JPS61236798A - モノクロ−ナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はヒトの、特に膵癌の診断に有用なモノクローナ
ル抗体に関する。

［従来の技術］ 膵癌は近年増加傾向にあるにもかかわらず、確たる早期
診断法は確立されていない。

［発明が解決しようとする問題点］ 膵癌の悪性度は高く、早期にリンパ節や他臓器へ転移し
、予後は不良である。従って、膵癌の早期発見が可能な
診断法の確立が望まれている。

［問題を解決するための手段］ 本発明者等は早期診断と治療への応用を意図し、膵癌関
連抗原に対するモノクローナル抗体について種々検討を
行なった結果、本発明を完成した。

即ち、本発明は、 ［１，ヒト膵癌に含まれる分子量１０万の抗原と抗原抗
体反応をし、次の性質を有するＩｇＧ１亜群に属するモ
ノクローナル抗体ＡＰ−２゜（１）　　ヒト膵癌と反応
する。

■　ヒト肺腺癌、胆管路、十二指腸乳頭部癌と弱く反応
する。

（３）　　ヒトの膵臓２食通、胃、十二指腸、肝、胆管
、大腸、肺、甲状腺、耳下腺、子宮頚部。

赤血球、末梢血リンパ球の正常組織と反応しない。

次の性質を有するＩｇＧ１亜群に属するモノクローナル
抗体ＡＰ−９゜ （１）　　ヒト膵癌と反応する。

■　ヒト耳下腺腫瘍と反応する。

（３）　　ヒト大腸癌、胆管路、十二指腸乳頭部癌。

肺小細胞層、肺腺癌と弱く反応する。

（１１）　　ヒトの膵臓２食道、胃、十二指腸、肝、胆
管、大腸、肺、甲状腺、耳下腺、子宮頚部。

赤血球、末梢血リンパ球の正常組織と反応しない。」 に関するものである。

なお、以下の説明において述べる細胞２組織等は特にこ
とわりのない限り全てヒトの細胞２組織等である。

本発明のモノクローナル抗体ＡＰ−２及びＡＰ−〇は、
後述する実施例に示すように、膵癌とは反応するが、正
常膵臓や、慢性膵炎の膵臓と反応せず、更に食道、胃、
大腸、肝臓、胆管、十二指腸、子宮頚部、甲状腺、肺、
耳下腺、末梢血リンパ球、赤血球の正常組織と反応しな
い。又、ＡＰ−２抗体は肺腺癌、胆管路、十二指腸乳頭
部癌と弱く反応する。ＡＰ−９抗体は耳下腺肺癌と反応
し、肺腺癌や肺小細胞病、十二指腸乳頭部癌、胆管癌、
大腸癌とも非常に弱く反応する。

ＡＰ−２抗体と反応する抗原は分子量１０万のタンパク
分子である。一方ＡＰ−９抗体に反応する抗原は糖質で
ある。又、ＡＰ−２，ＡＰ−９抗体によって認識される
抗原決定基にはシアル酸は含まれていない。

ＡＰ−２及びＡＰ−９抗体はいずれもＩａＧ１亜群に属
するものである。

本発明のモノクローナル抗体は例えば次のようにして製
造することができる。即ち、ヒト膵癌細胞等でマウス又
はラット等の動物を免疫し、免疫された動物から抗体産
生細胞を得、これと骨髄腫細胞を融合し、得られた融合
細胞をクローン化し、ヒト膵癌に対する抗体を産生する
融合細胞を選択し、これを培養して抗体を回収する。免
疫、融合。

融合細胞の選択等は公知の通常の方法によって行なうこ
とができる。

更に詳しくは、例えば次のようにして本発明のモノクロ
ーナル抗体を製造することができる。

先ず、マウスを膵癌細胞で免疫する。免疫する動物はマ
ウスに限らず、ラット等のネズミ科の動物又はその他の
動物を使用してもよいが、通常はマウスを用いるのが好
ましい。又、膵癌細胞の代りにそのホモジネート又はそ
れから採取された抗原を用いてもよい。例えばＢＡＬＢ
／ｃマウスに膵癌細胞又はそのホモジネート又はそれか
ら採取された抗原を数日〜数週間おきに数回接種する。

