JPS61171500A - 抗オクラトキシンａモノクロ−ナル抗体及びこれを用いるオクラトキシン類の測定方法 - Google Patents
抗オクラトキシンａモノクロ−ナル抗体及びこれを用いるオクラトキシン類の測定方法Info
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- JPS61171500A JPS61171500A JP927685A JP927685A JPS61171500A JP S61171500 A JPS61171500 A JP S61171500A JP 927685 A JP927685 A JP 927685A JP 927685 A JP927685 A JP 927685A JP S61171500 A JPS61171500 A JP S61171500A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
本発明はオクラトキシンＡ （ＯＴＡ）に対し特異性の
高いモノクローナル抗体及びそれを産生ずるハイブリド
ーマ及びそれらの製造方法並びにその抗オクラトキシン
Ａモノクローナル抗体ヲ用いるオクラトキシン類の測定
方法に関するものである。
高いモノクローナル抗体及びそれを産生ずるハイブリド
ーマ及びそれらの製造方法並びにその抗オクラトキシン
Ａモノクローナル抗体ヲ用いるオクラトキシン類の測定
方法に関するものである。
【従来の技術とその問題点Ｊ
オクラトキシン類は、アスペルギルス属（ａｓｐｅｒｇ
ｉｌｌｕｓ）やペニシリウムＡ （ｐｅｎｉｃｉｌｌｉ
ｕｍ）のある種のものから産生される有毒二次代謝産物
である。オクラトキシンＡはマイコトキシンの中でも毒
性の強いものの一つであり、腎毒性や腎・肝催腫瘍性を
有し、現在では穀物、飼料及び食肉等のすクラトキシン
Ａによる汚染が問題となっている。 オクラトキシンＡを穀物又はその加工製品から検出する
方法としては、ＴＬＣやＨＰＬＣ等が用いられており、
最近では感度や特異性の高い免疫測定法も試みられてい
る。 さて、免疫測定法で特異的にオクラトキシンＡを測定す
るためには、特異性の高い抗体が必要であることは論す
るまでもない、オクラトキシンＡのような低分子化合物
に対する抗体を作製する場合は、それ自身が免疫原性を
持たないので、蛋白質等の高分子キャリアーと結合させ
てハプテン抗原とし、そのハプテン抗原を動物に免疫す
ることが通常行なわれている。しかしながら、オクラト
キシン類のように類似の化合物が多数存在する化合物群
の場合、その中の一種の化合物のみに特異的な抗体を作
成することは困難であり、従来の方法で得られた抗体は
その化合物が属する群のその他の多くの化合物と交叉反
応するのが通常であった。 即ち、オクラトキシンＡに対する抗体の作製には、従来
オクラトキシンＡにウシ血清アルブミン（Ｂ Ｓ Ａ）
を結合させたハプテン抗原を用いていたが、この方法で
得られた抗体の特異性は充分ではなく、オクラトキシン
類全体に交叉反応を示した。 このように特異性の高いオクラトキシンＡに対する抗体
としては多くの研究者の努力にもかかわらず未だ充分な
ものが得られておらず、しかも穀類中のオクラトキシン
Ａの特異的な測定法の開発が要求されている折から、特
異抗体の作製が強く待ち望まれていた。 また、従来の非特異的な抗体の作製方法では、得られる
抗体自身の保存安定性が悪いため、抗血清の製造を目的
として動物を免疫する度に何度もハプテン抗原を調製し
なければならないという手間を要した。しかも、ハプテ
ン抗原の作製方法や使用する動物個体差、免疫の仕方に
よって、その都度、力価、特異性及び抗体サブクラスの
異なった抗体ゎ得、、ゎ６えあ、オケ、１ヤッ２類。測
定 （結果に微妙な影響が生じた。 ［発明の目的］ 本発明の目的は、オクラトキシンＡに対し特異性の高い
モノクローナル抗体を提供するとともに、該モノクロー
ナル抗体を用いてオクラトキシン類を精度良く測定し得
る方法を提供することにある。 ［発明の概要１ ′ 本発明者らは、ハプテン抗原を用いて免疫した場合、動
物の免疫担当臓器、主に膵臓において出現する多数の抗
体産生クローンの中には目的の抗原に対して特異的な抗
体を産出するクローンが存在しており、クローニングに
より目的とするクローンのみを選び出して単クローンと
すれば特異性の高い抗体の製法が確立できるものと考え
、研究を進めて本発明を完成するに至った。 即ち、本発明の抗体は、マウスのミエローマとオクラト
キシンＡをハプテンとした抗原であらかじめ免疫された
マウスからのリンパ球との細胞融合により形成されたハ
イブリドーマから産生される抗オクラトキシンＡモノク
ローナル抗体であることを特徴とする。また、本発明の
オクラトキシン類の測定方法は、上記抗オクラトキシン
Ａモノクローナル抗体を用いてオクラトキシン類を測定
することを特徴とする。 以下、本発明を更に詳細に説明する。 本発明において抗オクラトキシンＡモノクローナル抗体
を製造するための第一段階は、抗体を産生ずる新規な単
クローンハイブリドーマを確立することである。このハ
イブリドーマを確立するための具体的な方法については
後述する実施例にて詳細に説明するが、簡単に父えば該
方法は、免疫、細胞融合、ハイブリドーマの選択と単ク
ローン化の３工程から成る。 立並 オクラトキシンＡは、例えば、アスペルギルス・オクラ
セウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｃｈｒａｃｅｕｓ
）の培養液を分離・精・製することによって得ることが
できるが、オクラトキシンＡ単独では抗原になり得ない
、このため、オクラトキシンＡを蛋白質と結合させて免
疫抗原とするが、蛋白質としては通常入手できるもであ
れば格別限定されない０通常、入手し易い牛血清アルブ
ミン等が用いられる。オクラドキシンＡと蛋白質とを結
合させるためには、自体公知の方法が有効に利用できる
。 蛋白質との結合方法としては、オクラトキシンＡのカル
ボキシル基を利用し、カルボジイミドにより脱水縮合さ
せるカルボジイミド法、酸無水物を利用する酸無水物法
等が例示される。 免疫抗原を作製した後は、免疫動物を選ぶ必要があるが
、免疫動物は細胞融合に使用する腫瘍細胞株によって決
められる。一般にはラット、マウスが多く用いられる。 マウスの中でも免疫グロブリンを産生しない腫瘍細胞株
が確立されているＢａ１ｂ／ｃがよく用いられる。 ハブテン抗原は１等張緩衝液又は生理食塩水等に溶解し
て使用するが、マウス−匹あたり１回に１０〜１００μ
ｇ投与するのが好ましい、免疫は数回に分けて行うが、
通常初回免疫はアジュバントと共に行う、アジュバント
としては、ミ震つバン、結核死菌、核酸、フロインドア
ジュバント等が使用される０通常、免疫は２〜４週間々
隔で行い、最終免疫はアジュバントを使用せず生理食塩
水に溶解し、腹腔又は静脈内に投与する。 １血亙澄 最終免疫が終了してから２〜４日後にリンパ節又は膵臓
を摘出し、得られるリンパ球を細胞融合に供する。一方
、細胞融合に使用される腫瘍細胞株としては初期にはＮ
ＰＣ−１１、Ｐ３−Ｘｌｌ１３−Ａｇ８等があったが、
これらは自身免疫グロブリンを産生ずるノテ、最近では
Ｐ３−Ｘ８３−Ａｇ８−［１１、Ｐ３−ＭＳ−１，５Ｐ
２１０−Ａｌ１４等が汎用されている。 細胞融合するときは、リンパ球を腫瘍細胞よりも約５〜
