JPH0431674B2 - - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明はヒト肝癌細胞を認識するモノクローナ
ル抗体（以下MoAbと略記することがある）、お
よび該モノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマ、並びに該ハイブリドーマを用いたモノクロ
ーナル抗体の製造法、さらには該モノクローナル
抗体の利用に関する。特に、本発明はヒト肝癌細
胞を正常細胞と区別して特異的に認識するととも
に、生体内で肝癌細胞のみを傷害する作用を持つ
モノクローナル抗体に関する。 （従来技術） 1975年、Ｋｏ¨hlerとMilsteinは、マウスミエロ
ーマP3Ｋの誘導変異株であるP3X63−Ag8
（HGPRT欠損株）と、抗ヒツジ赤血球マウス抗
体産生細胞よりハイブリドーマを作製し、このハ
イブリドーマが自律増殖性と抗ヒツジ赤血球抗体
産生能を共に有していることを報告した。この研
究で示された、単一抗原決定基のみを認識する均
一な抗体、即ちモノクローナル抗体の概念は、免
疫学、医学、薬学、生物学の分野で大いに注目を
集めた。1977年Wistar研究所のH.Koprowskiら
は、ウイルス又は悪性腫瘍に対するMoAbを産生
するハイブリドーマを作製し、MoAbの試薬とし
ての有用性、有効性を示すと共に治療薬としての
可能性を示唆した。殊に抗悪性腫瘍抗体の作製の
報告は、癌特異抗原を特異的に認識している可能
性から、それまで正常細胞へのダメージを免れな
かつた癌の治療という臨床分野に大いに注目され
た。即ち、癌特異抗原を特異的に認識する抗体に
よれば、たとえ同一個体から発生した細胞であつ
ても、正常細胞に対する反応性は無く、癌細胞の
みを特異的に識別することができる。この抗体自
身が細胞傷害性をもつか又は、この抗体に制ガン
剤を結びつければ、癌細胞のみを標的とした治療
ができると期待された。 この期待を実現すべく、種々の癌細胞に対する
MoAbの作成が試みられて来た（Proc.Natl.
Acad.Sci.75 3405（1978）；Proc.Natl.Acad.Sci.
76 1438（1979）；Proc.Natl.Acad.Sci.77 6841
（1980）；Br.J.Cancer43 696（1981））。しかし、
得られたMoAbは正常細胞との交叉反応性を示す
など、必ずしも癌特異抗原のみを認識していると
は限らないこと、また、癌特異的である場合で
も、この抗体でin vivo系における癌の治療を試
みたところ、一部の白血病などには効果を納めた
が、肝癌を代表とする固型癌には治療効果が認め
られないことが判明した（Cancer Res.403147
（1980）；Blood58 141（1981））。 したがつて、癌の治療に使用しうる抗体の条件
として、第一に癌細胞に特異的であり、正常細胞
との反応性を持たぬこと、および第二にin vivo
において実際に癌細胞に対する傷害性を有するこ
とが要求されるが、このような要求を同時に満足
し、癌の治療薬として有効なMoAbは未だ報告さ
れていない。なかでも、本発明が提供した肝癌細
胞の治療に有用なMoAbについての報告はない。 今日、肝癌の治療は切除術の適用が多くを占め
ているが、切除術による治療には限界がある。す
なわち、肝の70〜80％は切除可能と言われるが、
肝硬変合併例の場合、切除後に肝再生の期待でき
ない症例もあり、このような場合、切除が肝硬変
をさらに進行させる。化学療法剤等の薬剤を用い
た肝癌の治療法においても、投与の時期、方法、
部位を工夫するなど種々の方法が試みられている
が、未だに確立した方法や満足できる治療効果を
示す例は得られていない。このため肝癌細胞のみ
を特異的に認識し、死滅させることのできる
MoAbの開発が特に望まれている。 （発明が解決しようとする問題点） 本発明者らは、in vivo系においても肝癌細胞
を特異的に認識し、および死滅させうるMoAbの
作製とその診断・治療薬への利用を目的として研
究を行つた結果、ヒト肝癌細胞に対する特異的な
細胞傷害性を有し、in vivoでも顕著な抗腫瘍活
性を示すMoAbの開発に成功し、本発明を完成し
た。 （発明の構成） 本発明の抗体は、ヒト肝癌細胞を特異的に認識
するモノクローナル抗体である。 本発明の抗体は、ヒト肝癌細胞で感作された哺
乳動物から取り出した抗体産生細胞と、適当な動
物由来の腫瘍細胞とを融合させ、目的抗体を生産
する融合細胞をクローン化して得られる、本発明
のハイブリドーマを培養して製造される。 本発明のハイブリドーマを得るには、先ず、ヒ
ト肝癌細胞で哺乳動物を感作する。哺乳動物とし
ては、マウス、ラツト、ウサギ、モルモツト等一
般に用いられている動物が使用できる。例えばマ
ウスに抗原とするヒト肝癌細胞を腹腔内又は皮下
等に接種することにより感作する。接種は１回当
り106〜107cells／mouseで１〜２週毎に数回くり
返す。最終感作後１〜５日目に脾臓を摘出し、抗
体産生細胞として使用する。次に、この抗体産生
細胞と融合させてハイブリドーマを得るための親
細胞として、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホ
リボシルトランスフエラーゼ欠損（HGPRT-）
あるいはチミジンキナーゼ欠損（TK-）の様な、
