層
クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、ガ
スクロマトグラフィー質量分析δ１により分離定量か行
われていた。

（発明が解決しようとする課題） 然し乍ら、前記各方法は、天然物試料の定性・定量にお
いては、共存類似物質の妨碍、ＩＩ目的質がクロマ）・
グラ、フィーの検出限界以下の微量の場合、又カラムに
よる分離のために長時間要すること、その上比較的高価
な機器を必要としたりカラムなとの汚染のための、その
更新に多額の費用を要し、経済的でないことなとが指摘
されている。

即ち、天然に存在する低分子性の微量物質の定量評価に
は、その方法が特異的であることが第一の要件である。

その目的には免疫化学的な方法がすぐれているが、共存
する妨６す物質のことを考えるとき、特異性を保証する
ためモノクローナル抗体を利用するのが得策である。然
し、モノクロナル抗体の作製には、類似物質との交叉反
応性の低いことか要求され、その為多大の労力が要求さ
れる。

（課題を解決する為の手段） 本発明は、前記この問題を解決し、８−ＯＨｄＧに対し
、特異性の高いモノクローナル抗体を産生ずる安定した
ハイブリッド細胞（以下、ハイブリドマという）を創出
することができた。又、この抗８−ＯＨｄＧ抗体を利用
して８−ＯＨｄＧ定最のためのキットを構築することに
より、本発明の実用化が可能となった。又、この抗８−
ＯＨｄＧ抗体を利用して８−ＯＨｄＧ定量のためのキッ
トを構築することにより、本発明の実用化が可能となっ
た。又、この抗８−Ｏ１１ｄＧ抗体を用いて、天然の生
体成分中の８−ＯＨｄＧを濃縮するためのアフィニティ
クロマトグラフィー用のカラムも作製することができた
。

即ち、８−ＯＨｄＧ（！：　ＫＬＩ＋　（カサガイ・ヘ
モシアニン）とを結合させてコンシュゲイトを調製し、
これを抗原として、マウスを免疫し、細胞融合法により
、８−ＯＨｄＧに対するモノクローナル抗体を作製した
。

これには、多数回の細胞融合の結果、極少数ではあるが
抗体産生ハイブリドーマを得、この中から限界希釈法に
よる抗体産生クローンを分取したところ、８−ＯＨｄＧ
に極めて特異性の高いクローンを’ｌ’ｒ−＋た。そし
て、このクローンをヌードマウスの腹腔に接種し、腹水
中に抗体を作らせることができた。

また、このクローンの細胞培養により、同一のモノクロ
ーナル抗体を作らせることにも成功した。

本発明は、合成された８−ＯＨｄＧのハブテン抗原によ
り、免疫されたマウスの脾細胞と同系のミエローマとよ
りなることを特徴とした８−０１１（ＩＧハイブリドー
マである。

また他の発明は、合成された８−ＯＨｄＧのハブテン抗
原により、免疫されたマウスの脾細胞と同系のミエロー
マとのハイブリドーマを作製し、前記ハイブリドーマの
増殖により生産されたことを特徴とする抗８−ＯＨｄＧ
モノクローナル抗体であり、次に、８−ＯＨｄＧはモノ
クローナル抗体を用いて構築されたものであり、更に、
抗８−ＯＨｄＧ抗体を用いて作製される８−ＯＨｄＧ濃
縮のためのアフィニティクロマトグラフィー用の吸着カ
ラムである。

また製造法の発明は、合成された８−０１（ｄＧのハブ
テン抗原により、免疫されたマウスの脾細胞と、同系の
ミエローマとのハイブリッド細胞を作製し、該ハイブリ
ドーマを増殖させることにより、抗８ＯＨｄＧモノクロ
ーナル抗体量を増大させた後、該抗８−ＯＨｄＧモノク
ローナル抗体を分離することを特徴とした８−ＯＨｄＧ
のモノクローナル抗体製造法である。

