JPH01160494A - ヒト免疫不全ウイルスに対するモノクローナル抗体およびそのモノクローナル抗体の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因と
考えられているヒト免疫不全ウィルス（以下、ＨＩＶと
称する）に対するモノクローナル抗体およびそのモノク
ローナル抗体の製法に関する。

〔従来の技術〕

従来、種々の抗体がＡＩＤＳの診断またはＨＩＶの基礎
研究のために利用されてきている。

利用される抗体としては、ＨＩＶに対する血清（ポリク
ローナル抗体）よりもモノクローナル抗体の方が実用的
であると考えられることから、モノクローナル抗体の作
製が活発に行われているが〔例えば、Ｍ、Ｓ、Ｃ，Ｆｕ
ｎｇら；Ｂｉｏ　　Ｔｅｃｈｎｏ　ｌｏｇ７．５，９４
０　（１９８７）、高Ｂら；Ｊｐｎ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ
　　Ｒｅｓ、。

７８．２３５　（１９８７）、Ｔ、Ｃ０Ｃｈａｎｈら；
Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍｎｏｌ、、１６．１４６５　（１９
８６）など〕、今だにＨＩｖに対して非常に高い特異的
な反応性を有するモノクローナル抗体に関する報告は認
められていない。

〔発明が解決すべき問題点〕

本発明の目的は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の
原因と考えられているＨＩＶに対して非常に高い特異的
な反応性を有するモノクローナル抗体およびそのモノク
ローナル抗体の製法を提供することである。

〔問題点を解決するための手段］ 本発明者らは、前記の問題点を解決するために鋭意研究
した結果、ＨＩＶをマウスに免疫して得られた細胞株を
培養することによって、ＡＩＤＳの原因ウィルスである
ＨＩＶに対して非常に高い特異的な反応性を示すモノク
ローナル抗体を得ることができることを見出し、本発明
を完成するに至った。

郡ち、本発明は、 ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩ　Ｖ）をマウスニ免疫し、
それから得たリンパ球とマウスミエローマ細胞とを融合
して得られた細胞株が産生したものであって、 （ａ）　ＨＩ　ＶノＰ−２４（ＨＩ　Ｖ成分の分子量約
２４．０００の蛋白質）のみに対して高い特異性を有す
るか、 （ｂ）　ＨＩ　ＶノＰ−１８（ＨＩ　Ｖ成分）分子量約
１８．０００の蛋白質）のみに対して高い特異性を有す
るか、 または、 （ｃ）ＨＩＶのＰ−１８およびＰ−５５（ＨＩＶ成分の
分子量約５５，０００の蒼白質）のみに対して高い特異
性を有する ことを特徴とするモノクローナル抗体に関するものであ
る。

さらに、本発明は、 ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）を免疫されたマウスか
ら得たリンパ球とマウスミエローマ細胞とを融合して得
られた細胞株を培養することを特徴とする、 （ａ））ｆｒＶのＰ−２４のみに対して高い特異性を有
するか、 （ｂ）ＨＩＶのＰ−１８のみに対して高い特異性を有す
るか、 または、 （ｃ）ＨＩＶのＰ−１８およびＰ−５５のみに対して高
い特異性を有する モノクローナル抗体の製法に関するものである。

以下、本発明について詳細に説明する。

本発明のモノクローナル抗体は、ｔＶをマウスに免疫し
て得られた細胞株が産生ずるものであり、ＨＩＶに対し
て非常に貰い特異的な反応性を有するものである。

本発明でマウスの免疫に用いる免疫原としては、ＨＩＶ
に対して非常に高い特異的な反応性を有するモノクロー
ナル抗体を得ることができるものであれば待に制限され
ないが、例えば、ＨＩＶを構成する各種成分、Ｈ（Ｖ、
不活化ＨＩ　Ｖ、およびｆ（ＩＶの一部分を合成したベ
プチｉ″；どを挙げることができるが、好ましくは不活
化ＨＩＶを用いるのが良い。

本発明のＨＩＶのＰ−２４のみに対して高い特異性を有
するモノクローナル抗体は、ＨＩＶ成分のＰ−２４のみ
に対して高い特異性を有するが、ＨＩＶ成分のＰ−１８
、Ｐ−４０（ＨＩＶ成分の分子量が約４０，０００の蛋
白質）、Ｐ−５５、ＣＰ−４１（１（ＩＶ酸成分分子量
が約４１，０００の糖蛋白質）、ＣＰ−１２０（ＨＩＶ
成分の分子量が約１２０，０００の糖蛍白質）、ＣＰ−
１６０（ＨＩＶ成分の分子量が約１６０，０００（７）
ｉＮ白質）とは反応性が認められないものである。