接種量は１匹当り１回につき１０５〜１０８個の細胞を
使うのが好ましい。

その後マウスより牌臓を摘出し、遠心分離により抗体産
生細胞を得る。この細胞は増殖していく能力を持たない
ので、自己増殖能力を有する細胞と融合させる。自己増
殖能力を有する細胞としては骨髄腫細胞が特に好ましい
。骨髄腫細胞としては、同種の動物のものを用いるのが
好ましい。又、骨髄腫細胞としては、抗体を産生じない
ものを選択するのが好ましい。抗体産生細胞と骨髄腫細
胞をポリエチレングリコール等の細胞融合剤と混合し、
細胞融合を行なう。抗体産生細胞と骨髄腫細胞の使用割
合は、細胞数比で２：１〜１０：１とするのが好ましい
。

得られた融合細胞は限界希釈法により分離し、１個の細
胞に由来する細胞の集団、すなわちクローンとする。

抗体は公知の方法、例えば螢光抗体法又は酵素抗体法等
により各種細胞組織等と反応させ、その結果から所望の
抗体を産生するハイブリドーマを選択する。

選択したハイブリドーマをｉｎ　　ｖｉｔｒｏ培養法又
はｉｎ　　■別移植法により増殖させ抗体を得る。

ｉｎ　　ｖｉｔｒｏ培養法としては、例えば次のように
行なうことができる。即ち、ハイブリドーマを適当な培
養液（例えば完全ＲＰＭＩ培地）で増殖限界になるまで
培養し、その培養上清を回収する。

上清中に分泌されたモノクローナル抗体は一般には精製
しないで用いられるが、例えば以下の方法によりＩｇＧ
分画にしても使用できる。即ち、培養上清を４０％飽和
硫安で沈澱させた後、ｐ）−１７，８の２０　ｍＭリン
酸緩衝液で平衡化したジエチルアミノエチルセルロース
カラム又はセファデックスＧ２００カラムを通過させ不
純物を除去して用いる。

又、ｉｎ　　■籾移植法としては、例えば次のように行
なうことができる。即ち、生体内、例えばヌードマウス
腹腔内にハイブリドーマを注入し、ヌードマウス体内で
腫瘍として生育させ、ヌードマウス血清あるいは腹水か
ら抗体を回収する。更に詳しくは、ハイブリドーマを移
植するＢＡＬＢ／Ｃマウス腹腔内にあらかじめ（５〜１
０日前）　　２，６゜１０．１４−テトラメチルペンタ
デカンを０．５ｍｌ注射しておき、次にハイブリドーマ
５×１０６〜１０７個を腹腔内に移植する。移植された
マウスを適当な時間飼育すると、腹腔内にハイブリドー
マの腫瘍が形成され、腹部が肥大してくる。この結果、
腹水及び血清中に高濃度のモノクローナル抗体が生成さ
れるので、それらを採取する。この腹水及び血清中には
目的とするモノクローナル抗体以外に、マウス自身に由
来する多クローン性抗体が含まれているが、それらはヒ
トの組織とは反応しないため、特に分離しないで用いら
れる。又、知ｖｉｔｒｏ培養法の場合と同様に、ｉｎ　
　■独移植法においてもＩｇＧ分画にして使用すること
もできる。

［実施例］　。

実施例１ １）免疫 ８週令の＃１ＢＡＬＢ／Ｃマウスを５×１０６個の膵癌
由来の細胞株（以下Ｐａ　Ｃａ−２という）で皮下に免
疫し、その後２週間の間隔で２回腹腔内に５Ｘ１０６個
の細胞を注入した。

