JPH0244252A

JPH0244252A - カテコールアミン代謝産物の測定法

Info

Publication number: JPH0244252A
Application number: JP19335788A
Authority: JP
Inventors: Hirokazu Matsukawa; 寛和松川; Isamu Kokawara; 高河原　勇; Yoji Marui; 丸井　洋二; Hidetake Tanaka; 秀武田中; Chozo Hayashi; 林　長蔵
Original assignee: Oriental Yeast Co Ltd
Current assignee: Oriental Yeast Co Ltd
Priority date: 1988-08-04
Filing date: 1988-08-04
Publication date: 1990-02-14
Anticipated expiration: 2013-10-30
Also published as: JP2819133B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明はカテコールアミン代謝産物に対するモノクロー
ナル抗体を用いて３−メトキシ、４−ヒドロキシル基を
有するカテコールアミン代謝産物を分別定量する方法に
関するものである。

一般に、ヒト尿中に出現するカテコールアミン代謝産物
、とりわけ、バニリルマンデル酸（以下ＶＭＡと略す）
とホモバニリル酸（以下ＨＶＡと略す）が、種々の疾患
にかかわるマーカーとなっていることが見出されている
。

しかし、最近になって、とくにＨＶＡは、神経細胞腫に
おいて高値を示すことが分かり、新生児における神経細
胞腫のスクリーニング項目として重要な意味を持つよう
になってきた。

本発明のカテコールアミン代謝産物の測定法はＨＶＡ、
　ＶＭＡをきわめて簡便に分別定量することができるの
で、関連疾病の診断に大いに貢献するものである。

（従来技術及び問題点）従来、ＶＭＡ、　ＨＶＡを迅速にかつ簡便に分別定量す
る方法は知られていない。

従来法としては、尿中に狭雑する物質を分離する工程（
前処理）と抽出されたＨＶＡ、　ＶＭＡを分別定量する
工程（分析）とからなっているが、はん雑な前処理や）
ＩＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）を使用する分
析など処理操作を含めてはん雑であり、また分析に時間
を要するなど種々の欠点がみられるのである。

従来技術の問題点を次に列挙する。

１、　　ＶＭＡ、ＨＶＡ以外の狭雑物を有機溶媒処理等
により除去する必要がある。

２、　測定法によっては、ＶＭＡ、　ＨＶＡを各々誘導
体に変換する必要があり（ガスクロマド法）１分析操作
手順がはん雑である。

３、　特別な装置を必要とし、（ガスクロマド法、ＨＰ
ＬＣ法、　ＧＣ−ＭＳ法）、自動分析システムとしての
応用がむずかしい。

４、分析装置もしくは分析方法が特殊であり、誰でも、
迅速に、簡便に測定できるようにはなっていない。

（問題点を解決するための手段）本発明者らは、ヒト尿中に見出されるＶＭＡとＨＶＡの
両者を迅速にかつ簡便に分別定量できる測定系が確立で
きれば、神経芽腫や代謝異常症の早期発見、モニタリン
グができるようになるとの発想のもとに鋭意研究した結
果、本発明において、３−メトキシ、４−ヒドロキシル
基を有するカテコールアミン代謝産物と特異的に反応す
るモノクローナル抗体を用いれば、競合的酵素免疫分析
法によってＶＭＡ、　ＨＶＡが簡便に分別定量できるこ
とを知ったのである。

本発明は３−メトキシ、４−ヒドロキシル基を有するカ
テコールアミン代謝産物と特異的に反応するモノクロー
ナル抗体を用いて競合的酵素免疫分析法により３−メト
キシ、４−ヒドロキシル基を有するカテコールアミン代
謝産物を分別定量することを特徴とするカテコールアミ
ン代謝産物の測定法である。

また１本発明は競合的免疫分析法に於いて、抗原と抗体
との免疫化学的反応を環境条件を制御して調節し５種々
のカテコールアミン代謝産物に対するモノクローナル抗
体の親和性を変化せしめ、各々のカテコールアミン代謝
産物を分別定量することを特徴とするカテコールアミン
代謝産物の測定法である。

また１本発明は３−メトキシ、４−ヒドロキシル基を有
するカテコールアミン代謝産物が、バニリルマンデル酸
又はホモバニリル酸であることを特徴とするカテコール
アミン代謝産物の測定法である。