（実施例１） ８−ＯＨｄＧハプテン抗原により、抗８−０１１６Ｇモ
ノクロナル抗体を作るハイブリドーマを作製するには、
サクシニル−８−ハイドロキイデオキシグアノシン（５
ｕｅ−８−ＯＨｄＧ）　Ｉ　ｌ　、　Ｏμモルをジメチ
ルスルフォキサイドに溶解し、これにＮ、Ｎ−カルボニ
ル・ヂ・イミダゾール（Ｃ１）ｌ）（東京化成工業製’
）　１２６．８μモルを加え、室温で２時間反応させた
。ウシ血清アルブミン＋３３Ａ　（生化学二［−業製）
水溶液（２２，２ｍｇ／　ｍｌ　）又はカサガイ・ヘモ
シアニン（Ｋｌ、Ｉｔ）　（Ｓｉｇｍａ）の水溶液（５
，８ｍｇ／ｍ＋）に、夫々前記反応物を加えて室温で一
晩撹拌を行ってコンシュゲイトの反応を完結させた。反
応後、蒸溜水に対して投石を行い、遊離のＣＤＩと５ｕ
ｅ−８−ＯＨｄＧを除去した。前記５ｕｃ−８−Ｏｌｌ
ｄＧとタンパク質との結合量比は、（１１）Ｓカラムを
使用した逆相クロマトグラフィー（１０％メタノール溶
媒）で分析し、ピーク面積比から定量した。

ＫＬＩ＋は８−ＯＨｄＧとの反応後透析により、不溶化
したが、溶媒のｐｌ＋を２５に調製すると再び可溶化し
た。これをＮａ０１１によって加水分解しＩＩＰＩ、Ｃ
により測定したところ、８−ＯＨｄＧ／Ｋ１．ｌＩ＝　
３．２　（モル比）と推定された。又、８−ＯＨｄＧ／
ｌ５Ａ＝　４．ｂｔｇ／ｍ＋であった。

（実施例２） 免疫用の抗原としてＦ！−０１ｋｌＧ／Ｋ１．ｌＩを使
用し、マウス（Ｂａｌｂ／ｃ♀、６週令）の腹腔に、１
回の投与量１００μｇ／マウスをフロイントの完全アジ
ュバン１−　（ＦＣＡ）と共に投与した。２回１１以降
はフロイントの不完全アジュバンｌ−（ＰＩＡ）と共に
投す、シ、８１３〜６回の投！ｊ後、細胞融合を行った
。

ミエローマ細胞としテＰ３旧細胞（Ｐ３−Ｘｆ１３−Ａ
ｇ８−Ｕｌ）を用い】Ｏ％ＦＣ９、５ｘ１０５Ｍ２−メ
ルカプトエタノール、１１１１Ｍピルビン酸を加えたＩ
？Ｐ旧刊６４０培地（日永製薬製）で培養を行った。

肺臓細胞とＰ３Ｕｌ細胞との融合は、常法とおり、９［
１ｗｅｌ　ｌプレートを使用してＩＩＡＴ培地により選
択的にハイブリドーマを増殖させた。１回の細胞融合に
より、平均して１０００個のコロニーが得られ、酵素抗
体法（Ｅｌ八）により１次スクリーニングを行った。抗
体産生の確認されたものは平均継代培養を行った。２４
ｖｅｌ　ｌプレートで増殖のみとめられた細胞について
、ｒ４１Ａにより２次スクリーニングを行い、抗体産生
細胞を再度確認した。その結果、１回の細胞融合によっ
て得られた抗体産生細胞株は１株程度であった。

従って、２０回の細胞融合で得られた抗体産生株の合計
は、１６株となった。この１６株について、液体窒素内
に凍結保存してクローニングに備えた。

（実施例３） 抗体産生細胞のクローニングと交差反応の確認、及び８
−ＯＨｄＧに対する反応特異性の確認について。

抗体産生株１６株の内、Ｎ４５　）１とＮ３１０株の二
つについてクローン化を行った。その結果モノクロナル
抗体を産生ずるクローンＮ４５．Ｉ細胞とＮ３１０．１
細胞が得られた。

