JP2819133B2 - カテコールアミン代謝産物の測定法 - Google Patents
カテコールアミン代謝産物の測定法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はカテコールアミン代謝産物に対するモノクロ
ーナル抗体を用いて３−メトキシ、４−ヒドロキシル基
を有するカテコールアミン代謝産物を分別定量する方法
に関するものである。
ーナル抗体を用いて３−メトキシ、４−ヒドロキシル基
を有するカテコールアミン代謝産物を分別定量する方法
に関するものである。
一般に、ヒト尿中に出現するカテコールアミン代謝産
物、とりわけ、バニリルマンデル酸（以下VMAと略す）
とホモバニリル酸（以下HVAと略す）が、種々の疾患に
かかわるマーカーとなっていることが見出されている。
物、とりわけ、バニリルマンデル酸（以下VMAと略す）
とホモバニリル酸（以下HVAと略す）が、種々の疾患に
かかわるマーカーとなっていることが見出されている。
しかし、最近になって、とくにHVAは、神経細胞腫に
おいて高値を示すことが分かり、新生児における神経細
胞腫のスクリーニング項目として重要な意味を持つよう
になってきた。
おいて高値を示すことが分かり、新生児における神経細
胞腫のスクリーニング項目として重要な意味を持つよう
になってきた。
本発明のカテコールアミン代謝産物の測定法はHVA、V
MAをきわめて簡便に分別定量することができるので、関
連疾病の診断に大いに貢献するものである。
MAをきわめて簡便に分別定量することができるので、関
連疾病の診断に大いに貢献するものである。
（従来技術及び問題点） 従来、VMA、HVAを迅速にかつ簡便に分別定量する方法
は知られていない。
は知られていない。
従来法としては、尿中に狭雑する物質を分離する工程
（前処理）と抽出されたHVA、VMAを分別定量する工程
（分析）とからなっているが、はん雑な前処理やHPLC
（高速液体クロマトグラフィー）を使用する分析など処
理操作を含めてはん雑であり、また分析に時間を要する
など種々の欠点がみられるのである。
（前処理）と抽出されたHVA、VMAを分別定量する工程
（分析）とからなっているが、はん雑な前処理やHPLC
（高速液体クロマトグラフィー）を使用する分析など処
理操作を含めてはん雑であり、また分析に時間を要する
など種々の欠点がみられるのである。
従来技術の問題点を次に列挙する。
1.VMA、HVA以外の狭雑物を有機溶媒処理等により除去す
る必要がある。
る必要がある。
2.測定法によっては、VMA、HVAを各々誘導体に変換する
必要があり（ガスクロマト法）、分析操作手順がはん雑
である。
必要があり（ガスクロマト法）、分析操作手順がはん雑
である。
3.特別な装置を必要とし、（ガスクロマト法、HPLC法、
GC−MS法）、自動分析システムとしての応用がむずかし
い。
GC−MS法）、自動分析システムとしての応用がむずかし
い。
4.分析装置もしくは分析方法が特殊であり、誰でも、迅
速に、簡便に測定できるようにはなっていない。
速に、簡便に測定できるようにはなっていない。
（問題点を解決するための手段） 本発明者らは、ヒト尿中に見出されるVMAとHVAの両者
を迅速にかつ簡便に分別定量できる測定系が確立できれ
ば、神経芽腫や代謝異常症の早期発見、モニタリングが
できるようになるとの発想のもとに鋭意研究した結果、
本発明において、３−メトキシ、４−ヒドロキシル基を
有するカテコールアミン代謝産物と特異的に反応するモ
ノクローナル抗体を用いれば、競合的酵素免疫分析法に
よってVMA、HVAが簡便に分別定量できることを知ったの
である。
を迅速にかつ簡便に分別定量できる測定系が確立できれ
