JPS6236397A - モノクロ−ナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （技術分野） 本発明は、印環型胃癌由来株（ＩＴＯ−１）　　を免疫
原として作製されたバイブリド０−マの産生ずる特定の
特性を持つモノクローナル抗体に関する。

（従来技術） 癌研究の究極の目標は、抗癌、制癌作用を示す物質の探
索と、癌の早期発見、則ち早期診断法の確立にあるとい
える。従来、癌に関して種々の薬剤、治療法、試薬が開
発されているが、これらはいずれも癌細胞ばかシでなく
、正常組織、正常細胞にも影響を与え、如何に有効な薬
剤とはいえ、その副作用のために使用が著しく制限され
ているのが現状である。

免疫反応（抗原−抗体反応）は、非常に特異性が高いも
のであるが、従来のポリクローナル抗体ではいかに吸収
操作を繰り返しても、例えばリンノ七球間のサブセット
のような、非常にマイナーな抗原決定基によって区別さ
れるものを認識することは困難であった。ミルスティン
（Ｍｉ’１８ｔθｉｎ）　　Ｇ）によって開発されたモ
ノクローナル抗体〔ケーラー、ジーおよびミルスティン
、シー：ネーチャー（Ｋ６ｈｌｅｒ、　Ｇ、　ａｎｄ　
Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、　Ｃ，：Ｎａｔｕｒｅ）２５６、　
４９５（１９７５）ノは、この壁を打ち破るものであシ
、癌細胞上の癌特異抗原、あるいは癌関連抗原を特異的
に認識するモノクローナル抗体を得えることにより、正
常組織へのダメージを与えずに癌細胞のみを特異的に排
除できるものと期待される。また、モノクローナル抗体
を用いた診断薬あるいは検査試薬は、正常血清成分に対
する交叉反応がなく、感度良く、癌関連抗原、癌特異抗
原を検出できるものと思われる。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明は、特定の癌抗原に対して特異的に反応するモノ
クローナル抗体全提供するものである。

さらに本発明は、上記特定病に対する抗原検出用試薬を
提供するものである。

（問題点を解決するための手段） 本発明は、胃癌、特に胃癌の細胞膜表布型抗原に対して
特異的に反応するモノクローナル抗体よシなるものであ
る。

本発明のモノクローナル抗体は、いわゆる細胞融合によ
って製造される。すなわち、抗体産生細胞と骨髄腫細胞
との間に、融合ハイブリット９を形成させ、該ハイブリ
ット″をクローン化し、上記癌細胞（則ち、上記特性を
有する特定抗原）に対し特異性を示す抗体を産生するク
ローンを選択することによって製造される。その操作は
、免疫用細胞として下記細胞を使用する以外は、従来既
知の方法に準ずればよい。

抗体産生細胞は、例えば株化癌ＭｆＪ胞よｐ得られる抗
原によって免疫された動物からの肺細胞、リンパ節細胞
％Ｂ−リンＡ球である。株化癌細胞としては、卵塊型胃
癌由来の株化癌細胞（ＫＡＴＯ−１）が例示される。

免疫される動物としてはマウス、ラット、馬、ヤギ、ウ
サギなどが例示される。

抗体産生細胞は、たとえば次のようにして製造される。

すなわち、卵塊型胃癌由来細胞株ＫＡＴＯ−４ｔ−超音
波処理等で破壊し、遠心分離（例、ＩＱＯＯＯ〜２ＱＯ
ＯＯＧ、１０〜６０分）ｆ、行って細胞抽出液を得、こ
の上清を分子［１０万〜２００万の物質の分離が可能な
ゲル濾過担体（例、セファデックス、セファクリル、セ
ファロース、バイオゲル等）を使用して分子篩し、高分
子画分と低分子画分とに分離する。かくして得られた分
子量が約７０万〜１５０万の高分子画分は、たとえば、
先金７０インド９アジュバント（１’ｒｅｕｎｄＣｏｍ
ｐｌｅｔｅ　Ａａｊｕｖａｎｔ）　　と混和後、動物の
免疫用として使用する。免疫は動物の皮下、筋肉内ある
いは腹腔内に約１．５　Ｘ　１０　〜１０　　ｃｅｌｌ
相当分／回を注射することによシ行われ、初回免疫より
約３〜５週間ごとに２度免疫を行い更に１〜３ケ月後に
最終免疫を行う。最終免疫よシ約３〜５日後、免疫動物
から抗体産生細胞を分取する。

