JPS62212399A - モノクロ−ナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はヒトの肺癌等の診断及び治療に有用なモノクロ
ーナル抗体に関する。

（従来の技術） に０ｈｌＯｒ等の方法に基づき、癌に対するモノクロー
ナル抗体について種々の研究が行なわれており、ヒトの
癌の診断に利用しようとする試みが多くなされている。

（発明が解決しようとする問題点） 現在のところ、ヒトの肺癌の診断用のモノクローナル抗
体の作成は多く試みられているが、その特異性において
実用的価値のあるモノクローナル抗体はまだ見出されて
いない。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らは、ヒトの癌特に肺癌の組織診断等に有用な
実用化可能なモノクローナル抗体について鋭意研究を行
なった結果、本発明を完成した。

即ち本発明は、 「（１）　　ヒト肺小細胞癌に存在する２５Ｘ　１０３
ダルトンの分子量のタンパク質抗原と抗原抗体反応をし
、次の性質を有するＩｑＧ１アイソタイプに属するモノ
クローナル抗体ＮＥ−２５゜ １、ヒトの肺小細胞癌、神経膠原及び神経芽細胞腫と反
応する。

２、ヒトの神経、甲状腺及び副腎の正常組織と反応する
。

３、ヒ１〜の肺、食道、胃、小腸、大腸、腎臓の正常組
織と反応しない。

■　ヒトの正常上皮細胞及び上皮由来癌細胞に存在する
３５×１０３ダルトンの分子聞のタンパク質抗原と抗原
抗体反応をし、次の性質を有するＩ（ＩＧ１アイソタイ
プに属するモノクローナル抗体ＰＥ−３５゜ １、ヒトの肺癌、胃癌、大腸癌、乳癌、肝胆道癌と反応
する。

２、ヒトの神経膠原、神経芽細胞腫、肉腫、リンパ腫と
反応しない。

３、ヒトの肺、甲状腺、食道、胃、小腸、大腸の正常上
皮組織と反応する。」 に関するものである。

なお、以下の説明において述べる細胞、組織等は特にこ
とわりのない限りヒトの細胞、組織等を示す。

本発明のＮＥ−２５抗体及びＰ　Ｅ　−３５抗体のイム
ノグロブリン（Ｉｇ）のアイソタイプはＩｑＧｌである
。又、ＮＥ−２５抗体が反応する抗原（ＮＥ−２５抗原
）は肺小細胞癌に存在し、ＮＥ−２５抗原は２５×１０
３ダルトンの分子量のタンパク質抗原である。

一方、ＰＥ−３５抗体が反応する抗原（ＰＥ−３５抗原
）は正常上皮細胞及び上皮由来癌細胞に存在し、ＰＥ−
３５抗原は３５Ｘ　１０３ダルトンの分子■のタンパク
質抗原である。

ＮＥ−２５抗体の各種培養細胞株に対する反応性につい
ては、肺小細胞癌に関しては大部分の細胞株で陽性を示
し、神経性ｉ！Ｉ瘍（神経膠原及び神経芽細胞腫）に関
してはほとんど全ての細胞株で陽性を示す。又、ＮＥ−
２５抗体の各種腫瘍組織に対する反応性については、肺
小細胞癌に関しては大部分の症例で陽性を示し、神経性
腫瘍（神経ｌｌ１ｌ腫及び神経芽細胞腫）に関してはほ
とんど全ての症例で陽性を示し、肺扁平上皮癌、肺腺癌
、肺大細胞癌に関してはほとんどの症例で陰性を示す。

