JPS61183300A - モノクロ−ナル抗体 - Google Patents
モノクロ−ナル抗体Info
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- JPS61183300A JPS61183300A JP2404985A JP2404985A JPS61183300A JP S61183300 A JPS61183300 A JP S61183300A JP 2404985 A JP2404985 A JP 2404985A JP 2404985 A JP2404985 A JP 2404985A JP S61183300 A JPS61183300 A JP S61183300A
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- cells
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔技術分野〕
本発明は、背低分化型腺癌由来細胞株（ＭＫＮ＝４５）
を免疫原として作製されたハイブリ［−マの産生ずる特
定の特性を持つモノクローナル抗体に関する。
を免疫原として作製されたハイブリ［−マの産生ずる特
定の特性を持つモノクローナル抗体に関する。
癌研究の究極の目標は、抗癌、制癌作用を示す物質の探
索と、癌の早期発見、即ら早ＳＵＩ診断法の確立にある
といえる。従来、癌に関して種々の薬剤、治療法、試薬
が開発されているが、これらはいずれも癌細胞ばかりで
なく、正當組織、正常細胞にも影響を与え、如何に有効
な薬剤とはいえ、その副作用のために使用が著しく制限
されているのが現状である。
索と、癌の早期発見、即ら早ＳＵＩ診断法の確立にある
といえる。従来、癌に関して種々の薬剤、治療法、試薬
が開発されているが、これらはいずれも癌細胞ばかりで
なく、正當組織、正常細胞にも影響を与え、如何に有効
な薬剤とはいえ、その副作用のために使用が著しく制限
されているのが現状である。
免疫反応（抗原−抗体反応）は、非常に特異性が高いも
のであるが、従来のポリクローナル抗体ではいかに吸収
操作を繰り返しても、例えばリンパ球間のザブセットの
ような、非常にマイナーな抗原決定基によって区別され
るものを認識することは国側であった。Ｍｉｌｓｔｅｉ
ｎらによって開発されたモノクローナル抗体［Ｋｏｈｌ
ｅｒ、 Ｇ、 ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ。
のであるが、従来のポリクローナル抗体ではいかに吸収
操作を繰り返しても、例えばリンパ球間のザブセットの
ような、非常にマイナーな抗原決定基によって区別され
るものを認識することは国側であった。Ｍｉｌｓｔｅｉ
ｎらによって開発されたモノクローナル抗体［Ｋｏｈｌ
ｅｒ、 Ｇ、 ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ。
Ｃ，： Ｎａｔｕｒｅ、 釘型、 ４９５ （１９７５
））は、この壁を打ち破るものであり、癌細胞上の癌特
異抗原、あるいは癌関連抗原を特異的に認識するモノク
ローナル抗体を得ることにより、正常組織へのダメージ
を与えずに癌細胞のみを特異的に排除できるものと期待
される。また、モノクローナル抗体を用いた診断薬ある
いは検査試薬は、正常血清成分に対する交差反応がなく
、感度良く、癌関連抗原、癌特異抗原を検出できるもの
と思われる。
））は、この壁を打ち破るものであり、癌細胞上の癌特
異抗原、あるいは癌関連抗原を特異的に認識するモノク
ローナル抗体を得ることにより、正常組織へのダメージ
を与えずに癌細胞のみを特異的に排除できるものと期待
される。また、モノクローナル抗体を用いた診断薬ある
いは検査試薬は、正常血清成分に対する交差反応がなく
、感度良く、癌関連抗原、癌特異抗原を検出できるもの
と思われる。
本発明ｉｔ、特定の癌抗原に対して特異的に反応するモ
ノクローナル抗体を提供するものである。
ノクローナル抗体を提供するものである。
さらに本発明は、上記１、〒宝珠に夕、１する抗原検出
用試薬を提供するものである。
用試薬を提供するものである。
本発明は、胃癌、’ｌ＝’＋に胃癌の分泌物抗原に対し
