JPS60243026A - モノクロ−ナル抗体 - Google Patents
モノクロ−ナル抗体Info
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- JPS60243026A JPS60243026A JP59097549A JP9754984A JPS60243026A JP S60243026 A JPS60243026 A JP S60243026A JP 59097549 A JP59097549 A JP 59097549A JP 9754984 A JP9754984 A JP 9754984A JP S60243026 A JPS60243026 A JP S60243026A
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- Japan
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- human
- cancer
- monoclonal antibody
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、
［分子量１００万以上（ゲル濾過法）の糖蛋白質抗原と
反応し、認識する抗原決定基は末端にシアル酸が存在す
る糖鎖である１次の性質を有するＩｆＭのクラスに属す
るモノクローナル抗体。
反応し、認識する抗原決定基は末端にシアル酸が存在す
る糖鎖である１次の性質を有するＩｆＭのクラスに属す
るモノクローナル抗体。
（１） ヒト胃癌、ヒト大腸癌、ヒト膵癌、ヒト乳癌、
ヒト肺癌、ヒト胆管癌、ヒト子宮癌、ヒト食道癌と反応
する。
ヒト肺癌、ヒト胆管癌、ヒト子宮癌、ヒト食道癌と反応
する。
（２） 正常のヒト顎下腺、ヒト近位尿細管上皮、ヒト
気管支線、ヒト扁平上皮角化層、ヒト膵う成鳥（ヒト膵
うンゲルハンス氏島）％ヒト肝細胞膜、ヒト十二指腸腺
と反応する。
気管支線、ヒト扁平上皮角化層、ヒト膵う成鳥（ヒト膵
うンゲルハンス氏島）％ヒト肝細胞膜、ヒト十二指腸腺
と反応する。
（３） ヒトの腸上皮化生胃粘膜と反応する。
（４） 正常のヒト前立腺、ヒト胆管上皮、ヒト膵管上
皮とは反応しない。」 に関するものである。
皮とは反応しない。」 に関するものである。
細胞融合法を用いたモノクローナル抗体の作製が確立さ
れつつある現在、多くの研究者の手によって、癌の診断
、治療に役立つ癌関連抗原を認識する新しい抗体の作製
が試みられている。
れつつある現在、多くの研究者の手によって、癌の診断
、治療に役立つ癌関連抗原を認識する新しい抗体の作製
が試みられている。
本発明者らは、モノクローナル抗体について種種検討の
結果、ヒト胃癌を含む多種の癌と高率に反応するモノク
ローナル抗体を見出し７本発明を完成した。
結果、ヒト胃癌を含む多種の癌と高率に反応するモノク
ローナル抗体を見出し７本発明を完成した。
なお、以下の説明において述べる細胞、組織等は特にこ
とわりのない限り全て人の細胞、組織等である。
とわりのない限り全て人の細胞、組織等である。
現在までに報告された多くのモノクローナル抗体の中で
も、コブロフスキーらが開発したモノクローナル抗体Ｃ
Ａ１９−９は、癌の血清診断に実用化されつつある。こ
のモノクローナル抗体ＣＡ１９−９の認識する抗原決定
基は、 ５ｉａｌｙｌａｔｅｄ −Ｌθｗｉｓ である
ことも報告されている。本発明のモノクローナル抗体が
認識する抗原決定基も末端にシアル酸残基を持つ糖鎖で
ある。しかし、同一検体を、両者で免疫染色し比較する
と、ちるものは本発明の抗体と強く反応し、ＣＡ１９−
９とは反応せず、またある検体はその逆であった。そし
て、ヒト正常組織における両抗体の反応性を比較した所
１本発明のモノクローナル抗体は、肝細胞膜、腎の近位
尿細管上皮、膵う成馬細胞、扁平上皮角化層と反応した
が、ＣＡｊ９−９はこれらと反応しなかった。又、ＣＡ
１９−９は前立腺、胆管上皮、膵管上皮と反応したが、
本発明のモノクローナル抗体は反応しなかった。従って
両者は異なる抗原決定基を認識している。
も、コブロフスキーらが開発したモノクローナル抗体Ｃ
Ａ１９−９は、癌の血清診断に実用化されつつある。こ
のモノクローナル抗体ＣＡ１９−９の認識する抗原決定
基は、 ５ｉａｌｙｌａｔｅｄ −Ｌθｗｉｓ である
ことも報告されている。本発明のモノクローナル抗体が
認識する抗原決定基も末端にシアル酸残基を持つ糖鎖で
ある。しかし、同一検体を、両者で免疫染色し比較する
と、ちるものは本発明の抗体と強く反応し、ＣＡ１９−
９とは反応せず、またある検体はその逆であった。そし
て、ヒト正常組織における両抗体の反応性を比較した所
１本発明のモノクローナル抗体は、肝細胞膜、腎の近位
尿細管上皮、膵う成馬細胞、扁平上皮角化層と反応した
が、ＣＡｊ９−９はこれらと反応しなかった。又、ＣＡ
