JPS595121A - モノクロナル抗体 - Google Patents
モノクロナル抗体Info
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- JPS595121A JPS595121A JP10357783A JP10357783A JPS595121A JP S595121 A JPS595121 A JP S595121A JP 10357783 A JP10357783 A JP 10357783A JP 10357783 A JP10357783 A JP 10357783A JP S595121 A JPS595121 A JP S595121A
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- tissue
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6456—Plasminogen activators
- C12N9/6459—Plasminogen activators t-plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
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- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は一般に新規なハイプリドーマセルライン（ｈｙ
ｂｒｌｄｏｍａ ｃｅｌｌ １ｉｎｅｓ） 、特に組織
型（ｔ＋５−ｓｕｅ Ｔｙｌ）ｅ ）のヒト、プラスミ
ノゲンアクチベーター（ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍｌｎｏ
ｇｅｎ ａｃｔｌｖａｔｏｒ ） （ＰＡ ｎ ）に
対するモノクロナル抗体（ｍ０１１０ｃｌｏｎａｌ ａ
ｎｔｔｂｏ−ｄｌθＳ）の産生のためのハイプリドーマ
セルライン、このようにして産生された抗体、そのｉｌ
ｌ物としての使用、治療学的使用及びこれらの抗体を含
有する製薬学的組成物に関する。
ｂｒｌｄｏｍａ ｃｅｌｌ １ｉｎｅｓ） 、特に組織
型（ｔ＋５−ｓｕｅ Ｔｙｌ）ｅ ）のヒト、プラスミ
ノゲンアクチベーター（ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍｌｎｏ
ｇｅｎ ａｃｔｌｖａｔｏｒ ） （ＰＡ ｎ ）に
対するモノクロナル抗体（ｍ０１１０ｃｌｏｎａｌ ａ
ｎｔｔｂｏ−ｄｌθＳ）の産生のためのハイプリドーマ
セルライン、このようにして産生された抗体、そのｉｌ
ｌ物としての使用、治療学的使用及びこれらの抗体を含
有する製薬学的組成物に関する。
艶疫されたマイスからの牌繊細胞（５ｌｌｌｅｅｌｌ
Ｃｅ−１ｌｓ ）とマウスミエローマ（骨髄腫： ｍｙ
ｅｌｏｍａ ＞細胞との融合（ｆｕｓｉｏｎ） （Ｋ
ｏｌ＋Ｉｅｒ ａｎｄ Ｍ １ｌｓｔｅ−Ｉｎ、Ｎ
ａｔｕｒｅ ２５６．４９５−４９７ （１９７５
））は、均一な（いわゆる゛モノクロナル抗体）抗体を
産生ずる連続的セルライン（ｃｏｎｔ １ｎｕｏｕｓｃ
ｅｌｌ １．１ｎｅｓ）を得ることが可能であることを
最初に示したものであった。それ以来、種々のバイブリ
ド細胞（ｈｙｂｒｉｄ ｃｅｌｌｓ） （いわゆる゛
ハイプリトーマ）を産生じようとする及し種々の科学的
研究のためそれらにより形成された抗体を使用せんとす
る多数の試みがなされた（たとえば：Ｃｕｒｒｅｎｔ
’Ｉ−ｏ １ｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏ旧ｏｌｏｇｙ
ａｎｄ Ｉ ｍ−Ａ隻旦旦」ηｊｙ−，Ｖ ｏｆ、
８ １ − ” Ｌ ｙｍｐｈｏｃｙｔｅ
Ｈｙｂｒｌｄ−ｏｍａｓ” 、 Ｆ 、 Ｍｅｌｃｈｅ
ｒｓ ｅｔ ａｔ、、 Ｓ ｐｒｌｎｇｅｒ −Ｖｅｒ
ｌａｇ（１９７８＞及びその参考文献；Ｃ，Ｊ。
Ｃｅ−１ｌｓ ）とマウスミエローマ（骨髄腫： ｍｙ
ｅｌｏｍａ ＞細胞との融合（ｆｕｓｉｏｎ） （Ｋ
ｏｌ＋Ｉｅｒ ａｎｄ Ｍ １ｌｓｔｅ−Ｉｎ、Ｎ
ａｔｕｒｅ ２５６．４９５−４９７ （１９７５
））は、均一な（いわゆる゛モノクロナル抗体）抗体を
産生ずる連続的セルライン（ｃｏｎｔ １ｎｕｏｕｓｃ
ｅｌｌ １．１ｎｅｓ）を得ることが可能であることを
最初に示したものであった。それ以来、種々のバイブリ
ド細胞（ｈｙｂｒｉｄ ｃｅｌｌｓ） （いわゆる゛
ハイプリトーマ）を産生じようとする及し種々の科学的
研究のためそれらにより形成された抗体を使用せんとす
る多数の試みがなされた（たとえば：Ｃｕｒｒｅｎｔ
’Ｉ−ｏ １ｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏ旧ｏｌｏｇｙ
ａｎｄ Ｉ ｍ−Ａ隻旦旦」ηｊｙ−，Ｖ ｏｆ、
８ １ − ” Ｌ ｙｍｐｈｏｃｙｔｅ
Ｈｙｂｒｌｄ−ｏｍａｓ” 、 Ｆ 、 Ｍｅｌｃｈｅ
ｒｓ ｅｔ ａｔ、、 Ｓ ｐｒｌｎｇｅｒ −Ｖｅｒ
ｌａｇ（１９７８＞及びその参考文献；Ｃ，Ｊ。
１３ａｒｎｓｔａｂｌｅ ｅｔ ａｌ、、 Ｃｅ１ｌ
１４ 、９−２０（１９７８） ： Ｐ、Ｐａｒ
ｈａｍ、 Ｗ、 Ｆ、Ｂｏｄｍｅｒ。
１４ 、９−２０（１９７８） ： Ｐ、Ｐａｒ
ｈａｍ、 Ｗ、 Ｆ、Ｂｏｄｍｅｒ。
Ｎａｔｕｒｅ ２７６．３９７−３９９ （１９７
８）：旦ｌ烈ル殺り且ｆ［仲！ｒｌ＋ｕ通Ｕ±１ｍｍり
且匡］ヨ・３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｖｏｌｕｍｅ
２．Ｄ、Ｍ、Ｗｌｅｒ 。
８）：旦ｌ烈ル殺り且ｆ［仲！ｒｌ＋ｕ通Ｕ±１ｍｍり
且匡］ヨ・３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｖｏｌｕｍｅ
２．Ｄ、Ｍ、Ｗｌｅｒ 。
θ旧ｔｏｒ： Ｂａｃｋｗｅｌｌ、 １９７８ 、
Ｃｈａｐｔｅｒ ２５ 。
Ｃｈａｐｔｅｒ ２５ 。
Ｃｈｅｗ、ＥＩ）９．Ｎｅｗｓ、１５−１ ７ ＜１
９７９＞ ） 。
９７９＞ ） 。
これらの報文はハイブリドーマによるモノクロナル抗体
の産生の原理方法を説明している。
の産生の原理方法を説明している。
組織適合性抗原（ｈｌｓｔｏ ｃｏｍｐａｔｌｂｌｌ目
Ｖａｌ＋ｔｉ−ｇｅｎｓ） 、ハプテン、蛋白質及び酵
素に対するモノクロナル抗体は既に産生されている。し
かしながら、組織型のヒト、プラスミノゲンアクチベー
ターに対する体細胞ハイブリッド（ｓｏＩＩｌａｔｌｃ
ｃｅｌｌｈｙｂｒｉｄｓ ）の抗体産生についてはま
だ何も知られていない。
Ｖａｌ＋ｔｉ−ｇｅｎｓ） 、ハプテン、蛋白質及び酵
素に対するモノクロナル抗体は既に産生されている。し
かしながら、組織型のヒト、プラスミノゲンアクチベー
ターに対する体細胞ハイブリッド（ｓｏＩＩｌａｔｌｃ
ｃｅｌｌｈｙｂｒｉｄｓ ）の抗体産生についてはま
だ何も知られていない。
組織型のプラスミノゲンアクチベーターは、プラスミノ
ゲンをフィブリンを分解することができるプラスミンに
転化する繊維素溶解系（ｆｌｂｒｉｎｏ−１ｙｔｉｃ
ｓｙｓｔｅｍ＞の酵素である。故にそれは血栓融解作用
（ｔｈｒｏｍｂｏｌｙ口ｃ ａｃｔｉｏｎ ）を有する
。上記した３種の蛋白質（プラスミノゲン、プラスミン
及びフィブリン）は血液中゛に存在する。この故に、プ
ラスミノゲンアクチベーターはハイパーコアグユレーシ
ョン（ｈｙｐｅｒ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ）を伴な
う状態、特に血栓塞栓症（ｔｌ＋ｒｏｍｔ＋ｏｅｍｂｏ
ｌ Ｉｃ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）の治療に使用すること
ができる。
