JPS60204727A - 抗ヒトｖ型コラ−ゲン抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は蛋白質に対する抗体に関するものであり、さら
に詳しくはハイブリドーマを用いてのヒト■型コラーゲ
ンに対するモノクローナル抗体の製造ならびにそれによ
り得られたモノクローナル抗体に関するものである。

Ｖ型コラーゲンはヒト胎盤より見い出されたものでその
α鎖構成およびアミノ酸組成は従来の１、■、■、■型
コラーゲンとは異なっており新しい分子種に属するもの
である（　Ｂｕｒｇｅｓｏｎら。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ
Ａ、　７３．２５７９−２５８り。

１９７６）　Ｖ型コラーゲンの生体内分布に関しては間
葉系細胞の周囲、基底膜および一般間質にも広く存在す
ると報告されているが意見の一致をみていない。しかし
ながらヒト大動脈硬化巣でこれに接する正常中膜に比較
して■型コラーゲンの構成α鎖であるαＢ鎖の増加がみ
られ（Ｏｏｓｈｉｍａ、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２１３．
６６６−６６８．１９８１　）また皮膚創傷面が扁平上
皮細胞が被覆される際この細胞の遊走と共に持続的なＶ
型コラーゲンの産生が必須であるという事実からＶ型コ
ラーゲンは単に組織・器管の構築を形づくる繊維性蛋白
貴として存在するのみならず病的状態例えばアテローム
性動脈硬化症で変動しまた細胞の諸機能とも密接に関与
している可能性がある。

精製・純化した■型コラーゲンをウサギなどの動物に免
疫して抗体を作成することが出来るが各型コラーゲン分
子間のアミノ酸配列、立体構造の類似性に起因する共通
抗原性により型特異的な抗体を作成し難い。また使用す
る抗体力価が一定せず実験結果の解釈も制約をうける。

このような理由により抗体産生性Ｂ細胞またはその前駆
細胞と連続的分裂増殖可能な骨髄肺細胞（ミエローマ細
胞）を融合させ、これら両方の細胞の特性を有している
均質な融合細胞（）・イブリドーマ）を得ようとする試
みがなされ、そのクローンが得られることが明らかにさ
れている（　Ｋ６ｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、　２５６
．４９５−４９７゜１９７５）さらに同様な方法による
悪性腫瘍抗体（特許公告公報昭５８−４５４０７）はじ
めその他種々の抗原に対するモノクローナル抗体が作成
されている。

本発明はハイブリドーマによるＩｇＧクラス抗ヒトｖ型
コラーゲン抗体ならびにその製造方法を提供するもので
ある。すなわち、本発明は動物をヒ）Ｖ型コラーゲンで
免疫し、該動物からの抗ヒト■型コラーゲン産生細胞と
ミエローマ細胞によシ・・イブリドーマを形成させ、該
・・イブリドーマをクローン化する。ついで抗ヒト■“
　型コラーゲン抗体を産生ずるグロ・−ンを選択し培養
することからなるＩｇＧクラス抗体の製造法およびこの
ようにして得られた抗体、すなわち、ヒト■型コラーゲ
ンに存在する抗原決定基のうちのいずれか一つの抗原決
定基のみに免疫交さ反応性を有する各単クローン性抗体
を提供するものである。

以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。

実施例　１ （ａ）　抗原−■型コラーゲンの調製 ヒト胎盤を材料としてＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ
ｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、　７３．２５７９−２５８３．１９７６記載の
Ｂｕｒｇｅｓｏｎらの方法に従い０５Ｎ酢酸でホモゲナ
イズし、又プシン（１■／−）でコラーゲンを可溶化し
抽出した。コラーゲンを０．５ＭＮａＣｌ、［１，０５
Ｍ＋リスーＨＣｌ、ｐＨ７，４に溶解し、３．２Ｍ　Ｎ
ａＣｌ、　０．０５Ｍ’）リス−ＨＣ１，ｐＨ７，４に
透析した後遠沈（３０，ＯＤＤ×Ｉ）し、上溝を０．５
Ｎ酢酸で透析し凍結乾燥を行った。得られたコラーゲン
標本をＢｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、、　７２
．１４７２−１４８０．１９７６記載の５ｙｋｅｓらの
方法に従いドデシル硫酸ソーダ・ポリアクリルアミド電
気泳動で純度を調べたところ１００チであった。