１９−９は前立腺、胆管上皮、膵管上皮と反応したが、
本発明のモノクローナル抗体は反応しなかった。従って
両者は異なる抗原決定基を認識している。
本発明のモノクローナル抗体は、後述する実施例に示す
ように胃癌、大腸癌、膵癌、乳癌、肺癌、胆管癌、子宮
癌１食道癌に反応する。
ように胃癌、大腸癌、膵癌、乳癌、肺癌、胆管癌、子宮
癌１食道癌に反応する。
本発明のモノクローナル抗体は、正常の顎下腺、近位尿
細管上皮、気管支線、扁平上皮角化層、膵う成馬、肝細
胞膜、十二指腸線と反応する。
細管上皮、気管支線、扁平上皮角化層、膵う成馬、肝細
胞膜、十二指腸線と反応する。
本発明のモノクローナル抗体は腸上皮化生冑粘膜と反応
する。
する。
本発明のモノクローナル抗体は正常の前立腺、胆管上皮
、膵管上皮とは反応しない。
、膵管上皮とは反応しない。
胃癌組織をシアル酸分解酵素であるニューラミニダーゼ
で処理したところ、該胃癌組織に対する本発明のモノク
ローナル抗体の反応性は消失した。
で処理したところ、該胃癌組織に対する本発明のモノク
ローナル抗体の反応性は消失した。
このことは１本発明のモノクローナル抗体の認識する抗
原部位（抗原決定基）にシア尤酸が存在することを示し
ている。
原部位（抗原決定基）にシア尤酸が存在することを示し
ている。
又、胃癌組織を過沃素酸で処理したところ、該胃癌組織
に対する本発明のモノクローナル抗体の反応性が消失し
た。このことは１本発明のモノクローナル抗体の認識す
る抗原部位（抗原決定基）は糖鎖であることを示してい
る。
に対する本発明のモノクローナル抗体の反応性が消失し
た。このことは１本発明のモノクローナル抗体の認識す
る抗原部位（抗原決定基）は糖鎖であることを示してい
る。
本発明のモノクローナル抗体が反応する抗原の分子量は
１００万以上（ゲル濾過法）である。
１００万以上（ゲル濾過法）である。
又、本発明のモノクローナル抗体が反応する抗原はグル
コースアミンをとりこむ能力を有し、従ってこの抗原は
糖蛋白質である。
コースアミンをとりこむ能力を有し、従ってこの抗原は
糖蛋白質である。
即ち１本発明のモノクローナル抗体が反応する抗原は分
子量１００万以上（ゲル濾過法）の糖蛋−白質であり、
本発明のモノクローナル抗体が認識する抗原決定基は末
端にシアル酸が存在する糖鎖である。
子量１００万以上（ゲル濾過法）の糖蛋−白質であり、
本発明のモノクローナル抗体が認識する抗原決定基は末
端にシアル酸が存在する糖鎖である。
本発明のモノクローナル抗体はＩｒＭクラスに属するも
ので、そのＬ鎖はに鎖である。
ので、そのＬ鎖はに鎖である。
本発明のモノクローナル抗体と反応する抗原は、癌組織
中のみならず、胃癌患者、大腸癌患者及び膵癌患者の血
清中にも多量に存在する場合が多い。
中のみならず、胃癌患者、大腸癌患者及び膵癌患者の血
清中にも多量に存在する場合が多い。
本発明のモノクローナル抗体は例えば次のようにして製
造することができる。即ち、本発明のモノクローナル抗
体が認識する抗原（抗原を単離して用いてもよいが、該
抗原を含む癌細胞又はそのホモジネート等を用いてもよ
い。）でマウス又はラット等の動物を免疫し、免疫され
た動物から抗体産生細胞を得、これと骨髄腫細胞を融合
し、得られた融合細胞をクローン化し１本発明のモノク
ローナル抗体を産生ずる融合細胞を選択し、これを培養
し抗体を回収する。免疫法、融合法、融合細胞の選択等
は通常の方法によって行うことが出来る。
造することができる。即ち、本発明のモノクローナル抗
体が認識する抗原（抗原を単離して用いてもよいが、該
抗原を含む癌細胞又はそのホモジネート等を用いてもよ
い。）でマウス又はラット等の動物を免疫し、免疫され
た動物から抗体産生細胞を得、これと骨髄腫細胞を融合
し、得られた融合細胞をクローン化し１本発明のモノク
ローナル抗体を産生ずる融合細胞を選択し、これを培養
し抗体を回収する。免疫法、融合法、融合細胞の選択等
は通常の方法によって行うことが出来る。
更に詳しくは、例えば次のようにして本発明のモノクロ
ーナル抗体を製造することが出来る。
ーナル抗体を製造することが出来る。
先ず、マウスを胃癌細胞等の癌細胞等で免疫する。免疫
する動物はマウスに限らずラット等のネズミ科の動物又
はその他の動物を使用してもよいが１通常はマウスを用
いるのが好ましい。又、癌細胞の代りにそのホモジネー
ト又は単離された抗原を用いてもよい。例えばＢＡＬＢ
／Ｃマウスに癌細胞又はそのホモジネート又は単離され
た抗原を数日〜数週間おきに数回接種する。接種量は１
匹あたり１回につき１０５〜１０８個の細胞を使うのが
好ましい。その後マウスより＃［を摘出し遠心分離によ
り抗体産生細胞を得る。この細胞は増殖していく能力を
持たないので、自己増殖能力を有する細胞と融合させる
。自己増殖能力を有する細胞としては骨髄腫細胞が特に
好ましい。骨髄腫細胞としては、同種の動物のものを用