本発明のカテコールアミン代謝産物の測定法においては
カテコールアミン代謝産物に対するモノクローナル抗体
が使用される。

このモノクローナル抗体は、カテコールアミン代謝産物
をＢＡＬＢ／Ｃマウスに免疫して、抗血清中に本免疫抗
原に対する抗体価が、酵素免疫分析法（ＥＩＡ）等の方
法により有意に認められたのち、牌細胞を摘出し、マウ
スミエローマ細胞株（ヒポキサンチン、グアニンホスホ
リボシルトランスファラーゼ；　ＨＧＲＰ欠損株、ＨＡ
Ｔ培地感受性、ＸＡｇ３．６．５゜３等）との細胞融合
により、本抗原に対するモノクローナル抗体を産生ずる
細胞を不死化させ、当該ハイブリドーマ細胞株を培養す
ることで製造される。

免疫抗原としてのカテコールアミン代謝産物としては、
３−メトキシ、４−ヒドロキシル基を有するカテコール
アミン代謝産物５例えばＶＭＡ、　ＨＶＡ、メタネフリ
ンなどがあるが、いずれでもよい。

３−メトキシ、４−ヒドロキシル基を有するカテコール
アミン代謝産物、例えば市販のｄ、Ｑ−ＶＭＡはキャリ
アー蛋白質、例えば、ＫＬＨやＢＳＡ等に架橋化試薬の
作用のもとに結合させることで抗原が！！ｌｌ製される
。

得られたｄ、Ｑ−ＶＨＡ抗原をＢＡＬＢ／Ｃマウス腹腔
内に。

フレンド完全アジュバントまたは不完全アジュバントと
ともに免疫する。免疫後、部分採血を行ない、抗血清中
のｄ、Ｑ−ＶＭＡに対する抗体価を免疫分析法１例えば
、受身凝集反応、ＥＩＡ、　ＲＩＡ、望ましくは、ＥＩ
Ａ法にて測定する。

ＥＩＡ法にて測定する場合は、例えば固相化ＶＭＡ抗原
に対する抗体価を、２次抗体として西洋ワサビペルオキ
シダーゼｍ識つサギ抗マウスｒｇＧ抗体を使用して、Ｖ
ＭＡ抗原と反応して、反応後固相ＶＭＡ抗原に結合した
抗血清中に存在するマウスイムノグロブリン量を測定す
ることができる。

しかるべき抗体価の上昇が認められれば、ざらにＶＭＡ
免疫抗原を追加免疫した後、免疫動物より牌細胞を摘出
、調製し、不死化しているマウスミエローマ細胞株（Ｘ
Ａｇ８．６．５．３）と−数的なポリエチレングリコー
ル（Ｍ、Ｗ、１，５００）を融合剤として使用し、マウ
スハイブリドーマ細胞を得ることができる。ＨＡＴ選択
培地にて、融合細胞のみを増殖させ、培養上清中に存在
するＶＭＡ抗原に特異的な抗体活性を、上記ＥＩＡ法に
て見出することにより。

目的とするモノクローナル抗体が得られるものである。

本発明は、ここに得られる３−メトキシ、４−ヒドロキ
シル基を有するカテコールアミン代謝産物と特異的に反
応するモノクローナル抗体を用いて競合的酵素免疫分析
法により３−メトキシ、４−ヒドロキシル基を有するカ
テコールアミン代謝産物を分別定量するものである。

この分別定量が可能となったのは、モノクローナル抗体
と、抗原である３−メトキシ、４−ハイドロキシル基を
有するカテコールアミン誘導体、とくにＶＭＡと）ＩＶ
Ａの各々における免疫化学反応を詳しく調べた結果、抗
体の両者に対する親和性は、免疫化学反応をおこなう環
境条件（因子）によって変化し、さらには１両者に対す
る抗体の親和性の比が異ってくることを新たに見出した
ことが基礎となっている。

一般に、抗原と抗体間の免疫化学反応は、■、　イオン
結合２、疎水結合３、水素結合４、　ファンデルワース力等の相互作用の組み合せにより成立していることが知ら
れている。これらは、いずれも共有結合ではないために
、しかるべき環境の変化により、その結合は、切断され
、いったん形成された免疫複合体が壊われ、抗原及び抗
体は遊離型へともどっていく。このような事実は、広く
知られ、その応用例としては、抗原もしくは抗体を固定
化リガンドとしたイムノアフィニティークロマトグラフ
ィーが挙げられる。