て特異的に反応するモノクローナル抗体よりなるもので
ある。
て特異的に反応するモノクローナル抗体よりなるもので
ある。
本発明の千ツクローナル抗体は、いわゆる細胞融合によ
って製造される。すなわち、抗体産生細胞と骨髄腫細胞
との間に、融合ハイブリノ１−を形成させ、該ハイブリ
ノ［−をクローン化し、−に記癌細胞（即ち、上記特性
を存する特定抗原）に対し特異性を示す抗体を産生ずる
クローンを選択することによって製造される。その操作
は、免疫用細胞として下記細胞を使用する以外は、従来
既知の方法に準ずればよい。
って製造される。すなわち、抗体産生細胞と骨髄腫細胞
との間に、融合ハイブリノ１−を形成させ、該ハイブリ
ノ［−をクローン化し、−に記癌細胞（即ち、上記特性
を存する特定抗原）に対し特異性を示す抗体を産生ずる
クローンを選択することによって製造される。その操作
は、免疫用細胞として下記細胞を使用する以外は、従来
既知の方法に準ずればよい。
抗体産生細胞は、例えば株化癌細胞より得られる抗原に
よって免疫さセた動物からの肺細胞、リンパ節細胞、Ｂ
−リンパ球である。株化癌細胞としては、背低分化型腺
癌由来の株化癌細胞（ＭＫＮ−４５）が例示される。
よって免疫さセた動物からの肺細胞、リンパ節細胞、Ｂ
−リンパ球である。株化癌細胞としては、背低分化型腺
癌由来の株化癌細胞（ＭＫＮ−４５）が例示される。
免疫させる動物としてはマウス、ラット、馬、ヤギ、ウ
サギなどが例示される。
サギなどが例示される。
抗体産生細胞は、例えば次のようにして製造される。即
ち、胃癌由来細胞株ＭＫＮ−４５（低分化型腺癌）を超
音波処理等で破壊し、遠心分離（例、１０，０００〜２
０，０ＯＯＧ、１０〜６０分）を行って細胞抽出液を得
、この上清を分子量１０万〜２００万の物質の分離が可
能なゲル濾過担体（例、セファデックス、七フアクリル
、セファロース、バイオゲル等）を使用して分子篩し、
高分子画分と低分子画分とに分離する。かくして得られ
た分子量が約７０万〜１５０万の高分子画分は、たとえ
ばＦｒｅｕｎｄ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ
と混和後、動物の免疫用として使用する。免疫は動物の
皮下、筋肉内あるいは腹腔内に約１．５Ｘ１０５〜１０
８ｃａｌｌ相当分／回を週１〜２回、３〜７週間投与す
ることによって行われる。最終免疫より約３〜５日後、
免疫動物から抗体産生細胞を分取する。
ち、胃癌由来細胞株ＭＫＮ−４５（低分化型腺癌）を超
音波処理等で破壊し、遠心分離（例、１０，０００〜２
０，０ＯＯＧ、１０〜６０分）を行って細胞抽出液を得
、この上清を分子量１０万〜２００万の物質の分離が可
能なゲル濾過担体（例、セファデックス、七フアクリル
、セファロース、バイオゲル等）を使用して分子篩し、
高分子画分と低分子画分とに分離する。かくして得られ
た分子量が約７０万〜１５０万の高分子画分は、たとえ
ばＦｒｅｕｎｄ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ
と混和後、動物の免疫用として使用する。免疫は動物の
皮下、筋肉内あるいは腹腔内に約１．５Ｘ１０５〜１０
８ｃａｌｌ相当分／回を週１〜２回、３〜７週間投与す
ることによって行われる。最終免疫より約３〜５日後、
免疫動物から抗体産生細胞を分取する。
骨髄腫細胞としては、マウス、ラット、ヒト等由来のも
のが使用される。抗体産生細胞と骨髄細胞とは同種動物
由来のものであることが好ましい。
のが使用される。抗体産生細胞と骨髄細胞とは同種動物
由来のものであることが好ましい。
細胞融合は、例えばＧ、 Ｋｏｈｌｅｒ ＣＮａｔｕｒ
ｅ ２５６＋４９５ （１９７５））に記載の方法又は
これに準する方法によって行われる。この際、３０〜５
０％ポリエチレングリコール（平均分子ｉ！ １，００
０〜４，０００ ）を用いて３０〜４０°Ｃの温度下、
約１〜３分間程度反応さゼることによって行われる。
ｅ ２５６＋４９５ （１９７５））に記載の方法又は
これに準する方法によって行われる。この際、３０〜５
０％ポリエチレングリコール（平均分子ｉ！ １，００
０〜４，０００ ）を用いて３０〜４０°Ｃの温度下、
約１〜３分間程度反応さゼることによって行われる。