２０倍量多く用いる。細胞融合に供する腫瘍細胞及びリ
ンパ球は、まずＤＭＥＭ培地。 Ｍ ｃ Ｃｏ ｙ培地、ＲＰＭＩ１８４０培地、あるい
は等緩衝液等で洗浄し、混合した後、遠心分離し、ペレ
ット化する６次いで、ペレットをほぐした後、通常ＨＶ
Ｊ （センダイウィルス）又はポリエチレングリコール
（ＰＥＧ）を用いて細胞を融合させるが、一般には取扱
いの便利な平均分子量１．０００〜８，０００のＰＥＧ
の４０〜８０％溶液を０．５〜２厘ｌ使用する。融合を
促進するために、コルヒチン、ジメチルスルホキシド又
はポリーＬ−フルギニン等を添加することもあるが、本
発明においては必須ではない。 ＰＥＧ溶液中で融合反応を １〜１０分間程度行った後
、ＤＭＥＭ培地やＲＰＭＩ １ Ｂ４０培地等をｌＯ〜
５０１徐々に加えて融合反応を停止させる。停止後遠心
し、上清を除去する。しかる後、牛胎児血清（Ｆｅ２）
を５〜２０％含むＤＭＥＭ培地又はＲＰＭＩ１６４０培
地を加え、２４穴の培養プレートにリンパ球が１穴あた
りｌ Ｘ １０５〜ｌ Ｘ １０＠個となるよう各穴に
ｌ■ｌ毎分注する。あるいは、９６穴培養プレートにリ
ンパ球が１穴あたり１〜２ Ｘ １０”個となるよう各
穴に０．１腸ｌ毎分注する。 なお、いずれの場合であっても、フィーダー細胞は添加
した方が好ましい、フィーダー細胞としては、ラットの
胸腺細胞もしくは肺細胞、又はマウスの胸腺細胞もしく
は肺細胞等が用いられ、その濃度が０．５〜２ＸｌＯ’
／厘１となるように添加する。 リン４Ｘ１０−’Ｍ、チミジン１．８Ｘ １０（Ｍを含
むＲＰＭ１１６４０培地（又はＤＭＥＭ培ｊｌｌ） 、
即ちＨＡＴ培地に換えてい＜、ＨＡＴ培地に交換する←
は、一般には翌日、融合時に分注した容量と等容量のＨ
ＡＴ培地を培養プレートに加え、更に翌日その半量をＨ
ＡＴ培地と交換する。その後２〜３日毎ＨＡＴ培地で半
量ずつ交換する。融合後１０〜１４日目に７日日プテリ
ンを除いたＨＡＴ培地、即ちＨＴ培地に半量交−検し、
更にその１〜３日後より１〜３日毎にＨＴ培地の半量を
ＨＡＴを含まない通常の培地に交換する。 ハイブリドーマ ゛ クローンヒハイブリドーマ
の増殖の盛んな穴の細胞培養上清を種々の分析法、例え
ばＲＩＡ （放射免疫測定法）、プラーク法、凝集反応
、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫測定法）等の分析法によっ
て、目的の抗体産生ハイブリドーマを選択する。しかる
後、得たハイブリドーマについてクローニングを行う、
クローニングの方法としては、一般によく用いられる限
界希釈法や、あるいはＦＡＣ５（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎ
ｔ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅ１ｌ ５ｏｒｔｅｒ）を
用いたり、５ｏｆｔ Ａｇａｒを用いてコロニーを拾い
上げる方ｉ 等かアロ 、クローニングはコロニーが一
つのハイブリドーマから形成されるような細胞濃度で行
う、限界希釈法では９Ｂ穴プレートの１穴あたり細胞が
０．６個以下になるように行う、いずれの方法を用いた
場合もクローニングは２回繰返し、単一クローンとする
。 １オクラトキシンＡモノクローナル の目的とするク
ローンを確立したならば、抗オクラトキシンＡモノクロ
ーナル抗体は大量にｉｎマ１ｔｒｏで培養するか、ある
いはｉｎ ｖｉｖｏで培養することによって産生される
。 ＋ｎ ｖ＋ｔｒｏで産生されたモノクローナル抗体
については他の抗体の混入はないが抗体価は低い、他方
、ｉｎ ｖｉｖｏで産生されたモノクローナル抗体は、
宿主からの抗体が若干混ざるが、その抗体価はｉｎ ｖ
ｉｔｒｏと比べ非常に高い、どちらの方法によりモノク
ローナル抗体を産生させるかは、目的に応じて適宜に選
択される。 上記生産方法により、モノクローナル抗体ＯＴＡ、１．
２．３．４．５，６及び７の７種のモノクローナル抗体
が得られる。オフタロニー法による分析の結果、これら
のモノクローナル抗体中のＯＴＡ、１．２．３．４．５
及び７はマウスＩｇＧ１サブクラスに属し、０ＴＡ−６
のみがＩｇＭに属することが判明した。上記方法によっ
て得られた抗オクラトキシンＡモノクローナル抗体のク
ラスを第１表にまとめた。 ｉｔ表 オクラトキシン ０ＴＡ−１，３，４，５，６及び７（タイプＩ）はオク
ラトキシンＡに特異的であって、オクラトキシンＢ及び
オクラトキシンαとはほとんど反応しないが、ＯＴＡ、
２（タイプ■）はオクラトキシンＡ及びオクラトキシン
Ｂと同程度に反応し、オクラトキシンαには反応しない
、第二抗体としてアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マ
ウスＩｇＧを用いたＥＬＩＳＡにより、オクラトキシン
Ａ及びその類縁化合物と本抗体ＯＴＡ、１〜７との交叉
反応性を調べ、その結果を第２表に示した。なお、実験
方法については実施例中に詳細に記載されている。 第２表 モノクローナル抗体の交叉反応性 ＯＴＡ、５ ０丁＾、８
０〒Ａ、７０丁０ ３１５（０，００５
） １１３８（０，００５） １１２（０
，００１）攻５０％を阻害する量（ｎｇ／ａｓｓａｙ）
零吋）内の数値はＯＴＡに対する相対比を示す。 更に、上記タイプ■及びタイプ■についての代表的な交
叉反応性をそれぞれ第１図（ＯＴＡ 。 ｌ）及び８２図（ＯＴＡ 、２）に示し１合わせて従来
の抗血清（ポリクローナル抗体）の代表的な交叉反応性
を第３図に示した。 これらの結果から明らかなように、タイプＩのモノクロ
ーナル抗体は、従来のポリクローナル抗体と比べてオク
ラトキシンＡ以外の他のオクラトキシン類とはほとんど
反応せず、オクラトキシンＡに対する特異性が高いこと
がわかり、オクラトキシンＡの特異的測定に大きく寄与
するものである。他方、タイプＨのモノクローナル抗体
はオクラトキシンＡ及びＢと同程度に反応するため、タ
イプＩとタイプ■の２種の抗体を用いることにより、オ
クラトキシンＡのみならず、オクラトキシンＢについて
も定量が可能となる。 抗オクラトキシンＡモノクローナル抗体ヲ用いて特異的
にオクラトキシンＡを測定するためには、通常ＲＩＡ又
はＥＩＡ等によって行われる。 ＥＩＡに使用するときは標準酵素としてβ−ガラクトシ
ダーゼ、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ等
を用いることができる。 ［発明の効果］ 本発明の新規なタイプ■のモノクローナル抗体（ＯＴＡ
、１．３．４．５．６及び７）は第１図に示したように
、オクラトキシンＡのみに特異的に反応し、他のオクラ
トキシン類とは反応しない、他方、タイプＨのモノクロ
ーナル抗体（ＯＴＡ 、２）は第２図に示したように、
オクラトキシンＡ及びＢと特異的に反応し、他のオクラ
トキシン類とは反応しない、したがって、本発明のタイ
プＩのモノクローナル抗体を用いれば、特異的にオクラ
トキシンＡを測定することができ、またタイプ■のモノ
クローナル抗体を用いれば。 オクラトキシンＡ及びＢを同時に特異的に測定すること
が可能となる。 更に１本発明ではハイブリドーマを用いてモノクローナ
ル抗体を産生じているが、ハイブリドーマを培養さえし