いるのが好ましい。又、骨髄腫細胞としては、抗体を産
生しないものを選択するのが好ましい。抗体産生細胞と
骨髄腫細胞をポリエチレングリコール等の細胞融合剤と
混合し細胞融合を行なう。抗体産生細胞と骨髄腫細胞の
使用割合は、細胞数比で２：１〜１０；１とするのが好
ましい。得られた融合細胞は限界希釈法により分離し１
分離した融合細胞は増殖させたのち、各穴（ウェル）に
おいて産生される抗体は公知の方法例えば螢光抗体法又
は酵素抗体法等により、各種細胞組織等と反応させ、そ
の結果から所望の抗体を産生ずる・・イブリドーマを選
択する。選択したハイプリドーマを培養器中で培養し上
清液から抗体を得ることも出来るが、生体内例えば（ヌ
ード）マウス腹腔内にハイプリドーマを注入し、（ヌー
ド）マウス体内で腫瘍として生育させ、（ヌード）マウ
ス血清あるいは腹水から抗体を回収する方法によること
も出来る。
する動物はマウスに限らずラット等のネズミ科の動物又
はその他の動物を使用してもよいが１通常はマウスを用
いるのが好ましい。又、癌細胞の代りにそのホモジネー
ト又は単離された抗原を用いてもよい。例えばＢＡＬＢ
／Ｃマウスに癌細胞又はそのホモジネート又は単離され
た抗原を数日〜数週間おきに数回接種する。接種量は１
匹あたり１回につき１０５〜１０８個の細胞を使うのが
好ましい。その後マウスより＃［を摘出し遠心分離によ
り抗体産生細胞を得る。この細胞は増殖していく能力を
持たないので、自己増殖能力を有する細胞と融合させる
。自己増殖能力を有する細胞としては骨髄腫細胞が特に
好ましい。骨髄腫細胞としては、同種の動物のものを用
いるのが好ましい。又、骨髄腫細胞としては、抗体を産
生しないものを選択するのが好ましい。抗体産生細胞と
骨髄腫細胞をポリエチレングリコール等の細胞融合剤と
混合し細胞融合を行なう。抗体産生細胞と骨髄腫細胞の
使用割合は、細胞数比で２：１〜１０；１とするのが好
ましい。得られた融合細胞は限界希釈法により分離し１
分離した融合細胞は増殖させたのち、各穴（ウェル）に
おいて産生される抗体は公知の方法例えば螢光抗体法又
は酵素抗体法等により、各種細胞組織等と反応させ、そ
の結果から所望の抗体を産生ずる・・イブリドーマを選
択する。選択したハイプリドーマを培養器中で培養し上
清液から抗体を得ることも出来るが、生体内例えば（ヌ
ード）マウス腹腔内にハイプリドーマを注入し、（ヌー
ド）マウス体内で腫瘍として生育させ、（ヌード）マウ
ス血清あるいは腹水から抗体を回収する方法によること
も出来る。
本発明のモノクローナル抗体を作るだめに免疫原として
使用する細胞としては胃癌細胞等の癌細胞等が使用出来
るが、これら癌細胞等は特定の株のものに限定されない
。
使用する細胞としては胃癌細胞等の癌細胞等が使用出来
るが、これら癌細胞等は特定の株のものに限定されない
。
本発明のモノクローナル抗体を作るために用いる抗体産
生細胞はＢ細胞であ＃）、 ゛ｈ：Ｂ細胞は体内を循環
するが牌）藏等に蓄積するの七層成を摘出して使用する
のが好ましいが、必ずしも層成でなくてもよく、Ｂ細胞
が多く存在する部分を使用すればよい。
生細胞はＢ細胞であ＃）、 ゛ｈ：Ｂ細胞は体内を循環
するが牌）藏等に蓄積するの七層成を摘出して使用する
のが好ましいが、必ずしも層成でなくてもよく、Ｂ細胞
が多く存在する部分を使用すればよい。
又１本発明のモノクローナル抗体は上記の方法以外に、
次のようにして製造することも出来る。
次のようにして製造することも出来る。
即ち、本発明のモノクローナル抗体と反応する抗原を含
む癌組織例えば胃癌組織を胸腺欠損マウス例えばＢ Ａ
Ｌ Ｂ ／ Ｃｎｕ／ｎｕヌードマウスの皮下に移植
する。移植する癌組織としては１例えば２〜３問角の癌
組織を数個用いる。癌組織を移植した後１〜１゜５ケ月
後に腫瘍最大径が１ｃｍ位に成長した所で、胸腺を持つ
マウス例えばＢＡＬＢ／Ｃｎｕ／＋ヌードマウスの層成
に含まれるリンパ球（Ｔ細胞とＢ細胞）を前述の担癌マ
ウス（約１ｃｒｎ径の１顕瘍を持った胸腺欠損マウス）
の腹腔内に投与する。投与量はマウス１匹分の層成に含
まれるリン牌臓（抗体産生細胞）を摘出し、これを骨髄
腫細胞と融合する。融合の方法及びその後の融合細胞の
選択１選択した融合細胞の培養及び本発明の七ツクロー
ナル抗体の回収法は前記の方法と全く同様にして行なう
ことが出来る。
む癌組織例えば胃癌組織を胸腺欠損マウス例えばＢ Ａ
Ｌ Ｂ ／ Ｃｎｕ／ｎｕヌードマウスの皮下に移植
する。移植する癌組織としては１例えば２〜３問角の癌
組織を数個用いる。癌組織を移植した後１〜１゜５ケ月
後に腫瘍最大径が１ｃｍ位に成長した所で、胸腺を持つ
マウス例えばＢＡＬＢ／Ｃｎｕ／＋ヌードマウスの層成
に含まれるリンパ球（Ｔ細胞とＢ細胞）を前述の担癌マ
ウス（約１ｃｒｎ径の１顕瘍を持った胸腺欠損マウス）
の腹腔内に投与する。投与量はマウス１匹分の層成に含