（ｂ）　抗体産生細胞の調製 ８週令のＢＡＬＢ　／　Ｃ雌マウス６匹をまず完全フロ
インドアジュバントと共にヒト■型コラーゲンで初回免
疫する。マウスにはそれぞれ１００μＩのヒトＶ型コラ
ーゲンを０．５　ｆｎｌの溶液として腹腔内に投与する
。さらに２．４．６各週後、０．５ＭＮａＣ１，０，０
５Ｍ　トリス−１−ＩＣＩ、　ｐＨ７，４に溶解した同
量のヒ）Ｖ型コラーゲンを用いて追加免疫を行う。最終
免疫として５６日目に同量を腹腔内に投与した。３日後
に、マウスを層殺し肺臓を摘出し肺細胞を採取した。

（Ｃ）　ミエローマ細胞のｉ製 本発明方法において使用されるミエローマ細胞には特に
限定はなくマウス、ラット、ウサギ、ヒトなどの細胞株
がいずれも適用し得る。使用する細胞株は薬剤耐性のも
ので未融合のミエローマ細胞は選択培地で生存できない
がノ・イブリドーマは生存できることが望ましい。最も
普通に用いられる細胞株は８−アザグアニン耐性株でヒ
ボキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラ
ーゼ（ＨＧＰＲＴ）を欠損しヒポキサンチン−アミノプ
テリン−チミジン培地では生育できない性質のものであ
る。ここでは、マウスミエローマ細胞株（Ｐ３−Ｘ６３
−Ａｇ８　）を使用したが例えばＰ３−ＮＳ　１−１−
Ａｇ４−１、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕｌ　、Ｐ３Ｘ６
３−Ａｇ６．５．３、ＳＰ２１０−Ａｇ　１４、Ｆｏ、
　３１９４１５ＸＸＯ，ＢＵｌを好適に用いることがで
きる。融合前細胞数を２Ｘ１０５−３Ｘ１０５個／−以
上の濃度にならないように注意をはらいできるだけ生細
胞率を高めた。

（ｄ）細胞融合 ＰＰＭＩ　１６４０培地はＲＰＭＩ　Ａ　１６４０　（
Ｄｉｆｃ。

Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ、ｅｓ）に重炭酸ナトリウム（１
２ｍＭ）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、Ｌ−グル
タミｙ　（２ｍＭ）、ｇニジリンＧカリウム（５０μ／
−）、硫酸ストレプトマイシン（５０μｍ／／ｍｌ）お
よび硫酸アミカシン（１００μｌ／ｍｌ）を加えドライ
アイスでｐＨをＺ２に調製し、０．２μｍミリポアフィ
ルタ−で除菌濾過する。ＮＳ−１培地は上記の通り補充
したＲＰＭＩ−１６４０培地に除菌濾過した仔牛脂児血
清（Ｂｉｓｐｒｏｄｕｃｔ、　工ｎｃ、）を１５　％　
（Ｖ／Ｖ）の濃度に加え調製した。ＨＡＴ培地はＭＳ−
１培地にさらにヒポキサンチン（１００μＭ）、アミノ
プテリン（０，４μＭ）およびチミジン（１６μＭ）を
加える。

ＨＴ培地はアミノプテリンを除去した以外はＨＡＴ培地
と同一組成のものである。ポリエチレングリコール４０
００（ＰＥＧ４；０００、Ｍｅｒｃｋ’）はＲＰＭＩｆ
１６４０培地中５．０　％　（ｗ／ｗ）無血清溶液を調
製する。

非生産性のアザグアニン耐性骨髄腫細胞（Ｐ５−Ｘ６３
−Ａｇ８　）との融合は５ｅｌｅｃｔｅｄ　ＭｅｔｂＯ
ｄ　ｉｎ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ：Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　
（ｅｄ、　Ｂ、　Ｂ、　Ｍｉｓｈｅｌｌ　ａｎｄ　Ｓ、
Ｍ、Ｓｈｉｉｇｉ）、Ｗ、　Ｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎ
ｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ　（１９８０）　、　３５１−３７
２に記載の０１らの方法を若干改変して行った。本融合
ではｔｓｘ１０ａ個の有核肺臓細胞（生細胞率９５％）
を２．８Ｘ１０７個の骨髄腫細胞Ｐ３−Ｘ（Ｓ　３−Ａ
ｇ８株（生細胞率９５％）と融合する。肺臓細胞と骨髄
細胞とを血清無添加のＲＰＭＩ−１６４０培地で洗浄す
る。次に同じ培地にけん濁し、融合させるため上記の割
合で混合する。容量５０ｍの円錐形スチロール樹脂製試
験管（Ｃｏｒｎｉｎｇ　ＧｌａｓｓＷｏｒｋｓ）を用い
、４０＋ｄの血清無添加ＲＰＭニー１６４０培地中４０
０Ｘ、９．１０分間遠心し、上澄液を完全に吸出する。