ていれば、いつでも必要なときにモノクローナル抗体を
得ることができ、しかも一定の特性を有するものが得ら
れるため、動物を免疫する毎にハプテン抗原を調製する
必要はなく、動物の固体差に影響されることなく常に安
定した品質の抗体を得ることができる。 以下、実施例を挙げて更に詳細に説明するが、以下の実
施例は本発明の範囲を何ら限定するものではない。 【発明の実施例】 実施例１ 抗すクラトキシンＡモノクローナル抗体を産生ずるハイ
ブリドーマ及び抗体の作製 １）免疫抗原、分析用抗原の作製 ＯＴＡ５ｍｇをエタノール０．１２ｍ１と０．１ Ｍリ
ンｍ緩衝液（ｐ Ｈ７，０） ３ ｍｌニ溶解り、り、
０．１ Ｍ食塩水に溶かした牛血清アルブミン（Ｂ
Ｓ Ａ）５０１ｇをトキシン溶液と合わせた。ｌ−エチ
ル−３−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（
ＥＤＰＣ）をこの混合液に加え、２０℃で２４時間暗所
で攪拌した。蒸留水に対して透析した後、凍結乾燥し、
ＯＴＡ−ＢＳＡ３０ｍｇを得た。 また、ＢＳＡの代りに卵白アルブミン（ＯｖＡ）、陣笠
貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）を用いて、上記と同様の操作
−１？０ＴＡ−ＯＶＡ、０ＴＡ−ＫＬＨを作製した。 Ｋ Ｌ Ｈ１０＋＋＋ｇをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）
１２ｍｌに溶解し、ＨＤＰＣ１５■ｇを加えた。この溶
液にＴ２−トキシン−ヘミサクシネート（Ｔ２−Ｈ３）
１０１ｇをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１層ｌに溶
解したものを室温下で攪拌しながら滴下した。析出不溶
物を濾別しＥＤＰＣ５■ｇを追加した。ＩＮ塩酸でｐＨ
を５．５に調整し、室温で更に１８時間攪拌した。水に
対して透析した後、凍結乾燥し、分析用抗ｇＴ２−Ｈ５
−ＫＬＨを得た。 ２）免疫 ０ＴＡ−ＢＳＡ １０ＯＩＬ文を溶解した生理゛食塩
水０．２５ｍ１とフロイントの完全アジュバント０．２
５■ｔヲ混合し、エマルジョンとし、その０．５１をＢ
ａ１ｂ／ｃマウス（♀、４週齢）の腹腔内に投与した。 １〜３週間後、ＯＴ Ａ −Ｂ Ｓ Ａ １０〜１００
ｇ ｇ （７）生理食塩水溶液を腹腔内投与名は尾静
脈に注射することにより追加免疫を行った。 ３）細胞融合 最終免疫より３日後、マウスの肺臓を摘出し、１０ｍ１
のＤＭＥＭ培地を入れたプラスチックシャーレ中で、牌
リンパ球をほぐした０次いで、牌リンパ球を遠心操作（
１０００回転、１０分）を繰返し、ＤＭＥＭ培地で３回
洗浄した。牌リンパ球１×１０８個と、８−７ザグアニ
ン耐性ミエローマＳＰ２／０−Ａｇ１４ （Ｓ Ｐ ２
） ２ ＸＩＧ’個を混合し、１０００回転で１０分間
遠心してペレットとした。上清のＤＭＥＭ培地を吸引除
去し、ペレットをほぐした。５０％Ｐ Ｅ Ｇ ４００
０ １ ｍｌを１分間かけて加え、用いたピペットで攪
拌しながら３７℃で１分間反応させた。 続いて１１のＤＭＥＭ培地を３７℃のもとで１分間かけ
て加えた。再び１０００回転で１０分間遠心して同様の
操作をもう一度行なった後、３７℃に温めておいたＤＭ
ＥＭ培地７１を２〜３分間で加えた。直ちに、１０００
回転で１０分間、室温で遠心して、上清を除去した０次
いで、３７℃に温めておいた２０％牛脂児血清（Ｆｅ２
）−ＤＭＥＭ培地１０履ｌを加え。 ペレットを懸濁させた。さらに２０１の２０％ＦＣ５−
ＤＭＥＭ培地を加えて良く懸濁させた後、８Ｂ穴培養プ
レ一ト３枚にこの懸濁液を１穴あたり０．１鱈分注し、
ＣＯ２インキュベーター内で培養した。以下、細胞融合
を行った日を第０日として記述する。 ４）珪ＡＴ選択 第１日日に、ＨＡＴ培地（ヒボキサンチンｌ×１０”
Ｍ、アミノプテリン４ Ｘ １０−’ Ｍ、、チミジン
０．８ Ｘ １０（Ｍを含む２０％ＦＣ５−ＤＭＥＭ培
地）を１穴あたり０．１腸ｌ加えた。第２．３．５．８
及び１１日日日培地の半分を吸引除去し、ＨＡＴ培地０
．１１を加えた。１４日日日は、培地の半分をＨＴ（Ｈ
ＡＴ培地からアミノプテリンを除いたもの）と交換した
。以後、３又は４日毎にＨＴ培地と交換した。ハイブリ
ドーマは金穴に増殖してきた。 ５）ハイブリドーマの選択 融合後２週間から４週間までの間、３又は４日毎に培養
上清を穴ごとに集め、ＥＬＩＳＡにて分析した。 まず、ＥＬＩＳＡプレー）にＯＴＡ−ＯＶＡ（２ＩＬｇ
／ｌｏｏ ＩＬＪＬ）を分注し、２５℃で２時間静置し
て抗原をプレートに固定化した。 Ｔｗｅｅｎ ２Ｇを
０．０５％含むＰＢＳで３回洗浄した後、培養上清中
（の蛋白質の非特異的吸着を避けるため、０ＶＡ（５０
０紗ｇ／１００ＩＬｉ）を分注し、２５℃で１時間静置
した０次に、同上緩衝液で３回洗浄後、上記の各細胞培
養上清を１００ｘｉ分注し、２５℃で１時間静置した。 陰性対照として２０％ＦＣ５−ＤＭＥＭ培地１００ル文
を分注した。更に同上緩衝液で４回洗浄後、抗マウス免
疫グロブリン抗体−アルカリホスファターゼ複合体溶液
１００ＩＬＪＬをプレートに分注し、室温で２時間静置
した。再び同上緩衝液で４回洗浄後、ｐ−ニトロフェニ
ルリン酸２ナトリウムや６ Ｈ２０（１ｍｇ／■ｌ）溶
液を１００ト立ずつ分注し、室温で３０分間反応後、０
．０．４０５ ｎｍを測定して、アルカリホスファター
ゼ活性を定量した。 同様に、０ＴＡ−ＫＬＨｌＯＶＡ、Ｔ２−ＵＳ−ＫＬＨ
をプレートに固定化してＥＬＩＳＡを行い、０ＴＡ−Ｏ
ＶＡ及び０ＴＡ−ＫＬＨに対シテ陽性、かつＯＶＡ及び
Ｔ２−Ｈ３−ＫＬＨに対して陰性を示した培養上清で増
殖しているハイブリドーマを抗ＯＴＡ抗体産生ハイブリ
ドーマとして選択した。 ２５０穴中、２０穴に抗ＯＴＡ抗体産生が認められた。 ８）１１への培養スケールの拡大 どの穴で抗ＯＴＡ抗体を産生じているかが判明したら、
２４穴培養プレートへ植え換え、１１スケールでの培養
を行った。この際、Ｈａ １ ｂ／ｃマウスの胸腺細胞
を支持細胞として用いた。 ＨＴ培地０．５１を２４穴培養プレートに分注し、それ
ぞれの穴に１〜２ Ｘ １Ｇ’個の胸腺細胞を加えた。 このためには、４又は５週齢のマウスから胸腺を摘出し
、少なくとも３回洗浄した後、胸腺１個あたり１１のＨ
Ｔ培地に懸濁し、この懸濁液を５０〜１００ｐｉずつそ
れぞれの穴に加えればよい。 次いで、９Ｂ穴培養プレートにおける抗体産生穴の細胞
懸濁液を２４穴培養プレートに移す、これを再懸濁し、
そのうちの２５０１Ｌ！Ｌを元の９６穴培養プレートの
穴にもどす、これが複製となり、新しい細胞株の損失を
ふせぐことができる。 ２又は３日後、２４穴培養プレートにＨＴ培地０．５
ｍｌを加える（ここでは支持細胞は必要としない）、更
に２日後、上清を除き新しい培地を加える１、細胞がほ
ぼ全面に拡がってきたら、抗体活性の再テストをする。 もし引続いて抗体を産生じているようであれば即座にク
ローニングを行う。 もし抗体を産生している穴がそれほど多くなければ、９
８穴培養プレートで培養している段階から、直接クロー
ニングしてもよい、しかし、２４穴培養プレートに植え
換えてもなお抗体を産生じているものの中からクローニ
ングすることにより、より不安定な株をクローニングす
るという無駄を省くことができる。 ７）モノクローン化 クローニング培地として、Ｂａ１ｂ／ｃマウスの胸腺細