ば、神経芽腫や代謝異常症の早期発見、モニタリングが
できるようになるとの発想のもとに鋭意研究した結果、
本発明において、３−メトキシ、４−ヒドロキシル基を
有するカテコールアミン代謝産物と特異的に反応するモ
ノクローナル抗体を用いれば、競合的酵素免疫分析法に
よってVMA、HVAが簡便に分別定量できることを知ったの
である。
本発明は３−メトキシ、４−ヒドロキシル基を有する
カテコールアミン代謝産物と特異的に反応するモノクロ
ーナル抗体を用いて競合的酵素免疫分析法により３−メ
トキシ、４−ヒドロキシル基を有するカテコールアミン
代謝産物を分別定量することを特徴とするカテコールア
ミン代謝産物の測定法である。
カテコールアミン代謝産物と特異的に反応するモノクロ
ーナル抗体を用いて競合的酵素免疫分析法により３−メ
トキシ、４−ヒドロキシル基を有するカテコールアミン
代謝産物を分別定量することを特徴とするカテコールア
ミン代謝産物の測定法である。
また、本発明は競合的免疫分析法に於いて、抗原と抗
体との免疫化学的反応を環境条件を制御して調節し、種
々のカテコールアミン代謝産物に対するモノクローナル
抗体の親和性を変化せしめ、各々のカテコールアミン代
謝産物を分別定量することを特徴とするカテコールアミ
ン代謝産物の測定法である。
体との免疫化学的反応を環境条件を制御して調節し、種
々のカテコールアミン代謝産物に対するモノクローナル
抗体の親和性を変化せしめ、各々のカテコールアミン代
謝産物を分別定量することを特徴とするカテコールアミ
ン代謝産物の測定法である。
また、本発明は３−メトキシ、４−ヒドロキシル基を
有するカテコールアミン代謝産物が、バニリルマンデル
酸又はホモバニリル酸であることを特徴とするカテコー
ルアミン代謝産物の測定法である。
有するカテコールアミン代謝産物が、バニリルマンデル
酸又はホモバニリル酸であることを特徴とするカテコー
ルアミン代謝産物の測定法である。
本発明のカテコールアミン代謝産物の測定法において
はカテコールアミン代謝産物に対するモノクローナル抗
体が使用される。
はカテコールアミン代謝産物に対するモノクローナル抗
体が使用される。
このモノクローナル抗体は、カテコールアミン代謝産
物をBALB/Cマウスに免疫して、抗血清中に本免疫抗原に
対する抗体価が、酵素免疫分析法（EIA）等の方法によ
り有意に認められたのち、脾細胞を摘出し、マウスミエ
ローマ細胞株（ヒポキサンチン、グアニンホスホリボシ
ルトランスファラーゼ;HGRP欠損株、HAT培地感受性、XA
g8.6.5.3等）との細胞融合により、本抗原に対するモノ
クローナル抗体を産生する細胞を不死化させ、当該ハイ
ブリドーマ細胞株を培養することで製造される。
物をBALB/Cマウスに免疫して、抗血清中に本免疫抗原に
対する抗体価が、酵素免疫分析法（EIA）等の方法によ
り有意に認められたのち、脾細胞を摘出し、マウスミエ
ローマ細胞株（ヒポキサンチン、グアニンホスホリボシ
ルトランスファラーゼ;HGRP欠損株、HAT培地感受性、XA
g8.6.5.3等）との細胞融合により、本抗原に対するモノ
クローナル抗体を産生する細胞を不死化させ、当該ハイ
ブリドーマ細胞株を培養することで製造される。
免疫抗原としてのカテコールアミン代謝産物として
は、３−メトキシ、４−ヒドロキシル基を有するカテコ
ールアミン代謝産物、例えばVMA、HVA、メタネフリンな
どがあるが、いずれでもよい。
は、３−メトキシ、４−ヒドロキシル基を有するカテコ
ールアミン代謝産物、例えばVMA、HVA、メタネフリンな
どがあるが、いずれでもよい。
３−メトキシ、４−ヒドロキシル基を有するカテコー
ルアミン代謝産物、例えば市販のd,l−VMAはキャリアー