２）細胞融合 最終免疫より３日後に牌臓を取り出し、ステンレスメツ
シュを通すことにより細胞懸濁液を作製した。この１．
３Ｘ１０　　個の牌細胞と４．ｌＸ１０７個の８−アザ
グアニン耐性骨髄腫細胞ｐ３−ＮＳＩ−Ａａ４／１　　
（ＮＳＩ＞を混合し、遠沈後沈渣に１ｄの４５％ポリエ
チレングリコール（平均分子量６０００　）を加え、１
分間ゆるやかに撹拌した。洗浄後、細胞混合液を１０％
牛脂児血清を含むＲＰＭＩ培地（完全ＲＰＭＩ培地）に
懸濁し、９６穴マイクロ培養プレートに１穴当り１０６
個の割合で０．１ｒｎｌずつ分注した。２４時間後、ヒ
ボキサンチン１００μＭ、アミノプテリン０．４μＭ、
チミジン１６μＭを含む完全ＲＰＭＩ培地（ＨＡＴ培地
）を０．１ｄ加えた。

培養開始後２日目、３日目、５日目、７日日。

１０日日目培養上清ｏ、　ｉｍｌを捨て、ＨＡＴ培地０
．１戒を加えた。１２日後全ての穴にハイブリドーマが
増殖するのが観察された。

３）ハイブリドーマの選択 ｐａ　Ｃａ−２細胞に対して抗体を産生じているハイブ
リドーマを酵素抗体法により選択した。酵素抗体法は以
下の如く行なった。

Ｐａ　Ｃａ−２細胞を９６穴マイクロ培養プレートに増
殖限界に達するまで培養し、０．２５％グルタルアルデ
ヒドで５〜７分間固定し、５回洗浄した。

ハイブリドーマの培養上清０．１７を加え、室温で１時
間反応させた。５回洗浄した後、第２抗体として５０成
の西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス免疫グ
ロブリンを加え、１時間反応させた。６〜７回洗った後
、１．１％過酸化水素水と１５０１１！ｉ／ｒｒｄｌの
アジノービス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−６−
スルフォン酸）（ＡＢＴＳ）を含む５０ｍＭクエン酸緩
衝液をｉ　ｏｏｙ加え、１０分間室温で発色させた。停
止液として１０％シュウ酸を５０ｇ加え、４０５ｎｍの
吸光度をマイクロプレート用の分光光度計により測定し
、０．０２以上吸光度のあるハイブリドーマを選択した
。

選択されたハイブリドーマはあらかじめＢＡＬＢ／Ｃマ
ウスの胸腺細胞（フィーダー細胞）をまかれた２４穴培
養プレートに移され、１００μＭヒポキサンチンと１６
μＭチミジンを含む完全ＲＰＭＩ培地（ＨＴ培地）で培
養した。増殖限界に達した後、再び酵素抗体法によりＰ
ａ　Ｃａ−２細胞に対して抗体産生を行なっているハイ
ブリドーマを選んだ。

次に、選択されたハイブリドーマを限界希釈法によりク
ローニングした。即ち、細胞を５０個／ｒＩＪ！あるい
は１０個／Ｉｎｌに希釈し、あらかじめフィーダー細胞
をまかれた９６穴マイクロ培養プレートにｏ、ｉｍｆｉ
ずつ分注し、ＨＴ培地により２週間培養した。１穴に１
個のハイブリドーマコロニーが形成された場合をクロー
ンとして取り出した。酵素抗体法によりＰａ　Ｃａ−２
細胞に対して反応し、正常ヒト線維芽細胞に対して反応
しない抗体を分泌しているハイブリドーマクローンを選
択した。