胞を１０７債１１含んだ２０％ＦＣ５−ＤＭ’ＥＭ培地
を使用した。もし、クローニングを直接９Ｂ穴培養プレ
ートから行うときは、クローニング培地としてＨＴ培地
を用いる。 次いで、抗ＯＴＡ抗体産生ハイブリドーマを計数し、ク
ローニング培地４．６１中に２３０個の細胞が含まれる
ように希釈する。この懸濁液を １００ｋｌずつ、９６
穴培養プレート中の３６穴に分注し。 残った懸濁液に４１のクローニング培地を加え再懸濁す
る。この懸濁液を １００ＩＬＪｌずつ、３６穴に分注
する。再び、残った懸濁液に １．４１のクローニング
培地を加えて再懸濁し、これを １００ｋｌずつ、残り
の２４穴にまく、５日目と１２２日目 １００ｕ、ｉの
培地を加える。１４４日目でには。 ＥＬＩＳＡが可能なほどに細胞が増殖する。このうち、
モノクローナルであると思える穴について抗体産生のチ
ェックを行い、抗ＯＴＡ抗体産生ハイブリドーマ７クロ
ーン（ＯＴＡ−１〜７．微工研５８微寄文第１６７７号
）を得た。 ８）モノクローナル抗体の生産 モノクローナル抗体は培養上清中に１０〜５０ＪＬｇ／
鳳１分泌される。 ハイブリドーマを増殖させた後、はとんど全てのハイブ
リドーマを死ぬ直前まで培養し、培養上清を回収した゛
。 また、０ＴＡ−１〜０ＴＡ−７をそれぞれ２Ｘ （
１０６個ＤＭＥＭ培地０．５１に浮遊させ、Ｂａ１ｂ／
ｃマウス（♀、６週齢、あらかじめ３〜１０日前にブリ
スタン０．５１を腹腔内投与しておいたもの）の腹腔内
に投与し、腹水を回収した。 ８）モノクローナル抗体のクラスの決定それぞれのハイ
ブリドーマクローンの産生ずる免疫グロブリンのクラス
は、各クラスに特異的な抗血清（抗Ｉ ｇＧ １ 、
Ｉ ｇＧ２ａ、 Ｉ ｇＧ２ｂ。 Ｉ ｇＧ３ 、ＩｇＭ、Ｉ ｇＡ）を用いたオフタロニ
ー法によって決定した。 ＯＴＡ 、１ （ＯＴＡ−１より産生）、ＯＴＡ。 ２ （ＯＴＡ−２より産生）、ＯＴＡ 、３ （ＯＴＡ
−３より産生）、ＯＴＡ 、４ （ＯＴＡ−４より産生
） 、ＯＴＡ、５ （ＯＴＡ−５より産生）、及びＯＴ
Ａ 、７ （ＯＴＡ−７より産生）の６モノクロ一ナル
抗体はＩｇＧ１に属し、ＯＴＡ 、 ６（ＯＴＡ−６よ
り産生）のみがＩｇＭに属することがわかった。 実施例２ モノクローナル抗体０ＴＡ−１〜０ＴＡ−７の特異性を
調べるため、オクラトキシンＡ並びにその類似化合物で
あるオクラトキシンＢ （ＯＴＢ）、オクラトキシンα
（ＯＴα）、クマリン（ＣＭ）及び４−ヒドロキシクマ
リン（４−ＯＨＣ）との交叉反応性をＥＬＩＳＡにより
検討した。 測定操作は、実施例１の５）のハイブリドーマの選択の
欄で記載した方法に準じて行った。ただし、細胞培養上
清の代りに、多段階に希釈されたオクラトキシンＡ又は
その類似化合物のＰＢＳ−Ｔｗｅｓｎ溶液５０ＩＬｌと
同時にそれぞれのモノクローナル抗体又は０ＴＡ−ＵＳ
Ａを用いて免疫されたマウス抗ＯＴＡ血清を１０，００
０倍にＰＢＳで希釈した溶液を用いた。その結果を第２
表に示したが、その特異性から、２群に分類することが
できた。 即ち、ＯＴＡに特異的でＯＴＢ及びＯＴαとはほとんど
反応しないモノクローナル抗体（ＯＴＡ 。 １．３．４．５．６．７）と、ＯＴＡ及びＯＴＢと同程
度反応し、ＯＴαには反応しないモノクローナル抗体（
ＯＴＡ 、２）との２群に分類することができる。前者
のタイプの代表的な交叉反応性を第１図（ＯＴＡ、ｌ）
に示し、後者のタイプの交叉反応性を第２１Ｑ （ＯＴ
Ａ 、２）に示した。 なお、比較のために、従来の抗血清（ポリクローナル抗
体）の代表的な交叉反応性を第３図に示した。 このような２種の抗体を用いることにより、オクラトキ
シンＡのみならずオクラトキシンＢの定量も可能となる
。
ｉｌｌｕｓ）やペニシリウムＡ （ｐｅｎｉｃｉｌｌｉ
ｕｍ）のある種のものから産生される有毒二次代謝産物
である。オクラトキシンＡはマイコトキシンの中でも毒
性の強いものの一つであり、腎毒性や腎・肝催腫瘍性を
有し、現在では穀物、飼料及び食肉等のすクラトキシン
Ａによる汚染が問題となっている。 オクラトキシンＡを穀物又はその加工製品から検出する
方法としては、ＴＬＣやＨＰＬＣ等が用いられており、
最近では感度や特異性の高い免疫測定法も試みられてい
る。 さて、免疫測定法で特異的にオクラトキシンＡを測定す
るためには、特異性の高い抗体が必要であることは論す
るまでもない、オクラトキシンＡのような低分子化合物
に対する抗体を作製する場合は、それ自身が免疫原性を
持たないので、蛋白質等の高分子キャリアーと結合させ
てハプテン抗原とし、そのハプテン抗原を動物に免疫す
ることが通常行なわれている。しかしながら、オクラト
キシン類のように類似の化合物が多数存在する化合物群
の場合、その中の一種の化合物のみに特異的な抗体を作
成することは困難であり、従来の方法で得られた抗体は
その化合物が属する群のその他の多くの化合物と交叉反
応するのが通常であった。 即ち、オクラトキシンＡに対する抗体の作製には、従来
オクラトキシンＡにウシ血清アルブミン（Ｂ Ｓ Ａ）
を結合させたハプテン抗原を用いていたが、この方法で
得られた抗体の特異性は充分ではなく、オクラトキシン
類全体に交叉反応を示した。 このように特異性の高いオクラトキシンＡに対する抗体
としては多くの研究者の努力にもかかわらず未だ充分な
ものが得られておらず、しかも穀類中のオクラトキシン
Ａの特異的な測定法の開発が要求されている折から、特
異抗体の作製が強く待ち望まれていた。 また、従来の非特異的な抗体の作製方法では、得られる
抗体自身の保存安定性が悪いため、抗血清の製造を目的
として動物を免疫する度に何度もハプテン抗原を調製し
なければならないという手間を要した。しかも、ハプテ
ン抗原の作製方法や使用する動物個体差、免疫の仕方に
よって、その都度、力価、特異性及び抗体サブクラスの
異なった抗体ゎ得、、ゎ６えあ、オケ、１ヤッ２類。測
定 （結果に微妙な影響が生じた。 ［発明の目的］ 本発明の目的は、オクラトキシンＡに対し特異性の高い
モノクローナル抗体を提供するとともに、該モノクロー
ナル抗体を用いてオクラトキシン類を精度良く測定し得
る方法を提供することにある。 ［発明の概要１ ′ 本発明者らは、ハプテン抗原を用いて免疫した場合、動
物の免疫担当臓器、主に膵臓において出現する多数の抗
体産生クローンの中には目的の抗原に対して特異的な抗
体を産出するクローンが存在しており、クローニングに
より目的とするクローンのみを選び出して単クローンと
すれば特異性の高い抗体の製法が確立できるものと考え
、研究を進めて本発明を完成するに至った。 即ち、本発明の抗体は、マウスのミエローマとオクラト
キシンＡをハプテンとした抗原であらかじめ免疫された
マウスからのリンパ球との細胞融合により形成されたハ
イブリドーマから産生される抗オクラトキシンＡモノク
ローナル抗体であることを特徴とする。また、本発明の
オクラトキシン類の測定方法は、上記抗オクラトキシン
Ａモノクローナル抗体を用いてオクラトキシン類を測定
することを特徴とする。 以下、本発明を更に詳細に説明する。 本発明において抗オクラトキシンＡモノクローナル抗体
を製造するための第一段階は、抗体を産生ずる新規な単
クローンハイブリドーマを確立することである。このハ
イブリドーマを確立するための具体的な方法については
後述する実施例にて詳細に説明するが、簡単に父えば該