まれるリン牌臓（抗体産生細胞）を摘出し、これを骨髄
腫細胞と融合する。融合の方法及びその後の融合細胞の
選択１選択した融合細胞の培養及び本発明の七ツクロー
ナル抗体の回収法は前記の方法と全く同様にして行なう
ことが出来る。
本発明のモノクローナル抗体が反応する抗原は癌患者の
血清中にも多く出現するので１本発明のモノクローナル
抗体は、癌患者の血清診断に用いることが出来る。特に
本発明のモノクローナル抗体の認識する抗原が血清中に
多量に出現した患者の場合、治療効果や再発予知に使用
することが出来る。又、放射性同位元素を本発明のモノ
クローナル抗体に付加することにより釉の局在診断に用
いたり、あるいは、抗癌剤と本発明のモノクローナル抗
体を組合わせることによりミサイル療法に用いることが
出来る。更に１組織学的に癌と区別し難い病変に本発明
のモノクローナル抗体を用いることで、鑑別可能となり
得る。
血清中にも多く出現するので１本発明のモノクローナル
抗体は、癌患者の血清診断に用いることが出来る。特に
本発明のモノクローナル抗体の認識する抗原が血清中に
多量に出現した患者の場合、治療効果や再発予知に使用
することが出来る。又、放射性同位元素を本発明のモノ
クローナル抗体に付加することにより釉の局在診断に用
いたり、あるいは、抗癌剤と本発明のモノクローナル抗
体を組合わせることによりミサイル療法に用いることが
出来る。更に１組織学的に癌と区別し難い病変に本発明
のモノクローナル抗体を用いることで、鑑別可能となり
得る。
実施例１
（１） モノクローナル抗体の製造
ヒト胃低分化型腺癌のヌードマウス移植株（ｓｔ−４）
を２〜５闘に細切しＢ Ａ Ｌ Ｂ ／ Ｃｎｕ／ｎ
ｕ（胸腺欠損ヌードマウス）の皮下に移植し、約１ケ月
半後、腫瘍最大径が１０闘となった。一方。
を２〜５闘に細切しＢ Ａ Ｌ Ｂ ／ Ｃｎｕ／ｎ
ｕ（胸腺欠損ヌードマウス）の皮下に移植し、約１ケ月
半後、腫瘍最大径が１０闘となった。一方。
Ｂ Ａ Ｌ Ｂ ／ Ｃｎｕ／＋ヌードマウスの１匹の
牌１１＠を細切後、ステンレスメツンユを通し生理食塩
水０．５ｄを用い細胞浮遊液としこれを前述のＢ Ａ
Ｌ Ｂ ／ Ｃｎｕ／ｎｕ担癌マウス（約１ｏｉｍのａ
瘍を持ったＢ Ａ Ｌ Ｂ ／ Ｃｎｕ／ｎｕ ）の腹
腔内に投与した。
牌１１＠を細切後、ステンレスメツンユを通し生理食塩
水０．５ｄを用い細胞浮遊液としこれを前述のＢ Ａ
Ｌ Ｂ ／ Ｃｎｕ／ｎｕ担癌マウス（約１ｏｉｍのａ
瘍を持ったＢ Ａ Ｌ Ｂ ／ Ｃｎｕ／ｎｕ ）の腹
腔内に投与した。
投与後１ｔ月で腫瘍は消失した。そこで５ｔ−４のホモ
ジエネート０．−２ ｔｙｌ ｔ−Ｂ Ａ ’Ｌ Ｂ
／ Ｃ、ｎｌｌ／ｎｕ ノ腹腔に投与した。
ジエネート０．−２ ｔｙｌ ｔ−Ｂ Ａ ’Ｌ Ｂ
／ Ｃ、ｎｌｌ／ｎｕ ノ腹腔に投与した。
その３日後にマウスから！Ｉ＃：を摘出した。
細胞融合の方法は、渡辺等の方法（免疫実験操作法■、
２９６５〜２９６７．１９７８）に準じて行なった。
２９６５〜２９６７．１９７８）に準じて行なった。
即ち、摘出した層成を細切したのち、ステンレスメソシ
ュを通し、１５００ｒｐｍ、２００Ｇで遠沈して得た沈
渣に５０ｄの０．７％ＮＨ４Ｃｌを加え赤血球を除き、
ＲＰＭニー１６４０で２回洗浄して得た牌細胞１Ｘ１０
個に、マウス骨髄腫細胞（Ｐ５−１６！ｒ−Ａｇ８−
Ｕｌ）（以下Ｐ３（Ｔ１という）をＲＰＭニー１６４０
で２回洗浄して得た２５Ｕｊ ２Ｘ１０７個 （５７１
）を混合し。
ュを通し、１５００ｒｐｍ、２００Ｇで遠沈して得た沈
渣に５０ｄの０．７％ＮＨ４Ｃｌを加え赤血球を除き、
ＲＰＭニー１６４０で２回洗浄して得た牌細胞１Ｘ１０
個に、マウス骨髄腫細胞（Ｐ５−１６！ｒ−Ａｇ８−
Ｕｌ）（以下Ｐ３（Ｔ１という）をＲＰＭニー１６４０
で２回洗浄して得た２５Ｕｊ ２Ｘ１０７個 （５７１
）を混合し。
２０ＧＯｒｐｍ、２００Ｇで１０分間遠沈した。沈殿細
胞をよくときほぐした後、４５％（’Ｗ／Ｖ）のポリエ
チレングリコール４ｏｏｏ（メルク社）を含有した３７
℃、ｐＨ７，４のＲＰＭニー１６４０゜１ｄを加え８分
間処理した。
胞をよくときほぐした後、４５％（’Ｗ／Ｖ）のポリエ
チレングリコール４ｏｏｏ（メルク社）を含有した３７
℃、ｐＨ７，４のＲＰＭニー１６４０゜１ｄを加え８分
間処理した。
反応１分後からＲＰＭ工１６４０を徐々に加え総量４０
ｄとして細胞融合を終了した。１１０００ｒｐ、１００
Ｇで遠沈後１０％牛脂児血清を含んだＲＰＭニー１６４
０ ４’Ｏｄを加えて細胞浮遊液を作抄３７℃、５チＣ
０２充填培養器中で培養した。２４時間後、ＨＡＴ培地
（ヒボキサンチン。
ｄとして細胞融合を終了した。１１０００ｒｐ、１００
Ｇで遠沈後１０％牛脂児血清を含んだＲＰＭニー１６４
０ ４’Ｏｄを加えて細胞浮遊液を作抄３７℃、５チＣ
０２充填培養器中で培養した。２４時間後、ＨＡＴ培地
（ヒボキサンチン。
アミノプテリン、チミジン１０チ牛脂児血清）に入れ換