蛋白質、例えば、KLHやBSA等に架橋化試薬の作用のもと
に結合させることで抗原が調製される。
ルアミン代謝産物、例えば市販のd,l−VMAはキャリアー
蛋白質、例えば、KLHやBSA等に架橋化試薬の作用のもと
に結合させることで抗原が調製される。
得られたd,l−VMA抗原をBALB/Cマウス腹腔内に、フレ
ンド完全アジュバンドまたは不完全アジュバンドととも
に免疫する。免疫後、部分採血を行ない、抗血清中のd,
l−VMAに対する抗体価を免疫分析法、例えば、受身凝集
反応、EIA、RIA、望ましくはEIA法にて測定する。
ンド完全アジュバンドまたは不完全アジュバンドととも
に免疫する。免疫後、部分採血を行ない、抗血清中のd,
l−VMAに対する抗体価を免疫分析法、例えば、受身凝集
反応、EIA、RIA、望ましくはEIA法にて測定する。
EIA法にて測定する場合は、例えば固相化VMA抗原に対
する抗体価を、２次抗体として西洋ワサビペルオキシダ
ーゼ標識ウサギ抗マウスIgG抗体を使用して、VMA抗原と
反応して、反応後固相VMA抗原に結合した抗血清中に存
在するマウスイムノグロブリン量を測定することができ
る。
する抗体価を、２次抗体として西洋ワサビペルオキシダ
ーゼ標識ウサギ抗マウスIgG抗体を使用して、VMA抗原と
反応して、反応後固相VMA抗原に結合した抗血清中に存
在するマウスイムノグロブリン量を測定することができ
る。
しかるべき抗体価の上昇が認められれば、さらにVMA
免疫抗原を追加免疫した後、免疫動物より脾細胞を摘
出、調製し、不死化しているマウスミエローマ細胞株
（XAg8.6.5.3）と一般的なポリエチレングリコール（M.
W.1,500）を融合剤として使用し、マウスハイブリドー
マ細胞を得ることができる。HAT選択培地にて、融合細
胞のみを増殖させ、培養上清中に存在するVMA抗原に特
異的な抗体活性を、上記EIA法にて見出することによ
り、目的とするモノクローナル抗体が得られるものであ
る。
免疫抗原を追加免疫した後、免疫動物より脾細胞を摘
出、調製し、不死化しているマウスミエローマ細胞株
（XAg8.6.5.3）と一般的なポリエチレングリコール（M.
W.1,500）を融合剤として使用し、マウスハイブリドー
マ細胞を得ることができる。HAT選択培地にて、融合細
胞のみを増殖させ、培養上清中に存在するVMA抗原に特
異的な抗体活性を、上記EIA法にて見出することによ
り、目的とするモノクローナル抗体が得られるものであ
る。
本発明は、ここに得られる３−メトキシ、４−ヒドロ
キシル基を有するカテコールアミン代謝産物と特異的に
反応するモノクローナル抗体を用いて競合的酵素免疫分
析法により３−メトキシ、４−ヒドロキシル基を有する
カテコールアミン代謝産物を分別定量するものである。
キシル基を有するカテコールアミン代謝産物と特異的に
反応するモノクローナル抗体を用いて競合的酵素免疫分
析法により３−メトキシ、４−ヒドロキシル基を有する
カテコールアミン代謝産物を分別定量するものである。
この分別定量が可能となったのは、モノクローナル抗
体と、抗原である３−メトキシ、４−ハイドロキシル基
を有するカテコールアミン誘導体、とくにVMAとHVAの各
々における免疫化学反応を詳しく調べた結果、抗体の両
者に対する親和性は、免疫化学反応をおこなう環境条件
（因子）によって変化し、さらには、両者に対する抗体
の親和性の比が異ってくることを新たに見出したことが
基礎となっている。
体と、抗原である３−メトキシ、４−ハイドロキシル基
を有するカテコールアミン誘導体、とくにVMAとHVAの各
々における免疫化学反応を詳しく調べた結果、抗体の両
者に対する親和性は、免疫化学反応をおこなう環境条件