そのような特異性を有するモノクローナル抗体は、例え
ば、免疫マウスから得たリンパ球とマウスのミエローマ
細胞とを融合して得たハイプリドーマ株のＹＵ−３株（
微工研条寄第１６０３号）、ＹＵ−５株（微工研条寄第
１６０５号）などを培養することによって得ることがで
きる。

本発明のＨＩＶのＰ−１８のみに対して高い特異性を有
するモノクローナル抗体は、ＨＩＶ成分のＰ−１８のみ
に対して高い特異性を有するが、ＨＩＶ成分のＰ−２４
、Ｐ−４０、Ｐ−５５、ＧＰ−４１、ＣＰ−１２０、Ｃ
Ｐ−１６０とは反応性が認められないものである。その
ような特異性を有するモノクローナル抗体は、例えば、
免疫マウスから得たリンパ球とマウスのミエローマｍ胞
とを融合して得たハイプリドーマ株のＹＵ−１株（微工
研条寄第１６０１号）、ＹＵ−２株（微工研条寄第１６
０２号）などを培養することによって得ることができる
。

本発明のＨＩＶのＰ−１８およびＰ−５５のみに対して
高い特異性を有するモノクローナル抗体は、ＨＩＶ成分
のＰ−１８およびＰ−５５のみに対して憂い特異性を有
するが、ＨｒＶ成分のＰ−２４、Ｐ−４０、ＣＰ−４１
、ＧＰ−１２０、ＧＰ−１６０とは反応性が認められな
いものである。

そのようなモノクローナル抗体は、例えば、免疫マウス
から得たリンパ球とマウスのミエローマ細胞とを融合し
て得たハイブリドーマ株のＹＵ−４株（微工研条寄第１
６０４号）などを培養することによって得ることができ
る。

このようなハイブリドーマの作製は、従来公知の方法、
例えば、ＭｉｌｓｔｅｉｎとＫｈｏｌｅｒの方法〔Ｎａ
ｔｕｒｅ、２５６．４９５　（１９７６）〕に準じて行
うことができる。そのようなハイプリドーマ株の好まし
い作製方法について、概略を以下順次説明する。

モノクローナル　　　汁ハイブリドーマ　のｆ（ｉ）免
疫動物リンパ球の調製 マウスの免疫方法は、ＰＢＳ　（リンｍＷｋ衝食塩水）
に溶屏した不活化された）（ＩＶ（１０〜４００μｇ）
を動物に１回または数週間陽で数回投与することで行う
ことができる。

１回目の免疫は、アジュバント（ミョウバン、結核死蘭
体、核酸などを含む免疫促進物質）を投与せずに行うこ
ともできるが、アジュバントを用いて調製したエマルジ
ョンを投与することが好ましい。

リンパ球は、その免疫動物の充分な抗体価を確認後、最
終免疫から数日後の、血液、リンパ節、肺臓などから得
ることができるが、肺臓から得た方が好ましい。

（ｉｉ）ミエローマ細胞の準備 細胞融合には、マウス由来のＭＰＣ−１１゜Ｐ３−Ｘ６
３−Ａｇ８・６５３　（６５３）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ
８−Ｕｌ　（Ｐ３Ｕ１）、Ｐ３−ＮＳ−１（ＮＳ−１）
、ＳＰ２１０−Ａｇ１４　（ＳＰ２１０）など、および
ラット由来の２１０．ＲＣＹ３．Ａｇ１．２．３　（Ｙ
３）などのミエローマ細胞を用いることができるが、６
５３、Ｐ３Ｕ１、ＮＳ−１、Ｓ　Ｐ　２１０などの細胞
外に抗体を産生分泌しないミエローマ細胞を用いた方が
好ましい。

