JPS59128397A - 抗ヒト胃癌抗体 - Google Patents
抗ヒト胃癌抗体Info
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- JPS59128397A JPS59128397A JP374283A JP374283A JPS59128397A JP S59128397 A JPS59128397 A JP S59128397A JP 374283 A JP374283 A JP 374283A JP 374283 A JP374283 A JP 374283A JP S59128397 A JPS59128397 A JP S59128397A
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- Japan
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- cells
- gastric cancer
- antibody
- cell
- human gastric
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はヒト冑癌細胞に選択特異的に反応する新規なモ
ノクロナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔ量ｂｏｄ
ｙ ）に関する。
ノクロナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔ量ｂｏｄ
ｙ ）に関する。
近年、細胞融合法を利用してモノクロナル抗体を製造し
、これにより細胞のタイプに特異的な抗原の検出と解析
を行おうとする多くの研究がｈされている。特に、ヒト
癌細胞における抗原解析については多くの研究がなされ
、例えば悪性黒色腫（メラノーマ）、大腸癌、肺癌、卵
巣癌、前立腺癌、膵臓癌等の癌細胞に反応するモノクロ
ナル抗体が報告されている〔例えば、ムｒｅｈ、Ｂｉｏ
ｅｈａｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、５２１７．６４７〜６５１
頁（１９８２）及び１Ｊｃｉｅｎｃｅ 、 ２１２．５
３〜５５頁（１９８１）参照〕。
、これにより細胞のタイプに特異的な抗原の検出と解析
を行おうとする多くの研究がｈされている。特に、ヒト
癌細胞における抗原解析については多くの研究がなされ
、例えば悪性黒色腫（メラノーマ）、大腸癌、肺癌、卵
巣癌、前立腺癌、膵臓癌等の癌細胞に反応するモノクロ
ナル抗体が報告されている〔例えば、ムｒｅｈ、Ｂｉｏ
ｅｈａｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、５２１７．６４７〜６５１
頁（１９８２）及び１Ｊｃｉｅｎｃｅ 、 ２１２．５
３〜５５頁（１９８１）参照〕。
しかしながら、従来知られているヒト冑癌細胞と′反応
性を有する抗体は、背痛細胞以外の癌細胞あるいは正常
細胞とも交叉反応性を有するため、ヒト背痛の診断尋に
は使用できないという欠点があった。
性を有する抗体は、背痛細胞以外の癌細胞あるいは正常
細胞とも交叉反応性を有するため、ヒト背痛の診断尋に
は使用できないという欠点があった。
そこで、本発明者は斯かる欠点を解決せんと鋭意研党を
行った結果、胃癌細胞と選択特異的に反応し、ヒト正常
細胞、線維芽細胞、肺癌、膀胱癌、十二指腸瘍、子宮癌
、卵巣癌等の背痛以外の癌細胞とは反応しないモノクロ
ナル抗体を得ることに成功し、本発明を児成した。
行った結果、胃癌細胞と選択特異的に反応し、ヒト正常
細胞、線維芽細胞、肺癌、膀胱癌、十二指腸瘍、子宮癌
、卵巣癌等の背痛以外の癌細胞とは反応しないモノクロ
ナル抗体を得ることに成功し、本発明を児成した。
すなわち、本発明は、ヒト胃癌細胞で免疫した噴孔動物
の免疫細胞と骨髄腫細胞との融合によって得られるノ・
イブリドーアより生成されるヒト胃癌細胞と特異的に反
応するモノクロナル抗体を提供するものである。
の免疫細胞と骨髄腫細胞との融合によって得られるノ・
イブリドーアより生成されるヒト胃癌細胞と特異的に反
応するモノクロナル抗体を提供するものである。
本発明のモノクロナル抗体は上記のような特性を有して
いるので、ヒト胃癌の診断、治療及び研究に極めて有用
である。また、本発明のモノクロナル抗体は上記の如く
、ヒト胃癌細胞と特異的に反応することによって特定さ
れるが、その一つの態様として、ヒト胃癌細胞のうち、
特に分化型に分類される細胞に強く反応する。従って、
この抗体を用いれば、多様性に富むヒト胃癌の組織像に
おいて、その分化度の分類を、従来の煩雑な病理形態学
的観察によらず、容易かつ短時間に常に一定した結果を
得ることができる。
いるので、ヒト胃癌の診断、治療及び研究に極めて有用
である。また、本発明のモノクロナル抗体は上記の如く
、ヒト胃癌細胞と特異的に反応することによって特定さ
れるが、その一つの態様として、ヒト胃癌細胞のうち、