ＮＥ−２５抗体の正常組織に対する反応性については神
経、甲状腺及びｎ１腎等と反応性がみられ、肺、食道、
胃、小腸、大腸、腎臓等とは反応性が認められない。

一方、ＰＥ−３５抗体の各種培養細胞株に対する反応性
については、肺小細胞癌、肺扁平上皮癌、肺腺癌に関し
ては大部分の細胞株で陽性を示し、胃癌、大腸癌、膵臓
癌、肝胆道癌、乳癌、腎癌に関してはほとんどの細胞株
で陽性を示すが、神経性ｇ！瘍（神経膠原及び神経芽細
胞腫）、肉腫、リンパ腫に関してはほとんど全ての細胞
株で陰性を示す。又、ＰＥ−３５抗体の各種腫瘍組織に
対する反応性については、肺癌、胃癌、大腸癌、膵臓癌
、肝胆道癌、乳癌に関してはほとんどの症例で陽性を示
し、神経性腫瘍（神経膠原及び神経芽細胞腫）肉膝、リ
ンパ腫に関してはほとんど全ての症例で陰性を示す。Ｐ
　Ｅ　−３５抗体の正常組織に対する反応性については
、気管支、食道、胃、小刃、大腸等の上皮や甲状腺と反
応がみられた。

Ｎ’Ｅ−２５抗体はその正常組織及び腫瘍組織における
反応性より神経細胞及び神経内分泌細胞への分化に伴っ
て表現される分化抗原を認識していると考えられ、一方
、ＰＥ−３５抗体は汎上皮性抗原とでも言うべき抗原に
反応性を示し、神経内分泌ｌｌＪ胞への分化を示した肺
癌とされる肺小細胞癌の大部分には両抗原が認められた
。ＮＥ−２５抗体及びＰ　Ｅ　−３５抗体は肺癌の免疫
組織学的検査に有用な抗体である。

本発明のモノクローナル抗体は公知の方法例えばにｏｈ
ｌｅｒとＨｉｌｓｔｅｉｎの方法［ＮａｔＵｒｅ　２５
６．４９５−４９７（１９７５）］や［Ｊｅｄａらの方
法［Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　７８．５１２２−５１２６（１９８１）］　ニ
従ッテ作製することができる。

例えば本発明のモノクローナル抗体は次のようにして製
造することができる。本発明のモノクローナル抗体が認
識する抗原（例えば肺癌細胞、神経性Ｍ！瘍細胞等）で
マウス又はラン１−等の動物を免疫し、免疫された動物
から抗体産生細胞を冑、これどミエローマ細胞とを融合
し、得られたハイブリドーマから本発明のモノクローナ
ル抗体を産生ずるハイブリドーマを選択し、これを培養
し抗体を回収する。免疫法、融合法、ハイブリドーマの
選択、抗体の回収等は公知の常法により行なうことがで
きる。

更に詳しくは、例えば次のようにして本発明のモノクロ
ーナル抗体を製造することができる。

まず、マウスを肺癌細胞、神経性腫瘍細胞等で免疫する
。免疫する動物はマウスに限らず、ラット等のネズミ科
の動物又はその他の動物を使用してもよいが、通常はマ
ウスを用いることが好ましい。この免疫用マウスとして
は、ＢＡＬＢ／Ｃ系マウス、ＢＡＬＢ／Ｃ系マウスと他
系マウスとのＦ１マウス等が用いられる。

マウスに対して肺癌細胞等を数日〜数週間おきに数回接
種する。その後マウスより牌臓を摘出し、常法により狩
細胞（抗体産生細胞を含む）を採取する。

ミエローマ細胞としては同種の動物のものを用いること
が好ましく、マウス牌細胞を融合の相手とする場合には
、マウスミエローマ細胞を用いる。

具体的にはＭＯＰＣ−２１，８３／１　［Ｎａｔｕｒｅ
、　２５６．４９５−４９７（１９７５）］　、ＳＰ２
１０−Ａｇ１４　［Ｎａｔｕｒｅ、　２７ム１３１−１
３３［（１９７９）］　、８１９４１５．ＸＸＯ，ＢＵ
、１　　［Ｊ、Ｅｘｐ、Ｈｅｄ、　１４８゜３１３−３
２８（１９７８）］などが用いられる。

Ｉｌ！ｌｌｌ１胞とミエローマ細胞は１対１〜１０対１
の割合で混合し、融合は例えばＮａＣｆｆ　　（約０，
８５％）、ジメチルスルホキシド［１０〜２０％（Ｖ／
Ｖ）　］および９分子１０００〜６０００のボリエヂレ
ングリコールを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７，２〜１．４
）中で行う。

