JPH0196199A

JPH0196199A - オカダ酸群に対するモノクローナル抗体およびそのモノクローナル抗体の製法

Info

Publication number: JPH0196199A
Application number: JP62253782A
Authority: JP
Inventors: Taizo Uda; 泰三宇田; Yukimasa Ito; 伊藤　幸勝; Takashi Usagawa; 宇佐川　崇; Minoru Nishimura; 西村　実
Original assignee: Ube Industries Ltd
Current assignee: Ube Corp
Priority date: 1987-10-09
Filing date: 1987-10-09
Publication date: 1989-04-14

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野］本発明は、下痢性貝母であるオカダ酸群に対するモノク
ローナル抗体およびそのモノクローナル抗体の製法に関
する。

〔従来の技術〕

ホタテガイ、ムラサキガイ、イガイ、アサリ、コタマガ
イなどの貝類で見出される下痢性貝母としては、オカダ
酸群、ペクチンフィシストキシン群、イエソトキシンな
どが知られている。

これらの下痢性貝母による中毒発生例としては、多数の
例があるが、中でも１９７６年の岩手系、１９７７年の
神奈川系・宮城系および１９７８年の茨城系・福島県で
発生した事件が有名である。

これらの事件では、−度に数十人から数百人の食中毒患
者が発生した。

そこで、食中毒を起こす恐れがある量の下痢性貝母が前
記のような貝類の中に含まれているか否かの検査が必要
とされるようになった。

このような問題点を解決する方法としては、下痢性貝母
（例えば、オカダ酸群、ペクチンフィシストキシン群お
よび／またはイエソトキシン）に対して非常に高い特異
的な反応性を示すモノクローナル抗体を試薬として用い
た免疫学的測定方法が優れた方法であると考えられてい
るが、これまでに、オカダ酸群に対するモノクローナル
抗体の作製に関する報告は認められていない。

〔発明が解決すべき問題点〕

本発明の目的は、下痢性貝母であるオカダ酸群に対して
非常に高い特異的な反応性を示すモノクローナル抗体お
よびそのモノクローナル抗体の製法を提供することであ
る。

〔問題点を解決するための手段］本発明者らは、前記の問題点を解決するために鋭意研究
した結果、動物を免疫して得られた細胞株を培養するこ
とによって、オカダ酸群に対して非常に高い特異的な反
応性を示すモノクローナル抗体を得ることができること
を見出し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は、動物を免疫して得られた細胞株が産生
したオカダ酸群に対するモノクローナル抗体に関するも
のである。

さらに、本発明は、オカダ酸群に対するモノクローナル
抗体を産生ずる細胞株を培養することを特徴とするオカ
ダ酸群に対するモノクローナル抗体の製法に関するもの
である。

以下、本発明について詳細に説明する。

本発明のモノクローナル抗体は、免疫した動物から得ら
れた細胞株が産生ずるものであり、下痢性貝母であるオ
カダ酸群に対して非常に高い特異的な反応性を有するも
のである。

本発明で動物の免疫に用いる免疫原としては、オカダ酸
群に対して非常に高い特異的な反応性を有するモノクロ
ーナル抗体を得ることができるものであれば特に制限さ
れないが、例えば、オカダ酸（以下、ＯＡと略す）、デ
ィノフィシストキシン−１（以下、ＤＴＸ、と略す）、
ディノフィシストキシン−３、これらの塩顕、およびこ
れらを分子量１万以上の担体に結合させたものなどを挙
げることかできるが、好ましくはこれらを分子量１万以
上の担体に結合させたものをもちいるのが良い。この時
用いる分子量１万以上の担体としては、ウシ血清アルブ
ミン、卵白アルブミン、陣笠貝ヘモシアニン、免疫グロ
ブリンなどのような生体高分子を挙げることができる。