（ｉｉｉ）ａｌ胞融合 細胞融合は、前記のようにして免疫された動物のリンパ
球とミエローマ細胞とのａ］胞数を（５〜２０）：１の
割合で、細胞融合に支障をきたさない細胞悲濁溶液、例
えば、一般に用いられるリンパ球培養用培地成分（Ｍ　
Ｅ　Ｍ、　Ｄ　Ｍ　Ｅ　Ｍ、　Ｍ　ｃ　Ｃａｙ、ＲＰＭ
１１６４０などの培地成分）溶液、等張媛衝液などを用
いて良く混合し、遠心分離した後のベレット（！ｉｌ胞
塊）に、ＨＶＪ　（センダイウィルス）またはＰＥＧ　
（ポリエチレングリコール）溶液を添加することによっ
て行うことができるが、好ましくはＰＥＧ溶液を用いる
のがよく、さらに好ましくは平均分子量が１０００〜８
０００で３０〜６０重量％のＰＥＧ溶液を用いるのがよ
い。この時、細胞融合を促進するために、コルヒチン、
ジメチルスルホキシド、ポリーＬ−アルギニンなどを添
加することもできる。

細胞融合に用いるミエローマ細胞としては、免疫された
動物と異種の動物由来のものを使用することもできるが
、得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株の
抗体産生量および安定性の面を考えると、免疫された動
物とは同種のミエロ−マ組胞を用いた方がよく、さらに
好ましくは同系のものを用いた方がよい。

（ｉｖ）ハイブリドーマの選択 ハイブリドーマの選択は、細胞融合の操作後の細胞をＩ
（ＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジ
ン、ウシ胎児血清を含有した培地。

この培地成分としては一般に用いられるリンパ球培養用
培地成分を用いることができる）で培養して行うことが
できる。

ハイブリドーマの培養は、培養プレートの各ウェル（培
養ウェル）に抗体産生ウェルの検索に適した細胞個数を
入れて行い、この時、ハイブリドーマの増殖促進物質ま
たはそれを産生ずる細胞（例えば、胸腺、肺臓、リンパ
節由来のリンパ球など）をフィーダー細胞として必要に
応じて使用することができる。

ＨＡＴ培地で増殖することによって選択されたハイブリ
ドーマは、抗体産性ウェルの検索に適した細胞個数に達
するまで、ＨＴ培地（ヒボキサンチン、チミジン、ウシ
胎児血清を含有した培地、二の培地成分としては一般に
用いられるリンパ球培養用培地成分を用いることができ
る）で数日間培養し、さ゛らに、−船釣に用いられるウ
シ胎児血清を含有するリンパ球培養用培地で培養する。

（Ｖ）抗体産生ハイブリドーマの選択 前記（ｉｖ　）で得られたハイブリドーマが、目的とす
る抗体を産生じているか否かの検定は、例えば、ＥＬＩ
ＳＡ法（酵素免疫測定法）、プラーク形成法、凝集反応
法、ＲＩＡ（ラジオアイソトープを用いた方法）、間接
蛍光抗体法（ＩＦＡ）などで行うことができるが、検定
数が非常に多い場合には、ＥＬＩＳＡ法で行うことが好
ましい。

このＥＬＩＳＡ法は、以下のようにして行う。

不活化ＨＩＶを固定化したＥＬ　Ｉ　ＳＡプレートの各
ウェル（測定ウェル）に、ハイブリドーマ培養上清を加
えて一定時間静置する。そして、これらの洗浄した各測
定ウェルに結合した動物由来の抗体と反応して結合する
ことができる酵素ｉ＝抗体（標識に用いる酵素は、例え
ば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β
−ガラクトシダーゼなどを挙げることができる。標識さ
れる抗体は測定ウェルに結合した動物由来の抗体だけと
反応して結合することができる限り特に限定されず、例
えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギなどから得られた
血清、またはマウス細胞などを用いて作製されたハイブ
リドーマ株が産生じたモノクローナル抗体を挙げること
ができる。）をこれらの測定ウェルに加えて一定時間静
置する。次に、これらの測定ウェルを洗浄し、用いた酵
素に対応した基質溶液を加えて酵素活性を測定する。そ
して、酵素活性が認められれば、その培養上清をとった
培養ウェル中に目的とする抗体を産生ずるハイブリドー
マが存在していたことがわかる。