融合は例えば、両細胞を３５〜３７℃で１〜３分間イン
キュベー］・することによって行う。

ハイブリドーマの選択は、例えばヒボキサンチン（１，
３〜１．４　ｍｙ／ｄｆｌ　”）　、アミノプテリン（
１８〜２０埒／ｄＮ　）　、チミジン（３７５〜４００
埒／ｄｉ）、ス１−レブトマイシン（５０〜１００１１
！ｉ／ｄｉ）　、ペニシリン（５０〜１００単位／ｒｎ
１）、グルタミン（３，５〜４．０ｇ／ｐ）、牛胎児血
清（１０〜２０％）を含む基礎培地を用い、成育してく
る細胞として選択する。　　　□基礎培地としては、動
物細胞の培養に一般に使用されているＲＰＨ１１６４０
培地、［：ａｇｌｅのＨＥＭ培地などが用いられる。

ハイブリドーマのクローン化は限界希釈法にて少なくと
も３回繰返して行うのが好ましい。

本発明の抗体を産生ずるハイブリドーマの選択は、分泌
される抗体の反応性を調べ前記と同じ反応性、を有する
抗体を産生ずるハイブリドーマを選択し、その認識する
抗原分子が前記分子量を示すことを確認することにより
行なわれうる。

ハイブリドーマを通常の動物細胞の培養と同様にして培
養すれば、培地中に本発明の抗体が生産される。例えば
、２〜５Ｘ１’Ｏ’のハイプリドーマ細胞をストレプト
マイシン（５０〜１００４／ｄ）、ペニシリン（ｓｏ−
ｊｏｏ単位／ｆＩＩｔ）、グルタミン（３，５〜４．０
　ｇ／（１）　、牛胎児血清＜１０〜２０％）を含むＲ
ＰＨＴ１６４Ｑ培地１０〜２０−を用い、フラスコ内で
９５％Ｇｏ−５％０２存在下、３５〜３７℃、３〜７日
間培養することによって培養液中に抗体が分泌、蓄積さ
れる。

またハイブリドーマ細胞をプリスタン（ＰｒｉＳｊａｎ
８）処理のヌードマウスまたはＢＡＬＢ／ｃマウスの腹
腔内に移植して増殖することにより腹水中に本発明の抗
体を蓄積させることができる。即ち、これらマウス腹腔
内にブリスタン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ、　２．　Ｇ、　１
０．１４ｔａｔｒａｍａｔｈｙｌ　ｐｅｎｔａｄｃｃａ
ｎｅ、米国アルドリッチ社製）０．５〜１ｒｄｌを注射
し、その後２〜３遍目に腹腔に５〜１０Ｘ　１Ｏ６個の
ハイブリドーマ細胞ｔ胞を移植する。

通常７〜１０日後に腹水が貯溜し、これを採取する。

本発明のモノクローナル抗体の　　１標識した肺小細胞
癌５ＣＬＣ−３Ａを用いた免疫沈降反応による分子量測
定では、ＮＥ−２５抗原は２５Ｘ　１０３ダルトンを？
し、又、ＰＥ−３５抗原は３５Ｘ１０３ダルトンを呈し
た。

免疫沈降反応： 標的細胞として肺小細胞癌培養株５ＣＬＣ−３Ａ　２ｘ
１０７個を２００．ｑのアイオドグン存在下で０．５１
１＋ＣｉのＮａ１２５ＩテｅＡｇ１する。

これら標識した１ＩＩＩ１１をｏ、　１〜１％（ｖ／ｖ
）ＭＰ−４０を用いて可溶化し、その細胞抽出物（１〜
１０Ｘ１０５Ｃ１）ＩＩ）をモノクローナル抗体（１〜
１０Ｉｄ）と４℃にて６〜１２時間反応させ、第２次抗
体として５〜２０ｐの家兎抗マウスイムノグロブリン（
Ｃ８９９６１社、米国）と４℃で３００分間反応せ、さ
らに４℃で１時間スタフィロコッカス・アウレウス（Ｃ
ｏｗａｎ　１株）と反応させ免疫沈降物を作製し、５Ｏ
８−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動により解析する
。