ゲンをフィブリンを分解することができるプラスミンに
転化する繊維素溶解系（ｆｌｂｒｉｎｏ−１ｙｔｉｃ
ｓｙｓｔｅｍ＞の酵素である。故にそれは血栓融解作用
（ｔｈｒｏｍｂｏｌｙ口ｃ ａｃｔｉｏｎ ）を有する
。上記した３種の蛋白質（プラスミノゲン、プラスミン
及びフィブリン）は血液中゛に存在する。この故に、プ
ラスミノゲンアクチベーターはハイパーコアグユレーシ
ョン（ｈｙｐｅｒ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ）を伴な
う状態、特に血栓塞栓症（ｔｌ＋ｒｏｍｔ＋ｏｅｍｂｏ
ｌ Ｉｃ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）の治療に使用すること
ができる。
用柱では、ヒトの尿又は腎臓細胞培養物（ｋｌ−ｄｎｅ
ｙ ｃｅｌｌ ＣｔｌｌｔＬＩｒｅＳ）から得られたウ
ロキナーゼ及びβ−溶血性連鎖状球菌（β−１＋ａｅｍ
ｏｌｙｔｉｃｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｌ ）の培養物の
）ｒ液から単離されたス１−レプ１−キナーゼがｍｕ素
溶解剤（ｆ ｌｂｒｉｎｏｌｙＮｃａｇｅｎｔｓ ）と
し−Ｃ使用される。しかしながら、治療学的使用に対し
ては決して問題がないとは言えない。
ｙ ｃｅｌｌ ＣｔｌｌｔＬＩｒｅＳ）から得られたウ
ロキナーゼ及びβ−溶血性連鎖状球菌（β−１＋ａｅｍ
ｏｌｙｔｉｃｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｌ ）の培養物の
）ｒ液から単離されたス１−レプ１−キナーゼがｍｕ素
溶解剤（ｆ ｌｂｒｉｎｏｌｙＮｃａｇｅｎｔｓ ）と
し−Ｃ使用される。しかしながら、治療学的使用に対し
ては決して問題がないとは言えない。
組織型のプラスミノゲンアクチベーターはウロキナーゼ
及びス］〜レプ］・キナーゼから区別することができる
。Ｉ［型のプラスミノゲンアクチベーターに対して約７
２０００の分子量が見出された。
及びス］〜レプ］・キナーゼから区別することができる
。Ｉ［型のプラスミノゲンアクチベーターに対して約７
２０００の分子量が見出された。
それはヒトメラノーマ（黒色腫： ｍｅｌａｎｏｍａ）
細胞により産生されそしてＲｉＪｋｅｎ及びＣｏ１１ｅ
ｎ （ＪＢＣ２５６，７０３５−７０４１（１９８１
））の方法によって対応する培養物からの上澄液から単
離することができる。
細胞により産生されそしてＲｉＪｋｅｎ及びＣｏ１１ｅ
ｎ （ＪＢＣ２５６，７０３５−７０４１（１９８１
））の方法によって対応する培養物からの上澄液から単
離することができる。
組織型のプラスミノゲンアクチベ＝ターに対するモノク
ロナル抗体はいくつかの観点から興味がある。かくして
、たとえは、従来使用されたプラスミノゲンアクチベー
ターに、対する三段階精製プロセスはイムノアトソープ
ションクロマトグラフィー（ｉｍｍｕｎｏａｄｓｏｒｐ
目ｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ）においてこ
の型の抗体を使用することによって一段階プロセスに簡
単化することができる。
ロナル抗体はいくつかの観点から興味がある。かくして
、たとえは、従来使用されたプラスミノゲンアクチベー
ターに、対する三段階精製プロセスはイムノアトソープ
ションクロマトグラフィー（ｉｍｍｕｎｏａｄｓｏｒｐ
目ｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ）においてこ
の型の抗体を使用することによって一段階プロセスに簡
単化することができる。
本発明は組織型のプラスミノゲンアクチベーターに対す
る高度に特゛異的モノクロナル抗体を合成しそして分泌
するハイブリドーマセルラインを提供する。これらのハ
イブリドーマは緒言に述べたにｏｂｌｅｒ及びＭｌｌｓ
ｔｅｌｎの方法により産生される。
る高度に特゛異的モノクロナル抗体を合成しそして分泌
するハイブリドーマセルラインを提供する。これらのハ
イブリドーマは緒言に述べたにｏｂｌｅｒ及びＭｌｌｓ
ｔｅｌｎの方法により産生される。
組織型のプラスミノゲンアクヂペーターでマイス（ｍｉ
ｃｅ）を免疫した優、これらのマイスの稗臓細胞はマウ
スミエローマセルラインの細胞と融合される；それから
生じるハイフリトーマは、マイクロタイタープレート（
ｍｌｃｒｏｔｉｔｒｅ ｐｌａｔｅｓ ）に固定された
組織型のプラスミノゲンアクチベーターと選択的に反応
する抗体に対して系統的に検査された。このようにして
、プラスミノゲンアクチベーターに対する抗体を産生ず
るハイブリドーマが単離された。これらの抗体のいくら
かは組織型のプラスミノゲンアクチベータとのみ反応し
、−へ他のものはウロキナーゼとの交叉反応（ｃｒｏｓ
ｓ −ｒｅａｃｔｉｏｎ）を示す。本発明はこのように
産生された抗体にも関する。それらはプラスミノゲンア
クチベーター分子における特定の抗原決定基（ａｎｔ−
ｉｇｅｎｌｃ ｄｅｔｅｒｍｌｎａｎｔ）に対して単一
特異性である（ｍｏｎｏｓｐｅｃｌｆｉｃ） 。更に、
本発明はこれらのハイシリドーマを産生ずるための方法
を説明する。
ｃｅ）を免疫した優、これらのマイスの稗臓細胞はマウ
スミエローマセルラインの細胞と融合される；それから
生じるハイフリトーマは、マイクロタイタープレート（
ｍｌｃｒｏｔｉｔｒｅ ｐｌａｔｅｓ ）に固定された
組織型のプラスミノゲンアクチベーターと選択的に反応
する抗体に対して系統的に検査された。このようにして
、プラスミノゲンアクチベーターに対する抗体を産生ず
るハイブリドーマが単離された。これらの抗体のいくら
かは組織型のプラスミノゲンアクチベータとのみ反応し
、−へ他のものはウロキナーゼとの交叉反応（ｃｒｏｓ
ｓ −ｒｅａｃｔｉｏｎ）を示す。本発明はこのように
産生された抗体にも関する。それらはプラスミノゲンア
クチベーター分子における特定の抗原決定基（ａｎｔ−
ｉｇｅｎｌｃ ｄｅｔｅｒｍｌｎａｎｔ）に対して単一
特異性である（ｍｏｎｏｓｐｅｃｌｆｉｃ） 。更に、
本発明はこれらのハイシリドーマを産生ずるための方法
を説明する。
本発明に従う抗体は、たとえば、正常細胞及び悪性細胞
（ｍａｌｌａｎａｎｔ ｃｅｌｌｓ ）におけるプラス
ミノグンアクチベーターの決定に対して使用することが
できる。かくして、それらはたとえば腫瘍増殖又は正常
細胞の機能状態を監視するために、診断学的及び予浸判
定の（ｐｒｓｇｎｏｓｔ ｉｃ ）目的に使用すること
ができる。
（ｍａｌｌａｎａｎｔ ｃｅｌｌｓ ）におけるプラス
ミノグンアクチベーターの決定に対して使用することが
できる。かくして、それらはたとえば腫瘍増殖又は正常
細胞の機能状態を監視するために、診断学的及び予浸判
定の（ｐｒｓｇｎｏｓｔ ｉｃ ）目的に使用すること
ができる。
一般に、ハイブリドーマの産生は下記段階を含む：
Ａ、ヒト、プラスミノゲンアクチベータによるマイスの
免疫。雌Ｂａ１ｂ ／ｃマイスはこの目的に有用である
ことが見出されたが、他のマイス系統（ＳｔｒａｌｎＳ
）を使用することもできる。免疫計画（Ｉｍｍｕｎｌ
ｓａｔｌｏｎ ｓｃｈｅｍｅ ）及びプラスミノゲンア
クチベーターの濃度は十分な量の抗原刺激されたリンパ
球（ａｎＮｇｅｎ −ｓｔｉｍｕ！ａｔｅｄ ｌｙｍ
ｐｈｏｃｙｔｅｓ）が形成されるように選ばれるべきで
ある。マウス当り蛋白質１００μＱで１４日の間隔で３
回の免疫及びリン酸塩−緩衝生理食塩液の注入は効果的
であることが見出された。
免疫。雌Ｂａ１ｂ ／ｃマイスはこの目的に有用である
ことが見出されたが、他のマイス系統（ＳｔｒａｌｎＳ
）を使用することもできる。免疫計画（Ｉｍｍｕｎｌ
ｓａｔｌｏｎ ｓｃｈｅｍｅ ）及びプラスミノゲンア
クチベーターの濃度は十分な量の抗原刺激されたリンパ