このようにして、細胞増殖が認められ、かつ抗体を産生
じているハイブリドーマを得ることができる。

（ｖｉ）ハイブリドーマの株化（クローニング）抗体産
生が認められた培養ウェル中のハイブリドーマは、限界
希釈法、シングル・セル・マユブレーション法（倒立顕
微鏡下、Ｉウェルに１藺のハイブリドーマを入れる方法
）、軟寒天を用いてコロニーを拾い上げる方法、ＦＡＣ
Ｓ　（Ｆ　ｌ　ｕ　。

ｒｅｃｅｎｔ　　Ａｃｔｉｖａｔｅｄ　　Ｃｅ１ｌｓｏ
ｒｔｅｒ）を用いた方法などでクローニングすることが
できる。この時、前記のいずれかのクローニング方法に
よって（Ｖ）で見出した抗体産生ハイブリドーマを培養
し、その増殖が認められた培養ウェルの上滑を用い、（
ｖ）の抗体産生ハイブリドーマの選択で行ったＥＬ　Ｉ
　ＳＡ法と同様の方法で、抗体産生ウェルを検索する。

このようにして、ＨＩＶに対して特異性が高く、かつ抗
体価が高いモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドー
マ株を選択することができる。

３ツクローナル「尊辺玉広 ＨＩＶに対して特異性が高（、かつ抗体価が高いモノク
ローナル抗体の生産は、前記（ｖｉ）で得たハイプリド
ーマ株をフラスコ内で培養したり、または動物の腹腔内
で培養することによって行うことができる。

前記（ｖｉ）で得たハイプリドーマ株のフラスコ内培養
での該モノクローナル抗体の生産は、例えば、０〜２０
％ウシ胎児血清を含む一般的に用いられるリンパ球培養
用培地（例えば、ＭＥＭ、ＤＭ　Ｅ　Ｍ　、〜ｆｃｃｏ
７ＳＲＰＭＩ　１６４０などの培地成分を含む培地）で
細胞濃度が上限に達するまで培養することによって行う
ことができる。この時、該モノクローナル抗体は、遠心
操作で得た培養上清中に含まれている。

一方、前記（ｖｉ）で得たハイプリドーマ株の動物腹腔
内培養での該モノクローナル抗体の生産は、細胞融合に
用いた細胞が由来する動物とは異種の動物を用いて行う
こともできるが、同種の動物を用いて行った方が好まし
く、さらに好ましくは同系の動物を用いて行った方がよ
い。

このような方法によるＨＩＶに対して特異性が高（、か
つ抗体価が高い該モノクローナル抗体の生産は、マウス
、ラット、ハムスターなどの適当な動物の腹腔内にこの
動物の免疫能を低下させる物質、例えば、ブリスタンな
どの鉱物油を投与し、数週間後シこ１０６〜１０？個の
前記（ｖｉ）で得たハイプリドーマ株犯胞を投与し、そ
の腹腔内に２０株細胞を数週間で高音度に増殖させるこ
とによって行うことができる。この時、該モノクローナ
ル抗体は、遠心操作で得た腹水正清中に含まれている。

そして、その抗体濃度は、フラスコ内培養で得た時の培
養上清の抗体濃度の１０〜１０００倍である。

ハイプリドーマ株のフラスコ内または動物腹腔内での培
養で得られた該モノクローナル抗体は、蛍白質の一般的
な精製法に適用されている塩析、透析、イオン交換クロ
マトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーな
どを行うことによって精製され、高純度のモノクローナ
ル抗体となる。

前記のようにして得た該モノクローナル抗体は、ＨＩＶ
成分のポリペプチドであるＰ−１８、Ｐ−２４、または
Ｐ−１８とＰ−５５に対して非常に高い特異的な反応性
を有するものである。

〔実施例〕

以下、本発明の実施例を具体的に説明する。なお、これ
らの実施例は、本発明の範囲を限定するものではない。

実施例１ （ＨＩＶに対するモノクローナル抗体産生ハイプリドー
マ株の作製〕 （ａ）マウスの免疫及び肺臓リンパ球の調製不活化ＨＩ
Ｖ（５６℃で３０分間処理後、さらに放射線で１時間照
射し、増殖しないことを確認したウィルス）１００ｕｇ
を溶屏した１ｍｆのＰＢＳ（リン酸謹衝液、ｐ　Ｈ７，
４）と１ｍｌの７゜インドの完全アジュバントとを充分
に混合して得られたエマルジョンの０．５　ｍ　Ｉｌを
Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウス（♀、７週齢）の腹腔内
に投与した。