方法は、免疫、細胞融合、ハイブリドーマの選択と単ク
ローン化の３工程から成る。 立並 オクラトキシンＡは、例えば、アスペルギルス・オクラ
セウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｃｈｒａｃｅｕｓ
）の培養液を分離・精・製することによって得ることが
できるが、オクラトキシンＡ単独では抗原になり得ない
、このため、オクラトキシンＡを蛋白質と結合させて免
疫抗原とするが、蛋白質としては通常入手できるもであ
れば格別限定されない０通常、入手し易い牛血清アルブ
ミン等が用いられる。オクラドキシンＡと蛋白質とを結
合させるためには、自体公知の方法が有効に利用できる
。 蛋白質との結合方法としては、オクラトキシンＡのカル
ボキシル基を利用し、カルボジイミドにより脱水縮合さ
せるカルボジイミド法、酸無水物を利用する酸無水物法
等が例示される。 免疫抗原を作製した後は、免疫動物を選ぶ必要があるが
、免疫動物は細胞融合に使用する腫瘍細胞株によって決
められる。一般にはラット、マウスが多く用いられる。 マウスの中でも免疫グロブリンを産生しない腫瘍細胞株
が確立されているＢａ１ｂ／ｃがよく用いられる。 ハブテン抗原は１等張緩衝液又は生理食塩水等に溶解し
て使用するが、マウス−匹あたり１回に１０〜１００μ
ｇ投与するのが好ましい、免疫は数回に分けて行うが、
通常初回免疫はアジュバントと共に行う、アジュバント
としては、ミ震つバン、結核死菌、核酸、フロインドア
ジュバント等が使用される０通常、免疫は２〜４週間々
隔で行い、最終免疫はアジュバントを使用せず生理食塩
水に溶解し、腹腔又は静脈内に投与する。 １血亙澄 最終免疫が終了してから２〜４日後にリンパ節又は膵臓
を摘出し、得られるリンパ球を細胞融合に供する。一方
、細胞融合に使用される腫瘍細胞株としては初期にはＮ
ＰＣ−１１、Ｐ３−Ｘｌｌ１３−Ａｇ８等があったが、
これらは自身免疫グロブリンを産生ずるノテ、最近では
Ｐ３−Ｘ８３−Ａｇ８−［１１、Ｐ３−ＭＳ−１，５Ｐ
２１０−Ａｌ１４等が汎用されている。 細胞融合するときは、リンパ球を腫瘍細胞よりも約５〜
２０倍量多く用いる。細胞融合に供する腫瘍細胞及びリ
ンパ球は、まずＤＭＥＭ培地。 Ｍ ｃ Ｃｏ ｙ培地、ＲＰＭＩ１８４０培地、あるい
は等緩衝液等で洗浄し、混合した後、遠心分離し、ペレ
ット化する６次いで、ペレットをほぐした後、通常ＨＶ
Ｊ （センダイウィルス）又はポリエチレングリコール
（ＰＥＧ）を用いて細胞を融合させるが、一般には取扱
いの便利な平均分子量１．０００〜８，０００のＰＥＧ
の４０〜８０％溶液を０．５〜２厘ｌ使用する。融合を
促進するために、コルヒチン、ジメチルスルホキシド又
はポリーＬ−フルギニン等を添加することもあるが、本
発明においては必須ではない。 ＰＥＧ溶液中で融合反応を １〜１０分間程度行った後
、ＤＭＥＭ培地やＲＰＭＩ １ Ｂ４０培地等をｌＯ〜
５０１徐々に加えて融合反応を停止させる。停止後遠心
し、上清を除去する。しかる後、牛胎児血清（Ｆｅ２）
を５〜２０％含むＤＭＥＭ培地又はＲＰＭＩ１６４０培
地を加え、２４穴の培養プレートにリンパ球が１穴あた
りｌ Ｘ １０５〜ｌ Ｘ １０＠個となるよう各穴に
ｌ■ｌ毎分注する。あるいは、９６穴培養プレートにリ
ンパ球が１穴あたり１〜２ Ｘ １０”個となるよう各
穴に０．１腸ｌ毎分注する。 なお、いずれの場合であっても、フィーダー細胞は添加
した方が好ましい、フィーダー細胞としては、ラットの
胸腺細胞もしくは肺細胞、又はマウスの胸腺細胞もしく
は肺細胞等が用いられ、その濃度が０．５〜２ＸｌＯ’
／厘１となるように添加する。 リン４Ｘ１０−’Ｍ、チミジン１．８Ｘ １０（Ｍを含
むＲＰＭ１１６４０培地（又はＤＭＥＭ培ｊｌｌ） 、
即ちＨＡＴ培地に換えてい＜、ＨＡＴ培地に交換する←
は、一般には翌日、融合時に分注した容量と等容量のＨ
ＡＴ培地を培養プレートに加え、更に翌日その半量をＨ
ＡＴ培地と交換する。その後２〜３日毎ＨＡＴ培地で半
量ずつ交換する。融合後１０〜１４日目に７日日プテリ
ンを除いたＨＡＴ培地、即ちＨＴ培地に半量交−検し、
更にその１〜３日後より１〜３日毎にＨＴ培地の半量を
ＨＡＴを含まない通常の培地に交換する。 ハイブリドーマ ゛ クローンヒハイブリドーマ
の増殖の盛んな穴の細胞培養上清を種々の分析法、例え
ばＲＩＡ （放射免疫測定法）、プラーク法、凝集反応
、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫測定法）等の分析法によっ
て、目的の抗体産生ハイブリドーマを選択する。しかる
後、得たハイブリドーマについてクローニングを行う、
クローニングの方法としては、一般によく用いられる限
界希釈法や、あるいはＦＡＣ５（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎ
ｔ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅ１ｌ ５ｏｒｔｅｒ）を
用いたり、５ｏｆｔ Ａｇａｒを用いてコロニーを拾い
上げる方ｉ 等かアロ 、クローニングはコロニーが一
つのハイブリドーマから形成されるような細胞濃度で行
う、限界希釈法では９Ｂ穴プレートの１穴あたり細胞が
０．６個以下になるように行う、いずれの方法を用いた
場合もクローニングは２回繰返し、単一クローンとする
。 １オクラトキシンＡモノクローナル の目的とするク
ローンを確立したならば、抗オクラトキシンＡモノクロ
ーナル抗体は大量にｉｎマ１ｔｒｏで培養するか、ある
いはｉｎ ｖｉｖｏで培養することによって産生される
。 ＋ｎ ｖ＋ｔｒｏで産生されたモノクローナル抗体
については他の抗体の混入はないが抗体価は低い、他方
、ｉｎ ｖｉｖｏで産生されたモノクローナル抗体は、
宿主からの抗体が若干混ざるが、その抗体価はｉｎ ｖ
ｉｔｒｏと比べ非常に高い、どちらの方法によりモノク
ローナル抗体を産生させるかは、目的に応じて適宜に選
択される。 上記生産方法により、モノクローナル抗体ＯＴＡ、１．
２．３．４．５，６及び７の７種のモノクローナル抗体
が得られる。オフタロニー法による分析の結果、これら
のモノクローナル抗体中のＯＴＡ、１．２．３．４．５
及び７はマウスＩｇＧ１サブクラスに属し、０ＴＡ−６
のみがＩｇＭに属することが判明した。上記方法によっ
て得られた抗オクラトキシンＡモノクローナル抗体のク
ラスを第１表にまとめた。 ｉｔ表 オクラトキシン ０ＴＡ−１，３，４，５，６及び７（タイプＩ）はオク
ラトキシンＡに特異的であって、オクラトキシンＢ及び
オクラトキシンαとはほとんど反応しないが、ＯＴＡ、
２（タイプ■）はオクラトキシンＡ及びオクラトキシン
Ｂと同程度に反応し、オクラトキシンαには反応しない
、第二抗体としてアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マ
ウスＩｇＧを用いたＥＬＩＳＡにより、オクラトキシン
Ａ及びその類縁化合物と本抗体ＯＴＡ、１〜７との交叉
反応性を調べ、その結果を第２表に示した。なお、実験
方法については実施例中に詳細に記載されている。 第２表 モノクローナル抗体の交叉反応性 ＯＴＡ、５ ０丁＾、８
０〒Ａ、７０丁０ ３１５（０，００５