（因子）によって変化し、さらには、両者に対する抗体
の親和性の比が異ってくることを新たに見出したことが
基礎となっている。
一般に、抗原と抗体間の免疫化学反応は、 1.イオン結合 2.疎水結合 3.水素結合 4.ファンデルワース力 等の相互作用の組み合せにより成立していることが知ら
れている。これらは、いずれも共有結合ではないため
に、しかるべき環境の変化により、その結合は、切断さ
れ、いったん形成された免疫複合体が壊われ、抗原及び
抗体は遊離型へともどっていく。このような事実は、広
く知られ、その応用例としては、抗原もしくは抗体を固
定化リガンドとしたイムノアフィニティークロマトグラ
フィーが挙げられる。
れている。これらは、いずれも共有結合ではないため
に、しかるべき環境の変化により、その結合は、切断さ
れ、いったん形成された免疫複合体が壊われ、抗原及び
抗体は遊離型へともどっていく。このような事実は、広
く知られ、その応用例としては、抗原もしくは抗体を固
定化リガンドとしたイムノアフィニティークロマトグラ
フィーが挙げられる。
本発明では、３−メトキシ、４−ハイドロキシル基を
有するカテコール代謝産物とそれに対するモノクローナ
ル抗体間の結合性とその相互作用は、水素結合に影響を
与えるジメチルスルホキシド、エチレングリコール、ま
たイオン結合性を弱めると考えられるNaCl等の塩濃度、
更にはpHにより強く影響を受けるものであるところか
ら、あらかじめ種々の環境条件における各物質に対する
モノクローナル抗体の結合性を示す標準曲線を求め、こ
れと同じ環境条件下において尿等の試料の測定を行い、
各物質の含有量及びその含有比率をすみやかに定量する
ことができるものである。
有するカテコール代謝産物とそれに対するモノクローナ
ル抗体間の結合性とその相互作用は、水素結合に影響を
与えるジメチルスルホキシド、エチレングリコール、ま
たイオン結合性を弱めると考えられるNaCl等の塩濃度、
更にはpHにより強く影響を受けるものであるところか
ら、あらかじめ種々の環境条件における各物質に対する
モノクローナル抗体の結合性を示す標準曲線を求め、こ
れと同じ環境条件下において尿等の試料の測定を行い、
各物質の含有量及びその含有比率をすみやかに定量する
ことができるものである。
次に本発明の製造例及び実施例を示す。
製造例 （３−メトキシ、４−ヒドロキシル基を有するカテコー
ルアミン代謝産物と特異物に反応するモノクローナル抗
体の製造） 1.BALB/Cマウスへの免疫及び細胞融合。
ルアミン代謝産物と特異物に反応するモノクローナル抗
体の製造） 1.BALB/Cマウスへの免疫及び細胞融合。
市販d,l−バニリルマンデル酸（VMA）を予め水溶性カ
ルボジイミド（EDC）を用い、Keyhdelimpet hemocyani
n（KLH）に結合させ、得られた50μｇのVMA−KLH結合体
をBALB/Cマウス（♂、４週令）にフレンド完全アジュバ
ントと共に腹腔内注射した。その後、隔週毎に２度同量
のVMA−KLH結合体をフレンド不完全アジュバントと共に
追加免疫を実施した。マウスミエローマ細胞（XAg8.6.
5.3）との細胞融合を行なう３〜４日前に、10μｇのVMA
−KLHをPBS（−）に溶解し、腹腔内にブースター注射を
した。
ルボジイミド（EDC）を用い、Keyhdelimpet hemocyani
n（KLH）に結合させ、得られた50μｇのVMA−KLH結合体
をBALB/Cマウス（♂、４週令）にフレンド完全アジュバ
ントと共に腹腔内注射した。その後、隔週毎に２度同量
のVMA−KLH結合体をフレンド不完全アジュバントと共に
追加免疫を実施した。マウスミエローマ細胞（XAg8.6.