この初回免疫から２周間後、および５週間後に前記と同
様にして調製したエマルジョンの０．５ｍ２を前記マウ
スの腹腔内に投与した。

さらに、２週間後に、最終免疫として、前記の不活化Ｈ
ＩＶ５０μｇを溶屏した０、　２　ｍ　１２のＰＢＳを
前記マウスの尾静脈に投与した。

このようにして免疫されたマウスから、最終免疫から３
日、目に摘出した膵臓を、水冷下に、１０ｍ１のＭＥＭ
溶液（リンパ球培養用培地粉末を蒸溜水に溶屏したもの
、１０ｍＭ　　ＨＥＰＥＳを含む）を入れたシャーレ中
で洗い、新たに用意したＭＥＭ溶液の中に移して、ピン
セントで：よぐした。

このようにして得た浮遊リンパ球を、ＭＥＭ溶液に懸濁
して、遠心分溜しく回転数；１１０００ｒｐ、時間；５
分間）、ＭＥＭ溶液に再懸濁し、細胞融合に使用するマ
ウス肺臓リンパ球とした。

Φ）細胞融合 ４．５Ｘ１０’個の対数増殖期にある８−アザグアニン
耐性のマウスミエローマ１ｆｌ胞（Ｘ６３−Ａｇ、６５
３；６５３）と前記のマウスの肺臓リンパ球２．７Ｘ１
０”個とを５０ｍ２容プラスチツク製コニカル遠心管に
入れ、混合し、次いで、上清を遠心分離した後に（回転
数；１４００ｒｐｍ。

時間；６分間）、同遠心管を軽（たたいてペレットをほ
ぐした。

このペレットを激しく振とうしながら、この中に、５０
％ＰＥ（：、４０００溶液（３７“Ｃ）を１分間かけて
１ｍｉ！、入れ、さらに、１分間激しく振とうした。

同遠心管を穏やかに振とうしながらＭ　Ｅ　Ｍ溶液（３
７°Ｃ）を数分間かけて徐々に加え、最終的には１０ｍ
２とし、室温で遠心分離（回転数；８００μｌｍ、時間
；６分間）して、上清を吸引除去した。

同遠心管を軽くたたいてペレットをほぐし、１６０ｍｆ
のＨＡＴ培地（Ｉ　Ｘ−１０−’Ｍヒボキサンチン、４
Ｘ１０＝’Ｍアミノプテリン、１．６Ｘ１０−５Ｍチミ
ジン及び２０％ウシ胎児血清を含有するＲＰＭ１１６４
０培地、３７°Ｃに保温）に懸濁して、９６ウエルの培
養プレート１９枚の各培養ウェルに１００μ２づつ分注
して、ＣＯｔインキュベーターを用いて培養した（５％
ＣＯ□、９５％空気、３７°Ｃ１湿度１００％）。

（ｃ）ハイプリドーマの選択 前述ら）の培養開始から２〜４週間かけて、細胞増殖が
認められた培養プレートの各ウェルの培養上滑中に、Ｈ
ＩＶに対する抗体が含まれているか否かを、次に示すＥ
Ｌ　Ｉ　ＳＡ法で検討した。

まず、９６ウエルＥＬＩＳＡプレートの各分析ウェルに
、不活化ＨＩＶ溶液（２μｇ／ｍｆ、ｐＨ９，８のＯ−
００Ｍ炭酸緩衝液に溶解）を５０ｕｆづつ分注し、４℃
で１晩静１した。

次いで、ＥＬＩＳＡプレートの各分析ウェルを洗浄液（
０，０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で２回洗浄
した後、０．５％のＢＳＡ溶液（ＰＢＳに溶解）を各分
析ウェルに１００μｌづつ分注して室温で３０分間Ｆｉ
ｆし、これらの各分析ウェルを洗浄液で２回洗浄し、前
記培養プレートの各培養ウェルの培養上清を、これらの
各分析ウェルに５０μ２づつ分注して室温で２時間静置
した（陰性対照には、融合前のマウス肺臓リンパ球とマ
ウスミエローマ細胞との混合物を同様に培養して得た上
清を用いた。一方、陽性対照には、本発明での細胞融合
に用いたマウスの血清を洗浄液で１０倍に希釈したもの
を用いた。）。