本発明モノクローナル抗体の生物学的活性は実施例に示
した。実施例中に用いたマウス混合血球吸着試験［Ｍｏ
ｕｓｅ−ｍｉｘｅｄ　ｔｌｅｏｌａｄｓＯｒｐｔｉｏｎ
　ａｓｓａｙ、　Ｍ−ＭＨＡＩ法は下記の方法に従い、
マイクロプレート［Ｆａｌｃｏｎ社、３０４０　］に単
ＷＪＩＩ胞培養または浮遊細胞を付着させた標的細胞へ
の指示細胞の付着の有無で観察する。指示細胞としては
・ヒツジ赤血球とマウス抗ヒツジ赤血球抗体を反応させ
た後、さらに家兎抗マウスイムノグロブリン血清を反応
させたものを用いる。

マウス混合血球吸着試験ＣＭ−ＭＨ／Ｍ　：Ｍ−ＭＨＡ
はＥｓｐｍａｒｋとＦａｇｒｅｕｓの皿洗（八ｃｔａ。

ＰａｔｈＯｌ、旧ｃｒｏｂｉｏ１．５ｃａｎｄ、５ｕｐ
ｐ１．１５４　２５Ｂ−２６２゜１９６２）を改良して
行う。

指示赤血球の作製法は以下の通りである。

洗滌羊赤血球２ｘ浮遊液と等辺の１０００倍希釈マウス
抗羊赤血球抗体（ＢＡＬＢ／ｃマウスに羊赤血球を過免
疫して作製）とを２４℃にて４５分聞反応させ洗滌後再
び２ｘ浮遊液として等位の２００倍希釈家兎抗マウスイ
ムノグロブリン（ｃａｐｐｅ１社、米国）を２４℃にて
４５分間反応させた後、２回洗Ｗｉ後再び２％浮遊液と
したものをいわゆるＭ−Ｍｌ−ＩＡの指示赤血球として
用いる。

Ｍ　−Ｍ　ｌ−Ｉ　Ａ検査法の手法としては、被検索細
胞は、ハイブリドーマ細胞培養上清またはハイプリドー
マ細胞接種ＢＡＬＢ／ｃマウスもしくはＢＡＬＢ／ｃ由
来ヌードマウス腹水と２４℃にて４５分間反応させ、抗
体を洗滌除去後、０．２％指示羊赤血球と２４℃にて４
５分間反応させ、軽く一度リン酸緩衝液生理食塩水（Ｐ
ＢＳ）で洗滌後光学的顕微鏡下、指示赤血球のロゼツト
形成の有無にて判定する。

又、実施例中、本発明のモノクローナル抗体選定のため
の各種組織の染色及び本発明のモノクローナル抗体によ
る各種組織の染色は、Ｈｓｕ、Ｓ、Ｈ，等の方法（Ｊ、
　Ｉｆ　ｉ　ｓｔｏ、ｃｈｅ＋＋＋、　Ｃｙｔｏｃｈｅ
ｍ、　２９．５７７〜５８０．１９８１　）に準じてア
ビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体法（ＡＢＣ
法）によるアセトン固定、凍結切片の染色により行なっ
た。即ち肺癌組織等の凍結切片を１０％正常豚血清を含
むＰＢＳにて３０分間処理した後、抗体を含む溶液と室
温で２時間反応させ、更に４℃で一夜反応させた。そし
てＰＢＳで１５分間洗滌した後、ビオチン化抗マウス免
疫グロブリン（７，５埒／ｄ）にて３０分間処理した。

これをＰＢＳで１５分間洗滌した後、アビジンＤ１１−
ビオチン化ペルオキシダーゼ複合体と室温で３０分間処
理した。これをＰＢＳで１５分間洗滌した後ジアミノベ
ンヂジン溶液（５０ｑジアミノベンチジン、０．００６
％Ｈ２０２−トリスバッフｙ−ｐｉｆ　７．６）にて５
〜１０分間反応させた。細胞核をヘマトキシリンにて染
色後、通常の方法で封入し検鏡した。

