JPH0272894A - 単クローン性抗体及びこれを用いるアコニチン系アルカロイドの測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は猛毒なアコニチン系アルカロイドの一つでろる
アコニチンに対する単クローン性抗体および該抗体を用
いるアコニチン系アルカロイドの測定法に関する。

〔従来の技術及びその課題〕

日本の山野には猛毒なアコニチン系アルカロイドを含む
トリガブト属植物が自生しており、これを誤って採取し
食することによる中毒の例が報告１れている。この様な
事故に対し適切な処置を施すためには、簡便な操作で短
時間かつ正確にその原因を解明することか急務となる。

こ−ｒＬまでにアコニチン系アルカロイドの定量法とし
て、濾紙電気泳動法、薄層クロマトグラフィー　マルチ
パツ７アーペーノＱ−クロマトグラフィー　ガスクロマ
トグラフィー及び高速液体クロマトグラフィーなどが報
告されているが、微量定量が困難である上に、サンプル
の前処理等が繁雑でろり、多検体を測定するには非常に
長時間を要するという欠点がめつ几。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、簡便なアコニチン系アルカロイドの測定
法を開発すべく１種々検討をおこなつ九結果、アコニチ
ンに対する単クローン性抗体を新几に作製し、こｎｔｌ
−用いることにエリ、サンプルの前処理操作７行うこと
なく簡便かつ迅速にアコニチン系アルカロイドが測定で
きることを見い出し１本発明を完成した。

すなわち本発明は、アコニチンに対する単クローン性抗
体及びこれを用いるアコニチン系アルカロイドの測定方
法ｔ−ｍ供するものでめる。

本発明のアコニチンに対する単クローン性抗体は１例え
ば次のごとくして調製てれる。

すなわち、まず、アコニチンと無水コノ・り酸を反応さ
せ、その生成物でろるアコニチンヘミサクシネートを用
いて動物全免疫し、その動物の牌細胞を採取する。この
工程に於いて、アコニチンヘミサクシネートはそれ単独
では免疫原となりえないので、適当なキャリア・ｆ′−
ティン（ＣａｒｒｉｅｒＰｒｏｔｅｉｎ　’）と結合さ
せ几のち、免疫原として用いる。キャリア・プロティン
としては、ノ・ゾテンとなる物質全免疫担当細胞が認識
することを可能にする目的に用いられるプロティン、例
えばキーホール・リンベット・ヘモシアニン、　牛血ｍ
アルブミン、人血清アルブミン及び卵白アルブミン等を
用いることで５できる。まｔ、このアコニチンヘミサク
シネートとキャリア・ゾロティン金結合する方法として
は１例えば酸無水物法等の方法か挙げられる。更に、免
疫動物としては、マウス　ラット等が挙げられる。

次に得られた免疫動物の牌細胞全骨髄腫細胞と融合し、
−・イブリドーマを得る。細胞融合においてハ、公知の
ぼりエチレングリコールを用いる方法及びセンダイウィ
ルスを用いる方法のいず几を用いても良いが、ハイプリ
ドーマのスクリーニングに当っては、キャリア・プロテ
ィンに対する抗体産生ハイプリドーマを除去する九めの
留意が必要でろる。この几めには、免疫に用い九キャリ
ア・プロティンと異なった種由来のプロティンをアコニ
チンヘミサクシネートに結合させ九ものを抗原として用
い、スクリーニング全行う等の方法を用いることが望ま
しい。

次いで得られ九ノ・イブリドーマを培養して該培養物か
ら単クローン性抗体を採取するか、または・・イブリド
ーマ全動物体内に移植し、その腹水から単クローン性抗
体を採取することにより１本発明の単クローン性抗体が
得られる。

ここで培養物まｔは腹水から本発明率クローン性抗体を
分離するには、硫安塩析等を用いればよい０ かくして得られる本発明の単クローン性抗体は。

次に示すごとき性質を有する。

（１）　　抗体のクラス：　ＩｇＧ、１、（２）抗体価
：　３０００倍 （３）交差反応性　：メサコニチン　３０〜４５％。

ヒパコニチン　３０〜４５％ 斜上の如くして得られ九本発明の単クローン性抗体を用
いてアコニチン系アルカロイド全測定するＫは、被検体
にアコニチンに対する単クローン性抗体を加え、生じた
アコニチン系アルカロイド−単クローン性抗体複合体量
全測定することにより行なわれる。