） １１３８（０，００５） １１２（０
，００１）攻５０％を阻害する量（ｎｇ／ａｓｓａｙ）
零吋）内の数値はＯＴＡに対する相対比を示す。 更に、上記タイプ■及びタイプ■についての代表的な交
叉反応性をそれぞれ第１図（ＯＴＡ 。 ｌ）及び８２図（ＯＴＡ 、２）に示し１合わせて従来
の抗血清（ポリクローナル抗体）の代表的な交叉反応性
を第３図に示した。 これらの結果から明らかなように、タイプＩのモノクロ
ーナル抗体は、従来のポリクローナル抗体と比べてオク
ラトキシンＡ以外の他のオクラトキシン類とはほとんど
反応せず、オクラトキシンＡに対する特異性が高いこと
がわかり、オクラトキシンＡの特異的測定に大きく寄与
するものである。他方、タイプＨのモノクローナル抗体
はオクラトキシンＡ及びＢと同程度に反応するため、タ
イプＩとタイプ■の２種の抗体を用いることにより、オ
クラトキシンＡのみならず、オクラトキシンＢについて
も定量が可能となる。 抗オクラトキシンＡモノクローナル抗体ヲ用いて特異的
にオクラトキシンＡを測定するためには、通常ＲＩＡ又
はＥＩＡ等によって行われる。 ＥＩＡに使用するときは標準酵素としてβ−ガラクトシ
ダーゼ、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ等
を用いることができる。 ［発明の効果］ 本発明の新規なタイプ■のモノクローナル抗体（ＯＴＡ
、１．３．４．５．６及び７）は第１図に示したように
、オクラトキシンＡのみに特異的に反応し、他のオクラ
トキシン類とは反応しない、他方、タイプＨのモノクロ
ーナル抗体（ＯＴＡ 、２）は第２図に示したように、
オクラトキシンＡ及びＢと特異的に反応し、他のオクラ
トキシン類とは反応しない、したがって、本発明のタイ
プＩのモノクローナル抗体を用いれば、特異的にオクラ
トキシンＡを測定することができ、またタイプ■のモノ
クローナル抗体を用いれば。 オクラトキシンＡ及びＢを同時に特異的に測定すること
が可能となる。 更に１本発明ではハイブリドーマを用いてモノクローナ
ル抗体を産生じているが、ハイブリドーマを培養さえし
ていれば、いつでも必要なときにモノクローナル抗体を
得ることができ、しかも一定の特性を有するものが得ら
れるため、動物を免疫する毎にハプテン抗原を調製する
必要はなく、動物の固体差に影響されることなく常に安
定した品質の抗体を得ることができる。 以下、実施例を挙げて更に詳細に説明するが、以下の実
施例は本発明の範囲を何ら限定するものではない。 【発明の実施例】 実施例１ 抗すクラトキシンＡモノクローナル抗体を産生ずるハイ
ブリドーマ及び抗体の作製 １）免疫抗原、分析用抗原の作製 ＯＴＡ５ｍｇをエタノール０．１２ｍ１と０．１ Ｍリ
ンｍ緩衝液（ｐ Ｈ７，０） ３ ｍｌニ溶解り、り、
０．１ Ｍ食塩水に溶かした牛血清アルブミン（Ｂ
Ｓ Ａ）５０１ｇをトキシン溶液と合わせた。ｌ−エチ
ル−３−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（
ＥＤＰＣ）をこの混合液に加え、２０℃で２４時間暗所
で攪拌した。蒸留水に対して透析した後、凍結乾燥し、
ＯＴＡ−ＢＳＡ３０ｍｇを得た。 また、ＢＳＡの代りに卵白アルブミン（ＯｖＡ）、陣笠
貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）を用いて、上記と同様の操作
−１？０ＴＡ−ＯＶＡ、０ＴＡ−ＫＬＨを作製した。 Ｋ Ｌ Ｈ１０＋＋＋ｇをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）
１２ｍｌに溶解し、ＨＤＰＣ１５■ｇを加えた。この溶
液にＴ２−トキシン−ヘミサクシネート（Ｔ２−Ｈ３）
１０１ｇをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１層ｌに溶
解したものを室温下で攪拌しながら滴下した。析出不溶
物を濾別しＥＤＰＣ５■ｇを追加した。ＩＮ塩酸でｐＨ
を５．５に調整し、室温で更に１８時間攪拌した。水に
対して透析した後、凍結乾燥し、分析用抗ｇＴ２−Ｈ５
−ＫＬＨを得た。 ２）免疫 ０ＴＡ−ＢＳＡ １０ＯＩＬ文を溶解した生理゛食塩
水０．２５ｍ１とフロイントの完全アジュバント０．２
５■ｔヲ混合し、エマルジョンとし、その０．５１をＢ
ａ１ｂ／ｃマウス（♀、４週齢）の腹腔内に投与した。 １〜３週間後、ＯＴ Ａ −Ｂ Ｓ Ａ １０〜１００
ｇ ｇ （７）生理食塩水溶液を腹腔内投与名は尾静
脈に注射することにより追加免疫を行った。 ３）細胞融合 最終免疫より３日後、マウスの肺臓を摘出し、１０ｍ１
のＤＭＥＭ培地を入れたプラスチックシャーレ中で、牌
リンパ球をほぐした０次いで、牌リンパ球を遠心操作（
１０００回転、１０分）を繰返し、ＤＭＥＭ培地で３回
洗浄した。牌リンパ球１×１０８個と、８−７ザグアニ
ン耐性ミエローマＳＰ２／０−Ａｇ１４ （Ｓ Ｐ ２
） ２ ＸＩＧ’個を混合し、１０００回転で１０分間
遠心してペレットとした。上清のＤＭＥＭ培地を吸引除
去し、ペレットをほぐした。５０％Ｐ Ｅ Ｇ ４００
０ １ ｍｌを１分間かけて加え、用いたピペットで攪
拌しながら３７℃で１分間反応させた。 続いて１１のＤＭＥＭ培地を３７℃のもとで１分間かけ
て加えた。再び１０００回転で１０分間遠心して同様の
操作をもう一度行なった後、３７℃に温めておいたＤＭ
ＥＭ培地７１を２〜３分間で加えた。直ちに、１０００
回転で１０分間、室温で遠心して、上清を除去した０次
いで、３７℃に温めておいた２０％牛脂児血清（Ｆｅ２
）−ＤＭＥＭ培地１０履ｌを加え。 ペレットを懸濁させた。さらに２０１の２０％ＦＣ５−
ＤＭＥＭ培地を加えて良く懸濁させた後、８Ｂ穴培養プ
レ一ト３枚にこの懸濁液を１穴あたり０．１鱈分注し、
ＣＯ２インキュベーター内で培養した。以下、細胞融合
を行った日を第０日として記述する。 ４）珪ＡＴ選択 第１日日に、ＨＡＴ培地（ヒボキサンチンｌ×１０”
Ｍ、アミノプテリン４ Ｘ １０−’ Ｍ、、チミジン
０．８ Ｘ １０（Ｍを含む２０％ＦＣ５−ＤＭＥＭ培
地）を１穴あたり０．１腸ｌ加えた。第２．３．５．８
及び１１日日日培地の半分を吸引除去し、ＨＡＴ培地０
．１１を加えた。１４日日日は、培地の半分をＨＴ（Ｈ
ＡＴ培地からアミノプテリンを除いたもの）と交換した
。以後、３又は４日毎にＨＴ培地と交換した。ハイブリ
ドーマは金穴に増殖してきた。 ５）ハイブリドーマの選択 融合後２週間から４週間までの間、３又は４日毎に培養
上清を穴ごとに集め、ＥＬＩＳＡにて分析した。 まず、ＥＬＩＳＡプレー）にＯＴＡ−ＯＶＡ（２ＩＬｇ
／ｌｏｏ ＩＬＪＬ）を分注し、２５℃で２時間静置し
て抗原をプレートに固定化した。 Ｔｗｅｅｎ ２Ｇを
０．０５％含むＰＢＳで３回洗浄した後、培養上清中
（の蛋白質の非特異的吸着を避けるため、０ＶＡ（５０
０紗ｇ／１００ＩＬｉ）を分注し、２５℃で１時間静置
した０次に、同上緩衝液で３回洗浄後、上記の各細胞培
養上清を１００ｘｉ分注し、２５℃で１時間静置した。 陰性対照として２０％ＦＣ５−ＤＭＥＭ培地１００ル文
を分注した。更に同上緩衝液で４回洗浄後、抗マウス免
疫グロブリン抗体−アルカリホスファターゼ複合体溶液
１００ＩＬＪＬをプレートに分注し、室温で２時間静置
した。再び同上緩衝液で４回洗浄後、ｐ−ニトロフェニ
