JPS61221128A - プラスミノ−ゲン活性化因子に対するモノクロ−ナル抗体とその調製方法及び該モノクロ−ナル抗体の使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 崖ｍ汰肛 本発明は、ヒト胎児肺由来の線維芽細胞の培養により産
生されるプラスミノーゲン活性化因子に対するモノクロ
ーナル抗体に関し、更に詳しくは上記線維芽細胞の培養
により同時的に産生されるウロキナーゼ型のプラスミノ
ーゲン活性化因子と、該ウロキナーゼ型のプラスミノー
ゲン活性化因子とは異なる特性を有するプラスミノーゲ
ン活性化因子が混在している培養液からウロキナーゼ型
のプラスミノーゲン活性化因子のみを選択的に除去して
得られる上記プラスミノーゲン活性化因子に対するモノ
クローナル抗体に関する。

したがって、ここでいう“プラスミノーゲン活性化因子
′″　（以下ブラスミノーゲンアクチベーターと称する
）とは、ヒト胎児肺由来の線維芽綱胞が産生ずるブラス
ミノーゲンアクチベーターのうちからウロキナーゼ型の
ものを除去して得られる新しいタイプのプラスミノーゲ
ンアクチベータ−を意味するものである。

従来■肢血宜員 現在、血栓塞栓症（Ｔｈｒｏ＋ｎｂｏｅｎ＋ｂｏｌｉｃ
　ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）の治療には、ヒトの尿又は腎ｌ
ＩｆｉＩＩｍ胞培養物から得られたウロキナーゼ、及び
β−溶血性連鎖球菌（β−ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃ　５ｔ
ｒｅｐｔｏｃｃｉ）の培養液の濾液がら単離されたスト
レプトキナーゼがプラスミノーゲンアクチベーターとし
て線維素溶解剤に用いられている。

しかしながら、ウロキナーゼは線維素（フィブリン）に
対する親和性が低く、かつ大量投与に起因する出血等の
副作用を有し、一方ストレプトキナーゼは微生物由来の
酵素タンパクであるためヒトに投与した場合アレルギー
を起すなどの懸念があり、したがって、これらを血栓塞
栓症の治療剤とし゛て適用するうえで決して問題がない
とは言えない。

近年、これらのプラスミノーゲンアクチベータ〜とは異
なり、生体の組織中に存在する組織型プラスミノーゲン
アクチベーターが注目されてきている。

この組織型プラスミノーゲンアクチベーターは、上記ウ
ロキナーゼ及びストレプトキナーゼと分子量の点で区別
されるプラスミノーゲンアクチベーターであって、Ｒｉ
ｊｋｅｎ＆Ｃｏ１）ｅｎ　（Ｊ、Ｂ、Ｃ，、２５６７０
３５〜７０４１．　（１９８１）、Ｔｈｒｏ＋ｍｂ　Ｈ
ａｅｍｏｓｔａｓ（Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ）４８、　２９
４〜２９６　（１９Ｂ２））により、ヒトのメラノーマ
細胞の培養上清から単離、精製して採取されたものであ
る。その後、更にこのヒトメラノーマ細胞由来の組織型
プラスミノーゲンアクチベーターについて、Ｐｅｎｎ１
ｃａ　ｅｔ　ａｌ、　（Ｎａｔｕｒｅ、　３０１．２１
４〜２２１　（１９８３））は分子の一次構造であるア
ミノ酸配列を決定し′、またＢｅｎｎｅｔ　　（Ｔｈｒ
ｏｍｂ、Ｈａｅａ＋ｏｓｔａｓ。

剣、１０６（１９８３）　）は糖鎖の結合位置が異なる
２種のバリアントが存在し、両バリアント間に分子量的
に３０００の差異があることを明らかにしている。

また、他の組織型ブラスミノーゲンアクチベーターとし
て、Ｖｅｔｔｅｒ　１ｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ、　（Ｊ、Ｂ
、Ｃ，，２５４，５７５〜５７Ｂ　（１９７９）、Ｊ、
Ｂ、Ｃ，、国、３６６５〜３６７２　（１９８０）　）
は、ヒト胎児肺細胞由来の正常線維芽紺胞ＩＭＲ−９０
が産生ずるプラスミノーゲンアクチベーターについて報
告しており、このアクチベーターには分子量ｓｏ、ｏｏ
ｏ〜６０，０００のウロキナーゼ型プラスミノーゲンア
クチベーターと、抗ウロキナーゼ抗体に中和されない分
子量７３．０００の新しい型のブラスミノーゲンアクチ
ベーターが存在していることを明らかにしている。