（実施例） 実施例　１ （Ｐ　Ｅ　−３５抗体の！１Ｍ造） ８選令のｊｌ　ＢＡＬＢ／Ｃマウスを初回５×１０６個
の師事細胞癌培養株（師事［ｌ胞癌培養株ｌｌｌ胞５Ｃ
ＬＣ−８Ａと５ＣＬＣ−３８を１：１に混合した細胞集
団）で皮下に免疫し、その１ケ月後より２遍間の間隔で
２回腹腔内に各々ｌＸｌ０’個の細胞を注入し免疫を行
つた。なお、師事細胞癌培養株５ＣＬＣ−３Ａ及び５Ｃ
ＬＣ−３Ｈはいずれも愛知県がんセンターで樹立した株
である。

最終免疫より３日後に牌臓を取り出し、ステンレスメツ
シュを通すことによりａｍ懸濁液を作製した。この１．
ＯＸ　１００個の牌細胞と２．０Ｘ　１０７個の８−ア
ザグアニン耐性ミエローマ細胞Ｐ３−　Ｎ５Ｉ−Ａｏ４
／１（１４３／１）を混合し、遠沈後沈渣に１−の４７
．５％ポリエチレングリコール（平均分子ｆｆ１４００
Ｇ）を加え、２分間ゆるやかに撹拌した。洗ｒｐ１、細
胞混合液を１０％牛脂児血清を含むＲＰＨＩ培地（完全
ＲＰＨＩ培地）に懸濁し、９Ｇウエルマイクロ培養プレ
ートに１ウェル当り１０６個の割合で０．１ｄずつ分注
した。２４時間後、ヒボキサンチン１００μＨ１アミノ
プテリン０．４μＨ１チミジン１６μＨを含む完全ＲＰ
旧培地（１１＾■培地）を０．１ｄ加えた。

培養開始後週２回培養上清０．１ｓｅを捨て、ＨＡＴ培
地０．１−を加えた。１４日後よりウェルに融合細胞の
出現が観察されはじめた。

その後各ウェルの培養上清を取り出し、前述のＭ−ＭＨ
Ａ法により師事ｍ胞癌と反応する抗体が産生されている
か否かを確かめ、抗体産生が陽性を示したウェル中のハ
イプリドーマを限Ｗ希釈法により３回クローニングを繰
り返した。即ち、ｗＡ胞を５０個／ｄあるいは１０個／
Ｍ１に希釈し、あらかじめフィダー細胞がまかれた９６
ウエルマイクロ培養プレートにＯ，ｌａｅずつ分注し、
ＨＴ培地（１００μＨヒボキサンチンと１６μＨチミジ
ンを含む完全ＲＰ旧培地）により２週間培養した。１ウ
エルに１個のパイプリドーマコロニーが形成された場合
をクローンとして取り出した。これらクローンから、前
述のＭ　−Ｍ　ＨＡ法及びＡＢＣ法により、前記ＰＥ−
３５抗体の欄に示した各細胞及び組織に対する反応性を
有する抗体を分泌しているハイプリド−マクローンを選
択した。このようにして得られたハイブリドーマの産生
ずる抗体をＰＥ−３５抗体と命名した。

このハイブリドーマをマウスの腹腔内に投与する次の方
法で増殖させＰＥ−３５抗体を３産した。

即ち、マウス腹腔内にブリスタン０．５ｄ注射し、その
後２週日の腹腔に５×１０６個のハイブリドーマ細胞を
移植し、１０日後に腹水を採取した。

実施例　２ （ＮＥ−２５抗体の製造） ８迎合の雌ＢＡＬＢ／Ｃマウスに手術材料より得られた
神経芽細胞腫細胞（１１１３４）　　５Ｘ　１０６個を
皮下に注入し、１ケ月後より２週間の間隔で２回腹腔内
に各々１ｘ　１００個の細胞を注入し免疫を行った。

最終免疫より３日後に牌臓を取り出し、ステンレスメツ
シュを通すことにより細胞懸濁液を作製した。この５×
１０　　個の牌細胞とｌＸ１Ｇ７個のＭＳ／１を混合し
、実施例１と同様にして細胞融合、クローン化を行ない
、前述のＭ−ＭＨＡ法及びＡＢＣ法により、前記ＮＥ−
２５抗体の欄に示した各細胞及び組織に対する反応性を
有する抗体を分泌しているハイブリドーマクローンを選
択した。このようにして得られたハイブリドーマの産生
ずる抗体をＮＥ−２５抗体と命名した。このハイブリド
ーマを実施例１と同様にして培養し、抗体をは産した。