沈殿細胞に６７℃加温５０％ＰＥ（）４０００溶液１−
を穏やかに攪拌しながら１分間で滴下し、さらに１分間
攪拌し細胞を再けん濁、分散させる。次に３７℃加温Ｒ
ＰＭＩ−１６４０培地１ｍｌを１分間で滴下する。この
操作をさらに１回繰返した後、同培地７７！を２−６分
間で常に攪拌しながら滴下し細胞を分散させる。これを
４００×ｇ、１０分間遠心分離し、上澄液を完全に吸出
除去する。次にこの沈殿細胞に６７℃加温Ｎ５−１培地
１０−をすみやかに加え、細胞の大きい塊りを１０−の
ピはットを用いて注意深くピプツテイングして分散する
。さらに同培地２００−を加えて希釈し、ポリスチレン
製９６穴マイクロウエル（Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ｇｌａｓｓ
　Ｗｏ、ｒｋｓ）にウェル当り５．９Ｘ１０５個１０．
１−の細胞をまき込む。なお、この時使用した９６穴マ
イクロウエルの前処理として０．２艷のＭＳ−１培地を
加え、炭酸ガス培養器中（３７℃）で１晩保温し、使用
時に培地を吸引除去する。細胞融合完了したマイクロウ
ェルを５チ炭酸ガス／９５チ空気中温度６７℃、湿度１
００チ下にインキュベートする。

（ｅ）　選択培地によるノ・イブリドーマの選択的増殖
培養１日目にバスツールビはットでＨＡＴ培地２滴（約
０．１’　ｄ　）を加える。２．６．５．８．１１日目
に培地の半分（０，１ｄ）を新しいＨＡＴ培地で置き換
える。１４日目にＨＴ培地に切換え以降６−４日毎に同
操作を繰り返す。通常２−３週間で充分なノ・イブリド
ーマの生育が観察される。

ハイブリドーマ生育全ウェルについて次項記載の固相−
抗体結合テストにより陽性ウェルをチェックする。次に
検出された各陽性ウェルをフィーダとして１０７個のマ
ウス肺臓細胞を含むＨＴ培地１−をポリスチレン製２４
穴セルウエル（Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ｇｌａｓｓ　Ｗｏｒｋ
ｓ）に加え、検出された各陽性・・イブリドーマ全内容
物を移す。これを同様に５％炭酸ガス存在下６７℃で約
１週間インキュベツトする。その間１−２回各９エルの
上清０．５−を新しいＨＴ培地０５−と交換する。ノ・
イブリドーマの充分生育した時点で固相−抗体結合テス
トにより陽性を再確認し、それぞれについて限界希釈法
によりクローニングを行う。

なお、クローニングに使用後の残液をポリスチレン製の
２５儂２組織培養フラスコ（ＣｏｒｎｉｎｇＧｌａｓｓ
　Ｗｏ、ｒｋｓ　）に移し、凍結保存用試料を調製する
。

（ｆ）　固相−抗体結合テストによる抗ヒト■型コラー
ゲン抗体産生ハイブリドーマの検索本性はＡｎａｌ、　
Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１０４．２０５−２１４Ｎ９８０
）に記載のＲｅｎｎａｒｄらの方法を若干改変したもの
で、ハイブリドーマ抗体の検出に適している。

９６穴ミクロタイトレージヨンプレート（ファルコン）
を１．０μＩの■型コラーゲンでコートし、さらに１０
チ牛血清でブロックする。これにハイブリドーマの生育
したウェルの上清の一部を加えて室温で約１時間インキ
ュベートする。２次抗体として西洋わさびはルオキシダ
ーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧを加えてさらに室温で約６
０分インキュベートする。次に過酸化水素と基質である
０−フェニレンジアミンを加え生成した褐色の程度を肉
眼で定性的に判定する。一方、胎盤組織の凍結切片を作
成し冷アセトン固定を５分間行い、ハイブリドーマの生
育したウェルの上清で室温約１時間反応させ、洗浄後、
約１６０分間フルオレスセインイソチオシアネート標識
ヤギ抗すウス抗体を反応させ螢光顕微鏡による観察を行
って陽性所見の有無を判定した。

（ｇ）　クローニング 各ウェル中には２種以上のハイブリドーマが生育してい
る可能性があるので、限界希釈法によりクローニングを
行い、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを取得す
る。ＭＳ−１培地−当りフィダーとして１０７個のマウ
ス膵臓細胞を含むクローニング培地を調製し９６穴マイ
クロウエルの５６．３６および２４ウエルにウェル当り
５．１および０．５個のハイブリドーマを加える。

５．１２日目に約０．１−〇Ｎ５−１培地を追加する。

クローニング開始後１４−１５日で充分なハイブリドー
マの生育が認められ、コロニー形成陰性ウェルが５０チ
以下の群について固相−抗体結合テストを行う。テスト
した全ウェルが陽性でない場合、抗体陽性ウェル中のコ
ロニー数を確認り、ウェル中に１コロニーのウェルｔ４
−６個選び再クローニングする。最終的に６個のクロー
ンを得た。