そして、動物の免疫方法としては、これらの免疫原の中
の１種または２種以上をそのまま免疫原として用いるこ
ともできる。

本発明のモノクローナル抗体は、前記のようにして免疫
された動物（例えば、マウス、ラント、ウサギなどの哺
乳動物）から得られたリンパ球をウィルス、変異原性物
質などを用いて形質転換する方法によって作製された細
胞株を培養することによっても得られるが、免疫された
動物から得られたリンパ球に細胞増殖能を有する遺伝子
を導入して形質転換する方法（例えば、リン酸カルシウ
ム沈澱吻とした遺伝子の導入、同種または異種動物の細
胞融合りこよる遺伝子の導入など）によって作製された
細胞株を培養して得ることが好ましく、例えば、本発明
者らが、免疫マウスから得られたリンパ球とマウスのミ
エローマ細胞とを融合して作製して得たハイブリドーマ
の０Ａ−１株、０Ａ−２株（微工研条寄第　１４９１号
）、０Ａ−３株を培養することによって得られる。

このようなハイブリドーマの作製は、従来公知の方法、
例えば、ＭｉｌｓｔｅｉｎとＫｈｏｌｅｒの方法［Ｎａ
ｔｕｒｅ、２５６，４９５　（１９７６）］に準じて行
うことができる。そのようなハイブリドーマ株の好まし
い作製方法について、概略を以下順次説明する。

モノクローナル　　産生ハイブリドーマ株の作ｍ１Ｉ（
ｉ）免疫原および分析用抗原の調製免疫原は、例えば、オカダ酸（以下、ＯＡと略す）、デ
ィノフィシストキシン−１（以下、ＤＴＸ、と略す）、
ディノフィシストキシン−３などの化合Ｔｈを１−シク
ロへキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイ
ミドメト−Ｐ−１−ルエンスルホン酸塩（以下、ＣＭＥ
Ｃと略す）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプ
ロピル）カルボジイミド塩酸塩（以下、ＥＤＰＣと略す
）などのカルボジイミドなどを用いて活性エステル化し
た後に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵白アルブミ
ン（ＯＶＡ）、陣笠貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）、Ｔ−グ
ロブリンなどのような生体高分子と結合することによっ
て作製することができる。

一方、分析用抗原としては、免疫原の調製において用い
た担体とは異なったものを用いて、免疫原の調製法と同
様にして調製したものを用いる。

（ｉｉ　）免疫動物リンパ球の調製動物（例えば、マウス、ラットなど）の免疫方法は、Ｐ
ＢＳ　（中性のリン酸緩衝液）に溶解した前記（ｉ）の
免疫原（１〜４００ｕｇ）を動物に１回または敗退間隔
で数回投与することで行うことができる。

１回目の免疫は、アジュバント（ミョウハ′ン、結核死
菌体、核酸などを含む免疫促進物質）を投与せずに行う
こともできるが、アジュバントを用いて調製したエマル
ジョンを投与することが好ましい。

リンパ球は、その免疫動物の充分な抗体（西を躍如後、
最終免疫から数日後の、血液、リンパ節、肺臓などから
得ることができるが、実験操作上は、肺臓から得た方が
好ましい。

（ｉｉｉ　）ミエローマ細胞の準備細胞融合には、マウス由来のＭＰＣ−１１、Ｐ３−Ｘ６
３−Ａｇ８・６５３　（６５３Ｌ　Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ
８−Ｕ’ｌ　（Ｐ３Ｕ１）、Ｐ３−ＮＳ−１（ＮＳ−１
）、ＳＰ２１０−Ａｇ１４　（ＳＰ２１０）など、およ
びラット由来の２１０．ＲＣＹ３．Ａｇ１．２．３　（
Ｙ３）などのミエローマ細胞を用いることができるが、
６５３、Ｐ３ＵＬ　ＮＳ−１、Ｓ　Ｐ　２１０なとの細
胞外に抗体を産生分泌しないミエローマ細胞を用いた方
が好ましい。