更に、Ｗｉｌｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　　（Ｃａｎｃｅｒ
　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、４０９３３〜９３８　（１９８０
））も８退会のヒト胎児肺由来線維芽細胞が分子量６０
．０００のウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベー
ターと、抗ウロキナーゼ抗体に中和されない分子量約７
０．０００の新しい型のプラスミノーゲンアクチベータ
ーを産生ずることを確認している。

一方、最近、上記ヒトメラノーマ細胞由来の組織型プラ
スミノーゲンアクチベーターに対するモノクローナル抗
体の作成に関する発明が公表されている（特開昭５９−
５１２１号）、この発明では、ヒトメラノーマ細胞由来
の組織型プラスミノーゲンアクチベーターで免疫したマ
ウスの膵臓細胞とマウスミエローマ細胞との細胞融合に
より、上記プラスミノーゲンアクチベーターに対する抗
体を産生ずるハイプリドーマが４０株骨分離れ、そのう
ち５株のハイプリドーマが産生ずる抗体のみが該プラス
ミノーゲンアクチベーターに対して特異的であって、他
の大部分のハイプリドーマが産生ずる抗体はウロキナー
ゼに対しても交叉することを示し、そしてこのことは、
抗原として用いた上記組織型ブラスミノーゲンアクチベ
ーターがウロキナーゼにより汚染されていることに因る
ものではなくて、該プラスミノーゲンアクチベーターと
ウロキナーゼとの間に交叉反応が起ること、すなわち、
これらの２種の酵素には共通の抗原決定基を有すること
に因るものと教示している。

而して、上記ヒト胎児肺由来正常線維芽細胞が産生ずる
新しいタイプのブラスミノーゲンアクチベーターに関し
ては、未だその精製、単離の方法が確立されていないた
め、その酵素化学的性質も一次構造も明らかにされてい
ない。

したがって、ヒト胎児肺由来の正常線維芽細胞が産生ず
る上記プラスミノーゲンアクチベーターが上述したヒト
メラノーマ由来の組織型ブラスミノーゲンアクチベータ
ーと同一物質であるかどうかは勿論のこと、それらの分
子の一次構造に差異があるかどうかについても未だ明ら
かにされていない。

因に、ヒト正常線維芽細胞由来の上記新しいタイプのプ
ラスミノーゲンアクチベーターの精製取得方法として、
最近、亜鉛キレートカラム、フィブリンカラム、コンカ
ナバリンＡセファロースカラム、アルギニンセファロー
スカラム等を用いる方法が提案されている（特開昭５９
−５１２２０号）。

しかし、この方法ではこれらのカラムと上記プラスミノ
ーゲンアクチベーターとの結合が特異的でないため、高
純度のプラスミノーゲンアクチベーターを得ることは不
可能であり、加うるに回収率も低いので実用性に乏しい
。

また、上記ブラスミノーゲンアクチベーターの抗血清か
ら得られる特異的抗体を用いる精製法も考慮されるが、
該抗体は混合物であることからタンパク量当りの抗体力
価が低く、ブラスミノーゲンアクチベーターに対する親
和性、抗体の安定性及びカラムクロマトグラフィーの条
件等が均一でない欠点があり、したがって、カラムによ
る吸着効率が低（、回収率も高くない。

が　ゞ　しようとする。　占 本発明者は、ヒト胎児肺由来の線維芽細胞の培養により
産生される新しいタイプのプラスミノーゲンアクチベー
ターを高純度に精製してその酵素化学的性質を明らかに
すべく検討している過程で、該プラスミノーゲンアクチ
ベーターで免疫したマウスの膵臓細胞とマウスのミエロ
ーマ細胞との細胞融合によって得られたハイプリドーマ
の１３０株が産生ずる抗体の特異性について調べたとこ
ろ、全ての抗体が上記プラスミノーゲンアクチベーター
のみに特異的であって、ウロキナーゼには全く交叉しな
いことが確認されたことから、両者のブラスミノーゲン
アクチベーターの間には共通の抗原決定基が存在しない
ことを見出した。

したがって、本発明に係るプラスミノーゲンアクチベー
ターは、前述したヒトメラノーマ由来の組織型ブラスミ
ノーゲンアクチベーターとは異なる免疫化学的反応を示
すものと言うことができる。

本発明者は、上述した知見に基づき、多数の上記ハイプ
リドーマを作成して、それより上記プラスミノーゲンア
クチベーターに対して特異性を有する新規なモノクロー
ナル抗体を得ることに成功し、本発明をなすに至った。