え、Ｃｏｓｔａｒｍｉｃｒｏ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａ
ｔｅ Ｋ 。
え、Ｃｏｓｔａｒｍｉｃｒｏ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａ
ｔｅ Ｋ 。
１ウエルあだり０．２ｄずつ分注培養した。１０日目上
上清を取り出し、胃癌組織のホルマリン固定。
上清を取り出し、胃癌組織のホルマリン固定。
パラフィン切片を酵素抗体法で染色することにより抗体
産生の有無を確かめ、抗体産生が陽性を示したウェル中
のハイプリドーマを１ウエルあだり０．６個となるよう
限界希釈法によりクローニングを行なった。培地は最初
ＨＴ（ヒボキサンチン。
産生の有無を確かめ、抗体産生が陽性を示したウェル中
のハイプリドーマを１ウエルあだり０．６個となるよう
限界希釈法によりクローニングを行なった。培地は最初
ＨＴ（ヒボキサンチン。
テミジ／、１０％牛脂児血清）を用い、ｆｅｅｄｅ ｒ
ｌａｙｅｒとしてＢ Ａ Ｌ Ｂ ／ Ｃｎｕ７４−
ｒウスの胸腺細胞５ Ｘ １０５／ウエルを加えた。次
に１０％牛脂児血清を加えたＲＰＭニー１６４０培地に
置換した。
ｌａｙｅｒとしてＢ Ａ Ｌ Ｂ ／ Ｃｎｕ７４−
ｒウスの胸腺細胞５ Ｘ １０５／ウエルを加えた。次
に１０％牛脂児血清を加えたＲＰＭニー１６４０培地に
置換した。
限界希釈法によるりｐ−ニングは２回行った。
又、大量培養には１ウエルの−・イブリドーマを５ウエ
ル、２４つｘ ／ｌ／ （Ｆａｌｃｏｎ ３００ Ｂ
）と増量しながら、最終的にはＦａｌｃｏｎ ｔｉｓｓ
ｕｅ ｃｕｌ七ｕｒｅ ｆｌ−ａｅｋ培養で得た上清に
Ｎ ａＮ ３を０．１％加え４℃にて保存した。
ル、２４つｘ ／ｌ／ （Ｆａｌｃｏｎ ３００ Ｂ
）と増量しながら、最終的にはＦａｌｃｏｎ ｔｉｓｓ
ｕｅ ｃｕｌ七ｕｒｅ ｆｌ−ａｅｋ培養で得た上清に
Ｎ ａＮ ３を０．１％加え４℃にて保存した。
（２） 本発明のモノクローナル抗体の選定及びモノク
ローナル抗体による各種組織の染色。
ローナル抗体による各種組織の染色。
Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、、 ２９．５７７−５８０．１９８
１ ）に準じてアビジ−ビオチン−ペルオキシダーゼ複
合体法によるホルマリン固定、パラフィン切片の染色に
より行なった。即ち、広く一般的に用いられている１０
チホルマリン固定後パラフイン包埋、薄切されたヒト胃
癌組織、他のヒト癌組織及びヒト正常組織を脱パラフイ
ン後％ ０．３％Ｈ２Ｏ２を含むメタノールにて２０分
間処理した。その後リン酸緩衝食塩水（ＦＢ！３ ）で
洗った後、１０％正常豚血清を含むＰＢＳにて３０分間
処理した。
１ ）に準じてアビジ−ビオチン−ペルオキシダーゼ複
合体法によるホルマリン固定、パラフィン切片の染色に
より行なった。即ち、広く一般的に用いられている１０
チホルマリン固定後パラフイン包埋、薄切されたヒト胃
癌組織、他のヒト癌組織及びヒト正常組織を脱パラフイ
ン後％ ０．３％Ｈ２Ｏ２を含むメタノールにて２０分
間処理した。その後リン酸緩衝食塩水（ＦＢ！３ ）で
洗った後、１０％正常豚血清を含むＰＢＳにて３０分間
処理した。
次いで、抗体を含む溶液と室温で２時間反応させ、更に
４℃で一夜反応させた。そしてＰＢＢで１５分間洗った
後、ビオチン化抗マウス免疫グロブリン（７，５Ｐｆｔ
／ｌｄ ）にて３０分間処理した。これをＰＢＥＩで１
５分間洗った後、アビジンＤＨ−ビオチン化ペルオキシ
ダーゼ複合体と室温で３０分間処理した。これをＰＢＥ
Ｉで１５分間洗あた後ジアミノペンチジン溶液（ｓｏｔ
ｖジアミノペンテジン。
４℃で一夜反応させた。そしてＰＢＢで１５分間洗った
後、ビオチン化抗マウス免疫グロブリン（７，５Ｐｆｔ
／ｌｄ ）にて３０分間処理した。これをＰＢＥＩで１
５分間洗った後、アビジンＤＨ−ビオチン化ペルオキシ
ダーゼ複合体と室温で３０分間処理した。これをＰＢＥ
Ｉで１５分間洗あた後ジアミノペンチジン溶液（ｓｏｔ
ｖジアミノペンテジン。
０．００６４ Ｈ２Ｏ２，）リスバッフ７−ｐＨ７゜６
）にて５〜１０分間反応させた。細胞核をヘマトキシリ
ンにて染色後１通常の方法で封入し検鏡した。
）にて５〜１０分間反応させた。細胞核をヘマトキシリ
ンにて染色後１通常の方法で封入し検鏡した。
（３） 結 果
４００ウエル中７８ウエルについて産生抗体の反応性を
調べ、その中から、胃癌、大腸癌、膵癌、乳癌、肺癌、
胆管癌、子宮癌、食道癌と反応し。
調べ、その中から、胃癌、大腸癌、膵癌、乳癌、肺癌、
胆管癌、子宮癌、食道癌と反応し。
又、正常の顎下線、近位尿細管上皮、気管支線、扁平上
皮角化層、膵う成鳥、肝細胞膜、十二指腸腺と反応し、
腸上皮化生胃粘膜とも反応するが。
皮角化層、膵う成鳥、肝細胞膜、十二指腸腺と反応し、