球（ａｎＮｇｅｎ −ｓｔｉｍｕ！ａｔｅｄ ｌｙｍ
ｐｈｏｃｙｔｅｓ）が形成されるように選ばれるべきで
ある。マウス当り蛋白質１００μＱで１４日の間隔で３
回の免疫及びリン酸塩−緩衝生理食塩液の注入は効果的
であることが見出された。
Ｂ、免疫されたマイスの牌臓を得ること及び適当な培地
中の牌繊細胞懸濁液の調製。牌臓あたり培地的１ｍｌは
十分である。この目的に対する実験的方法は知られてい
る。
中の牌繊細胞懸濁液の調製。牌臓あたり培地的１ｍｌは
十分である。この目的に対する実験的方法は知られてい
る。
Ｃ０適当な融合促進剤（たとえばポリエチレングリコー
ル）を使用する、適当なセルライン（たとえばＰ３ｘ６
８Ａｇ８）のマウスミエローマ細胞と上記懸濁された牌
臓細胞の融合。好ましい融合促進剤は１０００乃至４０
００の平均分子量のポリエチレングリコール（たとえば
、商業的に入手可能なＰＥＧ１０００等）である。しか
しながら、他の公知の融合促進剤を使用づることもぐき
る。
ル）を使用する、適当なセルライン（たとえばＰ３ｘ６
８Ａｇ８）のマウスミエローマ細胞と上記懸濁された牌
臓細胞の融合。好ましい融合促進剤は１０００乃至４０
００の平均分子量のポリエチレングリコール（たとえば
、商業的に入手可能なＰＥＧ１０００等）である。しか
しながら、他の公知の融合促進剤を使用づることもぐき
る。
ミエローマ細胞当り約１０個の牌臓細胞の割合が好まし
い。融合培地約Ｑ、５ｍｌ乃至１．Ｑｍｌの全容量は１
０Ｂ牌繊細胞に対して十分である。多くのマウスミエロ
ーマセルラインが知られておりそして、たとえば、科学
的協会又は細胞受託機関、たとえばｔｌ＋ｅ ３ａｌｋ
１ｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅ１ｌ ［）ｌｓｔｒ −
１ｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｒ＋ｔｅｒ 、 Ｌａ Ｊｏｌｌ
ａ、ＣＡ、から得ることができる。使用されるセルライ
ンは、好ましくは、選択培地中で融合していないミエロ
ーマ細胞は死ぬがバイブリドは生き残るようにいわゆる
薬剤耐性タイプであるべきである。酵素ヒボキザンチン
ーグアニンホスホリボシルトランフエラーゼ（ｈｙｐｏ
ｘａｎｔｈｉｎｅ−ｇｕａｎｌｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒ
ｌｂｏｓｙｌｔｒａ−□ｎ５ｆｅｒａｓｅ ）に欠はテ
ィて、その故にＨＡＴ媒体（ヒポキサンチン、アミノプ
テリン、チミジン）中で増殖（ることができない８−ア
ザグアニンに抵抗性のセルラインは最も頻繁に使用され
る。
い。融合培地約Ｑ、５ｍｌ乃至１．Ｑｍｌの全容量は１
０Ｂ牌繊細胞に対して十分である。多くのマウスミエロ
ーマセルラインが知られておりそして、たとえば、科学
的協会又は細胞受託機関、たとえばｔｌ＋ｅ ３ａｌｋ
１ｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅ１ｌ ［）ｌｓｔｒ −
１ｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｒ＋ｔｅｒ 、 Ｌａ Ｊｏｌｌ
ａ、ＣＡ、から得ることができる。使用されるセルライ
ンは、好ましくは、選択培地中で融合していないミエロ
ーマ細胞は死ぬがバイブリドは生き残るようにいわゆる
薬剤耐性タイプであるべきである。酵素ヒボキザンチン
ーグアニンホスホリボシルトランフエラーゼ（ｈｙｐｏ
ｘａｎｔｈｉｎｅ−ｇｕａｎｌｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒ
ｌｂｏｓｙｌｔｒａ−□ｎ５ｆｅｒａｓｅ ）に欠はテ
ィて、その故にＨＡＴ媒体（ヒポキサンチン、アミノプ
テリン、チミジン）中で増殖（ることができない８−ア
ザグアニンに抵抗性のセルラインは最も頻繁に使用され
る。
使用されるミエローマセルラインは好ましくは、それが
抗体又は免疫グロブリンのＨもしくはＬ鎖をそれ自体形
成しないように゛非分泌型” （＋１１０ｎ−５ｅｃｒ
ｅｔｌｎ ｔｙｐｅ）でもあるべきである。しかしなが
ら、成る場合には分泌性ミエローマ細胞（ｓｅｃ−ｒｅ
ｔｌｎｇ ｍｙｅｌｏｍａ ｃｅｌｌｓ）が有利である
こともある。
抗体又は免疫グロブリンのＨもしくはＬ鎖をそれ自体形
成しないように゛非分泌型” （＋１１０ｎ−５ｅｃｒ
ｅｔｌｎ ｔｙｐｅ）でもあるべきである。しかしなが
ら、成る場合には分泌性ミエローマ細胞（ｓｅｃ−ｒｅ
ｔｌｎｇ ｍｙｅｌｏｍａ ｃｅｌｌｓ）が有利である
こともある。
Ｄ、未融合ミエローマ細胞がその中では分裂せず従って
該未融合ミエローマ細胞が死ぬ（約１〜２週間）選択培
地中での未融合牌臓細胞、未融合ミ■ローマ細胞及び融
合細胞の個々の容器中での希釈及び培養。個々の融合細
胞は、特定の数の細胞（約１−４）が各々の個々の容器
（たとえばミクロタイタープレーｊ〜の各ウェル（ｗｅ
ｌｌ） ）内に置かれるように希釈剤の容量を調節する
ことによって単離される。培地（たとえばＨＡＴ−培地
）は耐性の（たとえば８−アザグアニンに対して）未融
合ミエローマヒルラインが増殖するのを防止し、従って
それは死ぬ。未融合牌臓細胞は限定された数の分裂サイ
クルのみを有し、この故にこれらの細胞も又成る期間（
約１−２週間）の侵に死ぬ。
該未融合ミエローマ細胞が死ぬ（約１〜２週間）選択培
地中での未融合牌臓細胞、未融合ミ■ローマ細胞及び融
合細胞の個々の容器中での希釈及び培養。個々の融合細
胞は、特定の数の細胞（約１−４）が各々の個々の容器
（たとえばミクロタイタープレーｊ〜の各ウェル（ｗｅ
ｌｌ） ）内に置かれるように希釈剤の容量を調節する
ことによって単離される。培地（たとえばＨＡＴ−培地
）は耐性の（たとえば８−アザグアニンに対して）未融
合ミエローマヒルラインが増殖するのを防止し、従って
それは死ぬ。未融合牌臓細胞は限定された数の分裂サイ
クルのみを有し、この故にこれらの細胞も又成る期間（
約１−２週間）の侵に死ぬ。
対照的に、融合細胞は分裂し続ける。伺故ならばそれら
は綱ミエローマ細胞から永久的増殖を、そし−（−親牌
臓細胞から酵素ヒボキサンチン−グアニンホスホリボシ
ルトランスフェラーゼを合成する能力を継承したのであ
り、かくしてそれらは選択培地中で生き残ることができ
るからである。
は綱ミエローマ細胞から永久的増殖を、そし−（−親牌
臓細胞から酵素ヒボキサンチン−グアニンホスホリボシ
ルトランスフェラーゼを合成する能力を継承したのであ
り、かくしてそれらは選択培地中で生き残ることができ
るからである。
Ｅ、各容器中のプラスミノゲンアクチベーターに対Ｊる
抗体の存在のチェック。
抗体の存在のチェック。
Ｆ、所望の抗体を産生ずるハイプリドーマを選択するこ
と（たとえば限定希釈による）及びクロン化すること（
ｃｌｏｎｌｎｇ ）。所望のハイブリドーマが選択され
モしてクロン化されると、抗体は二つの異なった方法で
産生され得る。バイプリドーマが成る一定時間適当な培
地で培養されそして抗体が上澄液から得られるとき非常
に高い純度のモノクロナル抗体が得られる。適当な培地
及び最適培養時間を容易に決定することができる。この
試験管内技術は異種血清（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ
ｓｅｒｕｍ＞ （たとえば胎内仔ウシ血清（ｆｅｔａ
ｌ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ） ）からのほんの少量の蛋
白質で汚染されているモノクロナル抗体を与え。
と（たとえば限定希釈による）及びクロン化すること（
ｃｌｏｎｌｎｇ ）。所望のハイブリドーマが選択され
モしてクロン化されると、抗体は二つの異なった方法で