本発明では、３−メトキシ、４−ハイドロキシル基を有
するカテコール代謝産物とそれに対するモノクローナル
抗体間の結合性とその相互作用は、水素結合に影響を与
えるジメチルスルホキシド、エチレングリコール、また
イオン結合性を弱めると考えられるＮａＣＱ等の塩濃度
、更にはｐＨにより強く影響を受けるものであるところ
から、あらかじめ種々の環境条件における各物質に対す
るモノクローナル抗体の結合性を示す標準曲線を求め、
これと同じ環境条件下において尿等の試料の測定を行い
、各物質の含有量及びその含有比率をすみやかに定量す
ることができるものである。

次に本発明の製造例及び実施例を示す。

製造例（３−メトキシ、４−ヒドロキシル基を有するカテコー
ルアミン代謝産物と特異物に反応するモノクローナル抗
体の製造）１、　　ＢＡＬＢ／Ｃマウスへの免疫及び細胞融合。

市販ｄ、Ｑ−バニリルマンデル酸（ＶＭＡ）を予め水溶
性カルボジイミド（ＥＤＣ）を用い、Ｋｅｙｈｄｅｌｉ
ｍｐｅｔｈｅａｒｏｃｙａｎｉｎ　（ｌｕＨ）に結合さ
せ、得られた５０μｇのＶＭＡ−ＫＬＨ結合体をＢＡＬ
Ｂ／Ｃ７ウス（♂、４週令）ニフレンド完全アジュバン
トと共に腹腟内注射した。

その後、隔週毎に２度同量のＶＭＡ−ＫＬＨ結合体をフ
レンド不完全アジュバントと共に追加免疫を実施した。

マウスミエローマ細胞（ＸＡｇ８．６．５．３）との細
胞融合を行なう３〜４日前に、　１０μｇのＶＭＡ−Ｋ
ＬＨをＰＢＳ　（−）　　に溶解し、ａｍ内にブースタ
ー注射をした。

得られた牌細胞とマウスミエローマ細胞とは、通常の方
法に従い、５０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール（
ＭＬ　ｔ、５ｏＯ）を用いて細胞融合をした。融合細胞
は、４８穴−マイクロプレート（コースタ−社）に　１
　ｗｅｌｌ当り１０６個になるようにして播種し、１５
％ＦＣ５を含むＨＡＴ培地（ピポキサンチン、アミノプ
テリン、チミジンを含んだＲＰＭＩ−１６４０培地）に
てその後、ハイブリドーマ細胞のみを選択培養した。

２、　カテコールアミン代謝産物に特異的なモノクロー
ナル抗体のスクリーニングとその反応特性。

ＶＭＡ−ＢＳＡ結合体を物理化学的に吸着したＥＩＡ用
マイクロタイタープレート（ヌンク社）を用い、そこに
、ハイブリドーマ細胞株を培養して得られた上清を添加
、反応させ３−メトキシ、４−ヒドロキシル基を有する
カテコールアミン代謝産物に特異的なモノクローナル抗
体のスクリーニング法とした。

実際の測定法は、１００μΩのハイプリドーマ細胞培養
土浦を先のＶＭＡ−ＶＳＡ固相化マイクロタイタープレ
ートに添加し、３７℃で６０分間インキュベートした後
、よく洗浄後、吸着したマウスイムノグロブリンにＨＲ
ＰＯＤ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）標識したウサギ
抗マウスＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ鎖）抗体（マイルズ社）を同様
の条件にて反応させ、１００μΩのｌ　０ｍｇ１社の０
−フ二二レンジアミン、　０．０１％（Ｖ／Ｖ）Ｈ□Ｏ
７を含む０．１Ｍリン酸カリウムｂｕｆｆｅｒ（ｐｔ（
６，０）を酵素反応液として添加し、４ＮＨＣ１）、で
反応停止後Ａ　４　ｇ。ｎ１１１の吸光度を測定した。

上記スクリーニング法にて選択されたモノクローナル抗
体のカテコールアミン代謝産物及びそのカテコール体に
対する反応特性を調べた結果を第１図に示す、測定法は
、競合的ＥＩＡ法を用い、抗体とともに種々の濃度でカ
テコールアミン代謝産物及びそのカテコール体を添加し
、上記スクリーニング法の反応条件に準じて測定したも
のである。