特に分化型に分類される細胞に強く反応する。従って、
この抗体を用いれば、多様性に富むヒト胃癌の組織像に
おいて、その分化度の分類を、従来の煩雑な病理形態学
的観察によらず、容易かつ短時間に常に一定した結果を
得ることができる。
本発明の抗ヒト背痛抗体は、ヒト胃癌細胞で免疫した哺
乳動物の免疫細胞を骨髄腫細胞と融合させてハイブリド
ーマを生成させ、こねより上記特性を有するモノクロナ
ル抗体を分離することにより製造される。
乳動物の免疫細胞を骨髄腫細胞と融合させてハイブリド
ーマを生成させ、こねより上記特性を有するモノクロナ
ル抗体を分離することにより製造される。
本発明において、ハイブリドーマの調製は、自体公知の
方法、例えばＮ轟ｔｕｒｖ、 ２５６ 。
方法、例えばＮ轟ｔｕｒｖ、 ２５６ 。
４９５〜４９７ （１９７５）姉記載の方法に準じて行
われる。
われる。
抗原のヒト胃癌細胞としては、特に限定されず、すでに
確立された種々の培養ヒト胃癌細胞及び手術片よね得ら
れるヒト胃癌細胞を使用すればよく、好ましくけ、その
分化型の細胞を用いるのがよい。
確立された種々の培養ヒト胃癌細胞及び手術片よね得ら
れるヒト胃癌細胞を使用すればよく、好ましくけ、その
分化型の細胞を用いるのがよい。
ヒト胃癌細胞を免疫する哨乳動物は特に限定されないが
、細胞融合に使用する骨髄肺細胞との適合性を考慮して
選択するのが好ましく、一般にはマウス、ラット等が使
用される。
、細胞融合に使用する骨髄肺細胞との適合性を考慮して
選択するのが好ましく、一般にはマウス、ラット等が使
用される。
免疫も一般的方法によって行われ、例えばヒト胃癌細胞
を生理食塩水等で適当濃度に希釈し、フロイントの補助
液等との懸濁液とし、動物に皮内注射等によって投与す
る。投与は１〜２週間毎に数回行い、総投与量が１×１
０８個／マウス程度になるようにするのが好ましい。免
疫細胞としては、最終免疫約３日後に摘出した胱臓細胞
を使用するのが好ましい。
を生理食塩水等で適当濃度に希釈し、フロイントの補助
液等との懸濁液とし、動物に皮内注射等によって投与す
る。投与は１〜２週間毎に数回行い、総投与量が１×１
０８個／マウス程度になるようにするのが好ましい。免
疫細胞としては、最終免疫約３日後に摘出した胱臓細胞
を使用するのが好ましい。
次いで、かくして得た免疫細胞と骨髄腫細胞を融合する
。骨髄腫細胞としては、すでに公知の種々の細胞、例え
ばマウスにおけるＭＳ−１、Ｐ３、Ｐ３−Ｕｌ、Ｘ４５
．８ｐ２、Ｘ６３．６，５．３、ラットにおける７３゜
Ａｆ １ 、２ 、３等が使用される。融合反応は公知
の細胞融合方法に準じて行われ、例えば融合促進剤の存
在下培地中でインキュベートすることによって行われる
。
。骨髄腫細胞としては、すでに公知の種々の細胞、例え
ばマウスにおけるＭＳ−１、Ｐ３、Ｐ３−Ｕｌ、Ｘ４５
．８ｐ２、Ｘ６３．６，５．３、ラットにおける７３゜
Ａｆ １ 、２ 、３等が使用される。融合反応は公知
の細胞融合方法に準じて行われ、例えば融合促進剤の存
在下培地中でインキュベートすることによって行われる
。
融合促進剤としては、ν１１えはポリエチレングリコー
ル［ＰＥＧ ）、センダイウィルス（ＩＩＶＪ）等が使
用され、更に所望により融合効率を高めるだめにジメチ
ルスルホキシド等の補助剤を添加することができる。免
疫細胞と骨髄腫細胞との使用比は一般の方法と変りがな
く、例えば骨髄腫細胞に対し、免疫細胞を約１〜１０倍
程度用いればよい。上記融合時の培地としては、例えば
骨髄腫細胞株の増殖に用いられるようなＭＥＭ培地、そ
のダルベツコ改質培地、ＲＰＭＩ −１６４０培地、そ
の他この種の細胞培養に利用される通常の各種培地を利
用でき、通常はＦｅ２等の血清補液を抜いておくのがよ
い。
ル［ＰＥＧ ）、センダイウィルス（ＩＩＶＪ）等が使
用され、更に所望により融合効率を高めるだめにジメチ
ルスルホキシド等の補助剤を添加することができる。免
疫細胞と骨髄腫細胞との使用比は一般の方法と変りがな
く、例えば骨髄腫細胞に対し、免疫細胞を約１〜１０倍
程度用いればよい。上記融合時の培地としては、例えば
骨髄腫細胞株の増殖に用いられるようなＭＥＭ培地、そ
のダルベツコ改質培地、ＲＰＭＩ −１６４０培地、そ
の他この種の細胞培養に利用される通常の各種培地を利
用でき、通常はＦｅ２等の血清補液を抜いておくのがよ
い。
融合は、上記免疫細胞と骨髄腫細胞との所定量を上記培
地内でよく混ぜ、遠沈後上清を除去し、予め３７℃程度
に加温したＰＥＧ溶液、例えば平均分子量１，０００〜
６．０００程度のものを通常培地に約３０〜６０ ｗ
／ ｖ％の濃度で加えてまぜあわせることにより行なわ
れる。
地内でよく混ぜ、遠沈後上清を除去し、予め３７℃程度
に加温したＰＥＧ溶液、例えば平均分子量１，０００〜
６．０００程度のものを通常培地に約３０〜６０ ｗ
／ ｖ％の濃度で加えてまぜあわせることにより行なわ
れる。
以後、適当な培地を逐次添加して遠沈し、上清を除去す
る操作を縁り返すことによりハイプリドーマが形成され
る。