好ましい実施態様は次の通りでるる。

すなわち、９６ウエルデレートに、アコニチンヘミサク
シネートと牛血清アルブミン（ＢＳＡ）の結合物ｔ−０
，５μｇ／穴で添加し几のち４℃で、１２〜２４時間放
置する。次に各ウェルに１％ＢＳＡを含むリン酸緩衝生
理食塩水（ＰＢＳ’）ｋ１００μｌずつ添加することに
エリ、抗体その他のタン／ｌｉ’りの吸着全防止する。

次に試料（血液など）を各ウェルに５０μ！添加しさら
に、アコニチンに対する単クローン性抗体（２５００倍
希釈液）を各ウェルに５０　ｐｌ添加する。よくかくは
んし几のちに。

４℃で１時間放置する。反応混合物ＱＰＢＳでよく洗浄
し几のちに、アルカリホスファターゼ標識ヤギ抗マウス
ＩｇＧの３０００倍希釈液を各ウェルに１００μｌずつ
添加する。４℃で４５分間反応させ次のちに、ＰＢＳで
よく洗い、水分を切ったのちＶＣ基質溶液ｃノＱラニト
ａフェニルフォスフェート１〜／ａｔ、ｐＨ９，８ジェ
タノールアミンバッファー）を１００μｌずつ加え３７
℃で３００分間反応せる。

各ウェルの４０５ｎｍにおける吸光度ｋ　Ｅ　Ｉ　Ａ　
ＩＪ　−キーで測定することにより試料中に存在するア
コニチン量の定量を行う。

〔本発明の効果Ｊ 以上の工うに本発明の単クローン性抗体金用いれば、試
料の前処理金おこなうことなくアコニチン系アルカロイ
ドの測定をおこなうことができ。

しかも高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のごと
き大がかりな装置も必要としないので、簡便かつ迅速に
試料中のアコニチン系アルカロイドの有無全判定するこ
とができる。

〔実施例〕

次に実施例を挙げ、本発明全説明する。

実施例１ （１）　　免疫原の調製ニ アコニチンと無水コハク酸紫ビリシン中室温で２日間反
応させることにより合成したアコニチンヘミサクシネー
トと、キャリア・プロティンであるキーホール・リンペ
ット・ヘモシアニン（Ｋｅｙｈｏｌｅ　ｌｙｍｐｅｔ　
ｈｃｍｏｓｉａｎｉｎｅ　；　Ｋ　Ｌ　Ｈ）ｋ酸無水物
法にエフ結合しｔｏすなわち、アコ二チンヘミサクンネ
ートｔトリーｎ−ブチルアミン及びインブチルクロロカ
ーボネートと反応させ酸無水物を作り、アルカリ性（ｐ
Ｈ８５）条件下でＫＬＨと結合させた。この反応混合物
を緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水、　ｐＨ７，４’ｌ中
で一晩透析し、未反応の７コニチンヘミサクシネートを
除き、このめと凍結乾燥に付し一２０℃の冷凍庫内に保
存し友。

（２）単クローン性抗体の作製： （１）　　＋ｘ＋で得たアコニチンヘミサクシネートと
ＫＬＨ結合物金、フロイントの完全アゾユパン）　（Ｆ
ｒｅｕｎｄ’ｓ　Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ａｄｊｕｖａｎｔ
　）と等量混合シ、エマルションとし北のち、ＢＡＬＢ
／ｃマウスの腹腔内に一匹当り３０ｐ９投与した。２回
目以降は不完全アゾユバン）　（ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ
ａｄｊｕｖａｎｔ　）ｔ”用い几エマルションを、１０
日間隔で２回腹腔内に投与し几。最終免疫はアコ二チン
ヘミサクシネー）−ＫＬＨ１１００Ｐ／Ｒ１溶液を、０
．２ｍｌ静脈内投与した。