図中、縦軸は、抗体の見かけ上のカテコールアミン代謝
産物に対する反応性を示し、各々の抗原に対するＩＣ９
゜値（反応系を５０％阻害するのに必要な抗原濃度）は
、下記の様になる。

バニリルマンデル酸　　　　　　　　　　２．８　ｘ　
１０−’阿ホモバニリン酸　　　　　　　　　　　　６
．８Ｘ］、０−’Ｍ３．４−ジヒドロキシマンデル酸　
　　　　　１．４ＸＩＯ’″詔３．４−ジヒドロキシフ
ェニル酢酸　　　　＞１．４Ｘ１０−’Ｍ３、　カテコ
ールアミン代謝産物に特異的なモノクローナル抗体の製
造法。

カテコールアミン代謝産物に特異的なモノクローナル抗
体を産生分泌するハイブリドーマ細胞株（５ＸＩＯ’個
）を予め１週間前にブリスタンを０．５ｆｆｌＱＺ体の
割合で投与しておいたＢＡＬＢ／Ｃマウス（♂、４週令
以降のもの）の腹腔内に注射した。　１０〜１４日後、
腹水を採集し、腹水中に含まれる本モノクローナル抗体
をプロティンＡ固定セファロース４Ｂゲルを用いたアフ
ィーニティークロマトグラフィーにより精製した。その
結果を第２図に示す。詳しくは腹水と同量の３Ｍ　Ｎａ
ＣＱをふくむ１．５Ｍグリシンｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ９，
０）をよく混合し、同じｂｕｆｆｅｒにて平衡化したプ
ロティンＡゲルカラムにチャージする。非吸着画分を除
去したあと、カラムをよくＰＢＳ（−）にて洗浄し、カ
ラムに特異的に吸着したモノクローナル抗体は、　　０
．ＩＭ酢酸ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ３，０）にて溶出した。

実施例（１）　ｄ、Ｑ−ＶＭＡ（１）キャリアー蛋白、ＢＳＡ
　ヘの標識化。

５ｍｇのｄ、Ｑ−ＶＭＡを１５■ｇの水溶性カルボジイ
ミド（ＶＳＣ）と共Ｌニー　０．５ｍｕ（７）０．０Ｉ
Ｎ酢酸に溶解シ・、水冷下１５分間静置し、ｄ、ｆｌ−
ＶＭＡｇｆＪ鎖のα−カルボキシル基を活性化した。次
いで、１０ｍｇのＢＳＡを溶解した０、５１の０．ＩＭ
　ＮａＨＣＯ，（ｐＨ９，０）を添加し、３０℃にて９
０分間カップリング反応を行なった。反応後、過剰に残
存するｄ、Ｑ−ＶＭＡ及び水溶性カルボジイミドはＰＢ
Ｓ（−）にて透析することにより除去した。

（２）固相化ｄ、Ｑ−ｖＭＡ　ト３−　ｆｉ　トキシ、
４−ハイドロキシル基を有するカテコールアミン代謝産
物に特異的なモノクローナル抗体との結合性。

実施例の（１）で調製したＶＭＡ−ＢＳＡ（２μｇ／ｍ
Ｑ）をＭＭＣ社製活性化型マイクロタイタープレート（
９６穴）に反応させ、２５℃−夜のインキュベーション
にて。

ＶＭＡ−ＢＳＡ　を共有結合的にプレートに同相化した
。

次いで、共有結合以外の作用で同相に吸着したものは、
０．１％（ｖ／ｖ）ＳＯ３を含む０．ＩＮ酢酸にて洗浄
除冷した０次いで、第３図に示すように、各ｐＨに設定
した酢酸緩衝液に溶解した製造例で得たモノクローナル
抗体を添加し、また同時に各５μＮの３−メトキシ、４
−ハイドロキシル基を有するカテコールアミン代謝産物
であるＱ−ＶＭＡ及びＨＶＡを添加し、各環境（ρ１１
）下におけるモノクローナル抗体とカテコールアミン代
謝産物との親和性を検討した。

第３図に示した結果から示されるとおり、固相化ＶＭＡ
−ＢＳＡとモノクローナル抗体の反応は、ｐＨ６，０〜
８．０の範囲内において安定であることが見出され、ま
た、２種類の３−メトキシ、４−ハイヒドロキシル基を
有するカテコールアミン代謝産物であるＱ−ＶＭＡ　と
ＶＭＡとに対する親和性の比は用いたＥＩＡ系への両者
の阻害度の比として表わし、以下のようになった。

Ｑ−ＶＭＡ／ＨＶＡＰＨ６，ＯＯ，３８ｐＨ８，ｏ　　　　　　　　　Ｏ，８７したがッテ、Ｐ
Ｈ６，０及びｐＨ８，Ｏテは、Ｑ−ＶＭＡ、　ＨＶＡに
対する親和性が変化していることが示めされた。

（３）競合的ＥＩＡ系においてｆｌ−ＶＭＡ、ＨＶＡを
分別定量するための標準曲線の作製実施例の（２）の操作法をもとに、ｐＨ６，０及びｐＨ
８，０の条件下、免疫化学反応を行ない、Ｑ−ＶＭＡ、
ＨＶＡに対する各々の標準曲線を作製した。最終的にＶ
ＭＡ−ＢＳＡ固相に結合したモノクローナル抗体量は、
実施例の（２）ともにＨＲＰＯＤラベルしたウサギ抗マ
ウスＩｇＧ抗体を用い、ＨＲＰＯＤ９素活性を指標とし
て測定した。そのときの結果を第４図に示す。ＰＨ８６
０では、添加抗原１μ阿以下では、Ｑ−ＶＭＡとは反応
せず、ＶＭＡとのみ反応することが示され、またｐＨ６
，０テは１μＭ〜１０μににおイテ、Ｑ−ＶＨＡ、　Ｖ
ＭＡともに反応することが示された。

以上の結果をもとにして、　ＰＨ８，０及びρ１１６　
、０の条件下で、同時に検体中に含まれるカテコールア
ミン代謝産物を測定し、各々の回帰曲線より同時に。

Ｑ−ＶＭＡとＶＭＡを算出することができるものである
。

【図面の簡単な説明】

第１図は、製造例において、３−メトキシ、４−ヒドロ
キシル基を有するカテコールアミン代謝産物と、３，４
−ジヒドロキジル基を有するカテコールアミン代謝産物
に対する本発明で使用するモノクローナル抗体の反応性
をみた図であり、第２図はプロティンＡ固定化ゲルによ
る同モノクローナル抗体の精製を示す図であり、第３図
は実施例においテＰＨ３，０〜１０．における固相化Ｖ
ＭＡ−ＢＳＡ、モノクローナル抗体、（１−ＶＭＡ、　
ＩＩＶＡの安定性をみた図であり、第４図は競合的ＥＩ
Ａ系におけるＱ−ＶＭＡ、　ＨＶＡ分別定量のための標
準曲線を示す図で、ＡはｐＨ８，０下。ＢはｐＨ６，０下における図である。代理人　弁理士　戸　１）親　男図ｉｔイｒｌ’Ｊ　　ＥＩＡｆｆ、ｆｚｈ　い？　　！−
ＶＭＡ、ＨＶＡ　＆分％ｌ芝ｔ−ｒｉｒ：ｈ、ｎ！−１
、ｍ＆；＃　力ロ　市も１代　】４度　（ＨＭＩ暮か抗
原濃度（戸）

Claims

【特許請求の範囲】

（１）３−メトキシ、４−ヒドロキシル基を有するカテ
コールアミン代謝産物と特異的に反応するモノクローナ
ル抗体を用いて競合的酵素免疫分析法により３−メトキ
シ、４−ヒドロキシル基を有するカテコールアミン代謝
産物を分別定量することを特徴とするカテコールアミン
代謝産物の測定法。
（２）請求項１記載の競合的免疫分析法に於いて、抗原
と抗体との免疫化学的反応を環境条件を制御して調節し
、種々のカテコールアミン代謝産物に対するモノクロー
ナル抗体の親和性を変化せしめ、各々のカテコールアミ
ン代謝産物を分別定量することを特徴とするカテコール
アミン代謝産物の測定法。
（３）請求項１又は２記載の３−メトキシ、４−ヒドロ
キシル基を有するカテコールアミン代謝産物が、バニリ
ルマンデル酸又はホモバニリル酸であることを特徴とす
るカテコールアミン代謝産物の測定法。