次に、ＥＬ　Ｉ　ＳＡプレートの各分析ウェルを洗浄液
で４回洗浄し、マウス免疫グロブリンに対するアルカリ
フォスファターゼ標識抗体溶液を、５０μｌづつ、各分
析ウェルに分注し、室温で１時間静置した。そして、Ｅ
ＬＩＳＡプレートの各分析ウェルを洗浄液で４回洗浄後
、ｐ−ニトロフェニルリン酸ナトリウム・６Ｈ２０溶！
（１ｍｇ／ｍ、１）を１００μ２づつ各分析ウェルに分
注し、室温で３０分反応後、マイクロプレート用の吸光
度測定装置を用いて各ウェルの４０５　ｎｍにおける吸
光度を測定した。

このような検討の結果、培養プレート中の１４１１個の
培養ウェルの中の３４１ｉｌで、ＨＩＶに対する抗体の
産生が認められた。

これらの抗体を産生した３４個の培養ウェルについて、
間接蛍光抗体法（ＩＦＡ）を行った。

その結果、ＨＩＶ惑染細胞のみに反応した抗体を含有す
る培養ウェルは、３４個の中の１９個で認められた。皿
ち、この１９個の培養ウェルには、ＨＩＶと反応する抗
体を産生ずるハイプリドーマが存在することが確認され
た。

（ａｌハイブリドーマの株化（クローニング）２０％ウ
シ胎児血清を含むＲＰＭ（１６４０培地を用いて、前述
の（ｃ）工程において示した抗体産生が確認された１９
個の培養ウェルのうちの５個の培養ウェルについて限界
希釈法でハイプリドーマをクローニングした。

培養には、９６ウエル培養プレートを用い、支持細胞と
してＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスの狗腺紺胞懸濁液（
１０７個／　ｍ　１　）を使用して、（ハイブリドーマ
１〜５個）／（胸腺細胞懸濁液１００μｊ２）／ウェル
で培養した。

前記の５個の培養ウェルの各々のクローニングにおいて
、１０日目頃から単一コロニーとして観察される培養ウ
ェルの上清を採取して、不活化Ｈ■ｖを用いたＥＬＩＳ
Ａ法（前述の（ｃ）工程と同様の方法）で抗体産生ウェ
ルのスクリーニングを行ない、各々のクローニングにお
いてハイプリドーマ株を少なくとも１株づつ得、これら
を再クローニングした。

このようにして得られた株をＹＵ−１株（微工研条寄第
１６０１号）、ＹＵ−２株（微工研条寄第１６０２号）
、ＹＵ−３株（微工研条寄第１６０３号）、ＹＵ−４株
（微工研条寄第１６０４号）およびＹＵ−５株（微工研
条寄第１６０５号）と称し、これらの株が産生じたモノ
クローナル抗体を、それぞれＹＵ−１、ＹＵ−２、ＹＵ
−３、ＹＵ−４およびＹＵ−５と称す。

これら５株の培養上滑中に含まれるモノクローナル抗体
のクラス・サブクラス、Ｌ鎖の型を次の測定試験Ｉで決
定し、各種化合物に対する反応性を測定試験■で検討し
た。

災足跋腋土 ［ＨＩＶに対するモノクローナル抗体のクラス・サブク
ラスの決定］ ＹＵ−１株、ＹＵ−２株、ＹＵ−３株、ＹＵ−４株およ
びＹＵ−５株が産生じた免疫グロブリンのクラス・サブ
クラスの決定は、マウス抗体の各クラス・サブクラスに
特異的なペルオキシダーゼ標識抗体溶液（ＩｇＧ＋　、
ＩｇＧ、ａ　、Ｉ　ｇＧｚｂ、ＩｇＧｚ、Ｉ　ｇＭ、Ｉ
　ｇＡ、に型り類またはλ型り鎖などに対する西洋ワサ
ビペルオキシダーゼで標識された抗体）を用いた前述の
（ｃ）工程と同様のＥＬ　Ｉ　ＳＡ法、およびマウス抗
体の各クラス・サブクラスに特異的な抗体溶液（ＩｇＧ
、、ＩｇＧ、ａ　、ＩｇＧ、’ｂ　、Ｉ　ｇＧ、　、Ｉ
　ｇＭ、Ｉ　ｇＡ、に型Ｌｌまたはλ型ＬｉＸなどに対
する抗体）を用いたオフタロニー法で行った。