更に、これらのクローンのうち、ヒト正常膵組織と反応
せず、膵癌と反応するクローンを凍結切片の免疫パーオ
キシダーゼ染色により選択した。

つまり、ヒトの膵癌及び正常組織を手術材料から得、そ
の４ＩＪ！ｒｔ凍結切片を作製した。アセトン固定侵、
バイブリド７マクローンの培養上清を加え、室温で３０
分反応ざぜた。よく洗った後、ビオチン標識抗マウスＩ
（ＩＩＧ抗体（γ鎖、λ鎖、に鎖と反応する）と室温で
３０分反応させた。更に洗浄後、アビジンとビオチン標
識西洋ワサビパーオキシダーゼを加え室温で１時間反応
させ、よく洗った後基質として０．５ｍＭ　ｍｉｌのジ
アミノベンチジンと０、０１％町０２を含む５０ｍＭ　
＋−リス−塩酸緩衝液（ｐｌ−１７，０）を加え発色さ
せた。

このようにして、ヒト膵癌とは反応するが、膵臓２食道
、胃、十二指腸、肝、胆管、大腸、肺（肺胞、気管支粘
膜）、甲状腺、耳下腺、子宮頚部、赤血球、末梢血リン
パ球の正常組織と反応しないモノクローナル抗体を産生
するハイブリドーマクローンが得られ、これをＡＰ−２
’　と名付けた。そして、これらハイブリドーマＡＰ−
２’が産生するモノクローナル抗体をＡＰ−２と命名し
た。後述するように、ＡＰ−２は分子量１０万の抗原と
反応する。

４）モノクローナル抗体の作製 （ａ）　　ｉｎ　　ｖｉｔｒｏ培養法 １培養法１威５ （完全ＲＰＭＩ培地）で増殖限界（２Ｘ１０６個／ｒｎ
ｌ＞になるまで培養し、その培養上清を回収した。上清
中に分泌されたモノクローナル抗体は精製しないで用い
た。（但し、以下の方法によりＩｇＧ分画にして使用す
ることもできる。即ち、培養上清を４０％飽和硫安で沈
澱させた後、ｌ）Ｈ　７．８の２０ｍＭリン酸緩衝液で
平衡化したジエチルアミノエチルセルロースカラムを通
過させ不純物を除去して用いる。） （ｂ）　　肋　■叩移植法 ハイブリドーマを移植するＢＡＬＢ／Ｃマウスにあらか
じめ（５〜１０日前＞２．６。

１０、１４−テトラメチルペンタデカンを腹腔中に６．
幽注射しておく。次にハイブリドーマ５Ｘ１０６個を腹
腔内に移植する。移植されたマウスを３週間飼育すると
、腹腔内にハイブリドーマの腫瘍が形成され、腹部が肥
大してくる。この結果、腹水及び血清中に高濃度のモノ
クローナル抗体が生成され、それらを採取する。この腹
水及び血清中には目的とするモノクローナル抗体以外に
、マウス自身に由来する多クローン性抗体が含まれてい
るが、それらはヒトの組織とは反応しないために、特に
分離しないで用いる。（また、４）の（ａ）に示した方
法によりＩＱＧ分画にしても使用できる。）５）モノク
ローナル抗体ＡＰ−２の特性以下の例においては、前記
４）　（ａ）で得られた培養上清をそのまま用い反応性
を調べた。

（ａ）　　膵癌組織との反応性 手術により切除された癌組織７例の凍結切片との反応性
を免疫パーオキシダーゼ染色により調べた。後掲の第１
表に示すように、ＡＰ−２抗体は膵癌７例中５例と反応
した。反応しなかった２例のうち１例は膵ランゲルハン
ス島由来の腫瘍であった。

（ｂ）　　他の癌組織との反応性 ＡＰ−２抗体と膵以外の９種類の臓器の癌組織（２０検
体）の凍結切片との反応性を免疫パーオキシダーゼ染色
により調べた。

後掲の第２表に示すようにＡＰ−２抗体は肺腺癌の一部
、胆管癌の一部、十二指腸乳頭部癌の一部と弱く反応し
たが、他の癌とは反応しなかった。

（Ｃ）　　正常組織との反応性 ＡＰ−２抗体と膵臓をはじめとする１１種の正常組織（
２１検体）の凍結切片との反応性を免疫パーオキシダー
ゼ染色により調べた。また末梢血リンパ球に対する反応
性を間接蛍光抗体法によって、また赤血球に対する反応
性を間接凝集試験によって調べた。