（ｉｖ　）細胞融合細胞融合は、前記のようにして免疫された動物のり・ン
パ球とミエローマ細胞との細胞数を（５〜２０）：１の
割合で、細胞融合に支障をきたさない細胞懸濁溶液、例
えば、一般に用いられるリンパ球培養用培地成分（Ｍ　
Ｅ　Ｍ、　Ｄ　Ｍ　Ｅ　Ｍ、　Ｍ　ＣＣｏｙ、ＲＰＭＩ
１６４０などの培地成分）溶液、等張塑衝液などを用い
て良く混合し、遠心分離した後のペレツト（細胞塊）に
、ＨＶＪ　（センダイウィルス）またはＰＥＧ　（ポリ
エチレングリコール）溶液を添加することによって行う
ことができるが、好ましくはＰＥＧ溶液を用いるのがよ
く、さらに好ましくは平均分子量が１０００〜８０００
で３０〜６０重量％０ＰＥＣ溶液を用いるのがよい。こ
の時、細胞融合を促進するために、コルヒチン、ジメチ
ルスルホキシド、ポリーＬ−アルギニンなどを添加して
併用することもできる。

細胞融合に用いるミエローマ細胞としては、免疫された
動物と異種の動物由来のものを使用することもできるが
、得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株の
抗体産生量および安定性の面を考えると、免疫された動
物とは同種のミエローマ細胞を用いた方がよく、さらに
好ましくは同系のものを用いた方がよい。

（ｖ）ハイブリドーマの選択ハイブリドーマの選択は、細胞融合の操作後の細胞をＨ
ＡＴ培地（ヒボキサンチン、アミノプテリン、チミジン
、ウシ胎児血清を含有した培地、この培地成分としては
一般に用いられるリンパ球培養用培地成分を用いること
ができる）で培養して行うことができる。

ハイブリドーマの培養は、培養プレートの各ウェル（培
養ウェル）に抗体産生ウェルの検索に適した細胞個数を
入れて行い、この時、ハイブリドーマの増殖促進物質ま
たはそれを産生ずる細胞（例えば、胸腺、肺臓、リンパ
節由来のリンパ球など）をフィーダー細胞として必要に
応じて使用することができる。

ＨＡＴ培地で増殖することによって選択されたハイブリ
ドーマは、抗体産生ウェルの検索に適した細胞個数に達
するまで、ＨＴ培地（ヒボキサンチン、チミジン、ウシ
胎児血清を含有した培地、この培地成分としては一般に
用いられるリンパ球培養用培地成分を用いることができ
る）で数日間培養し、さらに、−船釣に用いられるウシ
胎児直清を含有するリンパ球培養用培地で培養する。

（ｖｉ）抗体産生ハイブリドーマの選択前記（Ｖ）で得
られたハイブリドーマが、目的とする抗体を産生じてい
るか否かの検討は、例えば、ＥＬ　Ｉ　ＳＡ法（酵素免
疫測定法）、プラーク形成法、凝集反応法、ＲＩＡ（ラ
ジオアイソトープを用いた方法）などで行うことができ
るが、ＥＬＩＳＡ法でおこなうことが好ましい。

このＥＬＩＳＡ法は、以下のようにして行う。

（ｉ）で調製した分計用抗原を固定化したＥＬＩＳＡプ
レートの各ウェル（測定ウェル）に、ハイブリドーマ培
養上清を加えて一定時間静置する。

そして、これらの洗浄した各測定ウェルに結合した動物
由来の抗体と反応して結合することができる酵素標識抗
体（標識に用いる酵素は、例えば、ペルオキシダーゼ、
アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼなど
を挙げることができる。

標識される抗体は測定ウェルに結合した動物出来の抗体
だけと反応して結合することができる躍り特に限定され
ず、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギなどから得
られた血清、またはマウス細胞などを用いて作製された
ハイブリドーマ株が産生したモノクローナル抗体を挙げ
ることができる。

