JPS59157569A - 異なる区分又は下位区分の単一クロ−ン抗体を用いる二部位免疫検定法及びその試験キツト - Google Patents
異なる区分又は下位区分の単一クロ−ン抗体を用いる二部位免疫検定法及びその試験キツトInfo
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は免疫検定法の分野にある。更に詳しくは、本発
明は異なる決定基に対して単一クローン抗体を使用する
多決定基抗原（ｍｕｌｔｉｄｅｔｃｒｍｉｎａｎｔａｎ
ｔ ｉｇｅｎ）向けの二部位免疫検定法（ｔｗｏ−ｓｉ
ｔｅｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）の分野に関する。
明は異なる決定基に対して単一クローン抗体を使用する
多決定基抗原（ｍｕｌｔｉｄｅｔｃｒｍｉｎａｎｔａｎ
ｔ ｉｇｅｎ）向けの二部位免疫検定法（ｔｗｏ−ｓｉ
ｔｅｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）の分野に関する。
ｉ既且涛
二部位免疫検定法は周知である。これらは液体試料中の
多決定基抗原の存在又は濃度を検出する（ｉｍｍｏｂｉ
ｌｉｚｅｄ）抗体、および（Ｂ）抗原決定基の他の一つ
に対して方向づけられた抗体であって生ずる免疫複合体
の検出ができるように直接ｅ間接にラベルされたものの
双方に抗原を反応させる工程をもつ。以下不１ｊ＋化の
語は「連動抑制ないし不動化」の意義で用いる。［ハン
ドブック・オブ・ラジオイミューノアッセイＪ （Ｈ
ａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｒａｄｉｏ−ｉｍｍｕｒｏａｓ
ｓａｙ） （１９７７年） １３１−１５４頁、及び「
メン、ド・イン・エンザイモロジー」（Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ） （１９８０年）７０
巻３３４〜３５５頁は、（順方向二段階法）とも呼ばれ
る二部位免疫検定法の最も一般的な変法を記述している
。これらの参考文献に記述された順方向二段階変法では
、試料を不動化多クローン抗血清と一緒に培養する。不
動化複合体を培養混合物から分離し、ラベルされた多ク
ローン抗血清と−Ｈに培養する。合衆国特許第４．０９
８．８７６号は、（逆方向二部位法）と呼ばれる免疫検
定法のもう一つの変法を開示している。逆方向二部位法
では試料を初めにラベルされた抗血清と一緒に培養し、
続いて不動化抗血清との培養を行なう。３反応体の全部
を同時に培養する第二の変法もある。
多決定基抗原の存在又は濃度を検出する（ｉｍｍｏｂｉ
ｌｉｚｅｄ）抗体、および（Ｂ）抗原決定基の他の一つ
に対して方向づけられた抗体であって生ずる免疫複合体
の検出ができるように直接ｅ間接にラベルされたものの
双方に抗原を反応させる工程をもつ。以下不１ｊ＋化の
語は「連動抑制ないし不動化」の意義で用いる。［ハン
ドブック・オブ・ラジオイミューノアッセイＪ （Ｈ
ａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｒａｄｉｏ−ｉｍｍｕｒｏａｓ
ｓａｙ） （１９７７年） １３１−１５４頁、及び「
メン、ド・イン・エンザイモロジー」（Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ） （１９８０年）７０
巻３３４〜３５５頁は、（順方向二段階法）とも呼ばれ
る二部位免疫検定法の最も一般的な変法を記述している