5.3）との細胞融合を行なう３〜４日前に、10μｇのVMA
−KLHをPBS（−）に溶解し、腹腔内にブースター注射を
した。
得られた脾細胞とマウスミエローマ細胞とは、通常の
方法に従い、50％（w/v）ポリエチレングリコール（MW.
1,500）を用いて細胞融合をした。融合細胞は、48穴−
マイクロプレート（コースター社）に1well当り106個に
なるようにして播種し、15％FCSを含むHAT培地（ピポキ
サンチン、アミノプテリン、チミジンを含んだRPMI−16
40培地）にてその後、ハイブリドーマ細胞のみを選択培
養した。
方法に従い、50％（w/v）ポリエチレングリコール（MW.
1,500）を用いて細胞融合をした。融合細胞は、48穴−
マイクロプレート（コースター社）に1well当り106個に
なるようにして播種し、15％FCSを含むHAT培地（ピポキ
サンチン、アミノプテリン、チミジンを含んだRPMI−16
40培地）にてその後、ハイブリドーマ細胞のみを選択培
養した。
2.カテコールアミン代謝産物に特異的なモノクローナル
抗体のスクリーニングとその反応特性。
抗体のスクリーニングとその反応特性。
VMA−BSA結合体を物理化学的に吸着したEIA用マイク
ロタイタープレート（ヌンク社）を用い、そこに、ハイ
ブリドーマ細胞株を培養して得られた上清を添加、反応
させ３−メトキシ、４−ヒドロキシル基を有するカテコ
ールアミン代謝産物に特異的なモノクローナル抗体のス
クリーニング法とした。
ロタイタープレート（ヌンク社）を用い、そこに、ハイ
ブリドーマ細胞株を培養して得られた上清を添加、反応
させ３−メトキシ、４−ヒドロキシル基を有するカテコ
ールアミン代謝産物に特異的なモノクローナル抗体のス
クリーニング法とした。
実際の測定法は、100μのハイブリドーマ細胞培養
上清を先のVMA−VSA固相化マイクロタイタープレートに
添加し、37℃で60分間インキュベートした後、よく洗浄
後、吸着したマウスイムノグロブリンにHRPOD（西洋ワ
サビペルオキシダーゼ）標識したウサギ抗マウスIgG
（Ｈ＆Ｌ鎖）抗体（マイルズ社）を同様の条件にて反応
させ、100μの10mg/mlのｏ−フェニレンジアミン、0.
01％（v/v）H2O2を含む0.1Mリン酸カリウムbuffer（pH
6.0）を酵素反応液として添加し、4NHClで反応停止後A
490nmの吸光度を測定した。
上清を先のVMA−VSA固相化マイクロタイタープレートに
添加し、37℃で60分間インキュベートした後、よく洗浄
後、吸着したマウスイムノグロブリンにHRPOD（西洋ワ
サビペルオキシダーゼ）標識したウサギ抗マウスIgG
（Ｈ＆Ｌ鎖）抗体（マイルズ社）を同様の条件にて反応
させ、100μの10mg/mlのｏ−フェニレンジアミン、0.