）をこれらの測定ウェルに加えて一定時間静置する。次
に、これらの測定ウェルを洗浄し、用いた酵素に対応し
た基質溶液を加えて酵素活性を測定する。そして、酵素
活性が認められれば、その培養上清をとった培養ウェル
中に目的とする抗体を産生ずるハイブリドーマが存在し
ていたことがわかる。

このようにして、細胞増殖が認められ、かつ抗体を産生
じているハイブリドーマを得ることができる。

（ｖｉｉ）ハイブリドーマの株化（クローニング）抗体
産生が認められた培養ウェル中のハイブリドーマは、限
界希釈法、シングル・セル・マニプレーション法（倒立
顕微鏡下、１ウエルに１個のハイブリドーマを入れる方
法）、軟寒天を用いてコロニーを拾い上げる方法、ＦＡ
Ｃ３（Ｆ　ｌ　ｕ　。

ｒｅｃｅｎｔ　　　Ａｃｔｉｖａｔｅｄ　　　Ｃｅ１ｌ
Ｓｏｒｔｅｒ）を用いた方法などでクローニングするこ
とができる。この時、前記のいずれかのクローニング方
法によって（ｖｉ）で見出した抗体産生ハイブリドーマ
を培養し、ハイブリドーマの増殖が認められた培養ウェ
ルの上清を用い、（ｖｉ）の抗体産生ハイブリドーマの
選択で行ったＥＬＩＳＡ法と同様の方法で、抗体産生ウ
ェルを検索し、抗体産生が認められた培養ウェルの上清
については、さらに他の抗原との反応性も検討する。

このようにして、オカダ酸群に対して特異性が高く、か
つ抗体価の高いモノクローナル抗体を産生ずるハイブリ
ドーマ株を選択することができる。

モノクローナル−本の製法オカダ酸群に対して特異性が高（、かつ抗体価が高いモ
ノクローナル抗体の産生は、前記（ｖｉｉ）で得たハイ
ブリドーマ株をフラスコ内で培養したり、または動物の
腹腔内で培養することによって行うことができる。

前記（ｖｉｉ）で得たハイブリドーマ株のフラスコ内培
養での該モノクローナル抗体の生産は、例えば、Ｏ〜２
０％ウシ胎児血清を含む一般的に用いられるリンパ球培
養用培地（例えば、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＭｃＣｏｙ、Ｒ
ＰＭＩ　１６４０などの培地成分を含む培地）で細胞濃
度が上限に達するまで培養することによって行うことが
できる。この時、該モノクローナル抗体は、遠心操作で
得た培養上清中に含まれている。

一方、前記（Ｖｌ＋）で得たハイブリドーマ株の動物脂
腔内培養での該モノクローナル抗体の生産は、細胞融合
に用いた細胞が由来する動物とは異種の動物を用いて行
うこともできるが、同種の動物を用いて行った方が好ま
しく、さらに好ましくは同系の動物を用いて行った方が
よい。

このような方法によるオカダ酸群に対して特異性が高く
、かつ抗体価が貰いモノクローナル抗体の産生は、マウ
ス、ラット、ハムスターなどの適当な動物の腹腔内にこ
の動物の免疫能を低下させる物質、例えば、ブリスタン
などの鉱物油を投与し、数週間後に前記（ｖｉ）で得た
ハイブリドーマ株細胞を１０ｂ−１０’個腹腔内投与し
、その腹腔内でこの株細胞を数週間で高密度に増殖させ
ることによって行うことができる。この時、該モノクロ
ーナル抗体は、遠心操作で得た腹水上清中に含まれてい
る。そして、その抗体濃度は、フラスコ内培養で得た時
の培養上清の抗体濃度の１０〜１０００倍である。

ハイブリドーマ株のフラスコ内または動物腹腔内での培
養で得られた該モノクローナル抗体は、蒼白質の一般的
な精製法に適用されている塩析、透析、イオン交換クロ
マトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーな
どを行うことによって精製され、高純度のモノクローナ
ル抗体となる。