る操作を縁り返すことによりハイプリドーマが形成され
る。
所望のハイプリドーマの分離は、上記細胞融合後の細胞
を、通常のハイプリドーマ選別用培地で培養することに
よ゛り行なわれる。前記した骨髄腫細胞株はヒポキサン
チングアニンホスホリボシルトランスフ゛エラーゼ（Ｈ
ＧＰＲＴ）欠損株であり、しだがってＨＡＴ培地（ヒポ
キサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む培地）
中では生育できない。従ってＨＡＴ培地中で生育してく
不細胞を選択すればよい。
を、通常のハイプリドーマ選別用培地で培養することに
よ゛り行なわれる。前記した骨髄腫細胞株はヒポキサン
チングアニンホスホリボシルトランスフ゛エラーゼ（Ｈ
ＧＰＲＴ）欠損株であり、しだがってＨＡＴ培地（ヒポ
キサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む培地）
中では生育できない。従ってＨＡＴ培地中で生育してく
不細胞を選択すればよい。
該）ＩＡＴ培地での細胞の培養は、目的とするハイプリ
ドーマ以外の細胞（未融合細胞等）が死滅するのに充分
な時間、通常数日〜数週間行えばよい、このハイプリド
ーマはヒボキサンチン及びチミジンを含むＨＴ培地で１
〜２週間程度培養した後、通常の培地で培養すればよい
。
ドーマ以外の細胞（未融合細胞等）が死滅するのに充分
な時間、通常数日〜数週間行えばよい、このハイプリド
ーマはヒボキサンチン及びチミジンを含むＨＴ培地で１
〜２週間程度培養した後、通常の培地で培養すればよい
。
かくして得られるハイプリドーマは通常の限界希釈法に
従い、目的とする抗体の産生株の検索及び単一クローン
化が行ガわねる。かくして得らハる本発明のモノクロへ
ナル抗体を産生ずるハイブリドーマは、通常の培地で継
代培養でき、また液体窒素中で容易に長期間保存が可能
である。本発明者は、このハイプリドーマの代表として
、後記実施例によって得られる人Ｈ−１〜ＡＨ−６の夫
々を自ら分醸可能な状態に保持している。
従い、目的とする抗体の産生株の検索及び単一クローン
化が行ガわねる。かくして得らハる本発明のモノクロへ
ナル抗体を産生ずるハイブリドーマは、通常の培地で継
代培養でき、また液体窒素中で容易に長期間保存が可能
である。本発明者は、このハイプリドーマの代表として
、後記実施例によって得られる人Ｈ−１〜ＡＨ−６の夫
々を自ら分醸可能な状態に保持している。
このようにして得たハイブリドーマが目的のモノクロへ
ナル抗体を産生ずるかどうかの検索は、例えばＥＩＪＳ
Ａ法［Ｅｎｇｖａｌｌ、Ｅ、；Ｍｏｔｈ。
ナル抗体を産生ずるかどうかの検索は、例えばＥＩＪＳ
Ａ法［Ｅｎｇｖａｌｌ、Ｅ、；Ｍｏｔｈ。
Ｅｎｚｙｍｏｌ、 ７０ ＋ ４１９−４３９ （１９
８０））及びプラーク法、スポット法、凝集反応法、Ｏ
ｕｃｈｔｅｒｌｏｎｇ法、ＲＩＡ法の一般に抗体の検出
に用いられている種々の方法によって行われる〔「ハイ
プリドーマ法とモノクローナル抗体」、（株）Ｒ＆Ｄプ
ランニング発行、昭和５７年３月５日〕。
８０））及びプラーク法、スポット法、凝集反応法、Ｏ
ｕｃｈｔｅｒｌｏｎｇ法、ＲＩＡ法の一般に抗体の検出
に用いられている種々の方法によって行われる〔「ハイ
プリドーマ法とモノクローナル抗体」、（株）Ｒ＆Ｄプ
ランニング発行、昭和５７年３月５日〕。
上記のようにして得た特定のハイブリドーマから本発明
の抗ヒト背筋細胞抗体を得るには、ハイブリドーマを常
法に従って組織培養し、培養上清から分離する方法、あ
るいはハイブリドーマをこれと適合性のある哺乳動物に
投与し増殖させ、その腹水から分離する方法等が採用さ
れる。前者の方法は高純度のものを得るのによく、後者
の方法は大量生産に優れている。
の抗ヒト背筋細胞抗体を得るには、ハイブリドーマを常
法に従って組織培養し、培養上清から分離する方法、あ
るいはハイブリドーマをこれと適合性のある哺乳動物に
投与し増殖させ、その腹水から分離する方法等が採用さ
れる。前者の方法は高純度のものを得るのによく、後者
の方法は大量生産に優れている。
このようＫすると、ハイブリドーマＡＨ−１〜ＡＨ−６
から、後記試験例に示す如く、ヒ占 ト冑癌細胞と特異的に反応するモノクロル抗体が得られ
る。
から、後記試験例に示す如く、ヒ占 ト冑癌細胞と特異的に反応するモノクロル抗体が得られ
る。
次に、実施例及び試験例を挙けて説明する。
実施例及び試験例で使用した培養癌細胞株は全て公知の
ものであり、次に示す文献に記載されている、 ＭＫＮ ７４：Ｌａｎｃｅｔ、３ｐＪｕｌｙｓ７〜１０
（１９８２）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、、４２，６０１〜
６０８（１９８２）ＭＫＮ２８ 同 上 八（ＫＮ４５ 同 上 ＭＫ ２ 同 上 ＭＫＮ １ 同 上 ＫＡＴＯＩ 同 上 ＱＧ ５６ ： Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、４２．６０