その結果、ＹＵ−１株、ＹＵ−３株、ＹＵ−４が産生じ
たモノクローナル抗体（ＹＵ−１、ＹＵ−３、ＹＵ−４
）は、いずれもＩｇＧ、に属する抗体であり、ＹＵ−２
株、ＹＵ−５株が産生じたモノクローナル抗体（ＹＵ−
２、ＹＵ−５）は、ＩｇＧ、ｂに属する抗体であること
がわかった。

１定メ翌■ ［ＨＩ　Ｖに対するモノクローナル抗体のＴ（ＩＶの各
種ペプタイドに対する反応性の検討］ＹＵ−１、ＹＵ−
２、ＹＵ−３、ＹＵ−４およびＹＵ−５などのモノクロ
ーナル抗体の反応特異性について、ＨＩＶ成分のポリペ
プチドであるＰＩ３、Ｐ２４、Ｐ２Ｏ、ＧＰ４１、ＧＰ
１２０、ＧＰ１６０との反応性をウェスタンブロッティ
ング法によって検討した。

その結果を表１に示す。

表　　　１ 実施例３ 〔フラスコ培養でのＨＩＶに対するモノクローナル抗体
の生産〕 １５％ウシ胎児血清を含むＲＰＭ１１６４０培地で培養
して得たＹＵ−１株の培養細胞を１０ｍ！のＲＰＭ１１
６４０液（ウシ胎児血清を含まない）に移しかえて、死
滅直前まで培養した。

ＨＩＶに対するモノクローナル抗体（ＹＵ−１）は、培
養液を遠心分離（回転数；３０００ｒｐｍ、時間；５分
間）して得られた上滑中に３５μｇ／ｍｆ　（−次元平
板免疫拡散法により測定）含有されていた。

実施例４ 〔マウス腹腔内でのＨＩＶに対するモノクローナル抗体
の生産〕 ＨＩＶに対する大量のモノクローナル抗体を得るために
、マウス腹腔内でＹＵ−１株の細胞を培養した。

Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウス（♀、６周齢、２週間前
にプリスタンを０．５　ｍ　ｌ　＠腔内に投与しておく
）の腹腔内に、ＲＰＭ１１６４０で浮遊させたＨＩＶ−
１５株の細胞を２Ｘ１０’個投与した。

このマウスの体重は、１週間目頃から顕著な増加を示し
、２週間目に腹水（１０ｍｌ／匹）を採取した。この腹
水を遠心分離（回転数；３０００ｒｐｍ、時間；５分！
Ｓｉ′Ｉ）シて、腹水上清を得た。

ＨＩＶに対するモノクローナル抗体（ＹＵ−１）は、こ
の腹水上滑中に８．０ｍｇ／ｍＡ　（−次元平板免疫拡
散法により測定）含有されていた。

〔発明の効果〕

本発明の？細胞株の培養によって得られたＨＩＶに対し
て非常に高い特異的な反応性を有するモノクローナル抗
体ｊは、ＨＩＶに関する基礎研究のための試薬、および
ＡＩＤＳを簡単で迅速に、かつ正確に診断するための臨
床検査測定試薬などへの用途として期待できる。

特許出瀬人　　宇部興産株式会社

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒト免疫不全ウィルス（以下、ＨＩＶと略す）を
   マウスに免疫し、それから得たリンパ球とマウスミエロ
   ーマ細胞とを融合して得られた細胞株が産生したもので
   あって、 （ａ）ＨＩＶのＰ−２４のみに対して高い特異性を有す
   るか、 （ｂ）ＨＩＶのＰ−１８のみに対して高い特異性を有す
   るか、 または、 （ｃ）ＨＩＶのＰ−１８およびＰ−５５のみに対して高
   い特異性を有する ことを特徴とするモノクローナル抗体。
2. （２）ヒト免疫不全ウィルス（以下、ＨＩＶと略す）を
   免疫されたマウスから得たリンパ球とマウスミエローマ
   細胞とを融合して得られた細胞株を培養することを特徴
   とする、 （ａ）ＨＩＶのＰ−２４のみに対して高い特異性を有す
   るか、 （ｂ）ＨＩＶのＰ−１８のみに対して高い特異性を有す
   るか、 または、 （ｃ）ＨＩＶのＰ−１８およびＰ−５５のみに対して高
   い特異性を有する モノクローナル抗体の製法。