細胞融合によって得られた細胞はクローニングにイ」さ
れる。すなわち、当該細胞を、例えばマイクロプレート
中で培養し、増殖の見られたウェルの培養上清中の抗体
価を、例えば酵素抗体法などによって測定し、さらに例
えば限界希釈法によってクローニングを行ってクローン
を得る。このクローンは、例えばあらかじめブリスタン
を投与したＢ Ａ Ｌ Ｂ ／ Ｃマウスの腹腔内へ移
植し、１０〜１４日後にモノクローナル抗体を高濃度に
含む腹水を採取し、検定する。得られたクローンは、次
いで、目的とするモノクローナル抗体を産生ずるクロー
ンのスクリーニングに（ツされる。スクリーニングは、
酵素抗体法などによって追跡される。
れる。すなわち、当該細胞を、例えばマイクロプレート
中で培養し、増殖の見られたウェルの培養上清中の抗体
価を、例えば酵素抗体法などによって測定し、さらに例
えば限界希釈法によってクローニングを行ってクローン
を得る。このクローンは、例えばあらかじめブリスタン
を投与したＢ Ａ Ｌ Ｂ ／ Ｃマウスの腹腔内へ移
植し、１０〜１４日後にモノクローナル抗体を高濃度に
含む腹水を採取し、検定する。得られたクローンは、次
いで、目的とするモノクローナル抗体を産生ずるクロー
ンのスクリーニングに（ツされる。スクリーニングは、
酵素抗体法などによって追跡される。
選ハれたクローンの産生ずるモノクローナル抗体の回収
は、ＩｇＧの精製法として従来既知の硫安分画法、ＰＥ
Ｇ分画法、エタノール分画法、陰イオン変換体を応用す
ることで、容易に達成される。
は、ＩｇＧの精製法として従来既知の硫安分画法、ＰＥ
Ｇ分画法、エタノール分画法、陰イオン変換体を応用す
ることで、容易に達成される。
本発明によって得られたモノクロール抗体は、腺癌系に
特異的と考えられ、胃癌分泌物抗原を認識し、かつ正常
組織由来培養細胞、赤血球、白血球及び正常組織とは反
応せず、癌特異的な抗原を認識するものと推測される。
特異的と考えられ、胃癌分泌物抗原を認識し、かつ正常
組織由来培養細胞、赤血球、白血球及び正常組織とは反
応せず、癌特異的な抗原を認識するものと推測される。
すなわち、本発明からなるモノクローナル抗体は腫瘍の
イメージング及び制癌剤とｃｏｎｊｕｇａｔｅさせｔａ
ｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅｒａｐｙ（ターゲティングセラ
ピイ）等への臨床応用が期待される。
イメージング及び制癌剤とｃｏｎｊｕｇａｔｅさせｔａ
ｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅｒａｐｙ（ターゲティングセラ
ピイ）等への臨床応用が期待される。
実施例
ｆｌ、ｌ 免疫用癌関連抗原の調製：株化胃癌細胞（
ＭＫＮ−４５株）を超音波処理法で破壊し、遠心分離（
１５，０００Ｇ、 ３０分）を行い細胞抽１）脅夜を得
た。この上清をセファ＋コース４Ｂのカラムを用い、ゲ
ル濾過し、高分子画分と低分子画分とに分離した。
ＭＫＮ−４５株）を超音波処理法で破壊し、遠心分離（
１５，０００Ｇ、 ３０分）を行い細胞抽１）脅夜を得
た。この上清をセファ＋コース４Ｂのカラムを用い、ゲ
ル濾過し、高分子画分と低分子画分とに分離した。
分子量が約７０万〜１５０万の高分子画分を、Ｆｒｅｕ
ｎｄ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ａｄｊｕｖａｎｔとン昆和後
、マつス△、週１回、５週間免疫した。
ｎｄ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ａｄｊｕｖａｎｔとン昆和後
、マつス△、週１回、５週間免疫した。
最終免疫より４日後にマウス肺臓を取り出し、以下の細
胞融合に用いた。
胞融合に用いた。
（２）細胞融合およびりｌコーニング：」−記のマウス
胛細胞と、マウスミエローマＰ３Ｕ ｌ （Ｃｕｒｒ
、Ｔｏｐ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、
、 旦、ＬＩ（１９７０） ）とを４．１の割合で混
合し、Ｋｏｔ＋ｌｅｎらの方法（１ｍｍｕｎｏｌｏｇｉ
ｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄ （Ａｃａｄｅｎｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ）＋Ｎｅｗ ’１０ｒｋ、 ３９１．（１９７９））
を一部改変して、４２．６％ポリエチレングリコール（
平均分子９１，０００）を用いて２分間反応させること
により細胞融合を行った。
胛細胞と、マウスミエローマＰ３Ｕ ｌ （Ｃｕｒｒ
、Ｔｏｐ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、
、 旦、ＬＩ（１９７０） ）とを４．１の割合で混
合し、Ｋｏｔ＋ｌｅｎらの方法（１ｍｍｕｎｏｌｏｇｉ
ｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄ （Ａｃａｄｅｎｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ）＋Ｎｅｗ ’１０ｒｋ、 ３９１．（１９７９））
を一部改変して、４２．６％ポリエチレングリコール（
平均分子９１，０００）を用いて２分間反応させること
により細胞融合を行った。
本細胞を９６ウエルマイクロプレートに植え込み、Ｉ（
ＡＴ培地（表１）で１９〜１４日間培養後、Ｉ■Ｔ培地
（表１）に移行し、更にフラスコ（２５ｃ＋Ｊ）に培養
できるようになってからＤ−ＭＥＭ培地（表１）で培養
した。増殖の見られたウェルの培養上清中の抗体価を酵
素抗体法により測定し、適切なウェルから限界希釈法に
より、求めるハイブリドーマのクローニングを行った。
ＡＴ培地（表１）で１９〜１４日間培養後、Ｉ■Ｔ培地
（表１）に移行し、更にフラスコ（２５ｃ＋Ｊ）に培養
できるようになってからＤ−ＭＥＭ培地（表１）で培養
した。増殖の見られたウェルの培養上清中の抗体価を酵
素抗体法により測定し、適切なウェルから限界希釈法に
より、求めるハイブリドーマのクローニングを行った。
すなわち、マイクロタイタープレートにウェル当たり２
５，０００個のマウス腹腔浸出細胞を植え込み、次にＤ
−ＭＥＭ培地で、１０．５．２．５．１個１０．１ｍｌ
となるようにハイブリドーマを希釈し、これをマイクロ
クイターブレー１・に０．１ｍｌずつ植え込み培養した
。４日後にＤ−ＭＥＭ培地を０．１ｍｌ加え、以後４〜
７日に１度培地の半量交換を行った。培養開始後１０〜
２０日で肉眼で認められるコロニーが形成され、クロー
ン株を得た。
５，０００個のマウス腹腔浸出細胞を植え込み、次にＤ
−ＭＥＭ培地で、１０．５．２．５．１個１０．１ｍｌ
となるようにハイブリドーマを希釈し、これをマイクロ
クイターブレー１・に０．１ｍｌずつ植え込み培養した
。４日後にＤ−ＭＥＭ培地を０．１ｍｌ加え、以後４〜
７日に１度培地の半量交換を行った。培養開始後１０〜
２０日で肉眼で認められるコロニーが形成され、クロー
ン株を得た。
（以下余白）
表１
（３） スクリーニング法
得られたハイブリ１−マについて目的とするモノクロー
ナル抗体を産生ずるクローンのスクリーニングを次のよ
うに行った。
ナル抗体を産生ずるクローンのスクリーニングを次のよ
うに行った。
（イ）方法の説明
以下のようにて酵素抗体法を行った。
抗原（各種株化癌細胞または部分精製癌関連抗原または
正常細胞をコートしたマイクロプレー）・に検体を加え
、３７°Ｃで１時間反応させ、洗浄後ペルオキシダーゼ
標識抗マウス免疫グロブリン（Ｉ ｇＧ＋ Ｉ ｇＡ＋
Ｉ ｇＭ）ウヅギ抗体を加え、さらに３７℃で１時間反
応させた。未反応の標識抗体を洗浄後、０−フェニレン
シアミン液を加え、室温にて３０分間反応させた後、２
Ｍ硫酸を加えて反応を停止さゼ、４９０ｎｍの吸光度を
測定した。
正常細胞をコートしたマイクロプレー）・に検体を加え
、３７°Ｃで１時間反応させ、洗浄後ペルオキシダーゼ
標識抗マウス免疫グロブリン（Ｉ ｇＧ＋ Ｉ ｇＡ＋
Ｉ ｇＭ）ウヅギ抗体を加え、さらに３７℃で１時間反
応させた。未反応の標識抗体を洗浄後、０−フェニレン
シアミン液を加え、室温にて３０分間反応させた後、２
Ｍ硫酸を加えて反応を停止さゼ、４９０ｎｍの吸光度を
測定した。
この方法で各種細胞との反応性を調べた。なお白血球と
