JPS62185099A - 制癌作用物質複合体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、前低分化型腺癌由来細胞株（ＭＫＮ−４５）
を免疫原として作成されたハイブリドーマが産生ずる特
定の特性を有するモノクローナル抗体またはそのフラグ
メントと、制癌作用物質とを酸化デキストランを介して
結合させてなる癌細胞への集積性の優れた制癌作用物質
複合体に関する。

〔従来技術〕

各種の制癌剤を全身的に投与し、癌細胞を死滅させるこ
とは通常の方法である。この場合、制癌剤が全身的に分
布するため、効果を発揮するに十分な濃度を得るために
は大量投与せざるを得ないのが現状である。

ところが、制癌効果が発現する投与量と副作用が発現す
る投与量が近接していることが多く、制癌効果が期待さ
れるにもかかわらず、副作用の発現により投与を中止せ
ざるを得ないことになり、不幸な結果となることが多い
。これを防止するためには、換言すれば、効果の発現濃
度と副作用発現濃度に差をつけるためには、癌細胞に制
癌剤を特異的に集積させることが必須である。

このために、癌細胞に親和性の高い物質を運搬体とし、
制癌剤を高濃度に局所に運搬させるという考え方が注目
を集めている。

このような運搬体として、免疫グロブリン、癌特異抗体
、フィブロネクチン、リポソーム、脂肪乳剤などが考え
られている。

ところで、このような運搬体として癌特異抗体を用いる
場合、治療を目的とする癌細胞に含まれる抗原に対して
特異的な抗体を使用しなければ特異的な集積を生じない
。

そこでこうした条件に適する癌ｖＰ異抗体の一つとして
モノクローナル抗体〔不一チャー（Ｎａｔｕｒｅ）、１
温、４９５　、（１９７５））が考えられる。

即ち、癌細胞上の癌特異抗原または癌関連抗原を特異的
に認識するモノクローナル抗体を得、これを制癌作用物
質の運搬体とすることにより、正常組織にはダメージを
最小限に抑え、癌細胞のみを特異的に攻撃できるものと
期待される。

〔発明が解決しようとする問題点〕

特定の癌抗原に対して特異的に反応するモノクローナル
抗体としては、各種のものが知られている。

そこで、本発明者らは、特異性の高い好適な運搬体とし
て、前低分化型腺癌由来細胞株（Ｍ　Ｋ　Ｎ−４５）を
免疫原として作成されたハイブリドーマが産生ずる特定
の特性を有するモノクローナル抗体（特願昭６０−８１
２９号中に記載）を選択した。

すなわち、このモノクローナル抗体を運搬体として用い
ることにより、各制癌作用物質単独投与に比べて癌細胞
への集積が向上し、制癌効果が著しく改善されることを
見出して本発明を完成した。

即ち、本発明は癌細胞への集積が向上し、制癌効果が著
しく改善された制癌物質複合体を提供することを目的と
する。

〔問題点を解決するため°の手段〕

本発明は、 ■前低分化型腺癌由来細胞株（ＭＫＮ−４５）を免疫原
として作成されたハイブリドーマが産生ずる、 ■Ｉｇクラス：ＩｇＧ１（κ）、 ■認識抗原タイプ：細胞膜表覆型抗原、■癌細胞との反
応性：食道癌（ＴＥ−３）、肺癌（ＰＣ−３）、胃癌（
ＭＫＮ−４５）、胃癌（ＫＡＴＯ−１１１）　、肝癌（
ＨＥ　Ｋ）細胞に対して陽性を示す、 以上［１］〜［４］の特性を有するモノクローナル抗体
またはそのフラグメントと、制癌作用物質とを酸化デキ
ストランを介して結合させてなる制癌作用物質複合体で
ある。

本発明で用いられるモノクローナル抗体は、前記［１］
〜［４］の特性を有するものであれば、特に制限されな
い。また、当＝亥モノクローナル抗体のフラグメントと
しては、たとえば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’　、Ｆａ
ｂなどが使用される。