１〜６０８（１９８２）ＱＧ ９０ 同
上 ＰＣ３同 上 １３Ｃ７同上 ＰＣ９同 上 ＰＣ１０同上 ＲＴ ４ ： Ｉｍｍｕｎｏｅｂ＠ｍ１ａｔｒｙ ｌ
１５ ＋ ４２９〜４３６（１９７８，’＋Ｊ、Ｎａ
ｔ１．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎ５ｔ、 ５８ ！ ２０９〜
２１４（１９７７）ＨｖＴｖ ｆ３０ 同
上ＨｅＬａ 同上 ５Ｋ−ＯＶ３ 同 上実施例１ １１ａｌｂ ／ ｃマウスに、ヒト培養癌細胞ＭＫＮ
７４．２ Ｘ １０’個を生理食塩水に浮遊液させたも
のを腹腔内に投与する。２週間間隔で合計３回同量を投
与し、最終免疫の３日後にｒｓ＃Ｌを摘出し、牌細胞を
ＲＰＭＩ −１６４０培地で３回洗浄する。マウス骨髄
腫細胞株ＮＳ ／ １ （ＮａｔｕｒｅＶｏｌ−２５６
、Ａｕｇｕｓｔ ７（１９７５）］を同様に洗浄後、こ
のＮＳ／Ｉ ｌＸ１０’Ｕと上記牌細胞４ Ｘ １０
７個を５０ゴ遠心管に入れ混合する。
ものであり、次に示す文献に記載されている、 ＭＫＮ ７４：Ｌａｎｃｅｔ、３ｐＪｕｌｙｓ７〜１０
（１９８２）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、、４２，６０１〜
６０８（１９８２）ＭＫＮ２８ 同 上 八（ＫＮ４５ 同 上 ＭＫ ２ 同 上 ＭＫＮ １ 同 上 ＫＡＴＯＩ 同 上 ＱＧ ５６ ： Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、４２．６０
１〜６０８（１９８２）ＱＧ ９０ 同
上 ＰＣ３同 上 １３Ｃ７同上 ＰＣ９同 上 ＰＣ１０同上 ＲＴ ４ ： Ｉｍｍｕｎｏｅｂ＠ｍ１ａｔｒｙ ｌ
１５ ＋ ４２９〜４３６（１９７８，’＋Ｊ、Ｎａ
ｔ１．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎ５ｔ、 ５８ ！ ２０９〜
２１４（１９７７）ＨｖＴｖ ｆ３０ 同
上ＨｅＬａ 同上 ５Ｋ−ＯＶ３ 同 上実施例１ １１ａｌｂ ／ ｃマウスに、ヒト培養癌細胞ＭＫＮ
７４．２ Ｘ １０’個を生理食塩水に浮遊液させたも
のを腹腔内に投与する。２週間間隔で合計３回同量を投
与し、最終免疫の３日後にｒｓ＃Ｌを摘出し、牌細胞を
ＲＰＭＩ −１６４０培地で３回洗浄する。マウス骨髄
腫細胞株ＮＳ ／ １ （ＮａｔｕｒｅＶｏｌ−２５６
、Ａｕｇｕｓｔ ７（１９７５）］を同様に洗浄後、こ
のＮＳ／Ｉ ｌＸ１０’Ｕと上記牌細胞４ Ｘ １０
７個を５０ゴ遠心管に入れ混合する。
２００×ｆ、５分遠心後、上清をパスツールピペットで
除去する。３７℃に保温した、ポリエチレングリコール
１５００ （Ｅａｓｔｍａｎ、Ｉｎｃ、）５０ ｖ ／
ｖ％のＲＰＭＩ −１６４０溶液１−を滴下し、２分
間ゆっくり混合する。３７℃に保温した１５％ＦＣ８、
Ｉ １１ＭピルベートのＲＰＭＩ−１６４０（以下［完
全ＲＰＭＩ −］ ６４０ Ｊとする）１ｙｅを加え１
分間、更に同量の完全ＲＰＭＩ −１６４０を加え１分
間、次いで８−の完全ＲＰＭＩを滴下し、２分間ゆっく
りと攪拌する。２００Ｘｆ、５分遠心後、上清を除去し
、３７℃保温完全ｎｐｍｒ −１６４（ｌｃ細胞Ｉ Ｘ
１０’個／ｄとなる様に懸濁し、マイクロテス）−Ｉ
ｔ・プレート（ファルコン社）＆Ｃ１００ｐｔずつ接種
し１．３７℃、５％度酸ガスインキュベーター内で培養
する。２４時間後１． ＯＸ １０−’ Ｍヒボキサン
チン、４．ＯＸ １０−７Ｍアミノプテリン、１．６
Ｘ １０−５Ｍチミジンを含む上記完全ＲＰＭＩ −１
６４０（以下ｒｕＡＴ培地」とする）１００μｔを各ウ
ェルに添加する。以後上清の半分を第２．３．５．８及
び１１日目に、夫々、新しいＨＡＴ培地に換え、１４日
目に同様に上清の半分を、１．ＯＸ １０−４Ｍヒボキ
サンチン、１．６ Ｘ １０−５ Ｍチミジンを含む完
全ＲＰＭＩ −１６４０（以下ｒ ＨＴ培地」とする）
に換える。同様に第１８．２２．２５及び２６日目に上
清の半分をＨＴ培地に換え、第２８Ｂ１に上清の半分を
完全ＲＰＭＩ−１６４０に換える。以抜、この完全ＲＰ
ＭＩ−１６４０で増殖維持する。かくして得られるハイ
ブリドーマは、これを限界希釈法によ、リクローニング
化した。即ち、ハイブリドーマ２．５Ｘ１０個／ｌｎ／
、、Ｂａ１ｂ／ｃマウス胸腺細胞４ Ｘ １０’／ｙｎ
ｌと々る様に完全ＲＰＭＩ −１６４０にｉ！Ｉ！ｌｆ
Ｊ！シ、これをハイプリビーフ５個／ウェルとなる様に
２００ウエルのプレートにまき培養した。増殖してくる
ハイブリドーマを更に同様にハイブリドーマ０．２５個
／ウェルとしてクローニング化した。目的の抗体を産生
ずるクローンの検索はＭＫＮ−７４及びパーオキシダー
ゼ標識ウサギ抗マウス免疫グロブリン（カッベル社！！
りを使用したＥＬＩＳＡ法（： Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｒ
ｎｏｌ 、 ７０ 、４１９〜４３９（１９８０）参照
〕により行った、斯くしてクローン階ＡＨ−１〜ＡＨ−