01％（v/v）H2O2を含む0.1Mリン酸カリウムbuffer（pH
6.0）を酵素反応液として添加し、4NHClで反応停止後A
490nmの吸光度を測定した。
上記スクリーニング法にて選択されたモノクローナル
抗体のカテコールアミン代謝産物及びそのカテコール体
に対する反応特性を調べた結果を第１図に示す。測定法
は、競合的EIA法を用い、抗体とともに種々の濃度でカ
テコールアミン代謝産物及びそのカテコール体を添加
し、上記スクリーニング法の反応条件に準じて測定した
ものである。図中、縦軸は、抗体の見かけ上のカテコー
ルアミン代謝産物に対する反応性を示し、各々の抗原に
対するIC50値（反応系を50％阻害するのに必要な抗原濃
度）は、下記の様になる。
抗体のカテコールアミン代謝産物及びそのカテコール体
に対する反応特性を調べた結果を第１図に示す。測定法
は、競合的EIA法を用い、抗体とともに種々の濃度でカ
テコールアミン代謝産物及びそのカテコール体を添加
し、上記スクリーニング法の反応条件に準じて測定した
ものである。図中、縦軸は、抗体の見かけ上のカテコー
ルアミン代謝産物に対する反応性を示し、各々の抗原に
対するIC50値（反応系を50％阻害するのに必要な抗原濃
度）は、下記の様になる。
バニリルマンデル酸 2.8×10-7M ホモバニリン酸 6.8×10-7M 3,4−ジヒドロキシマンデル酸 1.4×10-3M 3,4−ジヒドロキシフェニル酢酸 ＞1.4×10-3M 3.カテコールアミン代謝産物に特異的なモノクローナル
抗体の製造法。
抗体の製造法。
カテコールアミン代謝産物に特異的なモノクローナル
抗体を産生分泌するハイブリドーマ細胞株（５×10
6個）を予め１週間前にプリスタンを0.5ml/体の割合で
投与しておいたBALB/Cマウス（♂、４週令以降のもの）
の腹腔内に注射した。10〜14日後、腹水を採集し、腹水
中に含まれる本モノクローナル抗体をプロティンＡ固定
セファロース4Bゲルを用いたアフィーニティークロマト
グラフィーにより精製した。その結果を第２図に示す。
詳しくは腹水と同量の3M NaClをふくむ1.5Mグリシンbuf
fer（pH9.0）をよく混合し、同じbufferにて平衡化した
プロティンＡゲルカラムにチャージする。非吸着画分を
除去したあと、カラムをよくPBS（−）にて洗浄し、カ
ラムに特異的に吸着したモノクローナル抗体は、0.1M酢
酸buffer（pH3.0）にて溶出した。
抗体を産生分泌するハイブリドーマ細胞株（５×10
6個）を予め１週間前にプリスタンを0.5ml/体の割合で
投与しておいたBALB/Cマウス（♂、４週令以降のもの）
の腹腔内に注射した。10〜14日後、腹水を採集し、腹水
中に含まれる本モノクローナル抗体をプロティンＡ固定
セファロース4Bゲルを用いたアフィーニティークロマト
グラフィーにより精製した。その結果を第２図に示す。
詳しくは腹水と同量の3M NaClをふくむ1.5Mグリシンbuf
fer（pH9.0）をよく混合し、同じbufferにて平衡化した
プロティンＡゲルカラムにチャージする。非吸着画分を
除去したあと、カラムをよくPBS（−）にて洗浄し、カ
ラムに特異的に吸着したモノクローナル抗体は、0.1M酢
酸buffer（pH3.0）にて溶出した。
実施例 （１）d,l−VMAのキャリアー蛋白、BSAへの標識化。
5mgのd,l−VMAを15mgの水溶性カルボジイミド（WSC）
と共に0.5mlの0.01N酢酸に溶解し、氷冷下15分間静置
し、d,l−VMA側鎖のα−カルボキシル基を活性化した。
次いで、10mgのBSAを溶解した0.5mlの0.1M NaHCO3（pH
9.0）を添加し、30℃にて90分間カップリング反応を行
なった。反応後、過剰に残存するd,l−VMA及び水溶性カ
ルボジイミドはPBS（−）にて透析することにより除去
した。
と共に0.5mlの0.01N酢酸に溶解し、氷冷下15分間静置
し、d,l−VMA側鎖のα−カルボキシル基を活性化した。
次いで、10mgのBSAを溶解した0.5mlの0.1M NaHCO3（pH
9.0）を添加し、30℃にて90分間カップリング反応を行
なった。反応後、過剰に残存するd,l−VMA及び水溶性カ
ルボジイミドはPBS（−）にて透析することにより除去
した。
（２）固相化d,l−VMAと３−メトキシ、４−ハイドロキ
シル基を有するカテコールアミン代謝産物に特異的なモ
ノクローナル抗体との結合性。
シル基を有するカテコールアミン代謝産物に特異的なモ
ノクローナル抗体との結合性。
実施例の（１）で調製したVMA−BSA（２μg/ml）をMM