本発明で使用されるモノクローナル抗体を調製する方法
としては、例えば特願昭６０−８１２９号明細書に開示
されている方法が例示される。

本発明で用いられる酸化デキストランは分子量１０００
〜１０万程度のデキストランを酸化剤によって環開裂さ
せたものである。その開裂度は１０〜１００％であるこ
とが好ましい。酸化剤としては過ヨウ素酸ナトリウムが
挙げられる。

また、酸化デキストランの調製方法は公知の方法に準じ
て行えばよく、たとえば、プロシーデインダス・オブ・
ナショナル・アカデミ−・ソサイアティ・ニーニスエイ
（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＩＪＳＡ　、互、　２１２８．１９７６年）に記載され
ている方法等を用いればよい。

たとえば、デキストラン１ｇに対して約０．１〜５．０
ｇの酸化剤を添加し、５〜３０℃で１〜４８時間反応を
行う。反応終了後、たとえば反応液を蒸留水に対し１０
〜３０時間透析し、好ましくは凍結乾燥を行って酸化（
開裂）デキストランを得る。

本発明は特定のモノクローナル抗体を使用するところに
特徴を有するものであり、従って本発明で使用される制
癌作用物質は、アルデヒド基と反応性の基（例えばアミ
ン基、水酸基）を有するものであればよく、また、かか
る反応性の店を有しないものについても、当該制癌作用
物質に適当な化合物を反応させてアルデヒド基と反応性
のものに導くことによって本発明に使用しうる。好適な
制癌作用物質としてはたとえば、ダウノマイシン、マイ
トマイシンＣ１アドリアマイシンなどが挙げられる。

本発明の複合体を調製する方法としては、酸化デキスト
ラン、制癌物質およびモノクローナル抗体を同時に反応
させる方法（第１法）、まず酸化デキストランと制癌物
質とを反応させておき、次にモノクローナル抗体を反応
させる方法（第２法）、まず酸化デキストランとモノク
ローナル抗体とを反応させ、次に制癌物質を反応させる
方法（第３法）等があり、好ましくは第２法が用いられ
る。

第２法の概略は以下の通りである。

酸化デキストランと制癌作用物質との反応に際して、酸
化デキストラン１分子に対して制癌作用物質２〜２００
分子を結合させることが好ましく、かかる比とするため
には、例えばｐｌ＋６〜９において水性溶媒（好ましく
は、リン酸緩衝液）中に酸化デキストランを約０．０５
〜３０　ｗ／ｖ％、制癌作用物質を約０．０５〜ＩＯＷ
／Ｖ％となるように加えて０〜３０℃で１０分〜１５時
間程度反応させることが好適である。かくして、酸化デ
キストラン−制癌作用物質複合体が得られる。未反応の
制癌作用物質はゲル濾過法の他、自体公知の手段にて除
去される。

当該酸化デキストラン−制癌作用物質複合体にモノクロ
ーナル抗体を結合させるに際しては、当該複合体Ｏ９１
〜３０Ｗ／Ｖ％を食合する反応液にモノクローナル抗体
をたとえば０．１〜３０Ｗ／Ｖ％となるように添加し、
０〜３０℃で１〜４０時間反応させる。

このようにして得られた本発明複合体はゲル濾過、イオ
ン交換体などを用いて精製することができる。

また、本発明複合体製造時または製造後の複合体の過剰
な重合を防ぐために、酸化デキストランの未反応アルデ
ヒド基を保護することも可能である。保護方法としては
、ＮＨ，基を有する化合物（例えば、アミノ酸、アミノ
糖など）による処理が例示される。具体的には、例えば
、最終的に複合体を調製させる反応（上記第２法で言え
ば、酸化デキストラン−制癌作用物質複合体にモノクロ
ーナル抗体を結合させる反応）中に同時に保護を行うこ
とができる。あるいは、中間体（第２法で言えば、酸化
デキストラン−制癌作用物質複合体）調製後に未反応ア
ルデヒド基の約８５〜９５％を保護してから、モノクロ
ーナル抗体を反応させる方法なども挙げられる。