の交叉反応性はＲ−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ標識抗
体を用いた。その他、ヒト赤血球との交叉反応性は、ヒ
）Ａ、Ｂ、Ｏ型赤血球を混合し、Ｐ ＨＡ法で検討した
。Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ
（ＣＥ Ａ）との交叉反応性は、ＣＥＡ感作血球を用
いＰ ｌ−Ｉ Ａ法で行った。
の交叉反応性はＲ−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ標識抗
体を用いた。その他、ヒト赤血球との交叉反応性は、ヒ
）Ａ、Ｂ、Ｏ型赤血球を混合し、Ｐ ＨＡ法で検討した
。Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ
（ＣＥ Ａ）との交叉反応性は、ＣＥＡ感作血球を用
いＰ ｌ−Ｉ Ａ法で行った。
モノクローナル抗体がＭ Ｋ Ｎ−４，５の分泌物抗原
か或いは細胞膜抗原のどちらを認識しているかの検討の
ために、ＭＫＮ−４５の培養」二清でモノクローナル抗
体とＭＫＮ−４５細胞そのものとの反応性が■害される
かどうかを調べた。
か或いは細胞膜抗原のどちらを認識しているかの検討の
ために、ＭＫＮ−４５の培養」二清でモノクローナル抗
体とＭＫＮ−４５細胞そのものとの反応性が■害される
かどうかを調べた。
酵素抗体法を用いたＩｎｂｉｂｉｔｉｏｎ Ｔｅ５ｔ
の具体的な方法は、以下の通りである。即ち、ハイブリ
ドーマの上清を酵素抗体法でｔｉｔｒａｔｉｏｎを行い
、それより判断して適当な希釈倍率を決める。次にＭＫ
Ｎ−４５培養」−清を５〜２５倍濃縮したものを原液と
して、１；５．１：５２ ・ ・１；５９希釈したも
のを適当に希釈したハイブリドーマ上清にそれぞれ等量
刑え、１時間、３７°Ｃで１ｎｃｕ−ｈａｔｉｏｎする
。そして、通常の酵素抗体法（ｔａｒｇｅｔ：ＭＫＮ−
４５）の系でａｓｓａｙを行った。
の具体的な方法は、以下の通りである。即ち、ハイブリ
ドーマの上清を酵素抗体法でｔｉｔｒａｔｉｏｎを行い
、それより判断して適当な希釈倍率を決める。次にＭＫ
Ｎ−４５培養」−清を５〜２５倍濃縮したものを原液と
して、１；５．１：５２ ・ ・１；５９希釈したも
のを適当に希釈したハイブリドーマ上清にそれぞれ等量
刑え、１時間、３７°Ｃで１ｎｃｕ−ｈａｔｉｏｎする
。そして、通常の酵素抗体法（ｔａｒｇｅｔ：ＭＫＮ−
４５）の系でａｓｓａｙを行った。
（ロ）スクリーニングの瀦れ
１次スクリーニング： Ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌ
（ＭＫＮ−４５）および正常由来細胞（Ｐｌｏｗ ２０
００ ）を用いた酵素抗体法で、ＭＫＮ−４５に対して
陽性でＦｌｏｗ ２０００に対して陰性なｗｅｌｌを選
抜。
（ＭＫＮ−４５）および正常由来細胞（Ｐｌｏｗ ２０
００ ）を用いた酵素抗体法で、ＭＫＮ−４５に対して
陽性でＦｌｏｗ ２０００に対して陰性なｗｅｌｌを選
抜。
２次スクリーニング：さらに他の正常由来細胞株及び赤
血球、白血球を用いたａｓｓａｙ系ですべてに陰性の−
ａｌｌ を選抜。
血球、白血球を用いたａｓｓａｙ系ですべてに陰性の−
ａｌｌ を選抜。
３次スクリーニング：以」二で選抜された細胞株を２〜
３回クローニングし、その培養上清を多（の癌由来のＣ
１３＋１）ｉｎｅとの反応性を検討するとともに、分泌
型或いは細胞膜型抗原のどちらを認識するかを、酵素抗
体法を用いたＩｎ旧旧Ｌｉｏｎ Ｔｅ５ｔで同定する。
３回クローニングし、その培養上清を多（の癌由来のＣ
１３＋１）ｉｎｅとの反応性を検討するとともに、分泌
型或いは細胞膜型抗原のどちらを認識するかを、酵素抗
体法を用いたＩｎ旧旧Ｌｉｏｎ Ｔｅ５ｔで同定する。
（４）モノクローナル抗体の回収、精製（イ）」−記の
スクリーニングによって得られたクローン株を予め０．
５ｍｌ／匹プリスタンを投与した４週令以後のＢへＬＢ
／Ｃマウス（雄）の腹腔内へ２．０−３． ＯＸ ］
０７ｃｅｌｌ／匹移植し、１０−１４日後にモノクロー
ナル抗体を高濃度に含む腹水を採取した。
スクリーニングによって得られたクローン株を予め０．
５ｍｌ／匹プリスタンを投与した４週令以後のＢへＬＢ