後掲の第３表に示すようにＡＰ−２抗体はいずれの正常
組織，細胞とも反応しなかった。

（ｄ）　　モノクローナル抗体ＡＰ−２と反応する可溶
化抗原 ＡＰ−２抗体に反応する抗原を１２５■により細胞表面
タンパク質を標識して調べた。

４°ＣのＰＢＳにて機械的にＰＡＮＣ−１細胞をはがし
、０．５ｍキューリーの１２５１とラクトパーオキシダ
ーゼｏ、ｉｍｇ及び０．００３％Ｈ２０２を加え３０℃
で４分間、更に室温で１０分間反応させ、よく洗った。

細胞沈渣に０．５ｍｌの０．５％ノニデートＰ−４０を
加え、氷上で１０分間放置することにより細胞膜を可溶
化した。この混合液を２７０００Ｇ、２０分間遠心し、
上清を１２５■標識可溶化タンパク質とした。　　　■
標識可溶化タンパク質に約５０倍に濃縮したＡＰ−２培
養上清を加え、氷上で１時間反応せき、その後ヤギ抗マ
ウスＩｇＧ杭体を加え、更に１時間反応させた。対照と
して、 ｌ０Ｇ１産生マウス骨髄腫ＭＯＰＣ２１の培養上清を５
０倍に濃縮したものを用いた。この混合液にスタフィロ
コッカスアウレウス（旦」坦曵幻ヱ二匹犯長−ａｕｒｅ
ｕｓ）の死菌を加え、３０分間反応後よく洗い、菌に結
合した抗原をソディウムードデシルースルフォネートー
ポリアクリルアミドゲルディスク電気泳動で還元条件下
で分析した。

ＡＰ−２抗体が反応する抗原は１２５■で標識され、１
０万のタンパク分子であることがわかった。

尚、ＡＰ−２抗体はオフタロニー法により調べた結果Ｉ
ｇＧ１亜群に属するものであることがわかった。

叉簾■２ １）免疫 ８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに５Ｘ１０６個のヒト膵
癌由来の細胞株（以下ＰＡＮＧ−１という）を皮下に注
入し、２週間後６Ｘ１０６個、更に５力月後５Ｘ１０６
個の細胞が腹腔内に注入された。

２）ｍ胞融合 実施例１において、Ｐａ　Ｃａ−２で免疫された１、３
Ｘ１０８個の牌細胞の代わりにＰＡＮＣ−１で免疫され
た５Ｘ　１０’個の牌細胞を用い、４．１×１０　　個
のＮＳＩの代わりに４．９Ｘ　１０７個のＮＳＩを用い
た以外は実施例１と全く同様にして細胞融合を行なった
。実施例１の場合と同様に１２日後に全ての穴にハイブ
リドーマが増殖するのが観察された。

３）ハイブリドーマの選択 ＰＡＮＣ−１細胞に対して抗体を産生しているハイブリ
ドーマの選択を実施例１の場合と全く同様にして行なっ
た。

次に実施例１と全く同様にして、選択されたハイブリド
ーマを限界希釈法によりクローニングした。そして、酵
素抗体法によりＰＡＮＣ−１細胞に対して反応し、正常
ヒトフィブロブラストに対して反応しない抗体を分泌し
ているハイブリドーマクローンを選択した。