６を得た。このクローン株はこれが産生ずるモノクロナ
ル抗体忙よって特定され、これらは後述の試験例（３）
に示す特性を有する。このＡＨ−１〜ＡＨ−５は液体官
素中で安定に保存されている。
除去する。３７℃に保温した、ポリエチレングリコール
１５００ （Ｅａｓｔｍａｎ、Ｉｎｃ、）５０ ｖ ／
ｖ％のＲＰＭＩ −１６４０溶液１−を滴下し、２分
間ゆっくり混合する。３７℃に保温した１５％ＦＣ８、
Ｉ １１ＭピルベートのＲＰＭＩ−１６４０（以下［完
全ＲＰＭＩ −］ ６４０ Ｊとする）１ｙｅを加え１
分間、更に同量の完全ＲＰＭＩ −１６４０を加え１分
間、次いで８−の完全ＲＰＭＩを滴下し、２分間ゆっく
りと攪拌する。２００Ｘｆ、５分遠心後、上清を除去し
、３７℃保温完全ｎｐｍｒ −１６４（ｌｃ細胞Ｉ Ｘ
１０’個／ｄとなる様に懸濁し、マイクロテス）−Ｉ
ｔ・プレート（ファルコン社）＆Ｃ１００ｐｔずつ接種
し１．３７℃、５％度酸ガスインキュベーター内で培養
する。２４時間後１． ＯＸ １０−’ Ｍヒボキサン
チン、４．ＯＸ １０−７Ｍアミノプテリン、１．６
Ｘ １０−５Ｍチミジンを含む上記完全ＲＰＭＩ −１
６４０（以下ｒｕＡＴ培地」とする）１００μｔを各ウ
ェルに添加する。以後上清の半分を第２．３．５．８及
び１１日目に、夫々、新しいＨＡＴ培地に換え、１４日
目に同様に上清の半分を、１．ＯＸ １０−４Ｍヒボキ
サンチン、１．６ Ｘ １０−５ Ｍチミジンを含む完
全ＲＰＭＩ −１６４０（以下ｒ ＨＴ培地」とする）
に換える。同様に第１８．２２．２５及び２６日目に上
清の半分をＨＴ培地に換え、第２８Ｂ１に上清の半分を
完全ＲＰＭＩ−１６４０に換える。以抜、この完全ＲＰ
ＭＩ−１６４０で増殖維持する。かくして得られるハイ
ブリドーマは、これを限界希釈法によ、リクローニング
化した。即ち、ハイブリドーマ２．５Ｘ１０個／ｌｎ／
、、Ｂａ１ｂ／ｃマウス胸腺細胞４ Ｘ １０’／ｙｎ
ｌと々る様に完全ＲＰＭＩ −１６４０にｉ！Ｉ！ｌｆ
Ｊ！シ、これをハイプリビーフ５個／ウェルとなる様に
２００ウエルのプレートにまき培養した。増殖してくる
ハイブリドーマを更に同様にハイブリドーマ０．２５個
／ウェルとしてクローニング化した。目的の抗体を産生
ずるクローンの検索はＭＫＮ−７４及びパーオキシダー
ゼ標識ウサギ抗マウス免疫グロブリン（カッベル社！！
りを使用したＥＬＩＳＡ法（： Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｒ
ｎｏｌ 、 ７０ 、４１９〜４３９（１９８０）参照
〕により行った、斯くしてクローン階ＡＨ−１〜ＡＨ−
６を得た。このクローン株はこれが産生ずるモノクロナ
ル抗体忙よって特定され、これらは後述の試験例（３）
に示す特性を有する。このＡＨ−１〜ＡＨ−５は液体官
素中で安定に保存されている。
実施例２
（１）実施例１で得だＡＨ−１〜ＡＨ−６の各ハイブリ
ドーマをそれぞれ完全ＲＰＭＩ −１６４０培地ニて５
％炭酸ガスインキュベーター中テ、３７℃にて４８時間
培養した。培養液を遠心分離（３，００Ｏｒｐｍ、１９
分）して、本発明のモノクロナル抗体を含む培養上清を
取得した。以下、ハイブリドーマＡＨ−１〜ＡＨ−６由
来の抗体をそれぞれ「抗体１」〜「抗体６」と相称する
。
ドーマをそれぞれ完全ＲＰＭＩ −１６４０培地ニて５
％炭酸ガスインキュベーター中テ、３７℃にて４８時間
培養した。培養液を遠心分離（３，００Ｏｒｐｍ、１９
分）して、本発明のモノクロナル抗体を含む培養上清を
取得した。以下、ハイブリドーマＡＨ−１〜ＡＨ−６由
来の抗体をそれぞれ「抗体１」〜「抗体６」と相称する
。
（ｊ） 実施例１で得たＡＨ−１〜ＡＨ−６のハイブ
リドーマをそれぞれＩ Ｘ １０’個をＲｐＭＩ −１
６４０培地０．５ｍ／に懸濁し、Ｂａ１ｂ ／ ｅ マ
ウスに腹腔内投与した。２〜３週間後、蓄積した腹水を
採取し、抗体１〜抗体６を含む腹水２〜５−／マウスを
得た。これらの抗体濃度は伺れも０．２〜ｌＷ！ｇ、／
＋＋／であった。
リドーマをそれぞれＩ Ｘ １０’個をＲｐＭＩ −１
６４０培地０．５ｍ／に懸濁し、Ｂａ１ｂ ／ ｅ マ
ウスに腹腔内投与した。２〜３週間後、蓄積した腹水を
採取し、抗体１〜抗体６を含む腹水２〜５−／マウスを
得た。これらの抗体濃度は伺れも０．２〜ｌＷ！ｇ、／
＋＋／であった。
試験例
（１）免疫グロプリンタラス：
各種マウス免疫グロプリンタラスに対するウサギ抗体（
Ｌｌｔｔｏｎ、Ｂｉｏｎｅｔｉｅｏ、Ｉｎｃ、Ｋｅｎ＋
ｓ１ｎｇｔｏｎ。
Ｌｌｔｔｏｎ、Ｂｉｏｎｅｔｉｅｏ、Ｉｎｃ、Ｋｅｎ＋
ｓ１ｎｇｔｏｎ。
ＭＤ ２０７９５ ） 及ヒ１２’Ｉ ｓ識７’ ｏ
ｆインＡ ヲ使用してＹｅｈ等の方法に準じて行った［
： Ｍｉｎｇ −Ｙａｎｇ Ｙｅｈ ｅｔａｌ Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。
ｆインＡ ヲ使用してＹｅｈ等の方法に準じて行った［