骨髄腫細胞としては、マウス、ラット、ヒト等由来のも
のが使用される。抗体産生細胞と骨髄細胞とは同種動物
由来のものであることが好ましい。

細胞融合は、例えばジー、ガルファー（Ｇ、　Ｇａ１ｆ
ｒθ）〔ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２６６．５５０．
（１９７７）Ｊに記載の方法またはこれに準する方法に
よって行われる。この際％３０〜５０％ポリエチレング
リコール（平均分子量１，０００−４０００）を用いて
３０〜４０℃の温度下、約１〜３分間程度反応させるこ
とによって行われる。

細胞融合によって得られた細胞は目的とするモノクロー
ナル抗体を産生するクローンのスクリーニングに付され
る。すなわち、当該Ｍｆｉ胞を、例えばマイクロプレー
ト中で培養し、増殖の見られたウェルの培養土清中の抗
体価を、例えば酵素抗体法などによって測定し、適切な
抗体を産生じているウェルを得る。このようなウェルか
らさらに例えば限界希釈法によってクローニングを行っ
てクローンを得る。このクローンは、例えばあらかじめ
プリスタンを投与したＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔内へ移
動し、１０〜１４日後にモノクローナル抗体を高濃度に
含む腹水を採取し、検定する。選ばれたクローンの産生
するモノクローナル抗体の回収は、免疫グロブリンの精
製法として従来既知の硫安分画法、ＰＥＧ分画法、エタ
ノール分画法、陰イオン交換体を応用することで、容易
に達成される。

（発明の効果） 本発明によって得られたモノクローナｌし抗体は、２４
１胞膜表在型抗原１に認識し、かつ正常組織由来培養細
胞、赤血球、白血球及び正常組域とは反応せず、癌特異
的な抗原を認識するものと推測される。

すなわち、本発明からなるモノクローナル抗体は腫瘍の
イメージング及び制癌剤とコンジュゲート（ｃｏｎｊｕ
ｇａｔｅ）させｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ｔｈｅｒａｐｙ　
　（ターゲテイングセ２ビイ）等への臨床応用が期待さ
れる。

実施例、 （１）免疫用癌関連抗原の調製： 株化胃癌細胞（ＫＡＴＯ−１株）を超音波処理法で［１
１Ｌ、遠心分子１（１５０００Ｇ、３０分）を行い細胞
抽出液を得た。この上清をセファロース４Ｂのカラムを
用い、ゲル濾過し、高分子画分と低分子画分とに分離し
た。

分子量が約７０万〜１５０万の高分子画分を、完全７０
イドアジユノＺントと混和後、マウスへ月１回の割合で
計３回免疫した。

最終免疫よ９４日後にマウス肺臓を取シ出し、以下の細
胞融合に用い友。

（２）細胞融合およびクローニング： 上記のマウス牌細胞と、マウスミエローマＰ３Ｕ１カレ
ントトビツク　イン　マイクロバイオロジー　アント０
　イムノロジー（Ｃｕｒｒ、　Ｔｏｐ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　、工ｍｍｕｎｏｌ、、　８１　、
１　（１９７８）　）とを３−１の割合で混合し、ケー
ラー（Ｋ″ｏｈｌｅｒ）らの方法イムノロジカル　メソ
ッド、アカデミツクプレス、ニューヨーク〔工ｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏａ（Ａｃａｄｍｉｃ　Ｐ
ｒｅｓｓ）、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　３９１　、　（１９
７９））を一部改変して、４５％ポリエチレングリコー
ル（平均分子１ｉｉ４０００　）　ｋ用いて２分間反応
させることによシ細胞融合を行った。