更に、本発明者は、上記モノクローナル抗体を用いて上
記プラスミノーゲンアクチベーターを極めて効率的にか
つ高収率で精製して高純度のプラスミノーゲンアクチベ
ーターを取得できること、及び該モノクローナル抗体を
用いて各種組織及びその培養液中の該プラスミノーゲン
アクチベーターを容易に検出し得ることも見出し、本発
明をなすに至った。

したがって、本発明は、ヒト胎児肺由来線維芽糊胞の培
養により産出される新しいタイプのブラスミノーゲンア
クチベーターに対して特異性のある新規なモノクローナ
ル抗体及びその調製方法を提供することを目的とするも
のである。

また、本発明は、上記抗体を用いて上記プラスミノーゲ
ンアクチベーターを効率的に精製して高純度のプラスミ
ノーゲンアクチベーターを取得し得る方法を提供するこ
とを目的とする。

更に、本発明は、上記抗体を用いて種々の組織及びその
培養液中の上記プラスミノーゲンアクチベーターを検出
する方法を提供することを目的とする。

以下本発明の詳細な説明する。

又■皇盪底 本発明の特徴は、■ヒト胎児肺由来の線維芽細胞が産生
ずるブラスミノーゲンアクチベーターに対して特異性を
有し、分子量が約１５０．０００であって、ＩｇＧ１及
びＩｇＧ２ｂサブクラスに属し、等電点が５．１０乃至
６．２５である特性を有する上記プラスミノーゲンアク
チベーターに対するモノクローナル抗体、；■マウスミ
エローマ細胞と、ヒト胎児肺由来の線維芽細胞が産生ず
るプラスミノーゲンアクチベーターで免疫されたマウス
からの膵臓細胞を融合させ、得られたハイブリドーマの
細胞を培養し、産生した上記プラスミノーゲンアクチベ
ータ−に対するモノクローナル抗体を採取することから
成る上記モノクローナル抗体の調製方法；■上記モノク
ローナル抗体を用いたカラムクロマトグラフィーに、ヒ
ト胎児肺由来線維芽細胞が産生ずるプラスミノーゲンア
クチベーターを含有する液を通液して吸着させ、ついで
溶出することから成る該プラスミノーゲンアクチベータ
ーの精製方法及び■上記モノクローナル抗体を用い、酵
素免疫測定法により各種組織及び各種培養液中のプラス
ミノーゲンアクチベーターを検出する方法にある。

。　占を　”するための 本発明に係るヒト胎児肺由来の線維芽細胞が産生ずる新
しいタイプのプラスミノーゲンアクチベーターに対して
特異性を示すモノクローナル抗体は、下記性質により特
定される。

（イ）分子量（ＳＯ５−ポリアクリル　　約１５０，０
００アミド電気泳動法） （ロ）免疫グロブリンクラス　　ＩｇＧ１及びＩｇＧ２
ｂに属する （ハ）等電点　　　　　　　　　　　５．１０〜６．２
５なお、このモノクローナル抗体の上記プラスミノーゲ
ンアクチベーターに対する特異性は、後述するように、
該抗体を不溶性担体と化学的に結合させたカラムにブラ
スミノーゲンアクチベーターを含有する液を通液する場
合、該ブラスミノーゲンアクチベーターのみを吸着する
ことにより確認し得る。

本発明に係るモノクローナル抗体は、下記方法により調
製し得る。

モノクローナル抗体の調製； ヒト胎児肺由来の線維芽細胞の培養により産生されるプ
ラス′ミノーゲンアクチベーターを含有する培養液（こ
の培養液中には同時的に産生されるウロキナーゼ型のプ
ラスミノーゲンアクチベーターが混在している）から分
離、精製して得られる高純度（比活性１０４．０００単
位／ｍｇタンパク）の新しいタイプのプラスミノーゲン
アクチベーターで免疫したマウスからの膵臓細胞を、マ
ウスミエローマ細胞と細胞融合させ、得られたハイブリ
ドーマの細胞を培養することにより、モノクローナル抗
体を産生じ得る。

因に、上記高純度のブラスミノーゲンアクチベーターを
上記培養液から分離精製する手法は、本発明により開発
されたものであって（別に特許出願されている）、その
概要は、上記培養液を、イオン交換クロマトグラフィー
で処理して得られる溶出画分（ウロキナーゼ型のプラス
ミノーゲンアクチベーターが混在している）を、ｐ−ア
ミノベンツアミジン又はε−アミノカプロイルベンツア
ミジンをリガンドとしたアフイニテイクロマトグラフイ
ーで処理して上記溶出画分中のウロキナーゼ型プラスミ
ノーゲンアクチベーターを選択的に溶出させて除去し、
ついで新しいタイプのプラスミノーゲンアクチベーター
を溶出させ、得られた溶出画分をゲル濾過することから
成る。