腸上皮化生胃粘膜とも反応するが。
正常の前立腺、胆管上皮、膵管上皮とは反応しないモノ
クローナル抗体を産生ずるハイプリドーマ１株を選択し
た。
クローナル抗体を産生ずるハイプリドーマ１株を選択し
た。
選択したハイブリドーマの産生ずる本発明のモノクロー
ナル抗体を用いて、各種癌組織又は正常組織との反応試
験を上記（２）の方法に従って行った。
ナル抗体を用いて、各種癌組織又は正常組織との反応試
験を上記（２）の方法に従って行った。
（Ａ）表−１に本発明のモノクローナル抗体の各種癌組
織に対する反応性試験結果を示した。
織に対する反応性試験結果を示した。
表−１癌組織との反応性
癌 組 織 陽性例数 陽性例数／すｙｆｈ総数 陽性
率十十ａ） ＋ｂ） （チ） 胃癌 ５５ ２９ ６２／１０２ ６０．７大腸癌 １
７ ９ ２６／２６ １００膵癌 ２１ ７ ２８／２
８ １００ 肺腺癌 １１ ５ １６／１７ ９４．１肺扁平上皮癌
６ Ｂ 、１４／１９ ７３．７肺大細胞癌 ７ ３
１０／１８ ５５．６肺小細胞癌 ０ ４ ４／１９
２１．１乳癌 １５ ７ ２２７２７ ８１．５ａ）
十十 癌細胞の１７３以上が陽性 ｂ）十 癌細胞の１／３未満が陽性 上記のとおり、大戦癌、膵癌では１００％、胃癌６０．
７％、乳癌８１．５％、肺癌では特に腺癌で９４．１％
が本発明のモノクローナル抗体と反応した。腺癌の陽性
例では、しばしば粘液、細胞膜で強く本発明のモノクロ
ーナル抗体と反応した。又、扁平上皮癌の陽性例は、角
質層のみに強く反応を示した。その他胆管癌１例中１例
、子宮癌３例中２例、食道癌１例中１例、胃癌２例中１
例に反応陽性であった。
率十十ａ） ＋ｂ） （チ） 胃癌 ５５ ２９ ６２／１０２ ６０．７大腸癌 １
７ ９ ２６／２６ １００膵癌 ２１ ７ ２８／２
８ １００ 肺腺癌 １１ ５ １６／１７ ９４．１肺扁平上皮癌
６ Ｂ 、１４／１９ ７３．７肺大細胞癌 ７ ３
１０／１８ ５５．６肺小細胞癌 ０ ４ ４／１９
２１．１乳癌 １５ ７ ２２７２７ ８１．５ａ）
十十 癌細胞の１７３以上が陽性 ｂ）十 癌細胞の１／３未満が陽性 上記のとおり、大戦癌、膵癌では１００％、胃癌６０．
７％、乳癌８１．５％、肺癌では特に腺癌で９４．１％
が本発明のモノクローナル抗体と反応した。腺癌の陽性
例では、しばしば粘液、細胞膜で強く本発明のモノクロ
ーナル抗体と反応した。又、扁平上皮癌の陽性例は、角
質層のみに強く反応を示した。その他胆管癌１例中１例
、子宮癌３例中２例、食道癌１例中１例、胃癌２例中１
例に反応陽性であった。
（Ｂ） 表−２に、本発明のモノクローナル抗体の各種
正常組織に対する反応性試験結果を示した。
正常組織に対する反応性試験結果を示した。
表−２正常組織との反応性
正常組織 陽性例数／サンプル例数
顎下腺 ５１５
近位尿細管上皮 ５１５
気管支腺 １０／１０
扁平上皮角化層 １０／１０
膵う成鳥 １０／１゜
肝細胞膜 １０／１０
十二指腸腺 ５１５
正常組織 陽性例数／サンプル例数
前立腺 ０１５
胆管上皮 ０１５
膵管上皮 ０／１０
膵腺房 ０／１０
Ｏ１５
神経組織 ０／１０
平滑筋 ０／１０
横紋筋 ０／１０
脂肪組織 ０／１０
結合組織 ０／１０
血管 ０／１０
リンパ節 ０／１０
胃正常粘膜 ０７１０
大腸粘膜 ０／１０
小腸粘膜 ０／１０
牌臓 ０１５
甲状、腺 ０１５
乳腺 ０／１０
皐丸 ０／３
膀胱粘膜 ０１５
骨 ０１５
骨髄 ０１５
軟骨 ０１５
又、本発明のモノクローナル抗体は腸上皮化生胃粘膜と
２５例中１１例に反応した。
２５例中１１例に反応した。
実施例２
実施例１の（２）において、アビジンービオテンーベル
オキクダーゼ複合体法による染色をほどこす前に、胃癌
組織サンプルをニューラミニダーゼ０．２Ｕ／ｄにより
６７℃２時間処理した。一方、別の胃癌組織サンプルを
同様に０．５％過沃素酸にて３７℃１時間処理した。か
くして得られた胃癌組織２例に対する本発明のモノクロ
ーナル抗体の反応試験を実施例１と同様にして行った所
１両者共に染色性は消失した。
オキクダーゼ複合体法による染色をほどこす前に、胃癌
組織サンプルをニューラミニダーゼ０．２Ｕ／ｄにより
６７℃２時間処理した。一方、別の胃癌組織サンプルを
同様に０．５％過沃素酸にて３７℃１時間処理した。か
くして得られた胃癌組織２例に対する本発明のモノクロ
ーナル抗体の反応試験を実施例１と同様にして行った所
１両者共に染色性は消失した。
以上のことにより１本発明のモノクローナル抗体の認識
する部位（抗原決定基）は末端にンアル酸が存在する糖
鎖であることがわかる。
する部位（抗原決定基）は末端にンアル酸が存在する糖
鎖であることがわかる。
実施例３
本発明のモノクローナル抗体のイムノグロブリンクラス
を知るため、本発明のモノクローナル抗体と抗マウス各
種工Ｖ血清と寒天ゲル内沈降反応による試験を実施した
。
を知るため、本発明のモノクローナル抗体と抗マウス各