産生され得る。バイプリドーマが成る一定時間適当な培
地で培養されそして抗体が上澄液から得られるとき非常
に高い純度のモノクロナル抗体が得られる。適当な培地
及び最適培養時間を容易に決定することができる。この
試験管内技術は異種血清（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ
ｓｅｒｕｍ＞ （たとえば胎内仔ウシ血清（ｆｅｔａ
ｌ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ） ）からのほんの少量の蛋
白質で汚染されているモノクロナル抗体を与え。
相当に高い濃度の非常に僅かにのみ低い純度のモノクロ
ナル抗体を産生ずるために、選ばれたハイブリドーマは
同質遺伝子の（ｓｙｎｇｅｎｅｔｃ ）又は半同質遺伝
子の（ｓｅｍｌｓｙｎｇｅｎｅｌｃ ） マウスに往側
することができる。成るインキュベーション時間の後、
これは、宿主動物の血液中及び腹膜浸出液（ｐｅｒｌｔ
ｏｎｅａｌ ｅｘｕｄａｔｅ） （ＩＩＩ水（ａｓｃ
ｌｔｅ） １中に高い濃度の抗体（５−２０ｍｇ／ｍｌ
）を放出するマウスにおける腫瘍の形成を導く。これら
の÷イスは血液及び腹水中に正常な抗体を有していると
しても、それにもかかわらず、これらはモノクロナル抗
体の約５％の濃度において生じるにすぎない。
ナル抗体を産生ずるために、選ばれたハイブリドーマは
同質遺伝子の（ｓｙｎｇｅｎｅｔｃ ）又は半同質遺伝
子の（ｓｅｍｌｓｙｎｇｅｎｅｌｃ ） マウスに往側
することができる。成るインキュベーション時間の後、
これは、宿主動物の血液中及び腹膜浸出液（ｐｅｒｌｔ
ｏｎｅａｌ ｅｘｕｄａｔｅ） （ＩＩＩ水（ａｓｃ
ｌｔｅ） １中に高い濃度の抗体（５−２０ｍｇ／ｍｌ
）を放出するマウスにおける腫瘍の形成を導く。これら
の÷イスは血液及び腹水中に正常な抗体を有していると
しても、それにもかかわらず、これらはモノクロナル抗
体の約５％の濃度において生じるにすぎない。
このようにして得られたモノクロナル抗体は高い力価（
ｔｉｔｒｅ ）を有しくそれは１ｏ３又はそれより低い
希釈率で活性である）そして特異的免疫り０プリンと非
特異的免疫グロブリン間の割合は約２０＝１である。
ｔｉｔｒｅ ）を有しくそれは１ｏ３又はそれより低い
希釈率で活性である）そして特異的免疫り０プリンと非
特異的免疫グロブリン間の割合は約２０＝１である。
実施例 １
疫に される抗 の産生
プラスミノゲンアクチベーターはＲｉｊｋｅｎ及びＣｏ
１１ｅｎ（７）方法１１Ｂｃ２５６．７０３５−７０４
１（１９８１））によりメラノーマ細胞培養物の上澄液
から産生された。
１１ｅｎ（７）方法１１Ｂｃ２５６．７０３５−７０４
１（１９８１））によりメラノーマ細胞培養物の上澄液
から産生された。
３ａｌｂ／Ｃマイスの
雌の［３ａｌｂ／ｃマイスを完全な）０インドのアジュ
バント（ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆ ｒｅｕｎｄ ’ Ｓ
ａｄｊｔｌＶａｌｌｔ）中のプラスミノゲンアクチベー
ター１００μｇで皮下により免疫した。上記動物を１４
．２８及び４２日後に皮下によりプラスミノゲンアクチ
ベーター１００μｇを追加投与した（ｂｏｏｓｔ ）。
バント（ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆ ｒｅｕｎｄ ’ Ｓ
ａｄｊｔｌＶａｌｌｔ）中のプラスミノゲンアクチベー
ター１００μｇで皮下により免疫した。上記動物を１４
．２８及び４２日後に皮下によりプラスミノゲンアクチ
ベーター１００μｇを追加投与した（ｂｏｏｓｔ ）。
牌臓を５３日目に細胞融合（ｃｅｌｌ ｆｕｓｉｏｎ
）のために除去した。牌臓の除去の前の４日間上記動物
は各日に餞腔内にプラスミノゲンアクチベーター３０μ
９を受取った。
）のために除去した。牌臓の除去の前の４日間上記動物
は各日に餞腔内にプラスミノゲンアクチベーター３０μ
９を受取った。
の、 の
個々の細胞懸濁液は除去された牌臓からこの器官をステ
ンレス鋼スクリーンを通過させることにより調製された
。細胞をグルコース４．５９／ｌ、ペニシリン１０００
単位／ｍｌ及びス１−レプトマイシン１００μｏ／ｍｌ
を補充されたダルベツコの最小必須培地（［）ｕｌｂｅ
ｃｃｏ ’ ｓ Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓ５ｅｎｔ−Ｉ
ａｌ Ｍｅｄｌｕｍ ） （ＤＭＥＭ）に移した。細
胞をＤＭＥＭで３回洗浄し、次いで所望の濃度で同じ培
地中に再懸濁させた。一般に、約１０”細胞が各牌臓か
ら得られた。
ンレス鋼スクリーンを通過させることにより調製された
。細胞をグルコース４．５９／ｌ、ペニシリン１０００
単位／ｍｌ及びス１−レプトマイシン１００μｏ／ｍｌ
を補充されたダルベツコの最小必須培地（［）ｕｌｂｅ
ｃｃｏ ’ ｓ Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓ５ｅｎｔ−Ｉ
ａｌ Ｍｅｄｌｕｍ ） （ＤＭＥＭ）に移した。細
胞をＤＭＥＭで３回洗浄し、次いで所望の濃度で同じ培
地中に再懸濁させた。一般に、約１０”細胞が各牌臓か
ら得られた。
ミエローマ細胞の調製
ここに使用されたミエローマセルライン、ｘ６３−Ａｇ
８．６５３．はマウスミエローマセルラインＰ３−Ｘ６
３−Ａ１７８．のサブクＤＭ／（Ｓｔｌ−ｂｃｌｏｎｅ
） テある。セルラインはヘビイ（ｈｅａｖｙ ）又は
ライト（ｌｉｇｌ＋ｔ）免疫グロブリン鎖（１゜Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ、１２３．１５４８−１５５０（１９８０））
を示さない。それはレムヶ博士（Ｄｒ 。
８．６５３．はマウスミエローマセルラインＰ３−Ｘ６
３−Ａ１７８．のサブクＤＭ／（Ｓｔｌ−ｂｃｌｏｎｅ
） テある。セルラインはヘビイ（ｈｅａｖｙ ）又は
ライト（ｌｉｇｌ＋ｔ）免疫グロブリン鎖（１゜Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ、１２３．１５４８−１５５０（１９８０））
を示さない。それはレムヶ博士（Ｄｒ 。
しｅｍｋｅ、 口）ｓｔｌｔｕｔｅ ｏｒ （３ｅｎ
ｅｔｌｃｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎ−１ｖｅｒｓｌｔｙ
ｏｆ Ｃｏｌｏｇｎｅ）により提供された。細胞はヒ
ボキサンチン、アミノプテリン及びチミジン（１」Ａ
Ｔ ＞を含有する培地中で８−アザグアニン２０μＱ
／ｍｌに対して耐性である。それらをグル１−ス４．５
（］ ／Ｉ 、２０ｍ Ｍグルタミン、ペニシリン１０
００単位、−’ ｍ Ｉ 、ス（−レブトマイシン１０
００／’＋１１１及び１０％の胎内仔ウシ血清で補充さ
れたＤＭＥＭ （完全培地）中で培養した。ミエローマ
細胞は融合の時に細胞分裂の対数期にあった。
ｅｔｌｃｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎ−１ｖｅｒｓｌｔｙ
ｏｆ Ｃｏｌｏｇｎｅ）により提供された。細胞はヒ
ボキサンチン、アミノプテリン及びチミジン（１」Ａ
Ｔ ＞を含有する培地中で８−アザグアニン２０μＱ
／ｍｌに対して耐性である。それらをグル１−ス４．５
（］ ／Ｉ 、２０ｍ Ｍグルタミン、ペニシリン１０
００単位、−’ ｍ Ｉ 、ス（−レブトマイシン１０
００／’＋１１１及び１０％の胎内仔ウシ血清で補充さ
れたＤＭＥＭ （完全培地）中で培養した。ミエローマ
細胞は融合の時に細胞分裂の対数期にあった。
胆ｌ」１１
牌臓細胞の懸濁液を１０：１の割合で、内情のないＤＭ
ＥＭ中のミエローマ細胞に加え、そして１０分間に２０
０ｇで丸底チューブ中で遠心分離した。沈降物が沈降し