Ｎ４５　、　Ｉ細胞とＮ３１０．１細胞の夫々が産生ず
るモノクローナル抗体を含む培養上澄液について、反応
特異性を調べるため、まず蛋白質に対する交差反応を調
べた。９８ｖｅｌ　ｌプレートに５種類の蛋白質を夫々
コートシておき、抗体が反応するがどぅがをみた。その
結果、Ｎ４５．ｌ抗体は８−ＯＨｄＧ／ＵＳＡ（：強く
反応して、ｌ３ＳＡには反応しないことが分がった。

ＯＶＡとＫｌ、ＩＩに対しては、非常に弱いが反応する
可能性が示唆された。一方、Ｎ３１０．１抗体は、８−
０１１ｒｌＧ／！３ＳＡをはじめ、ＢＳＡ（ウシ血清ア
ルブミン）　、０ＶＡ（卵白アルブミン）　、Ｋ１．Ｉ
Ｉにも強く反応することが分かった。カゼインに対して
は、両抗体共に反応しなかった（第３図）。

両抗体の反応阻害実験を、８−０［１ｄＧ／ＢＳＡを抗
原としたＥＩＡ系に遊離の８−ＯＨｄＧを加え、抗原抗
体反応を競合的に阻害できるかとうかによって１１つだ
。

Ｎ４５．ｌ抗体は８−ＯＨｄＧ　］μＭから５００μＭ
の間で濃度依存的に反応が阻害された。ところがＮ３１
０．１抗体は、８−０１１＋ｌＧ５００μＭにおいても
阻害されなかった（第２図）。

従って、Ｎ４５．１抗体は８−ＯＨｄＧに結合し、反応
特異性が高く、Ｎ３１０．ｌ抗体は８−ＯＨｄＧに結合
しないことが分かった。

以上から、クローン４５．１細胞の産生ずるモノクロー
ナル抗体は８−ＯＨｄＧ／ｎｓＡに強く反応し、その反
応は遊離の８−ＯＨｄＧによって濃度依存的に阻害され
た。

従って、Ｎ４５．１抗体は８−ＯＨｄＧに特異的に反応
する抗体であることが判明した。

次に、抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体Ｎ４５．１の
反応交差性を調べるために、ｒ；　ｌ　Ａによる競合阻
害試験を行った。

すなわち、８−ＯＨｄＧ／ＢＳＡ抗原に対してＮ４５．
ｌ抗体が反応する系に４種のヌクレオサイド（２−デオ
キジグアノシン、２°−デオキシアデノシン、２゛−デ
オキシシチヂン、２°−デオキシウリジン）を円３ｓに
溶解させて、２ｍＭ溶液を調製し、８−＋１ＩｌｄＧ／
１３ｓ八抗原をコーチインクした９μｗｃｌｌマイクロ
プレートの１列］」に、ヌクレオシド溶液を入れ、１２
列１″１に向って２培段階希釈し、これに一定量のＮ４
５．ｌ抗体を加えて、３７℃で１時間インキュベートシ
、反応したＮ４５．ｌ抗体量は、ペルオキシダーゼ標識
抗マウスＩｇＧ抗体と０ＰＤＡ　（オルトフェニレンジ
アミン）による発色で検出した。

その結果、Ｎ４５．ｌ抗体の反応は、１μＭから１ｍＭ
の８−ＯＨｄＧによってのみ阻害された（第３図）。

又、Ｎ４５．ｌ抗体の反応は、２°−デオキシグアノシ
ンや、２−デオキシアデノシン、２′−デオキシシチヂ
ン、２−デオキシウリジンによっては阻害されなかった
（第３図）。それで、Ｎ４５．ｌ抗体は８−（ｌＩＩｒ
ｌＧに対し、より特異性の高い抗体と考えられた。

（実施例４） マウス腹水由来の抗８−ＯＨｄＧ抗体の作製抗８−ＯＨ
ｄＧ抗体産生ハイブリドーマＮ４５．Ｉ細胞をヌードマ
ウスの腹腔に移植して得た腹水から、Ｎ４５．１抗体を
精製した。又、この抗体を用いて８ＯＨｄＧ標準溶液に
よる競合阻害試験をＥＩＡ系にて行った。その結果、８
−ＯＨｄＧの検出限界濃度は１　ｎｇ／ｍ１．５０％競
合阻害濃度は、１．５１ｇ／ｍ＋であった。