適切な選択マーカーを持つたミエローマ等の腫瘍
細胞株を用意し、これと抗体産生細胞とを融合さ
せてハイブリドーマを作製する。 ハイブリドーマ作製は、培地として、イーグル
のMEM、ダルベツコの改良MEM、RPMI1640
などの通常よく使用されているものに10％CS
（calf serum）又は５％FCS（fetal calf serum）
＋５％CS、あるいは10％FCSを加える。親細胞
の通常の維持は、上記のいずれでも良いが、ハイ
ブリドーマ作製には10％FCSが望ましい。 まず、親細胞であるミエローマ等の腫瘍細胞と
脾細胞とを１：５の比率で用意する。融合剤とし
ては、HVJ（Hemagglutinating virus of
Japan，別名Sendai virus），ポリエチレングリ
コール（PEG）などを使用する。特に30〜50％
程度に調整したPEG1000が良い。融合株のHAT
セレクシヨンの方法は、既に一般化されている
ので省略する。生じるハイブリドーマのスクリー
ニング法は、主に培養上清を用い、間接ロゼツト
法（SPA−bind−SRBC法とも呼ばれる。
SPA：Staphyloco−ccus aureus proteinA，
SRBC：Sheep Red Blood Cell：免疫実験操作
法P2375，1979，日本免疫学会編），ELISA法
（Enzyme linked immuno−sorbent assay）
（Dynatech法）など、公知の方法を用いて目的の
免疫グロブリンを分泌しているハイブリドーマの
クローンをひろいあげる。クローンは徐々にふや
し、105cells／mlに達した時点でサブクローニン
グを行なう。ハイブリドーマの単一性を吟味する
ため、96穴のマイクロウエルにフイーダーレイア
ー（feeder layer）として正常な脾細胞をおよそ
105cells／wellまいた上にハイブリドーマを一穴
に１個より多くならないように（一穴平均確率と
して0.1個）まき、約１週間培養後生育してくる
クローンについて再びスクリーニングを行なう。
このサブクローニングをくり返すことにより、単
一性の本発明ハイブリドーマを得る。 尚、融合の親細胞としての腫瘍細胞は、マウス
ミエローマ細胞に限られることなく、例えば特願
昭58−7744号に本出願人が開示したハイブリドー
マ作製用ヒトメラノーマ細胞ラインを用いてもよ
い。 次に、本発明の肝癌に特異的なモノクローナル
抗体を製造するために、上記で得られたハイブリ
ドーマを培養容器中（in vitro）又は動物体内
（in vivo）で培養する。in vitro系で培養する場
合、培地は先に述べた通常培地にCS又はFCSを
添加したものでよく、この培地で３〜５日培養の
後、培養上澄よりMoAbを得る。in vivo系によ
る培養では、ハイブリドーマを哺乳動物の腹腔に
接種し、７〜14日後に腹水を採取し、これより
MoAbを得る。in vivo系での培養の場合、in
vitro系での培養に比べて遥かに多量の抗体を効
率的に取得しうるので好ましい。 こうして得られた培養上澄又は腹水からの
MoAbの精製は、硫安分画、proteinAセフアロ
ースカラム等の公知の方法を適宜組合せて、例え
ば後記実施例２に記載した様にして行なうことが
できる。 以下、実施例を示すが、これらは特に示さない
限り、下記の条件で行なつた。 培養条件：５％CO2，95％air，湿度約100％，温
度37℃ 培 地：RPMI1640＋10％FCS（CSL社オース
トラリア製） 動 物：BALB／ｃ系マウス（雌 ４週令） 又はBALB／cA−nu／JCR系ヌード
マウス（雌 ６週令） （いずれも日本クレアより購入） 細胞系 ：ヒト肝癌細胞 HC Ｃ−４ マウスミエローマ P3X63−Ag8.653 （いずれも、大学、研究機関等でよく
用いられており、用意に入手しうるもの
である） 実施例１ ハイブリドーマの作成 BALB／ｃ系マウスに、ヒト肝癌培養細胞
（HC Ｃ−４）107個／マウスを１週１回、４週間
に亘り腹腔内接種し、最終接種後３日目に脾臓を
摘出し、脾臓細胞浮遊液を調製した。すなわち、
ステンレスメツシユで圧迫、過し、培地に浮遊
させた。融合の親細胞として、BALB／ｃ系マ
ウス由来ミエローマP3X63−Ag8.653を107細胞培
養して準備した。 融合は、既存法（Nature256 495（1975））に
準じて以下の様に行なつた。 上記で調製したマウス脾臓細胞５×107個とミ
エローマ細胞１×107個とを遠心分離チユーブに
混合し、遠心したのち上清をすて、RPMI1640で
40％に調製したポリエチレングリコール
（PEG1000，和光純薬）をパツクになつた細胞の
上に約0.5ml加え、３分静置したのち、500rpmで
３分間遠心分離し、そののち培地をゆつくり５ml
程度加え、再度遠心分離し、上清をすてた。次
に、Ｔ−75（FalconNo.3024）に、ゆるやかにすべ
ての細胞をうつしとり、約40mlになるように培地
を加え、一晩培養する。次の日にこの培養液を細
胞も含めてすべての遠心チユーブに移し取り、遠
心分離を行ない上清をすてた。次にHAT培地
（RPMI1640培地，10％FCSに終濃度でヒポキサ
ンチン10-4Ｍ，アミノプテリン４×10-7Ｍ，チミ
ジン1.6×10-5Ｍを加える）を40ml加え、よく攪
拌した後、96穴マイクロプレート（Costar，No.
3596）に約100μ／well宛加えた。この状態で
１週間培養すると30〜50％程度の穴にコロニーが
認められた。１週間以後より、適宜HT培地
（HAT培地よりアミノプテリンを除いた組成を
もつ）を１滴（約25〜30μ）各穴に加えた。あ
る程度コロニーが生育した後に（10〜14日後）培
養上澄を用い、間接ロゼツト法でスクリーニング
を行ない、目的のヒト肝癌（HC Ｃ−４）に対
し、抗体を分泌しているかどうか検討した。この
結果、４つのコロニーがHC Ｃ−４に対する抗
体を分泌していた。次に、この４つのコロニーに
ついてサブクローニングを行なつた。即ち、96穴
マイクロプレートにフイーダー層（feeder
layer）として未処理のBALB／ｃ系マウス脾細
胞105cell／wellをまいた上に、上記で得られたコ
ロニーの細胞を0.1cells／wellとなる様に加え、
１週間培養した。得られたクローンについてスク
リーニング及びサブクローニングを行ない、最終
的にHC Ｃ−４に対するモノクローナル抗体を
産生する４つのハイブリドーマを得た。このうち
の１つのハイブリドーマをHY−2014と命名し
た。これから得られるモノクローナル抗体をHC
−2014と命名した。次に、HC−2014の精製法に
ついて述べる。 実施例２ MoAbの精製および特異性の検討 ａ BALB／ｃ系マウスの腹腔に0.5mlのプリス
テン（ミネラルオイル）を投与し、７日後に
HC−2014産生ハイブリドーマ５×106個を腹腔
に接種し、腹水化を行つた。接種の２週間後に
腹水を採取し、以下の方法でMoAbの精製を行
なつた。 まず、得られた腹水30mlを10000rpm，
15min遠心後上清に、硫酸アンモニウムを33.3
％の濃度となるように加え、４℃60min塩析し
た。10000rpm 15min遠心後、沈澱物をPBS
（Phosphate Buffered−Saline；8.1mM−
NaH2PO4，1.5mMKH2PO4，2.7mMKC，
137mMNaC，pH7.2）５mlに溶解し、同液
３に対して一晩透析を行なつた。透析後
Protein Ａセフアロースカラムにかけ、0.1M
酢酸−PBS溶液で溶出し、溶出液を0.1N
NaOHで中和した。 精製されたMoAbは−80℃フリーザーで凍結
保存した。 ｂ 次に、上記ａ）で作製したMoAbのHC Ｃ−
４および他の種々の腫瘍細胞に対する反応性に
ついて、ELISA法および間接ロゼツト法によ
り検討した。 抗原として次の細胞を用いた。 HC Ｃ−４ 抗体産生に用いたヒト肝癌
細胞 A549 ヒト肺癌細胞 KATO ヒト胃癌細胞 AZ521 〃 BM314 ヒト結腸癌細胞 これらの抗原を、５倍〜3125倍の５倍希釈列の
MoAb HC−2014と反応させて、ELISA法にお
ける反応性を調べた。ELISA法には、ザイメド
社β−galactosidaseキツト（丸善より購入）を
使用した。その結果、第４図に示したように、
HC−2014は抗原であるHC Ｃ−４ヒト肝癌細胞
にのみ反応した。 また、HC−2014は間接ロゼツト法において
も、表１に示すように、抗原であるHC Ｃ−４
ヒト肝癌細胞とのみロゼツトを形成し、他の腫瘍
細胞に対しては反応しなかつた。 【表】 実施例３ オクタロニー法によるMoAbのクラ
ス，サブクラスの検討 実施例２で得られたMoAbについてオクタロニ
ー法（Ouchterlony法）により免疫グロブリンの
クラス、サブクラスを決定した。即ち、1.5％ア
ガロース溶液（0.01％NaN3を含む）をペトリ皿
（内径52mm）に５ml宛加え、約30分間凝固するま
で待つた。次に第５図に示すように凝固アガロー
スに穴をあけ、各穴１〜６に下記表２の各抗グロ
ブリン抗体を5μづつ加え、中央の穴７には実
施例２で精製されたモノクローナル抗体を15μ
加えた。この状態で24時間放置し、生じた阻止線
をもつてモノクローナル抗体のクラスを決定し
た。 【表】 この結果、得られたモノクローナル抗体は３と
７の間にのみ、阻止線が生じたことより、マウス
IgGであることが判明した。 次にIgGのサブクラスを検討するために、上記
と同様の実験を行なつた。即ち、アガロース上に
第６図の如く穴をあけ１から４までに各サブクラ
スの抗体（表３）を5μ宛入れ、中央の５に得
られたモノクローナル抗体（HC−2014）を15μ
加え、24時間室温で放置した。 【表】 これらの結果により、得られたモノクローナル
抗体（HC−2014）は２と５の間に阻止線が生じ
たことからIgG2aであることが判つた。 さらに、ハイブリドーマが分泌する抗体の単一
性は、SDSホリアクリルアミドゲル電気泳動法に
より確認した。 実施例４ in vitroにおけるHC−2014のADCC
活性 本発明のモノクローナル抗体が、エフエクター
細胞の存在下にヒト肝癌細胞を攻撃して死滅させ
うることをin vitroで調べるため、HC−2014の
ヒト肝癌細胞（HC Ｃ−４）に対する細胞傷害
性を、ヒト胃癌に対するモノクローナル抗体
（YK024）を対照として、ADCC活性（Antibody
−dependent Cell−mediated Cytotoxicity）に
より検討した。 HC Ｃ−４を96穴マイクロプレートに105
cells／wellの割合でまき、一晩培養した。これ
に、実施例２で得たHC−2014又は、YK024を
０，0.1，0.5，2.5Mg／mlとなる様に加え、30分
間CO2インキユベータに放置した後、PBSを用い
て３回洗浄した。次にエフエクター細胞として
BALB／ｃ系マウスの脾臓細胞を106cells／well
宛加え、一晩培養した後PBSで３回洗浄し、各
wellのHC Ｃ−４の生存の有無を判定した。判
定はトリパンブルーで染色後、生細胞を算定する
ことにより行なつた。 結果を表４に示した。表中、生存率が10％以下
のものをADCC活性陽性（＋）として示す。 【表】 実施例５ 腹水癌モデルに対するHC−2014の抗
腫瘍効果 本発明のモノクローナル抗体が、in vivoにお
いてもヒト肝癌細胞傷害性であることを確認する
ため、ヌードマウスによるモデル試験を行なつ
た。 ヌードマウスを１群６匹に分け、腹腔にHC
Ｃ−４細胞を２×107個接種し、接種日を０日目
として１，３，５日目に実施例２で得た
MoAbHC−2014を1.5mg又は3.0mg腹腔内投与し、
未投与群を対照として生存日数から延命率（ILS
％）を求めたところ、200％以上という高い値を
示した。又、HC−2014投与直後及び投与中に
は、体重の減少並びに毒性症状は認められなかつ
た。なお、延命率（ILS％）は次の式で求めた。 ILS＝（投与群の平均生存日数／対照群の平均生存日
数−１）×100 各群のマウスの生存日数を第２図に示した。 一方、HC Ｃ−４のかわりに、BM314（ヒト結
腸癌培養細胞系）を用いて同様に実験したとこ
ろ、対照群との間に差は認められなかつた。結果
を第３図に示した。 実施例６ 固型癌モデルに対するHC−2014の抗
腫瘍効果 ヌードマウスを１群６匹に分け、背部皮下に
HC Ｃ−４細胞を１×107個接種し（０日目）、実
施例５と同様、１，３，５日目にHC−2014を1.5
mg又は3.0mg腹腔内投与し、腫瘍容積
（長径×短径2／２）をはかり、HC−2014未投与群を 対照としてＴ／Ｃ％を次の式で求めた。 Ｔ／Ｃ％ ＝（投与群の平均腫瘍容積（Ｔ）／対照群の平均
腫瘍容積（Ｃ））×100％ 結果を第１図に示した。図から明らかなとお
り、対照群の一匹が死亡した時点（80日目）で
Ｔ／Ｃ％は10％以下であつた。このことは、本発
明のモノクローナル抗体の投与により、背部の固
型癌の容積が、対照群の1/10以下に抑制されたこ
とを意味する。 （発明の効果） 本発明により得られるモノクローナル抗体は、
免疫原であるヒト肝癌細胞とのみ特異的に結合
し、in vitroにおいてADCC活性を、in vivoにお
いて顕著な抗腫瘍活性を示すことより、EIA法、
RIA法等による、試薬、診断薬として、さらに肝
癌の治療薬としての可能性が期待できる。
ル抗体（以下MoAbと略記することがある）、お
よび該モノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマ、並びに該ハイブリドーマを用いたモノクロ
ーナル抗体の製造法、さらには該モノクローナル
抗体の利用に関する。特に、本発明はヒト肝癌細
胞を正常細胞と区別して特異的に認識するととも
に、生体内で肝癌細胞のみを傷害する作用を持つ
モノクローナル抗体に関する。 （従来技術） 1975年、Ｋｏ¨hlerとMilsteinは、マウスミエロ
ーマP3Ｋの誘導変異株であるP3X63−Ag8
（HGPRT欠損株）と、抗ヒツジ赤血球マウス抗
体産生細胞よりハイブリドーマを作製し、このハ
イブリドーマが自律増殖性と抗ヒツジ赤血球抗体
産生能を共に有していることを報告した。この研
究で示された、単一抗原決定基のみを認識する均
一な抗体、即ちモノクローナル抗体の概念は、免
疫学、医学、薬学、生物学の分野で大いに注目を
集めた。1977年Wistar研究所のH.Koprowskiら
は、ウイルス又は悪性腫瘍に対するMoAbを産生
するハイブリドーマを作製し、MoAbの試薬とし
ての有用性、有効性を示すと共に治療薬としての
可能性を示唆した。殊に抗悪性腫瘍抗体の作製の
報告は、癌特異抗原を特異的に認識している可能
性から、それまで正常細胞へのダメージを免れな
かつた癌の治療という臨床分野に大いに注目され
た。即ち、癌特異抗原を特異的に認識する抗体に
よれば、たとえ同一個体から発生した細胞であつ
ても、正常細胞に対する反応性は無く、癌細胞の
みを特異的に識別することができる。この抗体自
身が細胞傷害性をもつか又は、この抗体に制ガン
剤を結びつければ、癌細胞のみを標的とした治療
ができると期待された。 この期待を実現すべく、種々の癌細胞に対する
MoAbの作成が試みられて来た（Proc.Natl.
Acad.Sci.75 3405（1978）；Proc.Natl.Acad.Sci.
76 1438（1979）；Proc.Natl.Acad.Sci.77 6841
（1980）；Br.J.Cancer43 696（1981））。しかし、
得られたMoAbは正常細胞との交叉反応性を示す
など、必ずしも癌特異抗原のみを認識していると
は限らないこと、また、癌特異的である場合で
も、この抗体でin vivo系における癌の治療を試
みたところ、一部の白血病などには効果を納めた
が、肝癌を代表とする固型癌には治療効果が認め
られないことが判明した（Cancer Res.403147
（1980）；Blood58 141（1981））。 したがつて、癌の治療に使用しうる抗体の条件
として、第一に癌細胞に特異的であり、正常細胞
との反応性を持たぬこと、および第二にin vivo
において実際に癌細胞に対する傷害性を有するこ
とが要求されるが、このような要求を同時に満足
し、癌の治療薬として有効なMoAbは未だ報告さ
れていない。なかでも、本発明が提供した肝癌細
胞の治療に有用なMoAbについての報告はない。 今日、肝癌の治療は切除術の適用が多くを占め
ているが、切除術による治療には限界がある。す
なわち、肝の70〜80％は切除可能と言われるが、
肝硬変合併例の場合、切除後に肝再生の期待でき
ない症例もあり、このような場合、切除が肝硬変
をさらに進行させる。化学療法剤等の薬剤を用い
た肝癌の治療法においても、投与の時期、方法、
部位を工夫するなど種々の方法が試みられている
が、未だに確立した方法や満足できる治療効果を
示す例は得られていない。このため肝癌細胞のみ
を特異的に認識し、死滅させることのできる
MoAbの開発が特に望まれている。 （発明が解決しようとする問題点） 本発明者らは、in vivo系においても肝癌細胞
を特異的に認識し、および死滅させうるMoAbの
作製とその診断・治療薬への利用を目的として研
究を行つた結果、ヒト肝癌細胞に対する特異的な
細胞傷害性を有し、in vivoでも顕著な抗腫瘍活
性を示すMoAbの開発に成功し、本発明を完成し
た。 （発明の構成） 本発明の抗体は、ヒト肝癌細胞を特異的に認識
するモノクローナル抗体である。 本発明の抗体は、ヒト肝癌細胞で感作された哺
乳動物から取り出した抗体産生細胞と、適当な動
物由来の腫瘍細胞とを融合させ、目的抗体を生産
する融合細胞をクローン化して得られる、本発明
のハイブリドーマを培養して製造される。 本発明のハイブリドーマを得るには、先ず、ヒ
ト肝癌細胞で哺乳動物を感作する。哺乳動物とし
ては、マウス、ラツト、ウサギ、モルモツト等一
般に用いられている動物が使用できる。例えばマ
ウスに抗原とするヒト肝癌細胞を腹腔内又は皮下
等に接種することにより感作する。接種は１回当
り106〜107cells／mouseで１〜２週毎に数回くり
返す。最終感作後１〜５日目に脾臓を摘出し、抗
体産生細胞として使用する。次に、この抗体産生
細胞と融合させてハイブリドーマを得るための親
細胞として、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホ
リボシルトランスフエラーゼ欠損（HGPRT-）
あるいはチミジンキナーゼ欠損（TK-）の様な、
適切な選択マーカーを持つたミエローマ等の腫瘍
細胞株を用意し、これと抗体産生細胞とを融合さ
せてハイブリドーマを作製する。 ハイブリドーマ作製は、培地として、イーグル
のMEM、ダルベツコの改良MEM、RPMI1640
などの通常よく使用されているものに10％CS
（calf serum）又は５％FCS（fetal calf serum）
＋５％CS、あるいは10％FCSを加える。親細胞
の通常の維持は、上記のいずれでも良いが、ハイ
ブリドーマ作製には10％FCSが望ましい。 まず、親細胞であるミエローマ等の腫瘍細胞と
脾細胞とを１：５の比率で用意する。融合剤とし
ては、HVJ（Hemagglutinating virus of
Japan，別名Sendai virus），ポリエチレングリ
コール（PEG）などを使用する。特に30〜50％
程度に調整したPEG1000が良い。融合株のHAT
セレクシヨンの方法は、既に一般化されている
ので省略する。生じるハイブリドーマのスクリー
ニング法は、主に培養上清を用い、間接ロゼツト
法（SPA−bind−SRBC法とも呼ばれる。
SPA：Staphyloco−ccus aureus proteinA，
SRBC：Sheep Red Blood Cell：免疫実験操作
法P2375，1979，日本免疫学会編），ELISA法
（Enzyme linked immuno−sorbent assay）
（Dynatech法）など、公知の方法を用いて目的の
免疫グロブリンを分泌しているハイブリドーマの
クローンをひろいあげる。クローンは徐々にふや
し、105cells／mlに達した時点でサブクローニン
グを行なう。ハイブリドーマの単一性を吟味する
ため、96穴のマイクロウエルにフイーダーレイア
ー（feeder layer）として正常な脾細胞をおよそ
105cells／wellまいた上にハイブリドーマを一穴
に１個より多くならないように（一穴平均確率と
して0.1個）まき、約１週間培養後生育してくる
クローンについて再びスクリーニングを行なう。
このサブクローニングをくり返すことにより、単
一性の本発明ハイブリドーマを得る。 尚、融合の親細胞としての腫瘍細胞は、マウス
ミエローマ細胞に限られることなく、例えば特願
昭58−7744号に本出願人が開示したハイブリドー
マ作製用ヒトメラノーマ細胞ラインを用いてもよ
い。 次に、本発明の肝癌に特異的なモノクローナル
抗体を製造するために、上記で得られたハイブリ
ドーマを培養容器中（in vitro）又は動物体内
（in vivo）で培養する。in vitro系で培養する場
合、培地は先に述べた通常培地にCS又はFCSを
添加したものでよく、この培地で３〜５日培養の
後、培養上澄よりMoAbを得る。in vivo系によ
る培養では、ハイブリドーマを哺乳動物の腹腔に
接種し、７〜14日後に腹水を採取し、これより
MoAbを得る。in vivo系での培養の場合、in
vitro系での培養に比べて遥かに多量の抗体を効
率的に取得しうるので好ましい。 こうして得られた培養上澄又は腹水からの
MoAbの精製は、硫安分画、proteinAセフアロ
ースカラム等の公知の方法を適宜組合せて、例え
ば後記実施例２に記載した様にして行なうことが
できる。 以下、実施例を示すが、これらは特に示さない
限り、下記の条件で行なつた。 培養条件：５％CO2，95％air，湿度約100％，温
度37℃ 培 地：RPMI1640＋10％FCS（CSL社オース
トラリア製） 動 物：BALB／ｃ系マウス（雌 ４週令） 又はBALB／cA−nu／JCR系ヌード
マウス（雌 ６週令） （いずれも日本クレアより購入） 細胞系 ：ヒト肝癌細胞 HC Ｃ−４ マウスミエローマ P3X63−Ag8.653 （いずれも、大学、研究機関等でよく
用いられており、用意に入手しうるもの
である） 実施例１ ハイブリドーマの作成 BALB／ｃ系マウスに、ヒト肝癌培養細胞
（HC Ｃ−４）107個／マウスを１週１回、４週間
に亘り腹腔内接種し、最終接種後３日目に脾臓を
摘出し、脾臓細胞浮遊液を調製した。すなわち、
ステンレスメツシユで圧迫、過し、培地に浮遊
させた。融合の親細胞として、BALB／ｃ系マ
ウス由来ミエローマP3X63−Ag8.653を107細胞培
養して準備した。 融合は、既存法（Nature256 495（1975））に
準じて以下の様に行なつた。 上記で調製したマウス脾臓細胞５×107個とミ
エローマ細胞１×107個とを遠心分離チユーブに
混合し、遠心したのち上清をすて、RPMI1640で
40％に調製したポリエチレングリコール
（PEG1000，和光純薬）をパツクになつた細胞の
上に約0.5ml加え、３分静置したのち、500rpmで
３分間遠心分離し、そののち培地をゆつくり５ml
程度加え、再度遠心分離し、上清をすてた。次
に、Ｔ−75（FalconNo.3024）に、ゆるやかにすべ
ての細胞をうつしとり、約40mlになるように培地
を加え、一晩培養する。次の日にこの培養液を細
胞も含めてすべての遠心チユーブに移し取り、遠
心分離を行ない上清をすてた。次にHAT培地
（RPMI1640培地，10％FCSに終濃度でヒポキサ
ンチン10-4Ｍ，アミノプテリン４×10-7Ｍ，チミ
ジン1.6×10-5Ｍを加える）を40ml加え、よく攪
拌した後、96穴マイクロプレート（Costar，No.
3596）に約100μ／well宛加えた。この状態で
１週間培養すると30〜50％程度の穴にコロニーが
認められた。１週間以後より、適宜HT培地
（HAT培地よりアミノプテリンを除いた組成を
もつ）を１滴（約25〜30μ）各穴に加えた。あ
る程度コロニーが生育した後に（10〜14日後）培
養上澄を用い、間接ロゼツト法でスクリーニング
を行ない、目的のヒト肝癌（HC Ｃ−４）に対
し、抗体を分泌しているかどうか検討した。この
結果、４つのコロニーがHC Ｃ−４に対する抗
体を分泌していた。次に、この４つのコロニーに
ついてサブクローニングを行なつた。即ち、96穴
マイクロプレートにフイーダー層（feeder
layer）として未処理のBALB／ｃ系マウス脾細
胞105cell／wellをまいた上に、上記で得られたコ
ロニーの細胞を0.1cells／wellとなる様に加え、
１週間培養した。得られたクローンについてスク
リーニング及びサブクローニングを行ない、最終
的にHC Ｃ−４に対するモノクローナル抗体を
産生する４つのハイブリドーマを得た。このうち
の１つのハイブリドーマをHY−2014と命名し
た。これから得られるモノクローナル抗体をHC
−2014と命名した。次に、HC−2014の精製法に
ついて述べる。 実施例２ MoAbの精製および特異性の検討 ａ BALB／ｃ系マウスの腹腔に0.5mlのプリス
テン（ミネラルオイル）を投与し、７日後に
HC−2014産生ハイブリドーマ５×106個を腹腔
に接種し、腹水化を行つた。接種の２週間後に
腹水を採取し、以下の方法でMoAbの精製を行
なつた。 まず、得られた腹水30mlを10000rpm，
15min遠心後上清に、硫酸アンモニウムを33.3
％の濃度となるように加え、４℃60min塩析し
た。10000rpm 15min遠心後、沈澱物をPBS
（Phosphate Buffered−Saline；8.1mM−
NaH2PO4，1.5mMKH2PO4，2.7mMKC，
137mMNaC，pH7.2）５mlに溶解し、同液
３に対して一晩透析を行なつた。透析後
Protein Ａセフアロースカラムにかけ、0.1M
酢酸−PBS溶液で溶出し、溶出液を0.1N
NaOHで中和した。 精製されたMoAbは−80℃フリーザーで凍結
保存した。 ｂ 次に、上記ａ）で作製したMoAbのHC Ｃ−
４および他の種々の腫瘍細胞に対する反応性に
ついて、ELISA法および間接ロゼツト法によ
り検討した。 抗原として次の細胞を用いた。 HC Ｃ−４ 抗体産生に用いたヒト肝癌
細胞 A549 ヒト肺癌細胞 KATO ヒト胃癌細胞 AZ521 〃 BM314 ヒト結腸癌細胞 これらの抗原を、５倍〜3125倍の５倍希釈列の
MoAb HC−2014と反応させて、ELISA法にお
ける反応性を調べた。ELISA法には、ザイメド
社β−galactosidaseキツト（丸善より購入）を
使用した。その結果、第４図に示したように、
HC−2014は抗原であるHC Ｃ−４ヒト肝癌細胞
にのみ反応した。 また、HC−2014は間接ロゼツト法において
も、表１に示すように、抗原であるHC Ｃ−４
ヒト肝癌細胞とのみロゼツトを形成し、他の腫瘍
細胞に対しては反応しなかつた。 【表】 実施例３ オクタロニー法によるMoAbのクラ
ス，サブクラスの検討 実施例２で得られたMoAbについてオクタロニ
ー法（Ouchterlony法）により免疫グロブリンの
クラス、サブクラスを決定した。即ち、1.5％ア
ガロース溶液（0.01％NaN3を含む）をペトリ皿
（内径52mm）に５ml宛加え、約30分間凝固するま
で待つた。次に第５図に示すように凝固アガロー
スに穴をあけ、各穴１〜６に下記表２の各抗グロ
ブリン抗体を5μづつ加え、中央の穴７には実
施例２で精製されたモノクローナル抗体を15μ
加えた。この状態で24時間放置し、生じた阻止線
をもつてモノクローナル抗体のクラスを決定し
た。 【表】 この結果、得られたモノクローナル抗体は３と
７の間にのみ、阻止線が生じたことより、マウス
IgGであることが判明した。 次にIgGのサブクラスを検討するために、上記
と同様の実験を行なつた。即ち、アガロース上に
第６図の如く穴をあけ１から４までに各サブクラ
スの抗体（表３）を5μ宛入れ、中央の５に得
られたモノクローナル抗体（HC−2014）を15μ
加え、24時間室温で放置した。 【表】 これらの結果により、得られたモノクローナル
抗体（HC−2014）は２と５の間に阻止線が生じ
たことからIgG2aであることが判つた。 さらに、ハイブリドーマが分泌する抗体の単一
性は、SDSホリアクリルアミドゲル電気泳動法に
より確認した。 実施例４ in vitroにおけるHC−2014のADCC
活性 本発明のモノクローナル抗体が、エフエクター
細胞の存在下にヒト肝癌細胞を攻撃して死滅させ
うることをin vitroで調べるため、HC−2014の
ヒト肝癌細胞（HC Ｃ−４）に対する細胞傷害
性を、ヒト胃癌に対するモノクローナル抗体
（YK024）を対照として、ADCC活性（Antibody
−dependent Cell−mediated Cytotoxicity）に
より検討した。 HC Ｃ−４を96穴マイクロプレートに105
cells／wellの割合でまき、一晩培養した。これ
に、実施例２で得たHC−2014又は、YK024を
０，0.1，0.5，2.5Mg／mlとなる様に加え、30分
間CO2インキユベータに放置した後、PBSを用い
て３回洗浄した。次にエフエクター細胞として
BALB／ｃ系マウスの脾臓細胞を106cells／well
宛加え、一晩培養した後PBSで３回洗浄し、各
wellのHC Ｃ−４の生存の有無を判定した。判
定はトリパンブルーで染色後、生細胞を算定する
ことにより行なつた。 結果を表４に示した。表中、生存率が10％以下
のものをADCC活性陽性（＋）として示す。 【表】 実施例５ 腹水癌モデルに対するHC−2014の抗
腫瘍効果 本発明のモノクローナル抗体が、in vivoにお
いてもヒト肝癌細胞傷害性であることを確認する
ため、ヌードマウスによるモデル試験を行なつ
た。 ヌードマウスを１群６匹に分け、腹腔にHC
Ｃ−４細胞を２×107個接種し、接種日を０日目
として１，３，５日目に実施例２で得た
MoAbHC−2014を1.5mg又は3.0mg腹腔内投与し、
未投与群を対照として生存日数から延命率（ILS
％）を求めたところ、200％以上という高い値を
示した。又、HC−2014投与直後及び投与中に
は、体重の減少並びに毒性症状は認められなかつ
た。なお、延命率（ILS％）は次の式で求めた。 ILS＝（投与群の平均生存日数／対照群の平均生存日
数−１）×100 各群のマウスの生存日数を第２図に示した。 一方、HC Ｃ−４のかわりに、BM314（ヒト結
腸癌培養細胞系）を用いて同様に実験したとこ
ろ、対照群との間に差は認められなかつた。結果
を第３図に示した。 実施例６ 固型癌モデルに対するHC−2014の抗
腫瘍効果 ヌードマウスを１群６匹に分け、背部皮下に
HC Ｃ−４細胞を１×107個接種し（０日目）、実
施例５と同様、１，３，５日目にHC−2014を1.5
mg又は3.0mg腹腔内投与し、腫瘍容積
（長径×短径2／２）をはかり、HC−2014未投与群を 対照としてＴ／Ｃ％を次の式で求めた。 Ｔ／Ｃ％ ＝（投与群の平均腫瘍容積（Ｔ）／対照群の平均
腫瘍容積（Ｃ））×100％ 結果を第１図に示した。図から明らかなとお
り、対照群の一匹が死亡した時点（80日目）で
Ｔ／Ｃ％は10％以下であつた。このことは、本発
明のモノクローナル抗体の投与により、背部の固
型癌の容積が、対照群の1/10以下に抑制されたこ
とを意味する。 （発明の効果） 本発明により得られるモノクローナル抗体は、
免疫原であるヒト肝癌細胞とのみ特異的に結合
し、in vitroにおいてADCC活性を、in vivoにお
いて顕著な抗腫瘍活性を示すことより、EIA法、
RIA法等による、試薬、診断薬として、さらに肝
癌の治療薬としての可能性が期待できる。
第１図はHC Ｃ−４固型癌モデルに対する本
発明のモノクローナル抗体の抗腫瘍効果を示すグ
ラフであり、第２図はHC Ｃ−４腹水癌モデル
に対する本発明のモノクローナル抗体の抗腫瘍効
果を示すグラフであり、第３図は第２図における
HC Ｃ−４細胞の代りにBM314細胞を用いて行
つた試験の結果を示すグラフであり、第４図は本
発明のモノクローナル抗体の特異性をELISA法
で検討した結果を示すグラフであり、第５図およ
び第６図は夫々、実施例２のモノクローナル抗体
のクラス及びサブクラスを同定するためのオクタ
ロニー法を説明する図である。
発明のモノクローナル抗体の抗腫瘍効果を示すグ
ラフであり、第２図はHC Ｃ−４腹水癌モデル
に対する本発明のモノクローナル抗体の抗腫瘍効
果を示すグラフであり、第３図は第２図における
HC Ｃ−４細胞の代りにBM314細胞を用いて行
つた試験の結果を示すグラフであり、第４図は本
発明のモノクローナル抗体の特異性をELISA法
で検討した結果を示すグラフであり、第５図およ
び第６図は夫々、実施例２のモノクローナル抗体
のクラス及びサブクラスを同定するためのオクタ
ロニー法を説明する図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ マウスミエローマ細胞とヒト肝癌細胞HC
Ｃ−４で免疫された哺乳類の脾臓細胞とを融合さ
せて得られるハイブリドーマにより生産されるモ
ノクローナル抗体であつて、 サブクラスIgG2aに属し；ヒトの肝癌細胞HC
Ｃ−４を免疫化学的に認識することができ；肺癌
細胞Ａ 549、結腸癌細胞BM 314、胃癌細胞
KATO IIIおよび胃癌細胞AZ 521とは免疫化学
的に反応せず；そして生体外で培養されたヒト肝
癌細胞HC Ｃ−４に対してもヌードマウスの腹
腔内もしくは皮下に移植されたHC Ｃ−４細胞
に対しても細胞傷害性を発揮することを特徴とす
る、上記モノクローナル抗体。 ２ FERM BP−1566の番号で寄託されている
ハイブリドーマが生産するモノクローナル抗体で
ある、特許請求の範囲第１記載のモノクローナル
抗体。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59134556A JPS6115897A (ja) | 1984-06-29 | 1984-06-29 | ヒト肝癌細胞を特異的に認識するモノクロ−ナル抗体 |
| US06/749,564 US4820641A (en) | 1984-06-29 | 1985-06-27 | Monoclonal antibody capable of specifically distinguishing human hepato-carcinoma cells |
| DE8585108073T DE3580524D1 (de) | 1984-06-29 | 1985-06-28 | Monoklonaler antikoerper geeignet zur spezifischen unterscheidung von humanen hepatokarzinomzellen. |
| AT85108073T ATE58397T1 (de) | 1984-06-29 | 1985-06-28 | Monoklonaler antikoerper geeignet zur spezifischen unterscheidung von humanen hepatokarzinomzellen. |
| EP85108073A EP0166458B1 (en) | 1984-06-29 | 1985-06-28 | Monoclonal antibody capable of specifically distinguishing human hepato-carcinoma cells |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59134556A JPS6115897A (ja) | 1984-06-29 | 1984-06-29 | ヒト肝癌細胞を特異的に認識するモノクロ−ナル抗体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6115897A JPS6115897A (ja) | 1986-01-23 |
| JPH0431674B2 true JPH0431674B2 (ja) | 1992-05-27 |
Family
ID=15131083
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59134556A Granted JPS6115897A (ja) | 1984-06-29 | 1984-06-29 | ヒト肝癌細胞を特異的に認識するモノクロ−ナル抗体 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4820641A (ja) |
| EP (1) | EP0166458B1 (ja) |
| JP (1) | JPS6115897A (ja) |
| AT (1) | ATE58397T1 (ja) |
| DE (1) | DE3580524D1 (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6357596A (ja) * | 1986-08-29 | 1988-03-12 | Nisshin Flour Milling Co Ltd | モノクロ−ナル抗体、その製法およびそれからなる肝疾患診断剤 |
| JPH0798000B2 (ja) * | 1987-05-23 | 1995-10-25 | 萩原 義秀 | ガン関連抗原特異的ヒト免疫グロブリン |
| JPH0829078B2 (ja) * | 1991-11-25 | 1996-03-27 | 萩原 義秀 | ガン関連抗原特異的ヒト免疫グロブリン生産性ヒト／ヒトハイブリドーマ |
| JPH05268988A (ja) * | 1992-03-05 | 1993-10-19 | Hagiwara Yoshihide | ガン関連抗原特異的ヒト免疫グロブリン |
| US5760000A (en) * | 1994-05-13 | 1998-06-02 | University Technologies International,Inc. | Inhibition of liver cancer by the use of GnRH and GnRH analogs |
| JP2004529849A (ja) * | 2000-09-01 | 2004-09-30 | インターナショナル バイオイムン システムズ，インコーポレーテッド | 扁平上皮癌に対する特異的モノクローナル抗体の同定と開発 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4579827A (en) * | 1983-03-11 | 1986-04-01 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Monoclonal antibodies to human gastrointestinal cancers and hybridoma method of production of the monoclonal antibodies |
-
1984
- 1984-06-29 JP JP59134556A patent/JPS6115897A/ja active Granted
-
1985
- 1985-06-27 US US06/749,564 patent/US4820641A/en not_active Expired - Fee Related
- 1985-06-28 AT AT85108073T patent/ATE58397T1/de active
- 1985-06-28 EP EP85108073A patent/EP0166458B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-06-28 DE DE8585108073T patent/DE3580524D1/de not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| HEPATOLOGY=1982 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0166458B1 (en) | 1990-11-14 |
| EP0166458A3 (en) | 1988-05-18 |
| ATE58397T1 (de) | 1990-11-15 |
| JPS6115897A (ja) | 1986-01-23 |
| DE3580524D1 (de) | 1990-12-20 |
| EP0166458A2 (en) | 1986-01-02 |
| US4820641A (en) | 1989-04-11 |
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