た後、上澄液培地を注意深くデカンティションする。、
沈降物を、分子１２０００のポリエチレングリコールの
溶液（ＤＭＥＭで３０％Ｗ／Ｗに希釈された、ＰＨ７，
６）２１と共に１分間３７℃でインキュベーションした
。
ＥＭ中のミエローマ細胞に加え、そして１０分間に２０
０ｇで丸底チューブ中で遠心分離した。沈降物が沈降し
た後、上澄液培地を注意深くデカンティションする。、
沈降物を、分子１２０００のポリエチレングリコールの
溶液（ＤＭＥＭで３０％Ｗ／Ｗに希釈された、ＰＨ７，
６）２１と共に１分間３７℃でインキュベーションした
。
次いでＤＭＥＭ２Ｃ１ｌを加え、そして細胞を数分間注
意深く再懸濁した。次いでそれらを再び５分間２００ｇ
で遠心分離し、しかる慢１０ら細胞／′１の濃度が得ら
れるように完全培地中に再懸濁し、次いでそれらをコス
タ−プレート（Ｃｏ５ｔａｒ ｐｌ −ａｔｅｓ）上に
１１分量に分配した。
意深く再懸濁した。次いでそれらを再び５分間２００ｇ
で遠心分離し、しかる慢１０ら細胞／′１の濃度が得ら
れるように完全培地中に再懸濁し、次いでそれらをコス
タ−プレート（Ｃｏ５ｔａｒ ｐｌ −ａｔｅｓ）上に
１１分量に分配した。
ハイブリドーマの び培養
細胞融合の後、細胞をＨＡ Ｔ培地（ヒボキサンチン、
アミノプテリン、チミジン）中で３７℃で湿った雰囲気
中の５％ＣＯεを使用して培養した。
アミノプテリン、チミジン）中で３７℃で湿った雰囲気
中の５％ＣＯεを使用して培養した。
数週間の襖、ハイブリドーマ細胞の培養物からの上澄液
１００μｍを抗−プラスミノゲンーアクチベーター活性
（ａｎｔｉ −ｐｌａｓｍｌｎｏｇｅｎ −ａｃｔｆｖ
ａｔｏｒａｃｔｌｖｌｔｙ）に対して試験した。
１００μｍを抗−プラスミノゲンーアクチベーター活性
（ａｎｔｉ −ｐｌａｓｍｌｎｏｇｅｎ −ａｃｔｆｖ
ａｔｏｒａｃｔｌｖｌｔｙ）に対して試験した。
抗−ブラスミノゲンーアクチベーター試験において正の
結果を示したこれらのハイブリドーマセルラインがりＯ
ン化に対して選ばれた。この目的Ｃ、ハイブリドーマは
、２倍階段希釈クロン化方法（ｄｏｕｂｌｅ−ｄｌｌｕ
ｔｌｏｎ ｃｌｏｎｌｎｇ ｔｅｃｈｎｌｑｕｅ）に付
した。この方法においては９６のミクロタイターウェル
をウェル当り０．５細胞の針棒された希釈率で接種し、
その際１０Ｓマウス胸腺細胞（ｔｂ−ＶＩｌｌＯＣＶｔ
ｅＳ ）が゛フィーダニ細ｌＢ” （ｆｅｅｄｅｒ ｃ
ｅｌｌｓ）としで作用する。このりＯン化プロセス後も
依然とし【抗体を産生ずる細胞を増殖せしめ、凍結し、
そして２５％胎内仔ウシ血清及び７．５％ジメチルスル
ホキシドを含有する完全培地中で液体窒素内で貯蔵され
た。
結果を示したこれらのハイブリドーマセルラインがりＯ
ン化に対して選ばれた。この目的Ｃ、ハイブリドーマは
、２倍階段希釈クロン化方法（ｄｏｕｂｌｅ−ｄｌｌｕ
ｔｌｏｎ ｃｌｏｎｌｎｇ ｔｅｃｈｎｌｑｕｅ）に付
した。この方法においては９６のミクロタイターウェル
をウェル当り０．５細胞の針棒された希釈率で接種し、
その際１０Ｓマウス胸腺細胞（ｔｂ−ＶＩｌｌＯＣＶｔ
ｅＳ ）が゛フィーダニ細ｌＢ” （ｆｅｅｄｅｒ ｃ
ｅｌｌｓ）としで作用する。このりＯン化プロセス後も
依然とし【抗体を産生ずる細胞を増殖せしめ、凍結し、
そして２５％胎内仔ウシ血清及び７．５％ジメチルスル
ホキシドを含有する完全培地中で液体窒素内で貯蔵され
た。
一プラスミノ゛ンアクチベーター■−活性の培養物上澄
液１００μＩを細胞培養物から除去しそしてプラスミノ
ゲンアクチベーター（５μす／１）が室温で３時間固定
され、次いで水で完全に洗浄されていたミクロタイター
ウェル内に入れた。次いで、１２Ｊ（ヤギ）−抗マウス
免疫グロブリン（”’ ｌ −（ｇｏａｔ） −ａｎｔ
ｌｍｏｕｓｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌ −ｏｂｕｌｌｎ）
（８−１０Ｘ １０’ ＣＤｍ）を加え、次にプレ
ー１−を室温で３時間インキュベートした。蒸留水で新
たに洗浄した後、試料をＬＫＢガンマカウンター（Ｌ
Ｋ Ｂ ａａｍｍａ ｃｏｕｎｔｅｒ）において！！１
数した。表１は組織型のヒトプラスミノゲンアクチベー
ターに対する抗体を分泌するハイブリドーマのいくつか
の代表的例を示す。
液１００μＩを細胞培養物から除去しそしてプラスミノ
ゲンアクチベーター（５μす／１）が室温で３時間固定
され、次いで水で完全に洗浄されていたミクロタイター
ウェル内に入れた。次いで、１２Ｊ（ヤギ）−抗マウス
免疫グロブリン（”’ ｌ −（ｇｏａｔ） −ａｎｔ
ｌｍｏｕｓｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌ −ｏｂｕｌｌｎ）
（８−１０Ｘ １０’ ＣＤｍ）を加え、次にプレ
ー１−を室温で３時間インキュベートした。蒸留水で新
たに洗浄した後、試料をＬＫＢガンマカウンター（Ｌ
Ｋ Ｂ ａａｍｍａ ｃｏｕｎｔｅｒ）において！！１
数した。表１は組織型のヒトプラスミノゲンアクチベー
ターに対する抗体を分泌するハイブリドーマのいくつか
の代表的例を示す。
抗体を含有する腹水液（ａｓｃｉｔｅｓ ｆｌｕｌｄ
）を得ルタメに、、１’）ステ＞ （ｐｒｌｓｔａｎｅ
） ０．５ｍｌで予備処理されたマイスに同じハイブリ
ドーマをその１０−１５日侵に腹腔内に注射した。抗体
活性を舶記し・た如（決定した。表１に示されている通
り、腹水液の抗体力価（ａｎｔｌｂｏｄｙ ｔｌｔｒｅ
ｓ ）は１゜−３〜３ｘ１０−Ｇの範囲にわたる。
）を得ルタメに、、１’）ステ＞ （ｐｒｌｓｔａｎｅ
） ０．５ｍｌで予備処理されたマイスに同じハイブリ
ドーマをその１０−１５日侵に腹腔内に注射した。抗体
活性を舶記し・た如（決定した。表１に示されている通
り、腹水液の抗体力価（ａｎｔｌｂｏｄｙ ｔｌｔｒｅ
ｓ ）は１゜−３〜３ｘ１０−Ｇの範囲にわたる。
＼
クローン化されたハイブリドーマにより産生きバイブリ
ドクローンにより産生された抗体のクラス及びサブクラ
スを分析した。各抗体を濃縮し、そしてｌ１ＩＩｌｌア
ンモニウム（４０％飽和）により培地上澄液からの沈殿
により部分的に精製した。免疫グロブリンの特定のクラ
スをクラス−特異性抗マウス−免疫グロブリン抗面清（
ｃｌａｓｓ −５ｐｅｃｌ−ｆｉｃ ａｎｔｌｍｏｕ
ｓｅ −ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｌｎ ａｎｔｌ
ｓｅｒａ ） を使用してオフテルロニーゲル拡散
試験（Ｑ ｕｃｈｔｅ−ｒｌｏｎｙ ｇｅｔ ｄｉｆｆ
ｕｓｉｏｎ ｔｅｓｔ）におい−（決定した。
ドクローンにより産生された抗体のクラス及びサブクラ
スを分析した。各抗体を濃縮し、そしてｌ１ＩＩｌｌア
ンモニウム（４０％飽和）により培地上澄液からの沈殿
により部分的に精製した。免疫グロブリンの特定のクラ
スをクラス−特異性抗マウス−免疫グロブリン抗面清（
ｃｌａｓｓ −５ｐｅｃｌ−ｆｉｃ ａｎｔｌｍｏｕ
ｓｅ −ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｌｎ ａｎｔｌ
ｓｅｒａ ） を使用してオフテルロニーゲル拡散
試験（Ｑ ｕｃｈｔｅ−ｒｌｏｎｙ ｇｅｔ ｄｉｆｆ
ｕｓｉｏｎ ｔｅｓｔ）におい−（決定した。
表２に示された如く、プラスミノゲンアクチベーターに
対する抗体の大部分は１ｇＭ又はＩａ Ｇｌクラスに属
し、そして１種のみがＩｇＧ２ｂ型であ東Ｊ１性−」し プラスミノゲンアクチベーターに対する抗体によるプラ
スミノゲンアクチベーター活性の抑制。
対する抗体の大部分は１ｇＭ又はＩａ Ｇｌクラスに属
し、そして１種のみがＩｇＧ２ｂ型であ東Ｊ１性−」し プラスミノゲンアクチベーターに対する抗体によるプラ
スミノゲンアクチベーター活性の抑制。
プラスミノゲンアクチベ＝ターはプラスミノゲンをプラ