： Ｍｉｎｇ −Ｙａｎｇ Ｙｅｈ ｅｔａｌ Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、ＵＳＡ、Ｍｏ１．７６ 、Ｎｎ ６ 、 ｐｐ
、２−９２７−２９３１ 。
、２−９２７−２９３１ 。
（１９７９））。
結果を下記第１表に示す、
第１表
（２） 培養ヒト胃癌細胞株ＭＫＮ −７４に対する
反応性： ９６穴ｆｆ（クロプレート（フロー社）の各ウェルに１
０％ＦＣ８加ＲＰＭＩ −１６４０培地に浮遊させたＭ
ＫＮ −７４，２Ｘ１０’Ｍを加え、３７℃、５％炭酸
ガス下で培養する。細胞が草層に増殖してきたところで
培養をやめ、培養液をすて、０．０１ＭＩＪン酸緩衝液
（ｐＨ７，２）（以下ｒ ｐｕｓ 」という）で細胞を
洗浄する。０．１％グルタルアルデヒドのＰＢＳを各ウ
ェルに１００μｔずつ加え、室温に３０分間放置して細
胞を固定する。細胞をｐｎｓで洗浄後、段階希釈した抗
体１〜６（腹水）の１００μｌを各ウェルに加え、３７
℃で４５分間反応させる。 ＰＢＳで２度洗浄した後ｉ
ｏ、ｏ ｏ 。
反応性： ９６穴ｆｆ（クロプレート（フロー社）の各ウェルに１
０％ＦＣ８加ＲＰＭＩ −１６４０培地に浮遊させたＭ
ＫＮ −７４，２Ｘ１０’Ｍを加え、３７℃、５％炭酸
ガス下で培養する。細胞が草層に増殖してきたところで
培養をやめ、培養液をすて、０．０１ＭＩＪン酸緩衝液
（ｐＨ７，２）（以下ｒ ｐｕｓ 」という）で細胞を
洗浄する。０．１％グルタルアルデヒドのＰＢＳを各ウ
ェルに１００μｔずつ加え、室温に３０分間放置して細
胞を固定する。細胞をｐｎｓで洗浄後、段階希釈した抗
体１〜６（腹水）の１００μｌを各ウェルに加え、３７
℃で４５分間反応させる。 ＰＢＳで２度洗浄した後ｉ
ｏ、ｏ ｏ 。
ｅｐｍの″′Ｉ標識プロティンＡをｉ ｏ ｏ ｐｔ加
え、３７℃で４５分間反応＋る。プレートをＰＢＳで洗
浄後、各ウェルを切り取り、結合した１２５１標識プロ
ティン人を、オートガンマカウンターで測定することに
より、各抗体のＭｘＮ −７４に対する結合性を検討し
た。その結果を第１図に示す。尚第１図中の各符号は次
のものを示す。
え、３７℃で４５分間反応＋る。プレートをＰＢＳで洗
浄後、各ウェルを切り取り、結合した１２５１標識プロ
ティン人を、オートガンマカウンターで測定することに
より、各抗体のＭｘＮ −７４に対する結合性を検討し
た。その結果を第１図に示す。尚第１図中の各符号は次
のものを示す。
（ト）○ ：抗体１
ゾ
△−△ ：１２
０臼］：１３
・−・ ：１４
ムーム ＠ ｙ ５
ＩＩ−ＩＩ ： ＃ ６
（３） 各種ヒト細胞との反応性：
抗体１（培養上清）を使用して、各細胞株に対する反応
性を上記（２）と同様にして測定した。結果を第２図に
示す。尚第２図中、横軸はＭＫＮ −７４に結合した１
２５１標識プロテインムの放射活性を１００％とした結
合率％で示した。
性を上記（２）と同様にして測定した。結果を第２図に
示す。尚第２図中、横軸はＭＫＮ −７４に結合した１
２５１標識プロテインムの放射活性を１００％とした結
合率％で示した。
（４）手術組織との反応性：
プロテインムーセファロースヵラムによるアフィニティ
クロマトにより精製した抗体−１（腹水）を使用して［
Ｉｍｍｕｎｏｅｈｅｍｉａｔｒｙ＊１５．４２９−４３
６（１９７８）参照］、以下の試験を行った、 胃癌患者の手術組織由来の癌組織（ＷＨＯ分類に従って
組織型を分類した）、２８例及び正常組織２０例を用い
、これを、０．３％過酸化水素のメタノール中で３０分
間インキュベートし、内在のパーオキシダーゼ活性をブ
ロックした。組織をｐｎｓで洗浄後、ＰＢＳにて１００
倍希釈した正常マウス血清とインキュベートし、ｌ Ｉ
ｉＣｐｎｓにて洗浄する。次いで、上記抗体−１と室温
で６０分インキュベートし、ＰＢＳにて３回洗浄後、Ｐ
ＢＳにて２０倍希釈したパーオキシダーゼ標識ウサギ抗
マウス免疫グロブリン（ダコケミカル社）と６０分イン
キュベートする。ｐｎｓにて洗浄後、過酸化水素中ジア
ミノベンジジンと５分間インキュベート後、洗浄し、ヘ
マトキシリンにて対比染色した。その結果を第２表に示
す。
クロマトにより精製した抗体−１（腹水）を使用して［
Ｉｍｍｕｎｏｅｈｅｍｉａｔｒｙ＊１５．４２９−４３
６（１９７８）参照］、以下の試験を行った、 胃癌患者の手術組織由来の癌組織（ＷＨＯ分類に従って
組織型を分類した）、２８例及び正常組織２０例を用い
、これを、０．３％過酸化水素のメタノール中で３０分
間インキュベートし、内在のパーオキシダーゼ活性をブ
ロックした。組織をｐｎｓで洗浄後、ＰＢＳにて１００
倍希釈した正常マウス血清とインキュベートし、ｌ Ｉ
ｉＣｐｎｓにて洗浄する。次いで、上記抗体−１と室温
で６０分インキュベートし、ＰＢＳにて３回洗浄後、Ｐ
ＢＳにて２０倍希釈したパーオキシダーゼ標識ウサギ抗
マウス免疫グロブリン（ダコケミカル社）と６０分イン
キュベートする。ｐｎｓにて洗浄後、過酸化水素中ジア
ミノベンジジンと５分間インキュベート後、洗浄し、ヘ
マトキシリンにて対比染色した。その結果を第２表に示
す。
第２表
（５）細胞蛋白との反応性：