ルリン酸２ナトリウムや６ Ｈ２０（１ｍｇ／■ｌ）溶
液を１００ト立ずつ分注し、室温で３０分間反応後、０
．０．４０５ ｎｍを測定して、アルカリホスファター
ゼ活性を定量した。 同様に、０ＴＡ−ＫＬＨｌＯＶＡ、Ｔ２−ＵＳ−ＫＬＨ
をプレートに固定化してＥＬＩＳＡを行い、０ＴＡ−Ｏ
ＶＡ及び０ＴＡ−ＫＬＨに対シテ陽性、かつＯＶＡ及び
Ｔ２−Ｈ３−ＫＬＨに対して陰性を示した培養上清で増
殖しているハイブリドーマを抗ＯＴＡ抗体産生ハイブリ
ドーマとして選択した。 ２５０穴中、２０穴に抗ＯＴＡ抗体産生が認められた。 ８）１１への培養スケールの拡大 どの穴で抗ＯＴＡ抗体を産生じているかが判明したら、
２４穴培養プレートへ植え換え、１１スケールでの培養
を行った。この際、Ｈａ １ ｂ／ｃマウスの胸腺細胞
を支持細胞として用いた。 ＨＴ培地０．５１を２４穴培養プレートに分注し、それ
ぞれの穴に１〜２ Ｘ １Ｇ’個の胸腺細胞を加えた。 このためには、４又は５週齢のマウスから胸腺を摘出し
、少なくとも３回洗浄した後、胸腺１個あたり１１のＨ
Ｔ培地に懸濁し、この懸濁液を５０〜１００ｐｉずつそ
れぞれの穴に加えればよい。 次いで、９Ｂ穴培養プレートにおける抗体産生穴の細胞
懸濁液を２４穴培養プレートに移す、これを再懸濁し、
そのうちの２５０１Ｌ！Ｌを元の９６穴培養プレートの
穴にもどす、これが複製となり、新しい細胞株の損失を
ふせぐことができる。 ２又は３日後、２４穴培養プレートにＨＴ培地０．５
ｍｌを加える（ここでは支持細胞は必要としない）、更
に２日後、上清を除き新しい培地を加える１、細胞がほ
ぼ全面に拡がってきたら、抗体活性の再テストをする。 もし引続いて抗体を産生じているようであれば即座にク
ローニングを行う。 もし抗体を産生している穴がそれほど多くなければ、９
８穴培養プレートで培養している段階から、直接クロー
ニングしてもよい、しかし、２４穴培養プレートに植え
換えてもなお抗体を産生じているものの中からクローニ
ングすることにより、より不安定な株をクローニングす
るという無駄を省くことができる。 ７）モノクローン化 クローニング培地として、Ｂａ１ｂ／ｃマウスの胸腺細
胞を１０７債１１含んだ２０％ＦＣ５−ＤＭ’ＥＭ培地
を使用した。もし、クローニングを直接９Ｂ穴培養プレ
ートから行うときは、クローニング培地としてＨＴ培地
を用いる。 次いで、抗ＯＴＡ抗体産生ハイブリドーマを計数し、ク
ローニング培地４．６１中に２３０個の細胞が含まれる
ように希釈する。この懸濁液を １００ｋｌずつ、９６
穴培養プレート中の３６穴に分注し。 残った懸濁液に４１のクローニング培地を加え再懸濁す
る。この懸濁液を １００ＩＬＪｌずつ、３６穴に分注
する。再び、残った懸濁液に １．４１のクローニング
培地を加えて再懸濁し、これを １００ｋｌずつ、残り
の２４穴にまく、５日目と１２２日目 １００ｕ、ｉの
培地を加える。１４４日目でには。 ＥＬＩＳＡが可能なほどに細胞が増殖する。このうち、
モノクローナルであると思える穴について抗体産生のチ
ェックを行い、抗ＯＴＡ抗体産生ハイブリドーマ７クロ
ーン（ＯＴＡ−１〜７．微工研５８微寄文第１６７７号
）を得た。 ８）モノクローナル抗体の生産 モノクローナル抗体は培養上清中に１０〜５０ＪＬｇ／
鳳１分泌される。 ハイブリドーマを増殖させた後、はとんど全てのハイブ
リドーマを死ぬ直前まで培養し、培養上清を回収した゛
。 また、０ＴＡ−１〜０ＴＡ−７をそれぞれ２Ｘ （
１０６個ＤＭＥＭ培地０．５１に浮遊させ、Ｂａ１ｂ／
ｃマウス（♀、６週齢、あらかじめ３〜１０日前にブリ
スタン０．５１を腹腔内投与しておいたもの）の腹腔内
に投与し、腹水を回収した。 ８）モノクローナル抗体のクラスの決定それぞれのハイ
ブリドーマクローンの産生ずる免疫グロブリンのクラス
は、各クラスに特異的な抗血清（抗Ｉ ｇＧ １ 、
Ｉ ｇＧ２ａ、 Ｉ ｇＧ２ｂ。 Ｉ ｇＧ３ 、ＩｇＭ、Ｉ ｇＡ）を用いたオフタロニ
ー法によって決定した。 ＯＴＡ 、１ （ＯＴＡ−１より産生）、ＯＴＡ。 ２ （ＯＴＡ−２より産生）、ＯＴＡ 、３ （ＯＴＡ
−３より産生）、ＯＴＡ 、４ （ＯＴＡ−４より産生
） 、ＯＴＡ、５ （ＯＴＡ−５より産生）、及びＯＴ
Ａ 、７ （ＯＴＡ−７より産生）の６モノクロ一ナル
抗体はＩｇＧ１に属し、ＯＴＡ 、 ６（ＯＴＡ−６よ
り産生）のみがＩｇＭに属することがわかった。 実施例２ モノクローナル抗体０ＴＡ−１〜０ＴＡ−７の特異性を
調べるため、オクラトキシンＡ並びにその類似化合物で
あるオクラトキシンＢ （ＯＴＢ）、オクラトキシンα
（ＯＴα）、クマリン（ＣＭ）及び４−ヒドロキシクマ
リン（４−ＯＨＣ）との交叉反応性をＥＬＩＳＡにより
検討した。 測定操作は、実施例１の５）のハイブリドーマの選択の
欄で記載した方法に準じて行った。ただし、細胞培養上
清の代りに、多段階に希釈されたオクラトキシンＡ又は
その類似化合物のＰＢＳ−Ｔｗｅｓｎ溶液５０ＩＬｌと
同時にそれぞれのモノクローナル抗体又は０ＴＡ−ＵＳ
Ａを用いて免疫されたマウス抗ＯＴＡ血清を１０，００
０倍にＰＢＳで希釈した溶液を用いた。その結果を第２
表に示したが、その特異性から、２群に分類することが
できた。 即ち、ＯＴＡに特異的でＯＴＢ及びＯＴαとはほとんど
反応しないモノクローナル抗体（ＯＴＡ 。 １．３．４．５．６．７）と、ＯＴＡ及びＯＴＢと同程
度反応し、ＯＴαには反応しないモノクローナル抗体（
ＯＴＡ 、２）との２群に分類することができる。前者
のタイプの代表的な交叉反応性を第１図（ＯＴＡ、ｌ）
に示し、後者のタイプの交叉反応性を第２１Ｑ （ＯＴ
Ａ 、２）に示した。 なお、比較のために、従来の抗血清（ポリクローナル抗
体）の代表的な交叉反応性を第３図に示した。 このような２種の抗体を用いることにより、オクラトキ
シンＡのみならずオクラトキシンＢの定量も可能となる
。
第１、？及び３図は、それぞれＯＴＡ、ｌ、ＯＴＡ、２
及び従来の抗血清についてのＯＴＡ。 ＯＴＢ、ＯＴα、ＣＭ及び４−０ＨＣに対する交叉反応
性の結果を示したものである。 第１図 （／Ａｓ５ａｙ） 第２図 第３図 （／ ａｓｓａｙ）
及び従来の抗血清についてのＯＴＡ。 ＯＴＢ、ＯＴα、ＣＭ及び４−０ＨＣに対する交叉反応
性の結果を示したものである。 第１図 （／Ａｓ５ａｙ） 第２図 第３図 （／ ａｓｓａｙ）
Claims (4)
- （１）マウスのミエローマとオクラトキシンＡをハプテ
ンとした抗原であらかじめ免疫されたマウスからのリン
パ球との細胞融合により形成されたハイブリドーマから
産生される抗オクラトキシンＡモノクローナル抗体。 - （２）オクラトキシンＡ及びその類縁化合物に対する相
対的な反応性が第１図又は第２図に示されているような
いずれかの特性を有する特許請求の範囲第１項記載のモ
ノクローナル抗体。 - （３）マウスのミエローマがＳＰ２／０−Ａｇ１４であ
る特許請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体。 - （４）マウスのミエローマとオクラトキシンＡをハプテ
ンとした抗原であらかじめ免疫されたマウスからのリン
パ球との細胞融合により形成されたハイブリドーマから
産生される抗オクラトキシンＡモノクローナル抗体を用