スミンに転化するプロテアーゼである。
スミンに転化するプロテアーゼである。
プラスミノゲンアクチベーターの活性はフィブリンプレ
ート法により測定することができる。この方法において
は、フィブリンに編入されたプラスミノゲンはプラスミ
ノゲンアクチベーターにより活性化される。抗プラスミ
ノゲンアクチベータ二抗体の効果は、単独で又は組合せ
において、フィブリンプレート試験において決定された
。表３は３４種の抗体の中から６種のものがこの試験シ
ステムにおいてｍ帷素溶解反応を抑制することを示す。
ート法により測定することができる。この方法において
は、フィブリンに編入されたプラスミノゲンはプラスミ
ノゲンアクチベーターにより活性化される。抗プラスミ
ノゲンアクチベータ二抗体の効果は、単独で又は組合せ
において、フィブリンプレート試験において決定された
。表３は３４種の抗体の中から６種のものがこの試験シ
ステムにおいてｍ帷素溶解反応を抑制することを示す。
６種の活性な抗体はそれらの抑制特性において定量的に
異なる。２つの抗体を混合するとき、追加の抑制がフィ
ブリンプレート試験において観測される。これは２つの
抗体が異なる抗原決定基に対して向けられる（ ｄｉｒ
ｅｃｔｅｄ）ことを示すものである。
異なる。２つの抗体を混合するとき、追加の抑制がフィ
ブリンプレート試験において観測される。これは２つの
抗体が異なる抗原決定基に対して向けられる（ ｄｉｒ
ｅｃｔｅｄ）ことを示すものである。
表３
プラスミノゲンアクチベーターに対する抗体の混合物に
よプラスミノゲンアクチベニターの抑制 御３１８１１ ２８２８８ ２０６Ｇ５１３１Ｂ１
１ ６５ ％ １００ ％ １００ ％２
８２８８ １００ ％ ９７ ％ １０
０ ％２０６Ｇ５ １００ ％ １００ ％
６５ ％３３Ｂ１２ ９１ ％ ８
２ ％ ６２ ％１３７Ｇ７ ８６ ％
６５ ％ ６５ ％２９９Ｇ１２ ７９
％ ５２ ％ ６５ ％７３Ｅ１０
７２ ％ ４５ ％ ５５ ％抗体の希
釈： １０−！ るフィブリンプレート試験における組織型の３３８１２
１３７Ｇ７ ２９９０１２ ７３Ｅ１０９１
％ ８６ ％ ７９ ％ ７２ ％８０
％ ６５ ％ ５２ ％ ４５ ％６
２ ％ ６５ ％ ６５ ％ ５５ ％
３０ ％ ４５ ％ ３０ ％ ３０
％４５ ％ ２２ ％ ３０ ％ ２０
％３０ ％ ３０ ％ １４ ％ １
４ ％３０ ％ ２０ ％ １４ ％
０ ％釆［ 組織型のヒト、プラスミノゲンアクチベーターに対する
抗体とウロキナーゼとの交叉反応。
よプラスミノゲンアクチベニターの抑制 御３１８１１ ２８２８８ ２０６Ｇ５１３１Ｂ１
１ ６５ ％ １００ ％ １００ ％２
８２８８ １００ ％ ９７ ％ １０
０ ％２０６Ｇ５ １００ ％ １００ ％
６５ ％３３Ｂ１２ ９１ ％ ８
２ ％ ６２ ％１３７Ｇ７ ８６ ％
６５ ％ ６５ ％２９９Ｇ１２ ７９
％ ５２ ％ ６５ ％７３Ｅ１０
７２ ％ ４５ ％ ５５ ％抗体の希
釈： １０−！ るフィブリンプレート試験における組織型の３３８１２
１３７Ｇ７ ２９９０１２ ７３Ｅ１０９１
％ ８６ ％ ７９ ％ ７２ ％８０
％ ６５ ％ ５２ ％ ４５ ％６
２ ％ ６５ ％ ６５ ％ ５５ ％
３０ ％ ４５ ％ ３０ ％ ３０
％４５ ％ ２２ ％ ３０ ％ ２０
％３０ ％ ３０ ％ １４ ％ １
４ ％３０ ％ ２０ ％ １４ ％
０ ％釆［ 組織型のヒト、プラスミノゲンアクチベーターに対する
抗体とウロキナーゼとの交叉反応。
ヒトの尿から得られたプロテアーゼ（たとえばセＤ／社
（ＳｅｒＯｎＯ）からのウキダン（１２）（Ｕｋｌ−ｄ
ａｎ”） ）又は組織培養物の上澄液から得られるプロ
テアーゼ（たとえばアボット社（Ａｂｂｏｔｔ ）から
の７ボキナーゼ （Ａ ｂｂｏｋｉｎａｓｅ（’） ＞
１ テあるウロキナーゼは、組織型のプラスミノゲン
アクチベーターと同様な方法でプラスミノダンをプラス
ミンに転化することができる。この理由で上記抗体を、
上記した２つのタイプのウロキナーゼとの交叉反応性に
対して調査した。′表４は、３５の抗体の中５積が組織
型のプラスミノゲンアクチベーターに対してのみ向けら
れ、これに対し３０種の他の抗体はＵｋｌｄａｌｌ（１
２）とも反応し、これらの中の１０種はＡ ｂｂｏｋｌ
ｎａｓｅ （１２）ト反ｂ ｔ ル。
（ＳｅｒＯｎＯ）からのウキダン（１２）（Ｕｋｌ−ｄ
ａｎ”） ）又は組織培養物の上澄液から得られるプロ
テアーゼ（たとえばアボット社（Ａｂｂｏｔｔ ）から
の７ボキナーゼ （Ａ ｂｂｏｋｉｎａｓｅ（’） ＞
１ テあるウロキナーゼは、組織型のプラスミノゲン
アクチベーターと同様な方法でプラスミノダンをプラス
ミンに転化することができる。この理由で上記抗体を、
上記した２つのタイプのウロキナーゼとの交叉反応性に
対して調査した。′表４は、３５の抗体の中５積が組織
型のプラスミノゲンアクチベーターに対してのみ向けら
れ、これに対し３０種の他の抗体はＵｋｌｄａｌｌ（１
２）とも反応し、これらの中の１０種はＡ ｂｂｏｋｌ
ｎａｓｅ （１２）ト反ｂ ｔ ル。
抗体のこの交叉反応性は、組織型のプラスミノダンアク
チベーター及びウロキナーゼにおける共通の構成要素（
ｓｔｒｖｃｔｕｒａｌ ｅｌｅｌｌｌｅｌｌｔｓ ）に
帰することができるが、ウロキナーゼによるこの蛋白質
の汚染に帰することもてきる。２つの解釈の何れがより
確からしいかを決定するために、イムノア１〜ソープシ
ヨンクロマトグラフイーを使用して組Ｉ１１！型のプラ
スミノグンアクチベーターを調製し、この蛋白質とのみ
反応するモノクロナル抗体を使用する。このように精製
されたプラスミノグンアクチベーターを次いで試験シス
テムに対する抗原として使用した。結合試験はこのプラ
スミノダンアクヂベーターはすべての抗体と反応４るこ
とも示した。この実験は１組織型のプラスミノダンアク
チベーターとウロキナーゼとの間に交叉反応が起こるこ
と、従って２つの酵素は共通の抗原決定基を有すること
を明らかにする。
チベーター及びウロキナーゼにおける共通の構成要素（
ｓｔｒｖｃｔｕｒａｌ ｅｌｅｌｌｌｅｌｌｔｓ ）に
帰することができるが、ウロキナーゼによるこの蛋白質
の汚染に帰することもてきる。２つの解釈の何れがより
確からしいかを決定するために、イムノア１〜ソープシ
ヨンクロマトグラフイーを使用して組Ｉ１１！型のプラ
スミノグンアクチベーターを調製し、この蛋白質とのみ
反応するモノクロナル抗体を使用する。このように精製
されたプラスミノグンアクチベーターを次いで試験シス
テムに対する抗原として使用した。結合試験はこのプラ
スミノダンアクヂベーターはすべての抗体と反応４るこ
とも示した。この実験は１組織型のプラスミノダンアク
チベーターとウロキナーゼとの間に交叉反応が起こるこ
と、従って２つの酵素は共通の抗原決定基を有すること
を明らかにする。
丸ｉ」−先
イムノアトソープションクロマトグラフイーによる組織
型のプラスミノダンアクヂベーターの精製及び濃縮 組織型のヒト、プラスミノダンアクチベーターとのみ反
応するこれらの抗体、即ち、１３１．２０６及び２８２
はＳ、 Ｃ，Ｍａｒｃｌ＋、 Ｊ、 ｐａｒｉｋｌ＋ａ
ｎｄ Ｐ、 Ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓ、 Ａｎａｌ 、
Ｂ ｉｏｃｈｅｍ、６０゜１４９ （１９７４）の方
法によりゲル１当り蛋白″１１１１０１１（］の濃度で
Ｓ ｅｐｈａｒｏｓｅ４ Ｂ に共有結合により（ｃ
ｏｖａｌｅｎｔｌｙ）結合された。
型のプラスミノダンアクヂベーターの精製及び濃縮 組織型のヒト、プラスミノダンアクチベーターとのみ反
応するこれらの抗体、即ち、１３１．２０６及び２８２
はＳ、 Ｃ，Ｍａｒｃｌ＋、 Ｊ、 ｐａｒｉｋｌ＋ａ