前記のようにして得た該モノクローナル抗体は、オカダ
酸群に対して非常に高い特異的な反応性を有するもので
ある。

〔実施例〕

以下、本発明の実施例を具体的に説明する。なお、これ
らの実施例は、本発明の範囲を限定するものではない。

実施例１〔免疫原および分析用抗原の調製〕免疫原は、・以下のようにして調製した。

９５％のジオキサン１ｍｆに、オカダ酸群の１種である
オカダ酸（ＯＡ）を０．５　ｍ　ｇ溶解し、これに１．
５　ｍ　ｇのＮ−ヒドロキシコハク酸イミドおよび２．
５　ｍ　ｇの１−シクロへキシル−３−（２−モルホリ
ノエチル）カルボジイミドメト−２−スルホン酸塩（Ｃ
ＭＥＣ）を添加し、室温下３時間攪拌し、０Ａ−Ｎ−コ
ハク酸イミドエステルを生成させた。この反応液を２０
ｍ１の水に加え、さらに、２０ｍｆの酢酸エチルを加え
て攪拌し、酢酸エチル層を得、この層を水洗後、溶媒を
減圧留去して０Ａ−Ｎ−コハク酸イミドエステルを精製
分離した。そして、この全量を０．０５　Ｍのリン酸緩
衝液（ｐＨ７，３）２．５ｍＩ！、に溶解し、２．５　
ｍ　ｌのピリジンと１０ｍｇの卵白アルブミン（ＯＶＡ
）を添加し、４°Ｃ下２４時間攪拌し、この溶液を純水
に対して透析し、非透析画分を凍結乾燥して、免疫原で
あるオカダ酸とＯＶＡとの結合物（以下、０Ａ−ＯＶＡ
と略す）を１．５　ｍ　ｇ得た。

分析用抗原は、以下のようにして調製した。

前記の免疫原の調製方法でＣＭＥＣのかわりに１ｍｇの
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カル
ボジイミド塩酸塩（ＥＤＰＣ）を用い、ＯＶＡのかわり
に牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いる以外は同様にし
て、分析用抗原であるオカダ酸とＢＳＡとの結合物（以
下、０Ａ−ＢＳＡと略す）を６ｍｇ得た。

実施例２〔ＯＡ群に対するモノクローナル抗体産生ハイブリドー
マ株の作製〕（ａ）マウスの免疫及び肺臓リンパ球の調製４００ｕｇ
の０Ａ−ＯＶＡ　（免疫原）を溶解した１ｍｌのＰＢＳ
　（リン酸緩衝液、ｐ　Ｈ７，４）と１ｍｊ２のフロイ
ントの完全アジュバントとを十分に混合して得られたエ
マルジョンの０．５　ｍ　ｌをＢＡ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマ
ウス（♀、８週齢）の腹腔内に投与した。

この初回免疫から２周間後、および４週間後に前記と同
様にして調製したエマルジョンの０．５　ｍｌを前記マ
ウスの腹腔内に投与した。

さらに、２週間後に、最終免疫として、前記の抗原１０
０μｇを溶解したＰＢＳの０．５　ｍ　ｌを前記マウス
の尾静脈に投与した。

このようにして免疫されたマウスから、最終免疫から３
日日に摘出した肺臓を、氷冷下に、ＲＰＭ１１６４０液
（リンパ球培養用培地粉末を蒸溜水に溶解したもの）を
入れたシャーレ中で洗い、新たに用意したＲＰＭＩＩ６
４０液の中に移して、ビンセットでほぐした。

このようにして得た浮遊リンパ球を、ＲＰＭ１１６４０
液に懸濁して、遠心分離しく回転数；１１０００ｒｐ、
時間；５分間）、ＲＰＭ１１６４０？ｖＬに再懸濁し、
細胞融合に使用するマウス肺臓リンパ球とした。