腹水の作製のため、ヌードマウス（８〜１０週令）に、
抗８−ＯＨｄＧ抗体産生ハイブリドーマＮ４５．Ｉ細胞
を腹腔内注射（１，Ｘ１０７細胞／マウス）後２週間［
１に腹水約４〜８ｍｌ採取した。

Ｎ４５１抗体の精製は、プロティンＡカラムを用いて行
った。

精製に先立って、マウスＩｇＧサブクラス検定キット（
アマジャムジャパン製）を用いて、Ｎ４５．］抗体のサ
ブクラスを決定したところ、本抗体は、ＩｇＧ　］であ
ることが分った。従って、このサブクラスに適したプロ
ティンＡカラムによる精製条件を使用した。

即ち、プロティンＡカラムを３ＭＮａＣＩＩ　、５Ｍク
リシン緩衝液（ｐＨ８，９）で平衡化し、Ｎ４５．ｌ抗
体を含む腹水をカラムに通してＮ４５．ｌ抗体をプロテ
ィンＡに吸着させた。その後、ｐＨ６，０の１００ｍＭ
クエン酸緩衝液にてＮ４５．ｌ抗体を回収し、１）ｌ）
Ｓ　　（０，１％ＮａＮ　３を含む）にて透析を行った
。同様の方法で２回の精製行程を繰り返し行い、合計し
て腹水２ｍｌ　（総蛋白質Ｊｕ１５１．４　ｍｇ）から
Ｎ４５．ｌ抗体液１２．４ｍｌ　（蛋白質２７．４６　
ｍｇ）を得た。また、２度に分けて精製したＮ４５１抗
体の比活性については、同じであることを確認した。

透＋１１終了後、Ｎ４５．ｌ抗体は一２０℃にて凍結保
存した。

（実施例５） 抗８−ＯＨｄＧ抗体を用いた８−ＯＨｄＧアッセイキッ
トの作製（］”：ＩＡ系の構築）について。

前記実施例４におけると同様な競合阻害試験法により、
ＥＩＡ系としての同時再現性の確認試験を行った。すな
わち、ｒｒ６で競合阻害試験を行い、作製した標準曲線
上に標準偏差（Ｓｌ）値）を示した（第４図）。このＳ
Ｄ値から判断して、サンプル内での測定値にばらつきは
少ないと言える。従って、本＋４１Ａ系による抗原検出
の再現性は安定したちのであることが分った。又、Ｎ４
５．ｌ抗体の最適濃度を決めるために、添加する抗体濃
度を０，２μｇ／ｍ＋と０．１μｇ／ｎ＋Ｉの２点設定
し、ｊ−ティングする８ＯＨｄＧ／ＢＳ＾抗原量は、４
．２μｇ／ｍｌ濃度とした（第５図）。

夫々の抗原検出限界値について比較を行った。

その結果、添加する抗体量を０．２μｇ／ｍｌとした場
合の遊離８−ＯＨｄＧ抗原の最少検出限界は５μｇ／ｍ
＋となったが、添加抗体量を０．１μｇ／ｍｌとした場
合には、抗原検出限界は１　ｎｇ／　’ｍｌとなり、測
定感度が上昇した。一方、遊離８−０１１（ＩＧ抗原を
添加しない場合に得られる最大発色値（標準曲線」二の
抗原ゼロ）は、添加抗体０．２１℃ｇ／ｍｌの場合０．
１）、−０，８４であるのに対し、抗体０．１μｇ／ｍ
ｌの場合にはＯ，Ｄ、−０，６９となった。このために
、標準曲線の傾きは抗体濃度を０．２μｇ／ｍｌで用い
た方が急勾配となった。従って、測定の精度を得る場合
には、抗体濃度０．２μｇ／ｍｌが良好と言える。木Ｒ
ＩＡキットでは測定の感度をより良くするために、添加
抗体濃度を０．１μｇ／ｎｎ＋とした。

（実施例６） 抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体によるアフィニティ
クロマトグラフィー用カラムのｆ＋製について。