種工Ｖ血清と寒天ゲル内沈降反応による試験を実施した
。
本発明のモノクローナル抗体は、抗マウスエ１Ｍ血清及
び抗マウスに鎖血清と明らかな沈降線を示したが、エク
Ｇ、工？ Ａ＋工ｆＤ＋ニゲＥ及びλ鎖に対するどの血
清とも反応せず１本発明のモノクローナル抗体カ１９Ｍ
ＫＨｌイムノグロブリンであることが判明した。
び抗マウスに鎖血清と明らかな沈降線を示したが、エク
Ｇ、工？ Ａ＋工ｆＤ＋ニゲＥ及びλ鎖に対するどの血
清とも反応せず１本発明のモノクローナル抗体カ１９Ｍ
ＫＨｌイムノグロブリンであることが判明した。
実施例４
（１） 実施例１で得られた本発明のモノクローナル抗
体を産生ずる・・イブリドーマをプリスタン処理後（７
） Ｂ Ａ Ｌ Ｂ ／ Ｃｎｕ／＋ｆｆウスの腹腔内
に１×１０７個投与した。１週間後、約５ｄの腹水を採
取し。
体を産生ずる・・イブリドーマをプリスタン処理後（７
） Ｂ Ａ Ｌ Ｂ ／ Ｃｎｕ／＋ｆｆウスの腹腔内
に１×１０７個投与した。１週間後、約５ｄの腹水を採
取し。
５ｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ −６Ｂによるゲルｐ過を行
なった。
なった。
各分画から実施例３と同様にしてオフタロニー法により
工１Ｍと反応する分画を得、これを純化された抗体とし
た。
工１Ｍと反応する分画を得、これを純化された抗体とし
た。
純化された抗体は、Ｇｕｅｅｄｏｎ等の方法（Ｊ、Ｈｉ
ｅしｏｃｈｅｍ、ＣＹｔｏｃｈｅｍ、２７．１１５１−
１１３９．１９７９ ）に従ってビオチン化した。
ｅしｏｃｈｅｍ、ＣＹｔｏｃｈｅｍ、２７．１１５１−
１１３９．１９７９ ）に従ってビオチン化した。
（２） 一方、膵癌患者血清５ｄを５ｅｐｈａｒｏｅｅ
ＣＬ６Ｂカラムによりゲル濾過し、各分画をそれぞ９
６ウエルマイクロタイタープレートに０・１１Ｌｅずつ
分注、２４時間後、各ウェルを５チ牛血清アルブミン化
ＦＢＥＩにてブロッキング後、（１）の項で作製したピ
オチン化抗体５μｆ／４ｅを加え、アビジン−ビオチン
−ベルオキシダーゼ複合体法を行なった。
ＣＬ６Ｂカラムによりゲル濾過し、各分画をそれぞ９
６ウエルマイクロタイタープレートに０・１１Ｌｅずつ
分注、２４時間後、各ウェルを５チ牛血清アルブミン化
ＦＢＥＩにてブロッキング後、（１）の項で作製したピ
オチン化抗体５μｆ／４ｅを加え、アビジン−ビオチン
−ベルオキシダーゼ複合体法を行なった。
反応は、１ｗｌ／ｍｌのオルソフェニルジアミンヲ含む
０．１Ｍクエン酸バッファー（ｐＨａ、５）に０．０１
５％ Ｈ２Ｏ２を加えて行ない、その反応結果をＯ，Ｄ
。
０．１Ｍクエン酸バッファー（ｐＨａ、５）に０．０１
５％ Ｈ２Ｏ２を加えて行ない、その反応結果をＯ，Ｄ
。
４５０で１）Ｙｎａｔｅｃｈ Ａｕｔｏｒｅａｄｅｒ
（Ｍ Ｒ５８０）を用いて測定した。本発明のモノクロ
ーナル抗体の認識する抗原は■０付近に検出され、その
分子量は１０ ダルトン以上であった。
（Ｍ Ｒ５８０）を用いて測定した。本発明のモノクロ
ーナル抗体の認識する抗原は■０付近に検出され、その
分子量は１０ ダルトン以上であった。
実施例５
カトウ■（胃印環癌）の培養培地にＨ３−グルコースア
ミンを１５１ｔｃｉ／ｌｄの濃度に添加し、３日間培養
し、その培養上清をとり、透析により遊離のＨ６−グル
コースアミンを排除した。
ミンを１５１ｔｃｉ／ｌｄの濃度に添加し、３日間培養
し、その培養上清をとり、透析により遊離のＨ６−グル
コースアミンを排除した。
この上清液を本発明のモノクローナル抗体によるアフイ
ニテイカラムを通すと、Ｈ３の放射活性を有する抗原が
得られた。
ニテイカラムを通すと、Ｈ３の放射活性を有する抗原が
得られた。
このことは、本発明のモノクローナル抗体が反応する抗
原は＠蛋白質であることを示している。
原は＠蛋白質であることを示している。
実施例６
正常人及び胃癌患者、膵癌患者、大腸癌患者の血清を１
本発明のモノクローナル抗体を用いてエンザイムイムノ
アツセイの固相サンドイツチ法によ抄測定した所、正常
人の血清では５例中１例において弱陽性（残りの４例は
陰性）であったのに対し、胃癌患者血清の場合７例中３
例、膵癌患者血清の場合８例中４例、大腸癌患者血清の
場合８例中３例が強陽性であった。
本発明のモノクローナル抗体を用いてエンザイムイムノ
アツセイの固相サンドイツチ法によ抄測定した所、正常
人の血清では５例中１例において弱陽性（残りの４例は
陰性）であったのに対し、胃癌患者血清の場合７例中３
例、膵癌患者血清の場合８例中４例、大腸癌患者血清の
場合８例中３例が強陽性であった。
特許出願人 浅 橋 説 雄
特許出願人 下 里 幸 雄
特許出願人 渡 辺 昌 彦
特許出願人 日本化薬株式会社
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 分子量１００万以上（ゲル濾過法）の糖蛋白質抗原