（ｂ）細胞融合５Ｘ１０’個の対数増殖期にある８−アザグアニン耐性
のマウスミエローマＩ胞（Ｘ６３−Ａｇ・６５３；６５
３）と前記のマウスの肺臓リンパ球２．５　Ｘ　１０　
”個とを５０ｍｊ２容プラスチック製コニカル遠心管に
入れ、混合し、次いで、上清を遠心分離した後に（回転
数；１４００ｒｐｍ、時間；６分間）、同遠心管を軽（
たたいてペレットをほぐした。

このペレットを激しく振とうしながら、この中に、５０
％ＰＥＧ４０００溶液（３７°Ｃ）を１分間かけて１ｍ
２入れ、さらに、１分間激しく振とうした。

同遠心管を穏やかに振とうしながらＲＰＭＩＩ６４０液
（３７’Ｃ）を徐々に加え、最終的には１０ｍ１．とじ
、室温で遠心分離（回転数；８００ｒｐｍ、時間；６分
間）して、上清を吸引除去した。

同遠心管を軽（たたいてペレットをほぐし、１５０ｍｆ
のＨＡＴ培地（Ｉ　Ｘ　１０−’Ｍヒポキサンチン、４
Ｘ１０−’Ｍアミノプテリン、１．６Ｘ１０−’Ｍチミ
ジン及び２０％ウシ胎児血清を含有するＲＰＭ１１６４
０培地）に懸濁して、９６ウエルの培養プレートの各ウ
ェルに１００μβづつ分注して、ＣＯ２インキュベータ
ーを用いて培養した（５％ＣＯｚ、９５％空気、３７°
Ｃ１湿度１００％）。

（Ｃ）ハイブリドーマの選択前述（ｂ）の培養開始から２〜４週間かけて、細胞増殖
が認められた培養プレートの各ウェルの培養上清中に、
ＯＡに対する抗体が含まれているか否かを、次に示すＥ
Ｌ　Ｉ　ＳＡ法で検討した。

まず、９６ウエルＵ底ＥＬ　Ｉ　ＳＡプレートの各分析
ウェルに、実施例１で調製した分計用抗原である０Ａ−
ＢＳＡ溶液Ｃ５ｕｇ／ｍｌ！、ＰＨ９，８の０．０５　
Ｍ炭酸緩衝液１？８解）を５０μ２づつ分注し、４°Ｃ
で１晩静置した（このような処理によって、０Ａ−ＢＳ
Ａが各分析ウェルの表面に吸着する。）。

次いで、ＥＬＩＳＡプレートの各分析ウェルを洗浄液（
０，０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で洗浄した
後、０．５％のＢＳＡ溶液（ＰＢＳに溶解）を各分析ウ
ェルに１００μ２づつ分注して室温で２時間静置し、こ
れらの各分析ウェルを洗浄液で洗浄し、前記培養プレー
トの各培養ウェルの培養上清を、これらの各分析ウェル
に５０μ２づつ分注して室温で２時間静置した（陰性対
照には、融合前のマウス肺臓リンパ球とマウスミエロー
マ細胞との混合物を同様に培養して得た上清を用いた。

一方、陽性対照には、本発明での細胞融合に用いたマウ
スの血清を洗浄液で１００倍に希釈したものを用いた。

）。

次に、ＥＬＩＳＡプレートの各分析ウェルを洗浄し、マ
ウス免疫グロブリンに対するアルカリフォスファターゼ
標識抗体溶液を、５０μｌづつ、各分析ウェルに分注し
、室温で１時間静置した。

そして、ＥＬ　ｒ　ＳＡプレートの各分析ウェルを洗浄
後、ｐ−ニトロフェニルリン酸ナトリウム・６Ｈ２０溶
液（１ｍｇ／ｍｊｌりを１００ａｆづつ各分析ウェルに
分注し、室温で３０分反応後、マイクロプレート用の吸
光度測定装置を用いて各ウェルの４０５ｎｍにおける吸
光度を測定した。