かくして得られた複合体は、例えば除菌濾過を行った後
、分注し、液状凍結品あるいは凍結乾燥した乾燥製剤と
される。

本発明複合体は、分子量が１６万〜１００万程度であり
、その結合比がモノクローナル抗体１分子に対してデキ
ストラン１〜３０分子、制癌作用物質１０〜７０分子で
ある。

本発明複合体はヒトを始めとする哺乳動物の癌に対して
有効であり、本発明の複合体に結合せしめた制癌作用物
質に応じた制癌作用が発揮される。

本発明の複合体はたとえば静脈内投与、点滴静注される
。当該複合体は製薬上許容される賦形剤、希釈剤等、た
とえば注射用蒸留水、生理食塩液等を使用して、たとえ
ば注射剤、点滴剤として製剤化される０本発明複合体の
投与量は、投与対象の種類、症状、体重、年齢等に応し
て変わりうる゛ものであり、たとえば胃癌の治療におい
ては、１０ｍｇ〜ｌＯｇの本発明複合体を適当な溶媒０
．５〜５０〇−に溶解し、１日１回または数回に分けて
投与される。

〔発明の効果〕

本発明複合体は、癌細胞に効率よく集積するので、正常
細胞に対する毒性を低く抑えることができる。従って、
その治療係数（効果を現す投与星／毒性を現す投与量）
が高く、ヒトの制癌剤として有用なものである。

〔参考例〕

＋１＋　　免疫用癌関連抗原の調製 株化胃癌細胞（ＭＫＮ−４５株）を超音波処理法で破壊
し、遠心分＃　（１５，０ＯＯＧ、３０分）を行い細胞
抽出液を得た。この上清をセファロース４Ｂのカラムを
用い、ゲル濾過し、高分子画分と低分子画分とに分離し
た。

分子■が約７０万〜１５０万の高分子画分を、完全フロ
インドアジュバントと混和後、マウスへ週１回、５週間
免疫した。

最終免疫より４日後にマウス肺臓を取り出し、以下の細
胞融合に用いた。

（２）細胞融合およびクローニング： 上記のマウス牌細胞と、マウスミエローマｘ６３゜６．
５．３．　（ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、）　、１２３．１５４８　（１９７９
）　）とを４＝１の割合で混合し、ケーラー（にｉ５ｈ
　１ｅｒ）らの方法〔イムノロジカル・メソッド（アカ
デミツク・プレス）ニューヨーク（１＋＋ｍｕｎｏｌｏ
ｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄ　（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅ
ｓｓ）、　Ｎｅｗ　Ｗｏｒｋ）　、３９１　、　（１９
７９））を一部改変して、４２．６％ポリエチレングリ
コール（平均分子量１．ｏｏｏ　）を用いて２分間反応
させることにより細胞融合を行った。

本細胞を９６ウエルマイクロプレートに植え込み、ＨＡ
Ｔ培地（表１）で９〜１４日間培養後、ＩＴ培地（表１
）に移行し、更にフラスコ（２５ｃＩ１１）に培養でき
るようになってからＤ−ＭＥＭ培地（表１）で培養した
。増殖の見られたウェルの培養上清中の抗体価を酵素抗
体法により測定し、適切なウェルから限界希釈法により
、求めるハイブリドーマのクローニングを行った。

すなわち、マイクロタイタープレートにウェル当たり２
５，０００個のマウス腹腔浸出細胞を植え込み、次にＤ
−ＭＥＭ培地で、１０．５．２．５．１個１０．１ｍ７
となるようにハイブリドーマを希釈し、これをマイクロ
タイタープレートに０．１　ｍｌずつ植え込み培養した
。４日後にＤ−ＭＥＭ培地を０．ｌ−加え、以後４〜７
日に１度、培地の半量交換を行った。培養開始後１０〜
２０日で肉眼で認められるコロニーが形成され、クロー
ン株を得た。

（余白） 表１ （３）　　スクリーニング法 得られたハイブリドーマについて目的とするモノクロー
ナル抗体を１生するクローンのスクリーニングを次のよ
うに行った。

（イ）方法の説明 以下のようにして酵素抗体法を行った。

抗原（各種株化癌細胞、部分精製癌関連抗原又は正常細
胞）をコートしたマイクロプレートに検体を加え、３７
℃で１時間反応させ、洗浄後ペルオキシダーゼ標識抗マ
ウス免疫グロブリン（ＩｇＧ＋　Ｉ　ｇＡ＋　Ｉ　ｇＭ
）ウサギ抗体を加え、更に３７℃で１時間反応させた。

未反応の標識抗体を洗浄後、Ｏ−フェニレンジアミン液
を加え、室温にて３００分間反応せた後、２Ｍ硫酸を加
えて反応を停止させ、４９０ｎｍの吸光度を測定した。

この方法で各種細胞との反応性を調べた。なお白血球と
の交叉反応性はＢ−ガラクトシダーゼ（Ｂ−Ｇａｌａｃ
ｔｏｓｉｄａｓｅ）標識抗体を用いた。その他、ヒト赤
血球との交叉反応性は、ヒ）Ａ、Ｂ、０型寿命球を混合
しＰＨＡ法で検討した。癌胎児性抗原（Ｃａｒｃｉｎｏ
ｅ＋＋ｂｒｙｏｎｉｃａｎｔｉｇｅｎ）　（ＣＥ　Ａ）
との交叉反応性は、ＣＥＡ％作血球を用いＰＨＡ法で行
った。

モノクローナル抗体がＭＫＮ−４５の分泌物抗原か或い
は細胞膜抗原のどちらを認識しているかの検討のために
、ＭＫＮ−４５の培養上清でモノクローナル抗体とＭＫ
Ｎ−４５細胞そのものとの反応性が阻害されるかどうか
を調べた。

酵素抗体法を用いたインヒビジョン　テスト（ｉｎｈｉ
ｂｉｔｉｏｎ　ｔｅｓｔ）の具体的な方法は、以下の通
りである。即ち、ハイブリドーマの上清を酵素抗体法で
タイトレージョン（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）を行い、それ
より判断して適当な希釈倍率を決める。次にＭＫＮ−４
５培養上清を５〜２５倍濃縮したものを原液として、１
：５．１：５２　・・・ｌ：５１１希釈したものを適当
に希釈したハイプリドーマ上清にそれぞれ等量刑え、１
時間、３７℃でインキエベーションする。そして、通常
の酵素抗体法（ターゲット：　ＭＫＮ−４５）の系でア
ッセイ（ａｓｓａｙ）を行った。

（ロ）スクリーニングの流れ １次スクリーニング：ターゲットセル（ＭＫＮ−４５）
及び正常由来細胞（Ｆｌｏ縛２０００）を用いた酵素抗
体法で、ＭＫＮ−４５に対して陽性でＦｌｏｗ２０００
に対して陰性な−ｅｌｌを選抜。

２次スクリーニング：さらに他の正常由来細胞株及び赤
血球、白血球を用いたアッセイ系ですべてに陰性の−ｅ
ｌｌを選抜。

３次スクリーニング二以上で選抜された細胞株を２〜３
回クローニングし、その培養上清を多くの癌由来のｃａ
ｌｌ　１ｉｎｅとの反応性を検討するとともに、分泌型
或いは細胞膜型抗原のどちらを認識するかを、酵素抗体
法を用いたインヒビジョンテストで同定する。

（４）モノクローナル抗体の回収、精製（イ）上記のス
クリーニングによって得られたクローン株を予め０．５
ｍｌ／匹プリスタンを投与した４週令以後のＢＡＬＢ／
Ｃマウス（ａ）の腹腔内へ２．０〜３．Ｏｘ　１０’　
ｃｅｌｌ／匹移植し、１０−１４日後にモノクローナル
抗体を高濃度に含む腹水を採取した。

この腹水を０．９％ＮａＣ１液に加え５〜１０倍希釈し
た後、硫酸アンモニウムを４０％濃度となるように加え
、沈澱画分を分取した。この沈澱画分をなるべく少量の
０．９％ＮａＣ１液で溶解させた後、０．９％ＮａＣｊ
！液を外液として透析した。