ｎｄ Ｐ、 Ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓ、 Ａｎａｌ 、
Ｂ ｉｏｃｈｅｍ、６０゜１４９ （１９７４）の方
法によりゲル１当り蛋白″１１１１０１１（］の濃度で
Ｓ ｅｐｈａｒｏｓｅ４ Ｂ に共有結合により（ｃ
ｏｖａｌｅｎｔｌｙ）結合された。
プラスミノダンアクチベーターに対するｈラムの結合容
量はゲル１当り０．５ｍｏ〜１゜５ｍｏであることが決
定された。このようにして精製された物質の酵素活性は
出発溶液の１０００倍より高く濃縮された。この方法で
精製されたプラスミノダンアクチベーターの電気泳動パ
ターンは常用の方法で精製された物質のそれと同一であ
った。イムノアトリープジョンクロマトグラフィーから
のプラスミノダンアクチベーターの収率は常用の方法に
対する約４０％と比較して９０％までであった。
量はゲル１当り０．５ｍｏ〜１゜５ｍｏであることが決
定された。このようにして精製された物質の酵素活性は
出発溶液の１０００倍より高く濃縮された。この方法で
精製されたプラスミノダンアクチベーターの電気泳動パ
ターンは常用の方法で精製された物質のそれと同一であ
った。イムノアトリープジョンクロマトグラフィーから
のプラスミノダンアクチベーターの収率は常用の方法に
対する約４０％と比較して９０％までであった。
表 ５：プラスミノグンアクチベーターのフィブリン結
合サイトと抗体の反応抗体ＩＩｐＸは約１０μｇ ７ｍ
１であった。
合サイトと抗体の反応抗体ＩＩｐＸは約１０μｇ ７ｍ
１であった。
抗体の試料を固定化１−リプシンで処理してこれらの試
料において痕跡鱗の天然に存在づるプロテアーゼを除去
する。
料において痕跡鱗の天然に存在づるプロテアーゼを除去
する。
これらの調製物を検定システム中に含ませ、それにおい
て光色原性基１４ｔ （ｃｈｒｏｍｏｏｅｎｌｃ ５ｕ
ｂｓｔｒ−ａｔｅ ）プラスミノダン及びプラスミノダ
ンアクチベーターはフィブリン単量体の存在下に又は不
存在下に一緒にインキュベートされる。フィブリン単量
体の含有は普通プラスミノグシアクチベーターの活性を
約１０倍増加させる。
て光色原性基１４ｔ （ｃｈｒｏｍｏｏｅｎｌｃ ５ｕ
ｂｓｔｒ−ａｔｅ ）プラスミノダン及びプラスミノダ
ンアクチベーターはフィブリン単量体の存在下に又は不
存在下に一緒にインキュベートされる。フィブリン単量
体の含有は普通プラスミノグシアクチベーターの活性を
約１０倍増加させる。
この増加は、プラスミノダンアクチベーターのフィブリ
ン結合サイトとこれらの抗体の相互作用を示す試験され
た抗体の３つにより抑制される。
ン結合サイトとこれらの抗体の相互作用を示す試験され
た抗体の３つにより抑制される。
結果は表５に与えられる。
特許出願人 バイエル・アクチェンゲゼルシャフト
手続補正書
昭和５８年ｖＭ２１日
特許庁１え１．・ イ゛。杉 和 夫 殿１事
Ｐ１の表、１． １［ｌｌ：・１−１ｓｓ−１（１３５７７＋号２、発明
の名称 一ヒツクはナルリし体 ３ ン山１１゛ンする名 車１’ｌンの関係 特、；゛１出願人（１１す（；
イ ・、・１ｉｊｌ（ＩＩ和国し ハ〔−ｌ・り 七・
／（番地なし）名称 パイ１ル ＩクブＴノケ邊す
電 ７９７１４１人、 １・１′ 人 １１所 ｔｘｔ 明細書第１３自１１行に、「である。１とあ
る後に、 ［本発明におけるハイブリドーマ細１１ｉ＋Ｊは微工研
寄託受託拒否の動物融合細１泡であって、例えば、後Ｉ
＠表ＩＫ示したハイブリドーマ’ＩＣ６は微工研通知番
号：５８微寄文填７３９号で寄託受託拒否通知を受けた
。」 と加入する。
Ｐ１の表、１． １［ｌｌ：・１−１ｓｓ−１（１３５７７＋号２、発明
の名称 一ヒツクはナルリし体 ３ ン山１１゛ンする名 車１’ｌンの関係 特、；゛１出願人（１１す（；
イ ・、・１ｉｊｌ（ＩＩ和国し ハ〔−ｌ・り 七・
／（番地なし）名称 パイ１ル ＩクブＴノケ邊す
電 ７９７１４１人、 １・１′ 人 １１所 ｔｘｔ 明細書第１３自１１行に、「である。１とあ
る後に、 ［本発明におけるハイブリドーマ細１１ｉ＋Ｊは微工研
寄託受託拒否の動物融合細１泡であって、例えば、後Ｉ
＠表ＩＫ示したハイブリドーマ’ＩＣ６は微工研通知番
号：５８微寄文填７３９号で寄託受託拒否通知を受けた
。」 と加入する。
＆ 添付書類の目優
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、組織型のプラスミノゲンアクチペーターに対り゛る
モノクロナル抗体。 ２、組織型のプラスミノグンアクチベーターに対するモ
ノクロナル抗体の製造方法において、組織型のプラスミ
ノゲンアクチベーターで免疫された哺乳動物から得られ
た細胞とミエローマ細胞を融合させ、そして抗体を産生
ずるこれから生じるハイツリドーマの細胞を選ぶことを
特徴とするｈ法。 ３、マウス細胞を使用することを特徴とする特許請求の
範囲第２項記載の方法。 ４、組織型の１ラスミノゲンアクチペーターに対するモ
ノクロナル抗体を産生ずるハイプリドーマ細胞。 ５、マウスミエローマ細胞と免疫されたマイスからの稗
臓細胞との融合により産生されることを特徴とする特許
請求の範囲第４項記載のハイプリドーマ細胞。 ６、イムノアトソープションクロマトグラフィーによる
プラスミノゲンアクチベーターの精製のための、組織型
のプラスミノグンアクチベーターに対するモノクロナル
抗体の使用。 １、正常な又は悪性の細胞及び組織におけるプラスミノ
ゲンアクチベーターの検出のための、組織型のプラスミ
ノゲンアクチベーターに対するモノクロナル抗体の使用
。 ８、特異的モノクロナル抗体によるフィブリン結合サイ
トの検出の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE32220847 | 1982-06-11 | ||
| DE19823222084 DE3222084A1 (de) | 1982-06-11 | 1982-06-11 | Monoklonale antikoerper |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS595121A true JPS595121A (ja) | 1984-01-12 |
Family
ID=6165881
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10357783A Pending JPS595121A (ja) | 1982-06-11 | 1983-06-11 | モノクロナル抗体 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS595121A (ja) |
| DE (1) | DE3222084A1 (ja) |
| FR (1) | FR2528451A1 (ja) |
| GB (1) | GB2122219A (ja) |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61148200A (ja) * | 1984-12-21 | 1986-07-05 | Fujisawa Pharmaceut Co Ltd | モノクローナル抗体 |
| JPS61176600A (ja) * | 1985-01-31 | 1986-08-08 | Asahi Chem Ind Co Ltd | 人正常細胞由来の新規な組織型プラスミノ−ゲンアクチベ−タ−に対するモノクロナル抗体 |
| JPS61181964A (ja) * | 1985-02-07 | 1986-08-14 | Kowa Co | 人正常細胞由来の組織型プラスミノーゲンアクチベーターに対するモノクロナル抗体を用いる免疫学的測定試薬 |