。これらの参考文献に記述された順方向二段階変法では
、試料を不動化多クローン抗血清と一緒に培養する。不
動化複合体を培養混合物から分離し、ラベルされた多ク
ローン抗血清と−Ｈに培養する。合衆国特許第４．０９
８．８７６号は、（逆方向二部位法）と呼ばれる免疫検
定法のもう一つの変法を開示している。逆方向二部位法
では試料を初めにラベルされた抗血清と一緒に培養し、
続いて不動化抗血清との培養を行なう。３反応体の全部
を同時に培養する第二の変法もある。
二部位免疫検定法の三つの変法全部に巾−クローン抗体
を使用することが、Ｃｌ１ｎ、 Ｃｈｅｗ、（１９８１
年）２７巻（１１号） １９７７〜１８０６頁、ベルギ
ー特許第８８９，８５５号、及びフランス特許出願第８
１１５０３０号（公告番号第２４８７９８３号）に開示
されている。
を使用することが、Ｃｌ１ｎ、 Ｃｈｅｗ、（１９８１
年）２７巻（１１号） １９７７〜１８０６頁、ベルギ
ー特許第８８９，８５５号、及びフランス特許出願第８
１１５０３０号（公告番号第２４８７９８３号）に開示
されている。
ＩｇＧ１および１ｇＧ２がプロティンＡ（ブドウ球菌の
細胞膜成分）に異なる親和力で結びつき、選ばれたｐＨ
でＩｇＧ１をプロティンＡから遠択的に溶離できること
が知られている（Ｉｍｍｕｎｏ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
（１９７８年）１５巻４２８〜４３６頁）。ミクロゾー
ムＰＧ）１合成酵素を沈降させるためにプロティンＡ膜
」二に不動化巾−クローンＩｇＧ２を使用することは、
Ｊ、 Ｂｉｏｌ。
細胞膜成分）に異なる親和力で結びつき、選ばれたｐＨ
でＩｇＧ１をプロティンＡから遠択的に溶離できること
が知られている（Ｉｍｍｕｎｏ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
（１９７８年）１５巻４２８〜４３６頁）。ミクロゾー
ムＰＧ）１合成酵素を沈降させるためにプロティンＡ膜
」二に不動化巾−クローンＩｇＧ２を使用することは、
Ｊ、 Ｂｉｏｌ。
Ｃｈｅｗ、（１１１８１年）２５６巻１０３７５〜１０
３８２頁に報告されている。
３８２頁に報告されている。
本発明の主な目的は、単一クローン抗体を使用する改良
された二部位免疫検定法を提供するにあり、この検定法
では直接・間接にラベルされた抗体の不動化化材料への
非特異的な結合の可能性と、間接検定法の場合には不動
化抗体へのラベル部分の非特異的結合の可能性が減少す
る。この改良された検定法は、このような非特異的な結
合が検出限度を許容できないものとしたり、許容できな
い水準の偽陽性判定をケーえるような非常な低水準の抗
原を検出すだめの検定に特に有用である。
された二部位免疫検定法を提供するにあり、この検定法
では直接・間接にラベルされた抗体の不動化化材料への
非特異的な結合の可能性と、間接検定法の場合には不動
化抗体へのラベル部分の非特異的結合の可能性が減少す
る。この改良された検定法は、このような非特異的な結
合が検出限度を許容できないものとしたり、許容できな
い水準の偽陽性判定をケーえるような非常な低水準の抗
原を検出すだめの検定に特に有用である。
幻Ｉｌ船に籠１
本発明の一つの態様は、（１）抗原決定基の一つに対す
る不動化単一クローン抗体、及び（２）抗原のもう−・
つの異なる決定基に対する直接間接にラベルされた単一
クローン抗体、以上の二つに抗原を反応させて、多決定
基抗原を検出するための二部位免疫検定法であり、不動
化抗体及びラベルＸれた抗体に異なる区分（ｃ １ａｓ