いるオクラトキシン類の測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP927685A JPS61171500A (ja) | 1985-01-23 | 1985-01-23 | 抗オクラトキシンａモノクロ−ナル抗体及びこれを用いるオクラトキシン類の測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP927685A JPS61171500A (ja) | 1985-01-23 | 1985-01-23 | 抗オクラトキシンａモノクロ−ナル抗体及びこれを用いるオクラトキシン類の測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61171500A true JPS61171500A (ja) | 1986-08-02 |
Family
ID=11715937
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP927685A Pending JPS61171500A (ja) | 1985-01-23 | 1985-01-23 | 抗オクラトキシンａモノクロ−ナル抗体及びこれを用いるオクラトキシン類の測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61171500A (ja) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010047555A (ja) * | 2008-08-25 | 2010-03-04 | Horiba Ltd | オクラトキシンに対する抗体、その抗体を用いた親和性カラム、およびオクラトキシンの免疫学的検出用キット |
| US7902798B2 (en) | 2007-03-12 | 2011-03-08 | Nippon Soken, Inc. | Electric power generation control apparatus for vehicle alternator |
| CN103215231A (zh) * | 2013-04-03 | 2013-07-24 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 杂交瘤细胞株1h2、其产生的抗赭曲霉毒素a单克隆抗体及其应用 |
| CN106872460A (zh) * | 2017-03-08 | 2017-06-20 | 广东省生态环境技术研究所 | 一种赭曲霉素a的检测方法及检测试剂盒 |
| CN109535251A (zh) * | 2018-12-13 | 2019-03-29 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 一种赭曲霉毒素a抗独特型纳米抗体及其制备方法 |
| CN109535256A (zh) * | 2018-12-12 | 2019-03-29 | 深圳市金阅科技有限责任公司 | 赭曲霉毒素a抗独特型纳米抗体作为赭曲霉毒素a标准品替代物的应用 |
| CN109575138A (zh) * | 2018-12-20 | 2019-04-05 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 一种赭曲霉毒素a抗独特型纳米抗体作为赭曲霉毒素a抗原替代物的应用 |
| CN111849791A (zh) * | 2020-05-11 | 2020-10-30 | 中国科学院微生物研究所 | 一株赭曲霉菌株l1295及其应用 |
-
1985
- 1985-01-23 JP JP927685A patent/JPS61171500A/ja active Pending
Cited By (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7902798B2 (en) | 2007-03-12 | 2011-03-08 | Nippon Soken, Inc. | Electric power generation control apparatus for vehicle alternator |
| JP2010047555A (ja) * | 2008-08-25 | 2010-03-04 | Horiba Ltd | オクラトキシンに対する抗体、その抗体を用いた親和性カラム、およびオクラトキシンの免疫学的検出用キット |
| CN103215231A (zh) * | 2013-04-03 | 2013-07-24 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 杂交瘤细胞株1h2、其产生的抗赭曲霉毒素a单克隆抗体及其应用 |
| CN103215231B (zh) * | 2013-04-03 | 2014-01-22 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 杂交瘤细胞株1h2、其产生的抗赭曲霉毒素a单克隆抗体及其应用 |
| CN106872460A (zh) * | 2017-03-08 | 2017-06-20 | 广东省生态环境技术研究所 | 一种赭曲霉素a的检测方法及检测试剂盒 |
| CN106872460B (zh) * | 2017-03-08 | 2019-10-18 | 广东省生态环境技术研究所 | 一种赭曲霉素a的检测方法及检测试剂盒 |
| CN109535256A (zh) * | 2018-12-12 | 2019-03-29 | 深圳市金阅科技有限责任公司 | 赭曲霉毒素a抗独特型纳米抗体作为赭曲霉毒素a标准品替代物的应用 |
| CN109535256B (zh) * | 2018-12-12 | 2022-10-21 | 深圳市金阅科技有限责任公司 | 赭曲霉毒素a抗独特型纳米抗体作为赭曲霉毒素a标准品替代物的应用 |
| CN109535251A (zh) * | 2018-12-13 | 2019-03-29 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 一种赭曲霉毒素a抗独特型纳米抗体及其制备方法 |
| CN109575138A (zh) * | 2018-12-20 | 2019-04-05 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 一种赭曲霉毒素a抗独特型纳米抗体作为赭曲霉毒素a抗原替代物的应用 |
| CN109575138B (zh) * | 2018-12-20 | 2022-08-05 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 一种赭曲霉毒素a抗独特型纳米抗体作为赭曲霉毒素a抗原替代物的应用 |
| CN111849791A (zh) * | 2020-05-11 | 2020-10-30 | 中国科学院微生物研究所 | 一株赭曲霉菌株l1295及其应用 |
| CN111849791B (zh) * | 2020-05-11 | 2022-05-24 | 中国科学院微生物研究所 | 一株赭曲霉菌株l1295及其应用 |
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