C社製活性化型マイクロタイタープレート（96穴）に反
応させ、25℃一夜のインキュベーションにて、VMA−BSA
を共有結合的にプレートに固相化した。次いで、共有結
合以外の作用で固相に吸着したものは、0.1％（w/v）SD
Sを含む0.1N酢酸にて洗浄除冷した。次いで、第３図に
示すように、各pHに設定した酢酸緩衝液に溶解した製造
例で得たモノクローナル抗体を添加し、また同時に５μ
Ｍの３−メトキシ、４−ハイドロキシル基を有するカテ
コールアミン代謝産物であるｌ−VMA及びHVAを添加し、
各環境（pH）下におけるモノクローナル抗体とカテコー
ルアミン代謝産物との親和性を検討した。
C社製活性化型マイクロタイタープレート（96穴）に反
応させ、25℃一夜のインキュベーションにて、VMA−BSA
を共有結合的にプレートに固相化した。次いで、共有結
合以外の作用で固相に吸着したものは、0.1％（w/v）SD
Sを含む0.1N酢酸にて洗浄除冷した。次いで、第３図に
示すように、各pHに設定した酢酸緩衝液に溶解した製造
例で得たモノクローナル抗体を添加し、また同時に５μ
Ｍの３−メトキシ、４−ハイドロキシル基を有するカテ
コールアミン代謝産物であるｌ−VMA及びHVAを添加し、
各環境（pH）下におけるモノクローナル抗体とカテコー
ルアミン代謝産物との親和性を検討した。
第３図に示した結果から示されるとおり、固相化VMA
−BSAとモノクローナル抗体の反応は、pH6.0〜8.0の範
囲内において安定であることが見出され、また、２種類
の３−メトキシ、４−ハイヒドロキシル基を有するカテ
コールアミン代謝産物であるｌ−VMAとVMAとに対する親
和性の比は用いたEIA系への両者の阻害度の比として表
わし、以下のようになった。
−BSAとモノクローナル抗体の反応は、pH6.0〜8.0の範
囲内において安定であることが見出され、また、２種類
の３−メトキシ、４−ハイヒドロキシル基を有するカテ
コールアミン代謝産物であるｌ−VMAとVMAとに対する親
和性の比は用いたEIA系への両者の阻害度の比として表
わし、以下のようになった。
ｌ−VMA/HVA pH6.0 0.38 pH8.0 0.87 したがって、pH6.0及びpH8.0では、ｌ−VMA、HVAに対
する親和性が変化していることが示めされた。
する親和性が変化していることが示めされた。
（３）競合的EIA系においてｌ−VMA、HVAを分別定量す
るための標準曲線の作製 実施例の（２）の操作法をもとに、pH6.0及びpH8.0の
条件下、免疫化学反応を行ない、ｌ−VMA、HVAに対する
各々の標準曲線を作製した。最終的にVMA−BSA固相に結
合したモノクローナル抗体量は、実施例の（２）ともに
HRPODラベルしたウサギ抗マウスIgG抗体を用い、HRPOD
酵素活性を指標として測定した。そのときの結果を第４
図に示す。pH8.0では、添加抗原１μＭ以下では、ｌ−V
MAとは反応せず、HVAとのみ反応することが示され、ま
たpH6.0では１μＭ〜10μＭにおいて、ｌ−VMA、HVAと
もに反応することが示された。
るための標準曲線の作製 実施例の（２）の操作法をもとに、pH6.0及びpH8.0の
条件下、免疫化学反応を行ない、ｌ−VMA、HVAに対する
各々の標準曲線を作製した。最終的にVMA−BSA固相に結
合したモノクローナル抗体量は、実施例の（２）ともに
HRPODラベルしたウサギ抗マウスIgG抗体を用い、HRPOD
酵素活性を指標として測定した。そのときの結果を第４
図に示す。pH8.0では、添加抗原１μＭ以下では、ｌ−V
MAとは反応せず、HVAとのみ反応することが示され、ま
たpH6.0では１μＭ〜10μＭにおいて、ｌ−VMA、HVAと
もに反応することが示された。
以上の結果をもとにして、pH8.0及びpH6.0の条件下
で、同時に検体中に含まれるカテコールアミン代謝産物
を測定し、各々の回帰曲線より同時に、ｌ−VMAとHVAを
算出することができるものである。
で、同時に検体中に含まれるカテコールアミン代謝産物
を測定し、各々の回帰曲線より同時に、ｌ−VMAとHVAを
算出することができるものである。
第１図は、製造例において、３−メトキシ、４−ヒドロ
キシル基を有するカテコールアミン代謝産物と、3,4−
ジヒドロキシル基を有するカテコールアミン代謝産物に
対する本発明で使用するモノクローナル抗体の反応性を
みた図であり、第２図はプロテインＡ固定化ゲルによる
同モノクローナル抗体の精製を示す図であり、第３図は
実施例においてpH3.0〜10.0における固相化VMA−BSA、
モノクローナル抗体、ｌ−VMA、HVAの安定性をみた図で