と反応し、認識する抗原決定基は末端にシアル酸が存在
する糖鎖である、次の性質を有するＩＰＭのクラスに属
するモノクローナル抗体。 （１） ヒト胃癌、ヒト大腸癌、ヒト膵癌、ヒト乳癌、
ヒト肺癌、ヒト胆管癌、ヒト子宮癌、ヒト食道癌と反応
する。 （２） 正常のヒト顎下腺、ヒト近位尿細管上皮、ヒト
気管支線、ヒト扁平上皮角化層、ヒト膵う成鳥、ヒト肝
細胞膜、ヒト十二指腸線と反応する。 （３） ヒトの腸上皮化生胃粘膜と反応する。 （４） 正常のヒト前立腺、ヒト胆管上皮、ヒト膵管上
皮とはｙ応しない。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59097549A JPS60243026A (ja) | 1984-05-17 | 1984-05-17 | モノクロ−ナル抗体 |
| US06/732,406 US4683200A (en) | 1984-05-17 | 1985-05-09 | Monoclonal antibody to human cancer antigen and method for producing same |
| KR1019850003312A KR930003912B1 (ko) | 1984-05-17 | 1985-05-15 | 모노클로날 항체 및 제조방법 |
| DE8585303481T DE3586440T2 (de) | 1984-05-17 | 1985-05-17 | Zur diagnose von menschlichem magen- oder brustkrebs zu verwendender monoklonaler antikoerper. |
| EP85303481A EP0161941B1 (en) | 1984-05-17 | 1985-05-17 | Monoclonal antibody useful in the diagnosis of human stomach or breast cancer |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59097549A JPS60243026A (ja) | 1984-05-17 | 1984-05-17 | モノクロ−ナル抗体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60243026A true JPS60243026A (ja) | 1985-12-03 |
| JPH0152400B2 JPH0152400B2 (ja) | 1989-11-08 |
Family
ID=14195319
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59097549A Granted JPS60243026A (ja) | 1984-05-17 | 1984-05-17 | モノクロ−ナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60243026A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6321562A (ja) * | 1986-07-15 | 1988-01-29 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | 抗ヒト胃癌単クロ−ン性抗体ａｍｃ−４６２ |
| JPH0347089A (ja) * | 1989-03-09 | 1991-02-28 | Meiji Seika Kaisha Ltd | 膵癌細胞に対するモノクローナル抗体及び該抗産生ハイブリドーマ |
-
1984
- 1984-05-17 JP JP59097549A patent/JPS60243026A/ja active Granted
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6321562A (ja) * | 1986-07-15 | 1988-01-29 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | 抗ヒト胃癌単クロ−ン性抗体ａｍｃ−４６２ |
| JPH0347089A (ja) * | 1989-03-09 | 1991-02-28 | Meiji Seika Kaisha Ltd | 膵癌細胞に対するモノクローナル抗体及び該抗産生ハイブリドーマ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0152400B2 (ja) | 1989-11-08 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |