JP5276924B2 - オクラトキシンに対する抗体、その抗体を用いた親和性カラム、およびオクラトキシンの免疫学的検出用キット - Google Patents
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本明細書において対象となる「オクラトキシン」とは、オクラトキシンA、B、およびCのいずれか1種を表すかまたは2以上のすべてを総称するが、本発明における「オクラトキシンに対するモノクローナル抗体」は、主にオクラトキシンAおよびBのいずれをも同等に認識するモノクローナル抗体を指す。
で表される化合物である。
(1)抗原を担体に固相化する。
用いる担体は、通常のELISAに用いる担体であれば特に制限されないが、96穴、48穴、192穴等のマイクロタイタープレートが好ましい。固相化は、例えば、固相化用抗原を含む緩衝液を担体上に載せ、インキュベーションすればよい。緩衝液中の抗原の濃度は、通常0.01μg/mLから100μg/mL程度である。緩衝液としては、検出手段に応じて公知のものを使用することができる。
免疫原としてスカシガイヘモシアニン(KLH)とオクラトキシンAとの複合体を、活性エステル法を用いて作製した。
実施例1で調製した免疫原を2mg/mLとなるようにPBSに溶解し、これに等量の完全アジュバント(商品名:フロイント完全アジュバント;FCA)を等量混合しエマルジョン化し、その100μLを6〜7週齢のメスのBALB/cマウスに腹腔投与した。これと同様の手順で、不完全アジュバント(商品名:フロイント不完全アジュバント;FICA)を等量混合した0.5mg/mLの免疫原100μLを2週間毎に追加免疫した。4回の免疫後、眼底から採血し、血清中の抗体力価が十分に上がっていることを間接ELISAにて確認した。
(1)実施例1で得られたオクラトキシンAとBSAとの複合体を、PBSを用いて1μg/mLに希釈し、96穴マイクロプレートに100μL/ウェルずつ分注し、4℃で一晩放置することにより固相化した。次に液を吸引除去後、0.4%BSAおよびPBSを300μL/ウェル分注し、4℃で一晩静置することによりブロッキングを行った後、ブロッキング液を吸引除去した。
マウスの血中の抗体価が十分に高くなったマウスを用いて、最終免疫(20μg/マウス)した。その3日後に当該マウスから脾臓を摘出し細胞融合に供した。
実施例2で得られたOCA−10AおよびOCA−1B抗体産生ハイブリドーマ株を10%牛胎児血清入りDMEMで培養し、約2×106個の細胞をBALB/c マウスの腹腔内に注射し、腹水液を採取した。得られた腹水はプロテインG カラムによりIgG精製を行った。得られたモノクローナル抗体はサブクラスがOCA−10AがIgG1、OCB-1BがIgG2aであり、軽鎖はいずれもκ鎖である。
(1)実施例1で得られたオクラトキシンAとBSAとの複合体を、PBSで1μg/mLに希釈し、96穴マイクロプレートに100μL/ウェルずつ分注し、4℃で一晩放置することにより固相化した。次に液を吸引除去後、0.4%BSAおよびPBSを300μL/ウェル分注し、4℃で一晩静置することによりブロッキングを行った後、ブロッキング液を吸引除去した。
オクラトキシンA、Bを、それぞれ一定濃度のメタノールを含む0.2%BSA含有PBSに加え、オクラトキシンA、Bの濃度が、0.1、0.6、3.2、16、80、400、2000ng/mL、メタノール濃度が、2、20、40、60、80%になるよう調製した。一方、得られた精製抗体OCA−10A、OCA−1Bは、0.2%BSA含有PBSで50ng/mLに希釈した。オクラトキシンの希釈溶液と抗体希釈液を、(1)で作製したオクラトキシンとBSAとの複合体固相化プレートに50μL/ウェルずつ分注して、25℃で1時間静置しオクラトキシンの競合阻害反応をさせた。
CNBr活性化セファロース4B(GEヘルスケアバイオサイエンス)60gを、1mM 冷塩酸12Lで洗浄した。このゲルを200mL量り取り、ここに、実施例3で得られた抗体(0.5mg/mL、PBSにて希釈した抗体溶液) 400mLを入れ、30分毎に撹拌しながら室温で2時間反応させた。このゲルを、モノエタノールアミン緩衝溶液1Lに加え、30分毎に撹拌しながら室温で2時間経過後、モノエタノールアミン緩衝溶液、酢酸ナトリウム緩衝溶液、の順に400mLで3回ずつ洗浄した。これに、PBS 400mL、2mol/L NaCl溶液400mL、PBS 400mLで洗浄した。
実施例6で調製したゲル0.2mLを市販のエンプティーカラム(直径3mm)につめ、PBS緩衝液3mLで2回ずつ洗浄した。
オクラトキシン検出用の抗体OCA−10Aを用いたカラムに、オクラトキシンAおよびBについて、各々200ngを含む4%メタノール溶液10mLを添加した。次にこのカラムをさらにPBS 3mLにて2回、10mM酢酸アンモニウム溶液3mLにて2回ずつ洗浄し、メタノール+酢酸(98+2)溶液1mLにて3回溶出した。
実施例7において調製した、本発明のモノクローナル抗体を用いたアフィニティーカラムと市販されているオクラトキシン用アフィニティーカラムを用いて、メタノール耐性について比較実験を行った。実施例7で調製したこのカラム、および市販カラムA、Bに、オクラトキシンAおよびBのそれぞれのタイプについて5ngを含むメタノール溶液(メタノール濃度20、40、60、80%)10mLを添加した。次にこのカラムをさらにPBS 3mLにて2回、10mM酢酸アンモニウム溶液3mLにて2回ずつ洗浄し、メタノール+酢酸(98+2)溶液1mLにて3回溶出した。
回収率(%)は、表3に示すとおりである。
Claims (7)
- オクラトキシンAに由来するハプテンと高分子化合物との結合体である抗原を用いて得られるモノクローナル抗体またはその抗原を認識する部位を含む抗体の断片であって、オクラトキシンAおよびオクラトキシンBに対する反応性の違いがIC 50 値(ng/ml)の比として3倍以内の結合能を有し、かつメタノール60%溶媒に対する耐性を有する、モノクローナル抗体またはその抗原を認識する部位を含む抗体の断片。
- さらに、エタノール50%溶媒およびアセトニトリル50%溶媒に対する耐性を有する、請求項1記載のモノクローナル抗体またはその抗原を認識する部位を含む抗体の断片。
- 前記モノクローナル抗体が、OCA−10AまたはOCA−1Bである、請求項1に記載のモノクローナル抗体又はその抗原を認識する部位を含む抗体の断片。
- 請求項1または2のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗原を認識する部位を含む抗体の断片を産生するハイブリドーマ。
- 受託番号FERMP−21644または受託番号FERMP−21645で寄託されている、請求項4に記載のハイブリドーマ。
- 請求項1から3までのいずれかに記載のモノクローナル抗体又はその抗原を認識する部位を含む抗体の断片を用いる、オクラトキシンの免疫学的検出用キット。
- 担体およびそれに固定化した請求項1から3までのいずれかに記載のモノクローナル抗体又はその抗原を認識する部位を含む抗体の断片とを含む親和性マトリックスを含む、親和性カラム。
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