本発明におけるモノクローナル抗体を産生ずる上記ハイ
ブリドーマの作成は、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉ
ｎら（Ｎａｔｕｒｅ、　２５６．４９５〜４９７　（１
９７５））により確立された原理に基づいて、マウスリ
ンパ球Ｂ系とマウスミエローマ細胞を、例えばＲ，Ａ、
Ｇｏｌｄｓｂｅｒｇｅｔ　ａｔ、　（Ｎａｔｕｒｅ、　
２６７．７０７（１９７７））　、杉正人〔生物と化学
、別、１）６〜１２２　（１９８２））及び田中重明〔
タンパク質、核酸、酵素、胆、９６５〜９７６（１９８
１）〕等に記載の手法により行なうことができる。

ハイブリドーマの作成： すなわち、上記高純度のプラスミノーゲンアクチベータ
ーを抗原として、マウス１匹当り１００〜２００μｇを
、アジュバントとしてＦｒｅｕｎｄ’ｓ　ｃｏｍｐ−１
ｅｔｅ　ａｄｊｕｖａｎｔを用いて通常６〜８週令のＢ
ＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内投与または背中への皮下投与
する。

投与スケジュールは、初回免疫後から２週間後に追加免
疫を行ない、以後２週間毎に数回の追加免疫を行なう、
ついで最終免疫後から３日目に肺臓を摘出し、肺臓から
のＢ細胞（Ｂリンパ球）と上記マウスの骨髄の腫瘍から
のミエローマ細胞（例えば、Ｐ−３ＮＳＩ／１−Ａｇ４
−１、略号ＭＳ−１）とを、１８１〜１０：１の範囲の
割合でポリエチレングリコール１０００もしくは１５０
０の存在下で融合させ、ハイブリドーマ用培地にミエロ
ーマ細胞としてｌＸｌ０’　ｃｅｌｌ／ｇ＋ｊ！前後に
なるように懸濁し、９６ｗｅｌｌマイクロタイタープレ
ートに０．１＋＋ｊ！宛をま（、ついで細胞融合を行な
った翌日に融合細胞のみが生育し得るように調整したＨ
ＡＴ培地を０．１ｍｊ！／ｗｅｌｌ添加し、以後１〜３
日おきに培養上清の半分を新しいＨＡＴ培地に置き代え
ると、約１週間後にはＢ細胞とミエローマ細胞とのハイ
ブリドーマ以外の細胞はほとんど死滅してハイブリドー
マのコロニーが形成される。

次に、このようにして形成したハイブリドーマが目的と
するブラスミノーゲンアクチベーターに対する特異的抗
体を産生じているかどうかを調べるため、その培養上清
及び上記の高純度（比活性１０４．０００単位／ｌａｇ
タンパク）ブラスミノーゲンアクチベータ−（ＳＯ５電
気泳動的に均一なもの）を抗原として用いて酵素免疫測
定法（Ｅｎｚｙｍｅ　ｉｍｗｕｎｏ−Ｂｓｓａｙ）によ
りマイクロタイタープレートを用いて抗体産生能をチェ
ックする。ついで抗体生産が認められた培養上清のハイ
ブリドーマコロニーについて限界希釈法により１個のハ
イブリドーマ細胞が１個の培養ｗｅｌｌに存在するよう
にクローニングを行ない、１週間培養後再び酵素免疫測
定法により抗体産生をチェックする。

上記クローニングを５〜６回繰返して行ない、モノクロ
ーナル抗体遺伝子の脱落が起らない安定なハイブリドー
マを得る。このようにして得られた安定なハイブリドー
マは前記新しいタイプのプラスミノーゲンアクチベータ
ーに対して高度な特異性を示すモノクローナル抗体を産
生じ、さらに無限に継代培養されて該モノクローナル抗
体を産生し続ける。なお、このモノクローナル抗体は、
上記クローニングにより得られた安定なハイプリドーマ
を１０％牛脂児血清添加ＲＰＭＩ−１６４０培地中にて
大量培養することにより得られた培養液から回収するか
、または予め１〜２週前に免疫抑制剤プリスタン（２，
６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）０．５ｍ
ｊ！を腹腔内投与した成熟マウスＢＡＬＢ／ｃの腹腔内
に、上記ハイプリドーマをｌＸｌ０’　ｃｅｌｌ／匹注
射して増殖させて得られた腹水から回収することができ
る。