あり、第４図は競合的EIA系におけるｌ−VMA、HVA分別
定量のための標準曲線を示す図で、ＡはpH8.0下、Ｂはp
H6.0下における図である。
キシル基を有するカテコールアミン代謝産物と、3,4−
ジヒドロキシル基を有するカテコールアミン代謝産物に
対する本発明で使用するモノクローナル抗体の反応性を
みた図であり、第２図はプロテインＡ固定化ゲルによる
同モノクローナル抗体の精製を示す図であり、第３図は
実施例においてpH3.0〜10.0における固相化VMA−BSA、
モノクローナル抗体、ｌ−VMA、HVAの安定性をみた図で
あり、第４図は競合的EIA系におけるｌ−VMA、HVA分別
定量のための標準曲線を示す図で、ＡはpH8.0下、Ｂはp
H6.0下における図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭62−233761（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) G01N 33/53 ＢＩＯＳＩＳ ＰＲＥＶＩＥＷＳ
Claims (2)
- 【請求項１】３−メトキシ、４−ヒドロキシル基を有す
るカテコールアミン代謝産物と特異的に反応するがその
１位の置換基に対しては特異性を有しない一種類のモノ
クローナル抗体を用いて、pH約6.0及びpH約8.0で、競合
的酵素免疫分析法により、３−メトキシ、４−ヒドロキ
シル基を有するカテコールアミン代謝産物を分別定量す
ること、を特徴とするカテコールアミン代謝産物の測定
法。 - 【請求項２】請求項１に記載の３−メトキシ、４−ヒド
ロキシル基を有するカテコールアミン代謝産物が、バニ
リルマンデル酸及びホモバニリル酸であること、を特徴
とするカテコールアミン代謝産物の測定法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63193357A JP2819133B2 (ja) | 1988-08-04 | 1988-08-04 | カテコールアミン代謝産物の測定法 |
| EP89114015A EP0352817A3 (en) | 1988-07-29 | 1989-07-28 | Monoclonal antibody to catecholamine metabolite and quantitative assay for catecholamine metabolite |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63193357A JP2819133B2 (ja) | 1988-08-04 | 1988-08-04 | カテコールアミン代謝産物の測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0244252A JPH0244252A (ja) | 1990-02-14 |
| JP2819133B2 true JP2819133B2 (ja) | 1998-10-30 |
Family
ID=16306566
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63193357A Expired - Fee Related JP2819133B2 (ja) | 1988-07-29 | 1988-08-04 | カテコールアミン代謝産物の測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2819133B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106596917B (zh) * | 2016-12-19 | 2018-04-20 | 苏州博源医疗科技有限公司 | 高香草酸均相酶免疫检测试剂、制备方法及检测方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0792456B2 (ja) * | 1986-04-04 | 1995-10-09 | ヤマサ醤油株式会社 | カテコ−ルアミン酸性代謝物の酵素標識体 |
-
1988
- 1988-08-04 JP JP63193357A patent/JP2819133B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0244252A (ja) | 1990-02-14 |
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