本細胞を９６ウエルマイクロプレートに植え込み、ＨＡ
Ｔ培地（表１）で９〜１４日間培養後、ＨＴ培地（表１
）に移行し、さらにフラスコ（２５ｃ１ｎ２）に培養で
きるようになってからＤ−ＭＥＭ培地（表１）で培養し
た。増殖の見られたウェルの培養上清中の抗体価を酵素
抗体法によシ測定し、適切なウェルから限界希釈法によ
り、求めるハイプリドーマのクローニングを行つ几。

すなわち、マイクロタイタープレートにウェル当た。９
２４％０００個のマウス腹腔浸出細胞を植え込み１次に
Ｄ−ＭＥＭ培地で、１０．５，２．５．１個１０．１ｄ
となるようにハイズリト９−マを希釈し。

これをマイクロタイタープレートに０．１　ｄずつ植え
込み培養した。４日後にＤ−ＭＩＭ培地ｔ　０．１　ｘ
ｇ加え、以後４〜７日に１度培地の半量交換を行った。

培養開始後１０〜２０日で肉眼で認められるコロニーが
形成され、クローン株を得た。

表１ （イ）Ｄ−ＭＥＭ培地： ダルイッコの修正イーグル培地（Ｄｕｌ’ｂｅｃｃａ’
ｓｍｏｄｔｆｉｅａ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（
日本製薬社製））に以下の龜加物を加えたもの。

添加物： （終濃度）　　　　　（成分） ｌＯ％　　　　　　馬血清　　　　（ＦＩＯＷ）３００
　弓し／ｌ　　　　　　　Ｌ−グルタミン１１０　　巧
／ｊ　　　　　　ソデイウムピルベート１００　工、Ｕ
、／−ペニシリン １００　　Ｐｌｉ／ｌｄ　　　　ストレプトマイシン３
．５　１１７１１　　　　　　　ダルコース３．７　　
ｇ７１　　　　　　ＮａＨＣＯ３（ロ）ＨＡＴ培地 Ｄ−ＭＥＭ培地に以下の添加物を添加 ｌＸｌ０”’Ｍ　　　　ヒポキサンチン４ｘｌＱ−’Ｍ
　　　　アミノプテリン１．６Ｘ１０”’Ｍ　　　　ｆ
ミジｙ （ハ）ＥＴ培地： ＨＡＴ培地から７ミノプテリンを除いた培地（３）　　
スクリーニング法 得られたバイブリド０−マについて目的とするモノクロ
ーナル抗体ｔ−産生ずるクローンのスクリ−ユングを次
のように行った。

（イ）方法の説明 以下のようにして酵素抗体法を行った。

抗原（各種株化癌細胞捷たは部分精製癌関連抗原または
正常細胞）ｔ−コートしたマイクロプレートに検体’に
７１０え、３７℃で１時間反応させ、洗浄後ハルオキシ
ダーゼ標識抗マウス免疫グロブリン（工ｇＧ十工ｇＡ十
工ｇＭ）　ウサギ抗体を刀Ｕえ、さらに３７℃で１時間
反応させた。未反応の標識抗体を洗浄除去後、○−７二
二レンジアミン液を加え、室温にて３０分間反応させた
後、２Ｍ硫１！１７＋ｏえて反応を停止させ、４９０ｎ
ｍの吸光度をｆｆ１ｌＪ定した。

この方法で各種ａ胞との反応性を詞べた。癌胎児性抗原
（ＣＥＡ）との交叉反応性は、ＣＥＡ感作血球を用いＰ
ＨＡ法で行った。

モノクローナル抗体がＫＡＴＯ−１の分泌物抗原か或い
は細胞膜抗原のどちらを認識しているかの検討の丸めに
、ＫＡＴＯ−１の培養上清でモノクローナル抗体とＫＡ
ＴＯ−１細胞そのものとの反応性が阻害されるかどうか
を調べた。