上述のようにして培養液または腹水からのモノクローナ
ル抗体の回収、精製は市販のプロティンＡ−アフイニテ
イゲル力ラムを用いた精製システム（バイオラッド社製
）により極めて容易に行なうことができる。

以上述べたようにして得られるモノクローナル抗体は、
ヒト胎児肺由来の線維芽細胞が産生ずる新しいタイプの
プラスミノーゲンアクチベータ−に対して高度の特異性
を示すことから、該モノクローナル抗体を不溶性担体と
化学的に結合したモノクローナル抗体固定化担体のカラ
ムを利用して上記プラスミノーゲンアクチベーターを精
製することができる。以下にその精製方法について説明
する。

モノクローナル抗体を用いたプラスミノーゲンアクチベ
ーターの精製方法： ヒト胎児肺由来の正常線維芽細胞の培養によりブラスミ
ノーゲンアクチベーターを産生した培養液もしくは遺伝
子工学的手法により造成したプラスミノーゲンアクチベ
ーター生産菌あるいは動物細胞の培養によりプラスミノ
ーゲンアクチベーターを産生した培養液を、上記モノク
ローナル抗体固定化担体のカラムに通液すると、目的と
するプラスミノーゲンアクチベーターのみが選択的に上
記カラムに吸着されるので該アクチベーターを極めて高
純度でかつ９０％以上の高収率で取得することができる
。

すなわち、目的とする新しいタイプのプラスミノーゲン
アクチベーターは、上記培養により同時的に産生される
ウロキナーゼ型のブラスミノーゲンアクチベーターに比
べて可成り高い疎水性タンパクであるため、上記カラム
に対する吸着能が非常に大きく（例えば、ｌ１ｍ１の不
溶性担体ゲルに対して３〜５＋ｓｇのモノクローナル抗
体を結合した担体に１５０，０００〜２５０，０００１
０が吸着する）、シたがって、比較的小さなカラムでも
大量のプラスミノーゲンアクチベーターを精製すること
が可能となる。また、この精製方法によると、一段階で
精製し得るので、従来の数段階で行なうカラム精製法に
比べて操作が非常に簡易化されるのみならず、目的とす
るプラスミノーゲンアクチベーターを上述のように極め
て高い回収率（９０％以上）で取得できるようになる。

因に、従来の数段階による精製法では回収率は３０〜５
０％にすぎない。

さらに、本発明による精製方法では、カラムに用いた不
溶性担体はそれに吸着させたプラスミノーゲンアクチベ
ーターを溶離させた後、中性域の緩衝液で洗浄するのみ
で繰返し使用できるので工業的にも非常に有利である。

なお、ここで用いる不溶性担体は、通常のアフイニテイ
クロマトグラフイーに用いられているものであれば適用
可能であって、特に限定されない。

次に、本発明による新しいタイプの精製プラスミノーゲ
ンアクチベーターの酵素化学的性質をウロキナーゼのそ
れとの比較において表１に示す。

表１にみられるとおり、本発明で対象とするプラスミノ
ーゲンアクチベーターは、従来のウロキナーゼとその酵
素化学的特性を異にしている。

また、参考として、Ｒｉｊｋｅｎ　＆　Ｃｏ１）ｅｎ　
（Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｗ、　２５６　、７０３５〜７０４１（１９８１
））が行なった種々の細胞由来のブラスミノーゲンアク
チベーターのアミノ酸組成の測定結果を表２に示す。

本発明では、上記プラスミノーゲンアクチベーターの精
製のほかに、上記モノクローナル抗体を用いて各種組織
及び各種培養液中のプラスミノーゲンアクチベーターを
検出することができる。以下その検出方法について説明
する。

モノクローナル抗体を用いたプラスミノーゲンアクチベ
ーターの検出方法： 本発明によるブラスミノーゲンアクチベーターの検出は
、上記モノクローナル抗体を用いて、酵素免疫測定法の
手法に従って行ない得るものであって、各種組織並びに
各種培養液中に微量に存在するプラスミノーゲンアクチ
ベーターを高い精度で測定できる。

したがって、本発明によるプラスミノーゲンアクチベー
ターの検出方法は、各種ヒト由来細胞の培養液中のプラ
スミノーゲンアクチベーターを免疫定量することによる
該プラスミノーゲンアクチベーター産生ヒト由来細胞の
スクリーニング、及び臨床などにおける血中のプラスミ
ノーゲンアクチベーターの免疫定量等に有効に利用する
ことができる。