（■）最終免疫の３日後に過免疫マウスから採取し建碑
細胞とＢＡＬＢ／ｃ　マウス由来ミエローマ細胞株ＳＰ
２１０−Ａｇ１４−Ｋ１３を？リエチレングリコール（
ＰＥＧ）４０００　全相いて融合し友。

細胞は９６穴プレートに１ｏｏｐｌ／穴ずつ加え、２４
時間後に培地の半量をハラ）（ＨＡＴ’）培地に交換し
２日おきに培地交換した。７〜１ｏ日後にハツト耐性の
ハイプリドーマの成長がみられてぐる。この時期に培地
をＨＴに変え、約１０日間培養し之のちにハイグリドー
マ生育培地に変え友。

（ＩＩＤ　　抗体産生細胞のスクリーニングはアコニチ
ンヘミサクシネートと牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を結
合重せ友ものを抗原として用い２抗体エライザ（ＥＬＩ
ＳＡ）法により行った。この方法により最も憂慮される
キャリア・７’ｏテインに対する抗体を産生ずるハイグ
リドーマを除外した。

次にアコニチンによる阻害がかがるが否が全検討するこ
とにエリアコニチンと特異的に反応する単クローン性抗
体を産生ずるハイプリドーマ全選択した。ここで選択て
れた細胞株を限界希釈法に＝リフローン化し単クローン
性抗体産生バイブリドーマクａ−ンを樹立し友。なお、
アコニチン系アルカロイドの測定には、ハイプリドーマ
全マウスに移植し、１０〜１５日目に採取し之腹水を硫
安塩析によＶ精製し九単クローン性抗体金用１／’１友
。

（３）　　単クローン性抗体の性質 アコニチンに対する単クローン性抗体は２種得られ抗体
のクラスはいずれもＩｇＧ、□でめつ九。

抗体価は３０００倍（マウス腹水から精製し次抗体全２
段階希釈し、そ几ぞｎとアコニチンヘミサクシネート−
ＢＳＡ苓：反応てせるＥＬＩＳＡ’ｉ行った時、最も高
い吸光度の持続する希釈倍率？抗体価とし友）でろつ友
。交差反応性を検討し九ところ。

アコニチン系アルカロイドであるメサコニチン及びと７
９二二チンと３０〜４５％の交差反応性全示し、これら
の検出にも有効でるることが判明した。

実施例２ アコニチンの３００，１００，３０，１０，３，１，０
．３及び０．１μ９７ｍｔ溶液’ｔ６らかじめアコニチ
ンＢ　Ｓ　Ａ　Ｏ，５μｇ／ウェルでコートされ几９６
ウェルプレートに５０ｐｌずつ加え、更に実施例１で得
几単クローン性抗体の３０００倍希釈液′Ｆ！：５０μ
ｌ　ずつ加えてインヒピンヨンエリザ（１ｎｈｉｂｉｔ
ｉｏｎＥＬＩＳＡ　）Ｔｈおこなつ九。この結果、第１
図に示すように添加したアコニチンの量に比例して抗体
とアコニチン−ＢＳＡの結合か阻害されることが明らか
となつ九。この測定系によるアコニチンの検出感度は、
１１００ｎ以下でめつ几。

【図面の簡単な説明】

第１図はアコニチンを測定する際の検量線を示す図面で
ある。 以上 出願人　財団法人　仙台微生物研究所 １＋

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、アコニチンに対する単クローン性抗体。 ２、次の性質 （１）抗体のクラス：ＩｇＧ＿１＿、＿ｋ （２）抗体価：３０００倍 （３）交差反応性： （Ａ）メサコニチン３０〜４５％ （Ｂ）ヒパコニチン３０〜４５％ を有する請求項１記載の単クローン性抗体。 ３、被検体にアコニチンに対する単クローン性抗体を加
   え、生じたアコニチン系アルカロイド−単クローン性抗
   体複合体量を測定することを特徴とするアコニチン系ア
   ルカロイドの測定法。