／Ｃマウス（雄）の腹腔内へ２．０−３． ＯＸ ］
０７ｃｅｌｌ／匹移植し、１０−１４日後にモノクロー
ナル抗体を高濃度に含む腹水を採取した。
この腹水を０．９％Ｎａ（１！液を加え５〜１０倍希釈
した後、硫酸アンモニウムを４０％濃度とな］ ２ るように加え、沈澱画分を分取した。この沈澱画分をな
るべく少量の０．９％ｐＪ ａ ＣＮ液で溶解させた後
、０．９％Ｎ、ａＣβ液を外液として透析した。
した後、硫酸アンモニウムを４０％濃度とな］ ２ るように加え、沈澱画分を分取した。この沈澱画分をな
るべく少量の０．９％ｐＪ ａ ＣＮ液で溶解させた後
、０．９％Ｎ、ａＣβ液を外液として透析した。
透析終了後、高速液体クロマトグラフィー（ＴＳＫ−Ｇ
ｅｌｌ Ｇ−３０００５Ｗ ）を行い、ＩｇＭ画分を得
、精製モノクローナル抗体とした。
ｅｌｌ Ｇ−３０００５Ｗ ）を行い、ＩｇＭ画分を得
、精製モノクローナル抗体とした。
（ロ）本りローン株は、ＢＳＡ含無血清培地中でも増殖
させることができる。ずなわら、０．５％ＢＳＡ含無血
７Ｈ培地（ＲＩＴＣ５５−９培地）中で増殖させ、培養
上清を集めた。この上清に硫酸アンモニウムを４０％濃
度となるように加え、沈澱画分を分取し、これに０．９
％ＮａＣβ液を加え、溶解させた後、さらに硫酸アンモ
ニウムを４０％濃度となるように加え沈澱画分を分取し
た。この沈澱画分をなるべく少量の０．９％Ｎａ Ｃ７
！液で溶解させた後、０．０２Ｍ生理的リン酸緩衝液を
外液として透析した。透析終了後、この溶液を再び抗生
胎児血清抗体（ウサギ）を結合した５ｅｐｈａｒｏｓｅ
４Ｂカラムに通した後ＤＨＡＩ−Ｃｅｌｌｕｌｏｆｉｎ
ｅカラムに加え、カラムクロマトグラフィーを行った。
させることができる。ずなわら、０．５％ＢＳＡ含無血
７Ｈ培地（ＲＩＴＣ５５−９培地）中で増殖させ、培養
上清を集めた。この上清に硫酸アンモニウムを４０％濃
度となるように加え、沈澱画分を分取し、これに０．９
％ＮａＣβ液を加え、溶解させた後、さらに硫酸アンモ
ニウムを４０％濃度となるように加え沈澱画分を分取し
た。この沈澱画分をなるべく少量の０．９％Ｎａ Ｃ７
！液で溶解させた後、０．０２Ｍ生理的リン酸緩衝液を
外液として透析した。透析終了後、この溶液を再び抗生
胎児血清抗体（ウサギ）を結合した５ｅｐｈａｒｏｓｅ
４Ｂカラムに通した後ＤＨＡＩ−Ｃｅｌｌｕｌｏｆｉｎ
ｅカラムに加え、カラムクロマトグラフィーを行った。
ＤＩミＡＨ−Ｃｅｌ １ｏｌｏｆ ｉｎｅクロマＬグラ
フィーの最初のピーク部分を精製モノクローナル抗体と
した。
フィーの最初のピーク部分を精製モノクローナル抗体と
した。
（５） モノクローナル抗体の特性
かくしてスクリーニングされたクローンの産生ずるモノ
クローナル抗体の性状は、表２及び表３のとおりである
。免疫グロブリンのクラスはオフタロニー法で検定した
。
クローナル抗体の性状は、表２及び表３のとおりである
。免疫グロブリンのクラスはオフタロニー法で検定した
。
表２
（余白）
特許出願人 株式会社 ミドリ十字
手続補正書印釦
昭和６０年８月 １ 日
Claims (6)
- （１）胃低分化型腺癌由来細胞株（ＭＫＮ−４５）を免
疫原として作製されたハイブリドーマの産生する以下の
特性を持つモノクローナル抗体：［１］１ｇクラス（Ｌ
ｉｇｈｔ鎖）：ＩｇＭ（Ｋ）［２］認識抗原タイプ：分
泌物抗原 ［３］癌細胞との反応性：少なくとも胃癌（ＭＫＮ−４
５）細胞に対して陽性を示す。 - （２）癌細胞との反応性において、さらに肺癌（ＰＣ−
１０：偏平上皮）に対して陽性を示す特許請求の範囲第
（１）項記載のモノクローナル抗体。 - （３）癌細胞との反応性において、さらに食道癌（ＴＥ
−３）に対して陽性を示す特許請求の範囲第（１）項記
載のモノクローナル抗体。 - （４）癌細胞との反応性において、さらに肺癌（ＰＣ−
３）および肝癌（ＨＥＫ）に対して陽性を示す特許請求
の範囲第（１）項記載のモノクローナル抗体。 - （５）癌細胞との反応性において、さらに肺癌（ＰＣ−
３）、胃癌（ＫＡＴＯ−III：卵環細胞）および結腸癌
（Ｃｏｌｏ２０１）に対して陽性を示す特許請求の範囲
第（１）項記載のモノクローナル抗体。 - （６）癌細胞との反応性において、さらに肺癌（ＰＣ−