酵素抗体法を用いたインヒビジョン　テスト（工ｎｈｉ
ｂｉｔｉｏｎ　Ｔｅ５ｔ）の具体［方ｍｌｄ、以下）通
りである。即ち、ハイズリドーマの上清を酵素抗体法で
タイトレージョン（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）　ｔ−行い、
それよシ判断して適当な希釈倍率を決める。次にＫＡＴ
Ｏ−ＩＩ培養上清を５〜２５倍濃縮したものを原液とし
て１：５．１：５２・・・・・・・・・１：５ｎ　希釈
したものを、適当に希釈したバイブリド９−マ上清にそ
れぞれ等量加え、１時間３７℃でインキュは−ジョン（
ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）する。そして１通常の酵素抗体
法（ターゲット（ｔａｒｇｅｔ）：　ＫＡＴＯ４）の系
でアッセイ（ａｓｓａｙ）　ｆ行った。

（ロ）スクリーニングの流れ １次スクリーニング：ターゲット　セル（Ｔａｒｐｅｔ
ｃｅｌｌ）　（ＫＡＴＯ−１［）及び正常皮膚城撓芽ｍ
ｕ（ＣＣＤ４５−３Ｋ）を用いた酵素抗体法で、ＫＡＴ
Ｏ−１に対して陽性でＣＣＤ４５−８Ｋに対して陰性な
ウェルを選抜。

２次スクリーニング：第１次スクリーニングで選抜され
た細胞味を２〜３回クローニングし、その培養上清を多
くの癌由来の株化細胞（ｃｅｌ’１１ｉｎｅ）や他の正
常組織由来細胞との反応性を検討するとともに、分泌型
或いは細胞膜表布型抗原のどちらｔ−認識するかを、酵
素抗体法を用いたインヒビショア　　テスト（工ｎｈｉ
ｂｉｔｉｏｎ　Ｔｅ５ｔ）　　で同定する。

（４）モノクローナル抗体の回収、精製（イ）上記のス
クリーニングによって得られたクローン株を予め０．５
ｄ／匹プリスタンを投与した４週令以後のＢ　ＡＬ　Ｂ
／Ｃマウス（雄）の腹腔内へ２．０〜３．０ｘｌＯｃｅ
１１／匹移植し、１０〜１４日後にモノクローナル抗体
を高濃度に含む腹水全採取した。

コノ腹水を０．９％ＮａＣＪ液を加え５〜１０倍希釈し
友後、硫酸アンモニウム′ｆｔ４０％濃度となるように
加え、沈澱画分を分取した。この沈澱画分をなるべく少
量の０．９％ＮａＣＪ　液で溶解させた後、０．９％Ｎ
ａＣＪ　Ｒｔ−外液として透析した。透析終了後、高速
液体クロマトグラフィー（ＴＳＫ−Ｇθ１１Ｇ−３００
０ＳＷ）を行い、ＩｇＭ画分を得、精製モノクローナル
抗体とした。

（ロ）本りローン株は、ＢＳＡ含無血清培地中でも増殖
させることができる。すなわち、０．５１　ＢＳＡ含無
血清培地（ＲＩＴＣｓ　５−９　培地）中で増殖させ、
培養上清を集めた。この上清に硫酸アンモニウムを４０
％濃度となるように加え、沈澱画分を分取し、これＫＯ
，９％ＮａＣＪ液を加え、溶解させた後。

さらに硫酸アンモニウムを４０％濃度となるように加え
沈澱画分を分取した。この沈澱画分をなるべく少量の０
．９％ＭａＣ１液で溶解させた後、０．０２Ｍ生理的リ
ン酸緩衝液を外液として透析した。透析終了後、この溶
液をＤＥＡＥ−セルロファイン力ラムに加え、カラムク
ロマトグラフィーを行った。

（５）モノクローナル抗体の特性 かくしてスクリーニングされたクローンの産生ずるモノ
クローナル抗体の性状は１表２及び表３のとお）である
。免疫グロブリンのクラスはオフタロニー法で検定した
。