以下に実施例を示して本発明及びその効果をさらに具体
的に説明する。

の　　　　　と一 実施例１ 本例は、モノクローナル抗体の調製方法を示したもので
ある。

高純度プラスミノーゲンアクチベーターの調製：ヒト胎
児肺細胞由来の、正常線維芽細胞ＩＭＲ−９０（ＡＴＣ
Ｃ，ＣＣＬ−１８６）を、無血清培地中で、ネオペプト
ン（又はプロテオースペプトン）１％添加して培養して
目的ブラスミノーゲンアクチベーターの産生を誘導した
培養濾液（１００〜１２０単位／ｎｕ）をＳＰカラム（
ＡＭＰ社製イオン交換樹脂カラム）に３〜６１／ｈｒの
流速で通液して該ブラスミノーゲンアクチベーターを完
全に吸着させ（この場合同時に産生したウロキナーゼ型
のブラスミノーゲンアクチベーターも共に吸着される）
、ついで該カラムを０，１５Ｍ　ＮａＣ１を含む１／１
００Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４゜５）で洗浄した後、１．Ｏ
Ｍ　Ｎａ１ｌを含む上記緩衝液で上記吸着プラスミノー
ゲンアクチベーターを溶出して濃縮と同時に部分精製を
行なった。ついで、得られた溶出液をｐ−アミノベンツ
アミジン−ＣＩ＋セファロース４Ｂアフイニテイ力ラム
に通液してプラスミノーゲンアクチベーターを吸着させ
た後、該カラムを１／ＩＯＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４，０）
と、０．１Ｍアルギニン及び０．０１％Ｔｗｅｅｎ　８
０を含む１／１００Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７゜４）を順
次的に通液して上記吸着物中のウロキナーゼ型のプラス
ミノーゲンアクチベーターのみを熔出させ、ついで０．
４Ｍアルギニン及び０．０１％Ｔｗｅｅｎ　８０を含む
１／１００Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）を通液して目
的のプラスミノーゲンアクチベーターを溶出した。つい
で得られた溶出液をセファクリルＳ−２００でゲル濾過
して、ＳＯＳ電気電気的動的一であって、ウロキナーゼ
の汚染のない高度に精製された目的のプラスミノーゲン
アクチベーター（比活性１０４．０００単位／ｍｇタン
パク）を得た。

バイブリドーマの作成： 上述のようにして得た高純度ブラスミノーゲンアクチベ
ーターを用いて免疫したマウスからの膵臓細胞とマウス
ミエローマ細胞を、本文に詳記した手法に従って細胞融
合させて、モノクローナル抗体産生能を有するハイブリ
ドーマを作成した。

このようにして作成したハイブリドーマ１３０株の中か
ら最も抗体産生量の高い１０株を選び、各株について６
回クローニングを繰返して行ない安定なハイブリドーマ
１０株を確立した。

モノクローナル抗体の採取： 次に上述のようにして得たハイブリドーマクローン１０
株を、それぞれブリスタン処理したマウスＢＡＬＢへの
腹腔内にｌＸ１０７／匹マウスの割合で、各ハイブリド
ーマ毎に約１０〜１５匹完接種し、腹腔が十分膨張する
まで飼育した後、腹水を採取した。

腹水中のモノクローナル抗体の精製は、モノクローナル
抗体精製システム（ＭＡＰＳ”、バイオラット社）を通
用して行なった。精製した結果は第１図に示すとおりで
ある。マウス１匹当りのモノクローナル抗体産生量は表
３に示すとおりである。

表３ 表３にみられるとおり、マウス１匹当りのモノクローナ
ル抗体産生量は３５．３〜？５．６ａ＋ｇで可成り高い
ことがわかる。

実施例２ 本例は、本発明に係るモノクローナル抗体の目的とする
プラスミノーゲンアクチベーターに対する特異性及び該
抗体についての免疫グロブリンクラス並びにサブクラス
を開べた結果を示したものである。

新しいタイプのプラスミノーゲンアクチベーターにたい
する特異性： 実施例１により作成したハイブリドーマの培養上清と、
抗原として高純度のブラスミノーゲンアクチベーター及
び精製ウロキナーゼを用い酵素免疫測定法（Ａｖｉｄｉ
ｎ−Ｂｉｏｔｉｎ　ＥＬＩＳＡを採用）により、モノク
ローナル抗体の上記各ブラスミノーゲンアクチベーター
に対する特異性を測定した。なお、上記ハイブリドーマ
は、実施例１で作成した１３０株について、各株が産生
のモノクローナル抗体について、上記各プラスミノーゲ
ンアクチベーターとの交叉反応性を調べることにより、
上記特異性を判定した。結果は表４に示すとおりである
。