実施例　３ ８癌及び正常組織又は細胞とＮＥ−２５抗体、ＰＥ−３
５抗体との反応を調べるために、前記Ｍ−ＭＨＡ法及び
ＡＢＣ法により試験を行った。結果を表１、表２及び表
３に示した。

表１　８Ｅ−２５抗体、ＰＥ−３５抗体の各種培養細胞
株に対する反応性（Ｈ−ＨＩＩＡ法による）表２　　Ｈ
Ｅ−２５抗体、ＰＥ−３５抗体の各種腫瘍組織に対する
反応性（ＡＢＣ法による） 表３　　ＮＥ−２５抗体、ＰＥ−３５抗体の正常！１織
又は細胞に対する反応性（ＡＢＣ法による） ａ）タルヂッキイ細胞のみ陽性 ｂ）皮質およびｆｆ１ｌｌｉ質が陽性 Ｃ）ランゲルハンス島のみ陽性 ｄ）ハラサル小体および髄質胸腺上皮が陽性ｅ）血球凝
集法による ｆ）Ｍ−ＭＨＡ法による 実施例　４ 本発明のモノクローナル抗体のイムノグロブリンのアイ
ソタイプを知るため、本発明のモノクローナル抗体を寒
天ゲル内で、マウス■９の各アイソタイプ（Ｉｏへ、Ｉ
ＯＮ、Ｉ（ＩＧｌ、Ｉｔ３Ｇ２．、Ｉ（ＩＧ２ｂ、Ｉ（
ＩＯ２）に対するウサギ抗血清に対して沈隣反応を行な
った。

その結果、本発明のモノクローナル抗体ＮＥ−２５及び
Ｐ　Ｅ　−３５はいずれもＩ（ＪＧｌと判明した。

実施例　５ 実施例１で用いた肺小細胞癌治療株に対する反応性をＭ
−ＭＨＡ法により検討したところＮＥ−２５抗体及びＰ
　Ｅ　−３５抗体の反応性は、いずれの場合も、ヌラミ
ニダーゼ（ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ）で処理したも
のでは変化がなく、又、１００℃、５分処理により文応
性が失活した。

以上の結果よりＮＥ−２５抗体及びＰＥ−３５抗体はい
ずれもタンパク質抗原を認識する抗体であることがわか
る。

実施例　６ 前記の免疫゛沈降反応によりＮＥ−２５抗原とＰＥｏ−
３５抗原の分子岱を測定した所、ＮＥ−２５抗原は２５
×１０３ダルトンを呈し、又、Ｐ　Ｅ　−３５抗原は３
５×１０３ダルトンを呈した。

（発明の効果） 本発明のモノクローナル抗体は肺癌の小細胞癌と非小細
胞癌の免疫組織学的鑑別に特に有用である。又、肺小細
胞癌治療への応用可能な抗体である。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒト肺小細胞癌に存在する２５×１０＾３ダルト
   ンの分子量のタンパク質抗原と抗原抗体反応をし、次の
   性質を有するＩｇＧ＿１アイソタイプに属するモノクロ
   ーナル抗体ＮＥ−２５。 １、ヒトの肺小細胞癌、神経膠腫及び神経芽細胞腫と反
   応する。 ２、ヒトの神経、甲状腺及び副腎の正常組織と反応する
   。 ３、ヒトの肺、食道、胃、小腸、大腸、腎臓の正常組織
   と反応しない。
2. （２）ヒトの正常上皮細胞及び上皮由来癌細胞に存在す
   る３５×１０＾３ダルトンの分子量のタンパク質抗原と
   抗原抗体反応をし、次の性質を有するＩｇＧ＿１アイソ
   タイプに属するモノクローナル抗体ＰＥ−３５。 １、ヒトの肺癌、胃癌、大腸癌、乳癌、肝胆道癌と反応
   する。 ２、ヒトの神経膠腫、神経芽細胞腫、肉腫、リンパ腫と
   反応しない。 ３、ヒトの肺、甲状腺、食道、胃、小腸、大腸の正常上
   皮組織と反応する。