透析終了後、高速液体クロマトグラフィー（ＴＳＫ−Ｇ
ｅｌｌ　Ｇ−３０００５Ｗ　）を行い、ＩｇＧ画分を得
、精製モノクローナル抗体とした。

（ロ）本りローン株は、ＢＳＡ含無血清培地中でも増殖
させることができる。すなわち、０．５％ＢＳＡ含無血
清培地（ＲＩＴＣ５５−９培地）中で増殖させ、培養上
清を集めた。この上清に硫酸アンモニウムを４０％濃度
となるように加え、沈澱画分を分取し、これに０．９％
Ｎ　ａ　Ｃ１ｔ（ｔＥを加え、溶解させた後、さらに硫
酸アンモニウムを４０％濃度となるように加え沈澱画分
を分取した。この沈澱画分をなるべく少量の０．９％Ｎ
ａＣｊｌ液で溶解させた後、０．０２　Ｍ生理的リン酸
緩衝液を外液として透析した。透析終了後、この溶液を
再び抗生胎児血清抗体（ウサギ）を結合したセファロー
ス４８カラムに通した後ＤＥＡＥ−セルロファインカラ
ムに加え、カラムクロマトグラフィーを行った。

ＤＥＡＥ−セルロファインクロマトグラフイーの最初の
ピーク部分を精製モノクローナル抗体とした。

（５）モノクローナル抗体の特性 かくしてスクリーニングされたクローンの産生ずるモノ
クローナル抗体の性状は、表２および表３のとおりであ
る。免疫グロブリンのクラスはオフタロニー法で検定し
た。

なお、本発明で用いた酵素抗体法は、ケ不ソト（Ｋｅｎ
ｎｅＬｔ　）　らの方法〔モノクロナル　アンチボディ
ー（ブレニウム　プレス）ニューヨーク　ロンドン、ｙ
υ、（１９８０）　）に準して細胞をそのまま利用する
エリザ（εＬＩＳＡ）法〔エンザイム　リンクド　イム
ノソルベント　アッセイ（Ｅｎｚｙｍｅ　Ｌｉｎｋｅｄ
ｌｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎＬ　Ａｓ５ａｙ））　（以下
、ＣＥＬＩＳ＾と略す）である。

実施例１ （モノクローナル抗体の調製） 参考例により、背低分化型腺癌由来細胞株（ＭＫＮ−４
５）を免疫原として調製されたモノクローナル抗体ＣＤ
、は表２および表３に示すような性状を有していた。

（風下余白） 表２　ヒト由来株化癌細胞に対する反応性ＣＥＬ　Ｉ　
ＳＡ反応性は、＋は反応陽性と判定される測定検体の程
度で示した。−は陰性を示した。

なお、ＣＥＬＩＳＡ法における０Ｄａｑ。値は、＝０．
０５未満 ＋　：　０．１以上０．４未満 である。

表３（性状） ＜ｆｌｌ化デキストランの調製） デキストラン（分子！１ｔｌｏ、０００）　５　ｇを５
０ｍＭリン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ７，２）に溶解し、
過ヨウ素酸ナトリウム１４．４ｇを加えた後、暗所で３
時間反応させた。反応後、この反応液を水に対して十分
透析した後、凍結乾燥し、１００％酸化デキストランを
得た。

（複合体の調！！！り 得られた１００％酸化デキストラン１０ｍｇに対してダ
ウノマイシン１０ｍｇを５０ｍＭリン酸緩衝生理食塩液
（ｐＨ８，０）　　１０　ｍｌで溶解後、室温下２時間
反応を行った。その後この反応液を、ゲル濾過に供し、
未反応のダウノマイシンを除去、ダウノマイシン−デキ
ストラン複合体を得た。

得られたダウノマイシン−デキストラン複合体にモノク
ローナル抗体の５０ｍＭリン酸緩衝生理食塩液（２ｈｇ
／ｍｌ）　　１０ｍｌおよびグリシン０．１ｍｇを加え
、室温下２４時間反応を行う。この反応液をゲル濾過に
より未反応のモノクローナル抗体、ダウンマイシン−デ
キストラン複合体およびグリシンを除去後、目的とする
ダウノマイシン−デキストラン−１ｇＧ複合体を得た。