免疫グロブリンのクラス並びにサブクラス：実施例１で
得られた精製モノクローナル抗体の１０種類について、
免疫グロブリンクラス及びサブクラス−特異性抗マウス
免疫グロブリン抗血清を使用して、酵素免疫測定法（Ｅ
ＬＩＳＡ）により決定した。結果は表５に示すとおりで
ある。

裏手にみられるとおり、本発明に係るモノクローナル抗
体は、新しいタイプのプラスミノーゲンアクチベーター
に交叉するが、ウロキナーゼには実質上交叉しないこと
から、上記プラスミノーゲンアクチベーターに特異的な
抗体であると解し得る。

また、表５にみられるとおり、このモノクローナル抗体
は、免疫グロブリンのクラスのＩｇＧ１とＩｇＧ２ｂサ
ブクラスに属することがわかる。

実施例３ 本例は実施例１で得られたモノクローナル抗体を利用し
て細胞培養液からプラスミノーゲンアクチベーターを精
製して分取する態様を示したものである。

ヒト胎児肺由来の正常２倍体線維芽細胞の培養液からの
プラスミノーゲンアクチベーターの精製：上記線維芽細
胞ＩＶＩＲ−９０（ＡＴＣＣＳＣＣＬ−１８６＞を培養
して得られた無血清培養液４．５１　　（抗ウロキナー
ゼポリクローナル抗体で中和後の活性、１２０１０／ｓ
＋１を、ハイブリドーマクローンＭＳ−１，０２、Ｃ−
１０が産生したモノクローナル抗体（実施例１参照）を
化学的に結合させたアフィゲル−１０のカラム（バイオ
ラッド社、抗体３．５ｓ＋ｇ／ｓ＋４！担体、φ０．９
ｃｍ　、５ｍｆ）に通液した。このカラムを、０．１％
↑■ｅｅｎ８０及び０．５Ｍ　ＮａＣ１を含む１／１０
０　ＭＰＢＳ（ｐＨ７，４）で、カラムからの流出液の
００２８０ｒｖの吸光度が０．００５以下になるまで十
分洗浄して未吸着画分を除去した後、カラムに吸着した
プラスミノーゲンアクチベーターを４Ｍ　ＭｇＣｌ２及
び０．１％Ｔｗｅｅｎ　８０を含む水溶液（ｐＨ７，４
）を用いて溶出した。原料としての上記無血清培養液と
、上述のようにして溶出させて得られた溶出画分の性状
を示すと表６のとおりである。

表６にみられるとおり、無血清培養液から比活性の著し
く高い精製プラスミノーゲンアクチベーターが９１％の
高収率で回収される。

実施例４ 本例は粗製のブラスミノーゲンアクチベーターを、実施
例１で得られたモノクローナル抗体を利用して精製する
態様を示したものである。

粗製プラスミノーゲンアクチベーターの調製：ヒト胎児
肺由来の正常２倍体線維芽細胞ＧＭ−１６０４を培養し
て得られた無血清培養液５．６Ａ　　（抗ウロキナーゼ
ポリクローナル抗体で中和後の活性、１００　Ｉ１）／
ｍＪ）をＨＣＩでｐＨ４，５に調整した後、ｓｐカラム
（ＡＭＦ社製イオン交換樹脂カラム）に通液してプラス
ミノーゲンアクチベーターを吸着させ、ついでこのカラ
ムを０．１５Ｍ　ＮａＣ１う含む０．０１Ｍ酢酸緩衝液
（ｐＨ４，５）で十分洗浄した後、ＬＭ　ＮａＣ１を含
む０．０１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，５）で溶出して粗製
プラスミノーゲンアクチベーター溶液（抗ウロキナーゼ
ポリクローナル抗体で中和後の活性、５３０．０００　
ＩＵ）を得た。

このようにして得た粗製ブラスミノーゲンアクチベータ
ー溶液を、ハイブリドーマクローンＮ５−１、Ｅ２、Ｈ
−１）が産生したモノクローナル抗体（実施例１参照）
を化学的に結合させた担体（抗体３．５ｔａｇ’ｓ　ｉ
ｔ担体）トレシールアチベイトセファロース（ファルマ
シア社製）のカラム（φ０．９ｃｍ　、　５ｍ１）に通
液した。