| JPS61183299A (ja) * | 1985-02-08 | 1986-08-15 | Kowa Co | 人正常細胞由来の組織型プラスミノ−ゲンアクチベ−タ−に対する新規なモノクロナル抗体およびそれによる精製法ならびに検出法 |
| JPS61221128A (ja) * | 1985-03-26 | 1986-10-01 | Snow Brand Milk Prod Co Ltd | プラスミノ−ゲン活性化因子に対するモノクロ−ナル抗体とその調製方法及び該モノクロ−ナル抗体の使用方法 |
| JPS6349096A (ja) * | 1986-08-13 | 1988-03-01 | モンサント カンパニ− | ヒト結腸線維芽細胞由来組織プラスミノ−ゲン活性化因子に対するモノクロ−ナル抗体及びその用途 |
| JPH01112157A (ja) * | 1987-07-10 | 1989-04-28 | Yamanouchi Pharmaceut Co Ltd | 組織プラスミノーゲンアクチベーター活性の測定法，測定具及び測定用キット |
| JPH02492A (ja) * | 1987-07-16 | 1990-01-05 | Yamanouchi Pharmaceut Co Ltd | 新規なモノクローナル抗体 |
| JPH0213395A (ja) * | 1988-04-26 | 1990-01-17 | E I Du Pont De Nemours & Co | 組織プラスミノーゲンアクチベーターに対するモノクローナル抗体 |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4753879A (en) * | 1984-08-27 | 1988-06-28 | Biogen N.V. | Modified tissue plasminogen activators |
| EP0190711B1 (en) * | 1985-02-07 | 1989-04-26 | Kowa Company, Ltd. | Monoclonal antibodies to tissue plasminogen activator derived from human normal cells |
| US4891312A (en) * | 1986-08-13 | 1990-01-02 | Monsanto Company | Monoclonal antibody specific for human colon fibroblast-derived t-PA |
| US4889922A (en) * | 1986-08-13 | 1989-12-26 | Monsanto Co. | Monoclonal antibody specific for human colon fibroblast-derived T-PA |
| US5102787A (en) * | 1987-07-10 | 1992-04-07 | Miho Sasamata | Method, device and kit for measurement of tissue plasminogen activator activity |
| US5411864A (en) * | 1987-11-05 | 1995-05-02 | Genentech, Inc. | Method of purifying recombinant proteins from corresponding host cell proteins |
| US5372812A (en) * | 1988-04-04 | 1994-12-13 | The General Hospital Corporation | Composition and method for acceleration of clot lysis |
-
1982
- 1982-06-11 DE DE19823222084 patent/DE3222084A1/de not_active Withdrawn
-
1983
- 1983-06-10 GB GB8316001A patent/GB2122219A/en not_active Withdrawn
- 1983-06-10 FR FR8309632A patent/FR2528451A1/fr not_active Withdrawn
- 1983-06-11 JP JP10357783A patent/JPS595121A/ja active Pending
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61148200A (ja) * | 1984-12-21 | 1986-07-05 | Fujisawa Pharmaceut Co Ltd | モノクローナル抗体 |
| JPS61176600A (ja) * | 1985-01-31 | 1986-08-08 | Asahi Chem Ind Co Ltd | 人正常細胞由来の新規な組織型プラスミノ−ゲンアクチベ−タ−に対するモノクロナル抗体 |
| JPH0575394B2 (ja) * | 1985-01-31 | 1993-10-20 | Asahi Chemical Ind | |
| JPS61181964A (ja) * | 1985-02-07 | 1986-08-14 | Kowa Co | 人正常細胞由来の組織型プラスミノーゲンアクチベーターに対するモノクロナル抗体を用いる免疫学的測定試薬 |
| JPS61183299A (ja) * | 1985-02-08 | 1986-08-15 | Kowa Co | 人正常細胞由来の組織型プラスミノ−ゲンアクチベ−タ−に対する新規なモノクロナル抗体およびそれによる精製法ならびに検出法 |
| JPS61221128A (ja) * | 1985-03-26 | 1986-10-01 | Snow Brand Milk Prod Co Ltd | プラスミノ−ゲン活性化因子に対するモノクロ−ナル抗体とその調製方法及び該モノクロ−ナル抗体の使用方法 |
| JPS6349096A (ja) * | 1986-08-13 | 1988-03-01 | モンサント カンパニ− | ヒト結腸線維芽細胞由来組織プラスミノ−ゲン活性化因子に対するモノクロ−ナル抗体及びその用途 |
| JPH01112157A (ja) * | 1987-07-10 | 1989-04-28 | Yamanouchi Pharmaceut Co Ltd | 組織プラスミノーゲンアクチベーター活性の測定法，測定具及び測定用キット |
| JPH0588783B2 (ja) * | 1987-07-10 | 1993-12-24 | Yamanouchi Pharma Co Ltd | |
| JPH02492A (ja) * | 1987-07-16 | 1990-01-05 | Yamanouchi Pharmaceut Co Ltd | 新規なモノクローナル抗体 |
| JPH0213395A (ja) * | 1988-04-26 | 1990-01-17 | E I Du Pont De Nemours & Co | 組織プラスミノーゲンアクチベーターに対するモノクローナル抗体 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| GB8316001D0 (en) | 1983-07-13 |
| DE3222084A1 (de) | 1983-12-15 |
| GB2122219A (en) | 1984-01-11 |
| FR2528451A1 (fr) | 1983-12-16 |
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