（ｈ）　単一抗体のインビトロおよびインビボ増殖単一
抗体は得られたクローンをＮ５−１培地などの適当な培
養液で培養（インビトロ増殖）し、その培養土清液から
得ることができる（単一抗体たん白濃度は１０−１００
μｍ９　／ｍｅ　）。一方、大量に抗体を得るためには
膵臓細胞とミエローマ細胞の由来動物と同系の動物［Ｂ
ａｊｂ　／　Ｃマウスンに腫瘍形成促進剤ブリスタン（
２，６，１０，１４−テトラメチルはンタデカン、Ａｌ
ｄｒｉｃｈ　ＣｈｅｍｉｃａｌｃＱｍｐａｎｙ、　Ｉｎ
ｃ、）をマウス−回当５０．５ｍ腹腔内投与する。１−
３週間後にハイブリドーマｌＸ１０７個を同じく腹腔的
投与することによりインビボで、１−２週間後に単一抗
体たん白質濃度４−７ｍｙ／−の腹水を得ることができ
る。

（ｉ）　単りローン性抗ヒト■型コラーゲン抗体のアイ
ソタイプ 得られた各々の腹水を先ず■型コラーゲンをコートした
ミクロタイトレーシフ／プレートを用いて固相−抗体結
合テストを前述の如く行う。

プレー１トを洗浄後アイソタイプ特異性ウサギ抗マウス
ＩｇＧ抗、体（Ｚｙｍｅｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
　Ｉｎｃ、　）を加える。洗浄後西洋わさびはルオキシ
ダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ　（Ｈ＋Ｌ）抗体を加え
基質として２．２′−アジノージ（６−ニチルベンゾチ
アゾリン硫酸−６）および過酸化水素を用いて検出した
。その結果をまとめて第１表に示した。調べた抗体のう
ち１個は免疫グロブリン鎖γ２ａ／にを、２個は、γ２
ｂ／にを有していた。

実施例　２ 単クローン抗体の特異性と力価 ヒト■型コラーゲン１．０μｇをマイクロタイトレーク
ヨンプレートにコートし腹水よシ得られた単クローン抗
体のＸ４００，０００希釈液を室温で約１時間反応させ
た後、さらに西洋わさびはルオキシダーゼ標識ヤギ抗マ
ウスＩｇＧと約６０分反応させた。次に過酸化水素と基
質である〇−フェニレンジアミンを加え生成した褐色の
程度をミクロプレートフォトメーター（コロナ・ニレス
トリック）で測定した。第２表に示したようにいずれの
単クローン抗体も４００，０００倍希釈で、陽性であっ
た。また、単クローン抗体の特異性を検索するためにヒ
ト胎盤より精製・純化したＩ型、■型、■型各コラーゲ
ンと同上の方法で反応性をみたところ、いずれの単クロ
ーン抗体（腹水単クローン抗体、１０００倍希釈）もＩ
型、■型、■警告コラーゲンと交叉反応を示さなかった
。また種属特異性の有無をみるために同上の方法で腹水
単クローン抗体（１０００倍希釈）をラット皮膚由来の
■型コラーゲンと反応させたところ陰性であった。

実施例　５ 胎盤中のＶ型コラーゲンの免疫螢光法による染色胎盤組
織をアセトン・ドライアイスで凍結しクリオスタットに
て切片（５μ）を作成した。冷アセトン固定を５分間行
い腹水単クローン抗体を１：１００に希釈したものを室
温で約１時間反応させた。洗浄後、さらに、ヤギフルオ
レスセインインチオシアネート標識抗マウスＩｇＧを室
温で約３０分反応させ螢光顕微鏡にて観察した。

いずれのクローンの抗体も陽性所見を示した。

第　１　表 Ａ３８　ＩｇＧ２ａ　γ２ａ／に ７１１１０工ｇＧ２ｂ　γ２ｂ／に Ａ１４　Ｉｇ（）２ｂ　γ２ｂ／に 第　２　表 Ａ３８．＋　−−−− ／ｌ６ｉｏ　＋　−−−一 ４１４　＋　−−−− ヒ）Ｖ型コラーゲ／に対しては各腹水を４００．０００
倍希釈、ラットＶ型、Ｌ）Ｉ型、■型、■型コラーゲン
に対してはそれぞれ各腹水を１０００倍希釈した。

特許出願人　富士薬品工業株式会社

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ヒト■型コラーゲンに存在する抗原決定基のうちのいず
   れか一つの抗原決定基のみに免疫交さ反応性を有する各
   単クローン性抗体。