ついで、上記カラムを、ｏ、ｉ％Ｔｗｅｅｎ　８０及び
０．５Ｍ　ＮａＣｌを含む１／１００Ｍ　ＰＢＳ（ｐＨ
７，４）を用いてカラムからの流出液のＯ口２８０ｎｍ
の吸光度が０．００５以下になるまで十分洗浄して未吸
着画分を除去した後、カラムに吸着しているプラスミノ
ーゲンアクチベーターを、０．５Ｍ　ＮａＣ１及び０．
１％Ｔｗｅｅｎ　８０を含むＯ，１Ｍグリシン塩酸緩衝
液（ｐＨ２，５）で溶出した。原料としての上記粗製プ
ラスミノーゲンアクチベーター溶液と、上記溶出して得
られた精製プラスミノーゲンアクチベーター画分の正常
を示すと表７のとおりである。また、上記溶出画分の溶
出パターンを示すと第２図のとおりである。

表７にみられるとおり、粗製プラスミノーゲンアクチベ
ーターの溶液を、モノクローナル抗体を用いたカラムク
ロマトグラフィーで精製すると比活性が著しく向上した
精製プラスミノーゲンアクチベーターが高い回収率で取
得し得る。

実施例５ 本例は、実施例１で得られたモノクローナル抗体を利用
してヒト組織由来の各種正常２倍体線維芽細胞が産生ず
るブラスミノーゲンアクチベーターのスクリーニングに
、本発明に係る検出方法を応用した態様を示したもので
ある。

ヒト組織由来の正常２倍体線維芽細胞であるＩＭＲ−９
０、Ｗｌ−３８、ＭＲＣ−５、Ｆｌｏｗ　２０００　、
ＨＥＬ−２９９及びＧＭ　１６０４　（これらの細胞は
＾ＴＣＣ及び米国Ｎｌ１）で入手し得る）をそれぞれ培
養し、１％のプロテオースペブトンでプラスミノーゲン
アクチベーターの産生を誘導して得られた無血清培養液
中の各プラスミノーゲンアクチベーターについて、実施
例１で作成したハイブリドーマクローンＭＳ−１ｏ、　
、Ｃ−１０が産生したモノクローナル抗体（ＩＭＲ−９
が産生したプラスミノーゲンアクチベーターに対する抗
体）を用いて酵素免疫測定法（ＥＬＩＳ＾）により測定
した。結果は表８に示すとおりである。

表８ 表８にみられるとおり、入手し得る上記各ヒト組織由来
の正常線維芽細胞は、ＩＭＲ−９０が産生ずるブラスミ
ノーゲンアクチベーターと免疫化学的に同一である、す
なわち、ＩＭＲ−９０が産生のプラスミノーゲンアクチ
ベーターと共通の抗原決定基を有するプラスミノーゲン
アクチベーターを産生ずることが確認される。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１に示したプラスミノーゲンアクチベ
ーターに対するモノクローナル抗体の精製結果をしめし
、第２図は、実施例４に示した精製ブラスミノーゲンア
クチベーターのカラムクロマトグラフィーによる溶出パ
ターンを例示したものである。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒト胎児肺由来の線維芽細胞が産生するプラスミ
   ノーゲン活性化因子に対して特異性を有し、分子量が約
   １５０，０００であつて、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ｂサブ
   クラスに属し、等電点が５．１０乃至６．２５であるこ
   とを特徴とする上記プラスミノーゲン活性化因子に対す
   るモノクローナル抗体。
2. （２）マウスミエローマ細胞と、ヒト胎児肺由来の線維
   芽細胞が産生するプラスミノーゲン活性化因子で免疫さ
   れたマウスからの脾臓細胞を融合させ、得られたハイブ
   リドーマの細胞を培養し、産生した上記プラスミノーゲ
   ン活性化因子に対するモノクローナル抗体を採取するこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第（１）項記載のモノク
   ローナル抗体を調製する方法、
3. （３）特許請求の範囲第（１）項記載のモノクローナル
   抗体を用いたカラムクロマトグラフィーに、ヒト胎児肺
   由来の線維芽細胞が産生するプラスミノーゲン活性化因
   子を含有する液を通液して吸着させ、ついで溶出するこ
   とを特徴とする上記プラスミノーゲン活性化因子の精製
   方法。
4. （４）プラスミノーゲン活性化因子含有液が、ヒト胎児
   肺由来の線維芽細胞を培養して得られる無血清培養液で
   ある特許請求の範囲第（３）項記載の精製方法。
5. （５）特許請求の範囲第（１）項記載のモノクローナル
   抗体を用い、酵素免疫測定法（エンザイムイムノアツセ
   イ）により、各種組織及び各種培養液中のプラスミノー
   ゲン活性化因子を検出する方法。