ｓ）又は下位区分（ｓｕｂＣ１δｓｓ）の単一クローン
抗体が使用されることを特徴としている。
る不動化単一クローン抗体、及び（２）抗原のもう−・
つの異なる決定基に対する直接間接にラベルされた単一
クローン抗体、以上の二つに抗原を反応させて、多決定
基抗原を検出するための二部位免疫検定法であり、不動
化抗体及びラベルＸれた抗体に異なる区分（ｃ １ａｓ
ｓ）又は下位区分（ｓｕｂＣ１δｓｓ）の単一クローン
抗体が使用されることを特徴としている。
本発明のもう一つの態様は、」二記検定の直接方法を実
施するための以下の（ａ）と（ｂ）からなる試験キット
である： （ａ）抗原決定基の一つに対して方向づけられる不動化
単一クローン抗体。
施するための以下の（ａ）と（ｂ）からなる試験キット
である： （ａ）抗原決定基の一つに対して方向づけられる不動化
単一クローン抗体。
（ｂ）抗原のもう−・つの異なる決定基に対して方向づ
けられ、ラベルＳれている第二の単一 クローン抗体で
あって、この第二の？１１−クローン抗体が不動化され
たり１−クローン抗体とは異なる免疫グロブリン区分又
は下位区分のものであるこ とを特徴とする抗体。間接
法向けの試験キットは、ラベルしていない第二の抗体と
、第ニーの単一クローン抗体に対して特異的に方向づけ
られる第三のラベルされた抗体を含有する。
けられ、ラベルＳれている第二の単一 クローン抗体で
あって、この第二の？１１−クローン抗体が不動化され
たり１−クローン抗体とは異なる免疫グロブリン区分又
は下位区分のものであるこ とを特徴とする抗体。間接
法向けの試験キットは、ラベルしていない第二の抗体と
、第ニーの単一クローン抗体に対して特異的に方向づけ
られる第三のラベルされた抗体を含有する。
々１脇
本発明によって検定できる試料は、存在又は濃度を決定
しようとする対象の多決定基抗原を含有するか、含有し
ていると考えられる任意の液体又は生物学的試料である
。血清、脳を髄液、羊膜液、尿、組織楠出液のようなヒ
ト又は動物の体液が？τ通には含まれる。新しくつくら
れた試料に対して検定を行なうことが実際−１−できな
いか不都合な場合には、はとんどの体液を凍結貯蔵でき
る。
しようとする対象の多決定基抗原を含有するか、含有し
ていると考えられる任意の液体又は生物学的試料である
。血清、脳を髄液、羊膜液、尿、組織楠出液のようなヒ
ト又は動物の体液が？τ通には含まれる。新しくつくら
れた試料に対して検定を行なうことが実際−１−できな
いか不都合な場合には、はとんどの体液を凍結貯蔵でき
る。
抗にｆが不安定で凝集しやすいか、貯蔵容器に吸収され
る傾向をもつ場合には、予備的な抽出又は他の４〜別な
ｆ・防措ＦＱが試料に必要となる。
る傾向をもつ場合には、予備的な抽出又は他の４〜別な
ｆ・防措ＦＱが試料に必要となる。
本発明の手法によって検定できる抗原は、多決定基抗原
である。このような抗原は、免疫ト別個の（同じでない
）二つ以上の抗原決定基（エピトープ）をもち、それら
の部位は相補的な抗体がそれらを認識、結合できるよう
な部位である。本明細書で使われる用語の「抗１り」は
、免疫原物質（免疫反応を示す物質）と、抗体によって
認識、結合５れるが免疫反応を示さない物質（／’％ブ
テン類）の双方を包含する。体液中に存在する抗原は、
細胞、酵素、蛋白質、ペプチド、細胞表面の抗原その他
の細１包成分、分化抗原 （ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ａｎｔｉｇｅｎ）
、 リンフ才力イン。