ＭＫＮ ７４、ＭＫＮ ４５及びＷＩ３８より、細胞蛋
白を、２％Ｅｍｐｉｇｅｎ ＢＢ （アルプライト＆ウ
ィルソン社：イギリス）、０１％ソジウムドデシルサル
フエート（ＳＤＳ ）の５ ｍＭホウ酸緩衝液にて抽出
するＣ Ｊ、Ｒｌａｌ、Ｃｈｅｍ、。
白を、２％Ｅｍｐｉｇｅｎ ＢＢ （アルプライト＆ウ
ィルソン社：イギリス）、０１％ソジウムドデシルサル
フエート（ＳＤＳ ）の５ ｍＭホウ酸緩衝液にて抽出
するＣ Ｊ、Ｒｌａｌ、Ｃｈｅｍ、。
２５６．６９５３−６９６０．（１９８１）参照〕。
これに、２％ＳＤＳ、５％２−メルカプトエタノールの
上記緩衝液を加え、水浴中、５分間加熱後、８％ポリア
クリルアミドゲルに付し、電気泳動する。これをＰＢＳ
中ＶＣ１晩浸漬した後、５％牛血清アルブビン（ＢＡＡ
）のＰＢＳ中に２時間浸漬する。次いで、該ケル聚１
％Ｂ８人のＰＢＳにて１．ｏｏｏ倍希釈した抗体１の４
０−と室温にて１８時間インキュベートし、ＰＢＳにて
洗浄後、１％ＢＳＡのＰＢＳにて５００倍希釈したウサ
ギ抗マウスＩｇＧ１抗体（前記に同じ）の４０ゴと８時
間インキュベートする。ゲルをＰＢＳにて３回洗浄後、
１％ＢＳＡのＰＢＳ中、Ｉ Ｘ １０７ｅｐｍの１２５
１標識プロテインＡと２時間インキュベートし、ＰＢＳ
Ｋで５回洗浄後、乾燥し、ＡＸＲ−２フイルム（コダッ
ク社）に感光した。分子量マーカーは、下記を使用した
。
上記緩衝液を加え、水浴中、５分間加熱後、８％ポリア
クリルアミドゲルに付し、電気泳動する。これをＰＢＳ
中ＶＣ１晩浸漬した後、５％牛血清アルブビン（ＢＡＡ
）のＰＢＳ中に２時間浸漬する。次いで、該ケル聚１
％Ｂ８人のＰＢＳにて１．ｏｏｏ倍希釈した抗体１の４
０−と室温にて１８時間インキュベートし、ＰＢＳにて
洗浄後、１％ＢＳＡのＰＢＳにて５００倍希釈したウサ
ギ抗マウスＩｇＧ１抗体（前記に同じ）の４０ゴと８時
間インキュベートする。ゲルをＰＢＳにて３回洗浄後、
１％ＢＳＡのＰＢＳ中、Ｉ Ｘ １０７ｅｐｍの１２５
１標識プロテインＡと２時間インキュベートし、ＰＢＳ
Ｋで５回洗浄後、乾燥し、ＡＸＲ−２フイルム（コダッ
ク社）に感光した。分子量マーカーは、下記を使用した
。
Ｍ、Ｗ、２００，０００：ミオシン（５ｋｅｌｅｔａｌ
ｍｕｓｃｌｅｍｙｏｓｉｎ ） １１６．０００：β−ガラクトシダーゼ
４゜９４．０００：フォスフォリラーゼＢ ６８．０００：Ｂ５Ａ ４３．０００ニオブアルブミン 結果を第３図に示す（、第３図中レーン１，２及び３は
クマーシーブルー染色、レーン４゜５及び６はオートラ
ジオグラム像を示す。レーン１及び４はＭＫＮ ７４抽
出蛋白、レーン２及び５はＭＫＮ ４５抽出蛋白、レー
ン３及び６はＷＩ３８抽出蛋白である。泥３図から背筋
細胞株ＭＫＮ ７４及びＭＫＮ ４５由来のＭ、Ｗ、系
Ｓ４５，０００の蛋白と本発明の抗体１が反応すること
が判る。同様にして得た綜維芽細胞株ＷＩ ３８には抗
体１と反応性を有する蛋白は存在しかい。
ｍｕｓｃｌｅｍｙｏｓｉｎ ） １１６．０００：β−ガラクトシダーゼ
４゜９４．０００：フォスフォリラーゼＢ ６８．０００：Ｂ５Ａ ４３．０００ニオブアルブミン 結果を第３図に示す（、第３図中レーン１，２及び３は
クマーシーブルー染色、レーン４゜５及び６はオートラ
ジオグラム像を示す。レーン１及び４はＭＫＮ ７４抽
出蛋白、レーン２及び５はＭＫＮ ４５抽出蛋白、レー
ン３及び６はＷＩ３８抽出蛋白である。泥３図から背筋
細胞株ＭＫＮ ７４及びＭＫＮ ４５由来のＭ、Ｗ、系
Ｓ４５，０００の蛋白と本発明の抗体１が反応すること
が判る。同様にして得た綜維芽細胞株ＷＩ ３８には抗
体１と反応性を有する蛋白は存在しかい。
第１図は本発明抗体と培養背筋細胞ＭＫＮ７４との反応
性を示す図面、第２図は本発明抗体と各種細胞との反応
性を示す図面、第３図はポリアクリルアミドゲル電気泳
動により分離した細胞蛋白と本発明抗体との反応性を示
す図面である。 以上 出願人 株式会社 日本抗体研究所 第１図 １０ １０２．１０３１０１ １０５ １０６１０７抗
体の希釈倍 抗体Ｉ ＫＮ 卵巣癌 線維芽Ｍ闘Ｉ １３５ １・５ Ｃｒａｗ［ Ｂ −→・°亀 ｒｅｎｔ ｒＩＩｗｆ ａｓｎｅｒ ヒトＲＩＩＣ Ｔｙｐｅ・ 結合率％
性を示す図面、第２図は本発明抗体と各種細胞との反応
性を示す図面、第３図はポリアクリルアミドゲル電気泳
動により分離した細胞蛋白と本発明抗体との反応性を示
す図面である。 以上 出願人 株式会社 日本抗体研究所 第１図 １０ １０２．１０３１０１ １０５ １０６１０７抗
体の希釈倍 抗体Ｉ ＫＮ 卵巣癌 線維芽Ｍ闘Ｉ １３５ １・５ Ｃｒａｗ［ Ｂ −→・°亀 ｒｅｎｔ ｒＩＩｗｆ ａｓｎｅｒ ヒトＲＩＩＣ Ｔｙｐｅ・ 結合率％
Claims (1)
- １、 ヒト冑癌細胞で免疫した叶乳動物の免疫細胞と骨
髄腫細胞との融合によって得られるハイブリドーマより
生成されるヒト冑癌細胞と特異的に反応するモノクロナ