上記の如く精製した抗８−０１１６Ｇ抗体をＣＮ１３篩
ζ性セフアロース（又はトシル活性化アガロース）に吸
ｉコ１させ、適当な１ノイスのカラムに充填し、８−０
１１＋ｌＧを含む試料を緩徐に通過ぜしめ吸着さぜる。

溶出はチオシアン酸塩などカオＩ・ロピック塩を含む水
溶液によって容易にｉｉわれる。適当な量のＣＮ１３ｒ
セフアロースをとり、１．　ｎ＋ＭＩＩｃｌて膨潤さぜ
た後、ガラスフィルター上で数回１　ｍＭｌｌｃＩで洗
う。次いでカップリング緩衝液で洗い、直ちにカップリ
ング緩衝液で希釈したモノクローン抗体液と混合する（
モノクローン抗体５１Ｔ１ｇ／　＋ｎｌ・ゲル又はそれ
以下の濃度）。室温２時間又は４℃で一晩撹拌しながら
反応させる。次に、上清を除き、ブロッキング液を加え
て室温で２時間もしくは４℃で一装置いて、抗体と反応
していない活性基をブロックする。

次に、カップリング緩衝液と０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ
−５，０）と交互に５回世体を洗浄し、担体と反応して
いないモノクローナル抗体を洗い流す。更に、１）ＢＳ
で洗い、保存する場合０．０５％ＮａＮ３を加えて４℃
で保存する。

以」−の如く調製した担体をカラムに填め、適当な条件
で８−ＯＨｄＧを含む溶液を流す。室温又は４℃で一晩
りＩｓでよくカラムを洗った後溶出液（ＳＣＮ１）１１
７〜８３Ｍ）で溶出する。溶＋（＋後はできるたけ早く
１０％ジオキサンを含む緩衝液でカラムをよく洗った後
、Ｏ，１Ｍトリス−１１ＣＩ緩衝液と０，１Ｍ酢酸緩衝
液で交互に洗い、最後に１）＋３９で洗い０．０５％Ｎ
ａＮ３を加えて４℃で保存する。

（実施例７） 抗８−Ｏ１１ｄＧモノクロナール抗体による尿中の８−
ＯＨｄＧの定量について。（ｌシＩＡ法） ８−ＯＨｄＧ／ＵＳＡ抗原の濃度４．２１ｚｇ／ｍｌに
希釈し、マイクロプレート（９６ｗｅｌｌ）にコーティ
ングするために１００μＩ／ｗｅｌ１分注し、４℃で一
晩静置した。

次に、上清をのぞき、円３Ｓ（０，１％ＮａＮ３　）を
２００μｌ／ｗｅｌ１分注し洗浄した。

ブロッキング液（０，Ｉ％ＢＳＡ−ＰＩ３Ｓ　Ｏ，１％
ＮａＮ３　）を３００μＩ／ｗｅｌ１分注し室温で２時
間もしくは４℃で一晩静置して、抗体のプレートへの吸
着をブロックする。

ブロッキング終ｊ′後、ｌ）＋３３（０，１％ＮａＮ、
　）を２００μＩ／ｗｅｌ１分注し洗浄した。

８−ＯＨｄＧ標準液はＯ（１）＋３３のみ）　、６４１
）ｇ／ｍｌ、　３２０ｒ１ｇ／ｍｌ、　Ｉ　、　Ｆｉｎ
ｇ／　ｍｌ、８　ｎｇ／　ｎ＋１．４０ｎｇ／ｍｌ、２
０（）ｎｇ／ｍｔ　（最終濃度）の８点を取り、これら
を順に５０　ｐ　Ｉ　／ｖｅｌ　ｌでプレートに分注し
、ｎ＝３で検量線を作成した。

サンプルは、起床後−寄切めの尿を用い、５０１ｚＩ／
ｗｅｌｌでプレートに分注した。

これにＮ４５．Ｉ抗体（タンパク質量０．２μｌ／ｎｎ
１）を５０　ｌｔ　Ｉ　／ｗｅｌ　Ｉで分注して、３７
℃で１時間インキュベート・シ、反応後、上清を除き０
．０５％Ｔｗｃｃｎ　２Ｏ−Ｐ１３Ｓ（ＮａＪｆｒｅｅ
）２００７ｚ　Ｉ／ｗｅｌ１分注し洗浄した。