このような検討の結果、培養プレート中の８８８個の培
養ウェルの中の７個で、ＯＡに対する抗体の産生が認め
られた。

これらの抗体を産生した７個の培養ウェルについて、Ｏ
Ａを用いた阻害試験（前記のＥＬＩＳＡで培養ウェルの
上清のかわりに、その上清に１ｕｇのＯＡを含む溶液を
入れる以外は同様な操作を行う。）を行った。

その結果、ＯＡで阻害される抗体を含有している培養ウ
ェルは、３個認められた。即ち、この３個の培養ウェル
には、ＯＡとだけ反応する抗体を産生ずるハイブリドー
マが存在することが確認された。

（ｄ）ハイブリドーマの株化（クローニング）２０％ウ
シ胎児血清を含むＲＰＭ１１６４０培地を用いて、前述
の（Ｃ）工程において示した抗体産生が確認された３個
のウェルについてシングル・セル・マニプレーション法
（倒立顕微鏡下、１ウエルに１個のハイブリドーマを入
れる方法）でハイブリドーマをクローニングした。

培養には、９６ウエル培養プレートを用い、支持細胞と
してＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスの胸腺細胞懸濁液（
１０７個／ｍ２）を使用して、（ハイブリドーマ１個）
／（胸腺細胞懸濁液１００μｆ）／ウェルで培養した。

前記の培養において、１０日日日から単一コロニーとし
て観察される培養プレートのウェルの上清を採取して、
分析用抗原として０Ａ−ＢＳＡを用いたＥＬＩＳＡ法（
前述の（Ｃ）工程と同様の方法）で抗体産生ウェルのス
クリーニングを行い、抗体産生が認められた上清につい
ては、さらに他のオカダ酸群の１種であるＤＴＸ、との
反応性を検討した。

このようにして、ＯＡおよびＤＴＸ、のいずれとも反応
性が認められた３株を得、これらを再クローニングした
。

このようにして得られた株を０Ａ−１株、０Ａ−２株（
微工研条寄第　１４９１号）および０Ａ−３株と称し、
これらの株が産生したモノクローナル抗体を、それぞれ
０Ａ−１，０Ａ−２および０Ａ−３と称す。

これら３株の培養上清中に含まれるモノクローナル抗体
のクラス・サブクラス、Ｌ鎖の型を次の測定試験Ｉで決
定し、各種抗原に対する反応性を測定試験■で検討した
。

皿定試並土［ＯＡ群に対するモノクローナル抗体のクラス・サブク
ラスの決定］０Ａ−１株、０Ａ−２株および０Ａ−３株が産生した免
疫グロブリンのクラス・サブクラスの決定は、マウス抗
体の各クラス・サブクラスに特異的なペルオキシダーゼ
標識抗体溶液（即ち、ＩｇＧ＋　、ＩｇＣ，ａ、ＩｇＧ
ｚｂ、ＩｇＧ：＋、ＩｇＭ、ＩｇＡ、に型り鎖またはλ
型り鎖などに対する西洋ワサビペルオキシダーゼで標識
された抗体）を用い、前述の（Ｃ）工程と同様のＥＬＩ
ＳＡ法およびマウス抗体の各クラス・サブクラスに特異
的な抗体溶液（即ち、ＩｇＧ＋　、ＩｇＧｚａ、■ｇＧ
−ｚ　ｂ　、　１ｇＧ３、ＩｇＭ、　Ｉ　ｇＡ、に型り
鎖またはλ型り鎖などに対する抗体）を用いたオフタロ
ニー法で行った。

その結果、０Ａ−１株が産生したモノクローナル抗体（
ＯＡ−１）は、に型のし鎖を有するＩｇＡに属する抗体
であり、０Ａ−２株および０Ａ−３株が産生したモノク
ローナル抗体（ＯＡ−２および０Ａ−３）は、いずれも
に型のし鎖を存するｒｇｃ、に属する抗体であることが
わかった。