ル抗体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP374283A JPS59128397A (ja) | 1983-01-13 | 1983-01-13 | 抗ヒト胃癌抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP374283A JPS59128397A (ja) | 1983-01-13 | 1983-01-13 | 抗ヒト胃癌抗体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59128397A true JPS59128397A (ja) | 1984-07-24 |
Family
ID=11565656
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP374283A Pending JPS59128397A (ja) | 1983-01-13 | 1983-01-13 | 抗ヒト胃癌抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59128397A (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59176298A (ja) * | 1983-03-11 | 1984-10-05 | スロ−ン−ケツタリング・インステイテユ−ト・フオ−・キヤンサ−・リサ−チ | ヒト結腸がんに対するモノクロ−ナル抗体および方法 |
| JPS6236397A (ja) * | 1985-08-12 | 1987-02-17 | Green Cross Corp:The | モノクロ−ナル抗体 |
| JPS6270400A (ja) * | 1985-09-25 | 1987-03-31 | Hagiwara Yoshihide | ガン関連抗原特異的ヒト免疫グロブリン生産性ヒト／ヒトハイブリド−マ及びその生産する抗体 |
| JPS62185099A (ja) * | 1986-02-10 | 1987-08-13 | Green Cross Corp:The | 制癌作用物質複合体 |
| EP0235817A2 (en) * | 1986-03-06 | 1987-09-09 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Anti-human stomach cancer monoclonal antibody |
| JPS6321562A (ja) * | 1986-07-15 | 1988-01-29 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | 抗ヒト胃癌単クロ−ン性抗体ａｍｃ−４６２ |
-
1983
- 1983-01-13 JP JP374283A patent/JPS59128397A/ja active Pending
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59176298A (ja) * | 1983-03-11 | 1984-10-05 | スロ−ン−ケツタリング・インステイテユ−ト・フオ−・キヤンサ−・リサ−チ | ヒト結腸がんに対するモノクロ−ナル抗体および方法 |
| JPS6236397A (ja) * | 1985-08-12 | 1987-02-17 | Green Cross Corp:The | モノクロ−ナル抗体 |
| JPS6270400A (ja) * | 1985-09-25 | 1987-03-31 | Hagiwara Yoshihide | ガン関連抗原特異的ヒト免疫グロブリン生産性ヒト／ヒトハイブリド−マ及びその生産する抗体 |
| JPS62185099A (ja) * | 1986-02-10 | 1987-08-13 | Green Cross Corp:The | 制癌作用物質複合体 |
| EP0235817A2 (en) * | 1986-03-06 | 1987-09-09 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Anti-human stomach cancer monoclonal antibody |
| EP0235817A3 (en) * | 1986-03-06 | 1990-08-22 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Anti-human stomach cancer monoclonal antibody |
| JPS6321562A (ja) * | 1986-07-15 | 1988-01-29 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | 抗ヒト胃癌単クロ−ン性抗体ａｍｃ−４６２ |
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