３）に対して陽性を示す特許請求の範囲第（１）項記載
のモノクローナル抗体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2404985A JPS61183300A (ja) | 1985-02-08 | 1985-02-08 | モノクロ−ナル抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2404985A JPS61183300A (ja) | 1985-02-08 | 1985-02-08 | モノクロ−ナル抗体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61183300A true JPS61183300A (ja) | 1986-08-15 |
Family
ID=12127613
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2404985A Pending JPS61183300A (ja) | 1985-02-08 | 1985-02-08 | モノクロ−ナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61183300A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61189299A (ja) * | 1985-02-15 | 1986-08-22 | Nisshin Flour Milling Co Ltd | モノクローナル抗体を含む肝疾患診断剤 |
| EP0218158A2 (en) * | 1985-09-30 | 1987-04-15 | Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha | Human monoclonal antibody, B-cell line for producing this antibody and method for preparing this B-cell line and antibody. |
| JPS6357596A (ja) * | 1986-08-29 | 1988-03-12 | Nisshin Flour Milling Co Ltd | モノクロ−ナル抗体、その製法およびそれからなる肝疾患診断剤 |
-
1985
- 1985-02-08 JP JP2404985A patent/JPS61183300A/ja active Pending
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| THE JOURNAL OF IMMUNOLOGY=1984 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61189299A (ja) * | 1985-02-15 | 1986-08-22 | Nisshin Flour Milling Co Ltd | モノクローナル抗体を含む肝疾患診断剤 |
| JPH0623763B2 (ja) * | 1985-02-15 | 1994-03-30 | 日清製粉株式会社 | モノクローナル抗体を含む肝疾患診断剤 |
| EP0218158A2 (en) * | 1985-09-30 | 1987-04-15 | Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha | Human monoclonal antibody, B-cell line for producing this antibody and method for preparing this B-cell line and antibody. |
| JPS6357596A (ja) * | 1986-08-29 | 1988-03-12 | Nisshin Flour Milling Co Ltd | モノクロ−ナル抗体、その製法およびそれからなる肝疾患診断剤 |
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