皿足跋狂工（ＯＡ群に対するモノクローナル抗体の他の貝母に対す
る反応性の検討〕０Ａ−１，０Ａ−２および０Ａ−３などのモノクローナ
ル抗体の反応特異性について、ペクテノトキシン群の１
種であるペクテノトキシン−１（ＰＴＸ、）およびイエ
ソトキシン（ＹＴＸ）などのＯＡ群とは異なる貝母との
反応性を前述の（Ｃ）工程と同様のＥＬ　Ｉ　ＳＡ法で
検討した（ただし、測定に用いる試薬は２倍量とし、ハ
イブリドーマ培養上清のかわりに洗浄液で多段階に希釈
した５０μ２の貝母の溶液と５０〃２のモノクローナル
抗体溶液との混合溶液を用いた。）。

これらの抗体のＯＡ、、ＤＴＸ＋　、、ＰＴＸ、および
ＹＴＸとの反応性をＯＡとの反応性比で表１に示す。

表　　　１実施例３〔フラスコ培養でのオカダ酸群に対するモノクローナル
抗体の生産］１５％ウシ胎児血清を含むＲＰＭ１１６４０培地で培養
して得た０Ａ−２株の培養細胞を１０ｍ１のＲＰＭ１１
６４０液（ウシ胎児血清を含まない）に移しかえて、死
滅直前まで培養した。

オカダ酸群に対するモノクローナル抗体（ＯＡ・−１）
は、培養液を遠心分Ｍ（回転数；３０００ｒ’ｐ　ｍ、
時間；５分間）して得られる上滑中に３８μｇ／ｍ１（
−次元平板免疫拡散法法により測定）含有されていた。

実施例４〔マウス腹腔内でのオカダ酸群に対するモノクローナル
抗体の生産〕オカダ酸群に対する大量のモノクローナル抗体を得るた
めに、マウス腹腔内で○Ａ−１株の細胞を培養した。

Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　Ｃ７ウス（♀、６周齢、２週間前
にブリスタンを０．５　ｍ　ｌ腹腔内に投与しておく）
の腹腔内に、ＲＰＭ１１６４０で浮遊させた０Ａ−１株
の細胞を５Ｘ１０６個投与した。

このマウスの体重は、１週間目頃から顕著な増加を示し
、２週間口に腹水（７，５ｍ　１７匹）を採取した。こ
の腹水を遠心分離（回転数；３０００ｒｐｍ、時間；５
分間）して、腹水上清を得た。

オカダ酸群に対するモノクローナル抗体（ＯＡ−１）は
、この腹水上清中に８．５ｍｇ／ｍＩ！。

（−次元平板免疫拡散法により測定）含有されていた。

〔発明の効果〕

本発明のｒ細胞株の培養によって得られた下痢性貝母で
あるオカダ酸群に対して非常に高い特異的な反応性を有
するモノクローナル抗体ｊは、オカダ酸群の検査、測定
などに利用できる。

特許出願人　　宇部興産株式会社

Claims

【特許請求の範囲】

（１）動物を免疫して得られた細胞株が産生したオカダ
酸群に対するモノクローナル抗体。
（２）細胞株が、ハイブリドーマ株である特許請求の範
囲第１項に記載のオカダ酸群に対するモノクローナル抗
体。
（３）ハイブリドーマ株が、マウスの細胞を用いて作製
されたものである特許請求の範囲第２項に記載のオカダ
酸群に対するモノクローナル抗体。
（４）オカダ酸群に対するモノクローナル抗体を産生す
る細胞株を培養することを特徴とするオカダ酸群に対す
るモノクローナル抗体の製法。
（５）細胞株が、ハイブリドーマ株である特許請求の範
囲第４項に記載のオカダ酸群に対するモノクローナル抗
体の製法。
（６）ハイブリドーマ株が、マウスの細胞を用いて作製
されたものである特許請求の範囲第５項に記載のオカダ
酸群に対するモノクローナル抗体の製法。