次に、ペルオキシダーゼ標識抗マウス１ｇＧ抗体（１／
１．０００希釈）を、１００μげｗｅｌｌでプレート分
ｌ＋し、３７°Ｃで１時間インキュベートシた後、上清
を除き、０．０５％Ｔｗｃｃｎ　２Ｏ−ＰＩ３Ｓ（Ｎａ
Ｎ３　）２００μＩ／ｗｃｌ　１分注し洗浄した。

ｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｄｉａｍｉｎ（０円）Ａ）による
発色で検出する為に、５０ｍＭクエン酸−１００ｍＭＮ
ａ２１１Ｐｃ４　　・１２Ｈ２０緩衝液ｐ１１４．５を
用意し、０ＰＤＡを１０ｇ７２５ｍ１の濃度で遮光しな
がら溶し、使用直前に、３５％Ｈ２Ｏ２溶液を１０μｍ
加えた。　１００μＩ／ｗｅｌｌでプレートに分注し、
室温で３０分間遮皮下利しながらインキュベートし、２
Ｎｌ１２　ＳＯ４溶液を１００１ｚ　Ｉ／ｖｅｌ　ｌで
プレトに加え反応を停止した。

反応停止後、４９２−１３２０ｎｍの吸光度を測定し、
検量線を作成後、サンプルの８−０１１ｄ（４を求めた
。その結果、尿中の８−ＯＨｄＧの定量が可能となった
。

（発明の効果） 本発明によれば、８−ＯＨｄＧ抗体を効率よく作製でき
ると共に、これを用いることにより従来法に比較して、
はるかに効率よく微量の８−０１１（ＩＧ　（１，ｎｇ
／ｍ＋）を再現性よく定量することができる効果がある
。又、遺伝毒性の評価のためには、１ｌ−ＯＨｄＧ抗体
をアフィニティカラムにより効率的に濃縮し、極微量レ
ベルにおいても追跡することができる効果がある。

【図面の簡単な説明】

第１図はＮ４５．ｌ抗体、Ｎ８１ｔ１．ｌ抗体の各種蛋
白質に対する交差反応の検出を示すグラフ、第２図はＮ
４５．ｌ抗体、Ｎ３１０．１抗体に対する競合阻害試験
を示すグラフ、第３図はヌクレオサイドによるＮ４５１
抗体の競合試験のグラフ、第４図はＮ４５．ｌ抗体濃度
Ｑ　、　ｌ　μｇ／ｍｌと０．２７ｚｇ／ｍ＋の標準曲
線図、第５図は８−ＯＨｄＧ競合阻害試験における標準
曲線の同時再現性を示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　合成された８−ハイドロキシ−２′−デオキシグア
   ノシン（８−ＯＨｄＧ）のハプテン抗原により、免疫さ
   れたマウスの脾細胞と同系のミエローマとよりなること
   を特徴とした８−ＯＨｄＧハイブリッド細胞 ２　合成された８−ハイドロキシ−２′−デオキシグア
   ノシンのハプテン抗原により、免疫されたマウスの脾細
   胞と同系のミエローマとのハイブリッド細胞を作製し、
   前記ハイブリッド細胞の増殖により生産されたことを特
   徴とする抗８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体３　請求項
   ２記載の８−ＯＨｄＧモノクローナル抗体を用いて構築
   された８−ＯＨｄＧ定量用免疫測定キット ４　請求項２記載の抗８−ＯＨｄＧ抗体を用いて作製さ
   れる８−ＯＨｄＧ濃縮のためのアフィニティクロマトグ
   ラフィー用の吸着カラム ５　合成された８−ハイドロキシ−２′−デオキシグア
   ノシンのハプテン抗原により、免疫されたマウスの脾細
   胞と、同系のミエローマとのハイブリッド細胞を作製し
   、該ハイブリッド細胞を増殖させることにより、抗８−
   ＯＨｄＧモノクローナル抗体量を増大させた後、該抗８
   −ＯＨｄＧモノクローナル抗体を分離することを特徴と
   した８−ハイドロキシ−２′−デオキシグアノシンのモ
   ノクローナル抗体製造法