なお、本発明で用いた酵素抗体法は、ケネット（Ｋｅｎ
ｎｅｔｔ）　　ラの方法〔モノクロナル　アンチボ７Ｅ
　−（７’レニウム　プレス）ニューヨーク　コント９
ン、３７６、（１９８０））に準じて細胞をそのｔま利
用するエリザ（ＥＬＩＺＡ）法〔エンザイムリンクトウ
　イムノツルはントアッセイ（ＢｎｚｙｍｅＬｉｎｋｅ
ｄ　Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　Ａｓ５ａｙ）Ｊ　　
（以下、　ＣＥＬ工ＳＡと略す）である。

表２ 表３　・抗ＫＡＴα１モノクローナル抗体の反応特異性
ＣＥＬ工ＳＡ反応性は、＋は反応陽性と判定される測定
検体の程度で示した。−は陰性を示した。

ＣＥＬＩＳＡ法におけるＯＤ　４９ｏ値は、−：〜０．
０４９、±：　０．０５０−０．０９９、＋：０．１０
０〜０．３９９゜（ほか２名） 手続補正書 昭和６０年１０月２７臼 １、事件の表示 昭和６０年特許願第　１７５６６９　　号２、発明の名
称 モノクローナル抗体 ３、補正をする者 事件との関係：特許出願人 名称　株式会社　ミドリ十字 霞が関ビル内郵便局　私書箱第４９号 栄光特許事務所　ｍ　ｆｆ１ｉ　（５８１）−９６０１
（代表）７、補正の対象 明細書の「発明の詳細な説明」の欄 ８、補正の内容 明細書の発明の詳細な説明の記載を以下の如く補正する
。

（１）　　第２頁１６行目の「則ち」を「即ち」と補正
する。

（２）第３頁／ｉ行目の「得える」を「得木」と補正す
る。

（３）第４頁１４行目の「則ち」を「即ち」と補正する
。

（４）第７頁１９行目の「セラビイ」を「セラビイ」と
補正する。

＋５１第８頁９行目の「フロイド」を「フロイント」と
補正てる。

（６）第８頁１８行目の［＝１Ｊを［：１Ｊと補正する
。

（〕）第１５頁３行目のｒＥＬＩＺＡＪをｌ’−ＥＬＩ
ＳＡＪと補正する。

（８）第１６頁表３の「株化細胞の名称」の欄のｒｃｃ
Ｄ−４５ＳｋＪの「由来」の欄に記載の「正常皮７Ｍ維
等」を「正常皮フ繊維芽」と補正する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）印環型胃癌由来株（ＫＡＴＯ−III）を免疫原と
   して作製されたハイブリドーマの産生する以下の特性を
   もつモノクローナル抗体。 ［１］Ｉｇクラス：ＩｇＭ ［２］認識抗原タイプ：細胞膜表在型抗原 ［３］癌細胞との反応性：少なくとも次の癌細胞に対し
   て陽性を示す。 胃癌（ＫＡＴＯ−III）、胃癌（ＭＫＮ−２８）（２）
   癌細胞との反応性がさらに肺癌（ＰＣ−９）に対して陽
   性を示す特許請求の範囲第（１）項記載のモノクローナ
   ル抗体。 （３）癌細胞との反応性がさらに食道癌（ＴＥ−１）、
   に対して陽性を示す特許請求の範囲第（２）項記載のモ
   ノクローナル抗体。 （４）癌細胞との反応性がさらに胃癌（ＮＲＣ−１２）
   に対して陽性を示す特許請求の範囲第（３）項記載のモ
   ノクローナル抗体。 （５）癌細胞との反応性がさらに食道癌（ＴＥ−２）、
   食道癌（ＴＥ−３）、肺癌（ＰＣ−３）に対して陽性を
   示す特許請求の範囲第（３）項記載のモノクローナル抗
   体。 （６）癌細胞との反応性がさらに食道癌（ＴＥ−２）、
   食道癌（ＴＥ−３）に対して陽性を示す特許請求の範囲
   第（１）項記載のモノクローナル抗体。