更に、これらのクローンのうちヒト膵癌組織と反応し、
正常組、＃！と反応しないクローンを実施例１と同様に
して選択した。

このようにして、ヒト膵癌、耳下腺腫瘍と反応し、肺腺
癌、肺小細胞癌、十二指腸乳頭部癌、胆管癌の一部と弱
く反応し、肺胞、胃、大腸２食道。

十二指腸、甲状腺、耳下腺、肝等の正常組織と反応しな
いモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクロー
ンＡＰ−９’が得られた。このハイブリドーマＡＰ−９
’が産生するモノクローナル抗体をＡＰ−９と命名した
。そして実施例１の４）（ａ）と同様にしてモノクロー
ナル抗体ＡＰ−９を含む培養上清を得た。

４）モノクローナル抗体ＡＰ−９の特性以下の例におい
ては、前記３）で得られた培養土清をそのまま用い実施
例１の５）と同様にして反応性を調べた。

（ａ）　　膵癌組織との反応性 ＡＰ−９抗体は膵癌組織１例中６例と反応し、ランゲル
ハンス島由来の腫瘍とも反応した。

（ｂ）　　他の癌組織との反応性 ＡＰ−９抗体は耳下腺腫瘍３例中２例と反応し、又、大
腸癌、胆管層、肺腺癌の一部と弱く反応した。又、−二
指腸乳頭部癌。

肺小細胞筋とも非常に弱く反応した。

（Ｃ）　　正常組織との反応性 ＡＰ−９抗体は検索したすべての正常組織に対し、反応
しなかった。

上記（ａ）〜（Ｃ）の結果は後掲の第１表〜第３表に示
した。

（ｄ）　　ＡＰ−９抗体の認識する抗原の性状ＡＰ−９
抗体のＰＡＮＣ−Ｉｌｌ［１胞に対する反応性を間接蛍
光抗体法による染色で検討したところ、ＡＰ−９抗体の
反応性はＰＡＮＣ−１細胞を０．２５％トリプシンやプ
ロナーゼで処理しても変化しなかった。又、ノイラミニ
ダーゼ処理に対しても抵抗性であった。しかし、ＰＡＮ
Ｃ−１細胞をＮａＩＯ４で処理したあとの反応性を　　
■−ヤギ抗マウスＩｇＧを使った結合試験で検討すると
反応性の低下を見た。以上の結果、ＡＰ−９抗体の結合
部位は、シアル酸を含まない糖鎖であると考えられる。

尚、ＡＰ−９抗体はオフタロニー法により調べた結果Ｉ
ｇＧ１亜群に属するものでおることがわかった。

第１人 表中Ｗは弱く反応したことを示す。

第２人 モノクローナル抗体の種々の癌組織に対する反応性表中
Ｗは弱く反応したことを示す。

第旦人 免疫パーオキシダーゼ染色による モノクローナル抗体の正常組織に対する反応性「発明の
効果Ｊ ＡＰ−２及びＡＰ−９抗体を用いた診断により、特に膵
癌の診断を的確に行うことが出来る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒト膵癌に含まれる分子量１０万の抗原と抗原抗体
   反応をし、次の性質を有するＩｇＧ＿１亜群に属するモ
   ノクローナル抗体ＡＰ−２。 （１）ヒト膵癌と反応する。 （２）ヒト肺腺癌、胆管癌、十二指腸乳頭部癌と弱く反
   応する。 （３）ヒトの膵臓、食道、胃、十二指腸、肝、胆管、大
   腸、肺、甲状腺、耳下腺、子宮頚部、赤血球、末梢血リ
   ンパ球の正常組織と反応 しない。 ２、ヒト膵癌に含まれる抗原と抗原抗体反応をし、次の
   性質を有するＩｇＧ＿１亜群に属するモノクローナル抗
   体ＡＰ−９。 （１）ヒト膵癌と反応する。 （２）ヒト耳下腺腫瘍と反応する。 （３）ヒト大腸癌、胆管癌、十二指腸乳頭部癌、肺小細
   胞癌、肺腺癌と弱く反応する。 （４）ヒトの膵臓、食道、胃、十二指腸、肝、胆管、大
   腸、肺、甲状腺、耳下腺、子宮頚部、赤血球、末梢血リ
   ンパ球の正常組織と反応 しない。