得られたダウンマイシン−デキストラン−モノクローナ
ル抗体の分子量は約２０万、結合モル比はモノクローナ
ル抗体１モルあたり、酸化デキストラン５モル、ダウノ
マイシン２０モルであった。

実施例２ ダウノマイシンのかわりにアドリアマイシンを用いる以
外は、全て実施例１に準じて行い、目的とするアドリア
マイシン−酸化デキストラン−モノクローナル抗体ｃＤ
ｉ？１合体を得た。

この複合体は分子量約２１万であり、結合モル比はモノ
クローナル抗体１モルに対して、酸化デキストラン６モ
ル、アドリアマイシン２０モルであった・ 〔実験例〕 実験例１ 実施例２で得られたアドリアマイシン複合体（ＣＤ　３
　　Ａｄｒ）の３Ｈ−ウリジン取り込み阻害効果をＭＫ
Ｎ−４５細胞を用いて調べた。対照薬剤としては、ＭＫ
Ｎ−４５細胞と反応しない抗ＨＢｓ−モノクローナル抗
体とアドリアマイシンの複合体（抗ＩＩＢｓ−Ａｄｒ　
）を実施例２と同じ方法で得たもの〔分子量約２１万、
結合モル比（抗体１モルあたり）酸化デキストラン６モ
ル、アドリアマイシン２０モル〕を用いた。

方法：ＭＫＮ−４５細胞に各薬剤を３０分間作用させ、
洗浄後３Ｈ−ウリジンを含む培地で３．５時間培養し、
酸不溶性画分に取り込まれた３Ｈ−ウリジンを測定した
。

結果：薬剤と接触させなかった対照群の値を１００％と
して阻害率５０％の薬剤濃度（Ｉ　Ｃ５ｏ）を求め、そ
の結果を表４に示す。

表４ 実験例２ 実施例２で得られたアドリアマイシン複合体（ＣＤｔ　
　Ａｄｒ）の抗腫瘍効果をＭＫＮ−４５細胞を移植した
ヌードマウスを用いて調べた。

方法：ＭＫＮ−４５細胞（１０’ｃｅｌｌｓ　／　７ウ
ス）をヌードマウスに移植後ＩＩＩ瘍が約２００ｍｎ？
に達したときに実施例２で得たモノクローナル抗体（Ｃ
Ｄａ　　Ａｄｒ）を投与し、投与後９日目に腫瘍径を測
定し、次式によって腫瘍容積を算出した。

腫瘍容積（ｍｒｒ？）　＝　（短径）２×長径／２対照
薬剤としては、＋１１アドリアマイシン（Ａｄｒ　）、
（２）実験例１で用いた抗ＨＢｓ−モノクローナル抗体
−アドリアマイシン複合体（抗１１Ｂｓ−Ａｄｒ　）お
よび（３）モノクローナル抗体（ＣＤ：＋）を用いた。

結果：薬剤投与時の腫瘍容積を１．０としたときの９日
目の相対腫瘍容積を表５および表６に示した。

（以下余白） 表５ 表６

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）［１］胃低分化型腺癌由来細胞株（ＭＫＮ−４５
   ）を免疫原として作成されたハイブリドーマが産生する
   、 ［２］Ｉｇクラス：ＩｇＧ＿１（κ）、 ［３］認識抗原タイプ：細胞膜表在型抗原、［４］癌細
   胞との反応性：食道癌（ＴＥ−３）、肺癌（ＰＣ−３）
   、胃癌（ＭＫＮ−４５）、胃癌（ＫＡＴＯ−III）、肝
   癌（ＨＥＫ）細胞に対して陽性を示す、 以上［１］〜［４］の特性を有するモノクローナル抗体
   またはそのフラグメントと、制癌作用物質とを酸化デキ
   ストランを介して結合させてなる制癌作用物質複合体。
2. （２）制癌作用物質がアドリアマイシンまたはダウノマ
   イシンである特許請求の範囲第（１）項記載の制癌作用
   物質複合体。