である。このような抗原は、免疫ト別個の（同じでない
）二つ以上の抗原決定基（エピトープ）をもち、それら
の部位は相補的な抗体がそれらを認識、結合できるよう
な部位である。本明細書で使われる用語の「抗１り」は
、免疫原物質（免疫反応を示す物質）と、抗体によって
認識、結合５れるが免疫反応を示さない物質（／’％ブ
テン類）の双方を包含する。体液中に存在する抗原は、
細胞、酵素、蛋白質、ペプチド、細胞表面の抗原その他
の細１包成分、分化抗原 （ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ａｎｔｉｇｅｎ）
、 リンフ才力イン。
成長因ｆ、ホルモン、薬剤、毒素、ウィルス、細菌、そ
の他病歴体を包含する。ε帽會で爬モ瑯イ會鋸露樵皐挑
募」（れれこれまでに一部位検定状が使われた多決定基
抗原の特異的な例としては、１汀炎関連の抗原、甲状腺
刺激ホルモン、がん胎児抗に！′、副甲状］Ｉ♀ホルモ
ン、神経成長因子、ヒｌ−ｔ＆長ホルモン、破傷風毒素
、アルブミン、オへｌレブミン、 Ｘ 而Ｆａ、−ｙ
ｘ ＋）チン、ＧＦＡ蛋白Ｙ１． Ｓ−１０ｎ蛋白質、
アルファーフェト蛋白質、抗胸腺リンパ球グ１ ０プリン、血液凝固因子■、ヘモグロビンＦのγ釦、濾
胞成熟ホルモン、及び絨毛膜生殖腺刺激ホルモンがある
。当該の予決定ノ＾抗原のはっきりと識別できる決定ノ
１（に対して方向づけられる異なる区分又は下位メー分
の単一クローン抗体は、コーラ−・シー（Ｋｏｈｌｅｒ
、Ｇ、）及びミ）Ｉｉ７．タイン−シー（Ｍｉｌｓｔｅ
ｉｎ、Ｃ，）、 Ｎａｔｕｒｅ （ロンドア） （１９
７５年）２５６巻４９５〜４８７真に初めて報告された
体細胞雑種形成技術によってつくることができる。この
技術は、雑種細胞形成パートナ−の一方として、抗原で
免疫化された宿主動物、好ましくはハツカネズミからの
抗体産生細胞、例えば牌臓又はリンパ様細胞を、また他
方の雑種細胞形成パートナ−として適当な選択可能なが
ん（骨髄腫）細胞系統を使用する。分子星１，０００な
いしｅ、ｏｏｏダルトンのポリエチレングリコールのよ
うな細胞融合剤を用いて抗体産生細胞を腫瘍細胞と雑種
形成（細胞融合）させる。ＨＡＴ培地リトルフィールド
（Ｌｉｔｔｌｅｆｉｅｌｒｌ ） ５ｃｉｅｎｃｅ（１
９８９年） １４５ 巻７０９〜７１０頁ような選択的
培地に対して感受性があ２ す、効率的に融合し、その雑種細胞形成パートナ−によ
る安定高水準の表現と抗体分泌を維持するので、骨髄腫
細胞類が使用される。任意の種からの骨髄腫細胞を使用
できるが、これらの特徴をもつネズミ骨髄腫系統が広く
入手可能でありｌｌｆましい。このような系統の例には
ンーク研究所細胞流通センター（Ｓａｌｋ Ｔｎｓｔｉ
ｔｕｔｅ Ｃｅ１１口１ｓｔｒｉｈｎｔｉｏｎＧｅ＋ｎ
ｔｅｒ米国９２１１２カリフォルニア州サンディエゴ、
ＰＯＢｏｚ １８０９）から入手できる元のＭＯＰＣ−
２１及びＮＰＣ−１１ハツカネズミ１撞瘍から誘導され
たものがある。約１：ＩＯないし約１０：ｌの範囲の骨
髄腫ＭＩ胞／抗体産生細胞比が通常使われる。個々の細
胞濃度は、融合培地１当たり細胞数的ＩＯないしＩＯｇ
、好ましくは１×１０ ないし５×１０ の範囲が典型
的である。約３０％ないし６０％（ｗハ）、好ましくは
３５％ないし５０％（Ｗ／Ｖ ）の細胞融合剤を含有す
るモ衡［２溶液が、融合培地として使用できる。細胞融
合後、細胞融合剤を除くために細胞融合剤を含まない培
地で細胞を洗う。次にこれらをｊ穴択培地に植え伺けて
培養すると、雑種形成していない親細胞はＩＪｌ除され
、選択培地に耐性があって、しかも骨１ｉ（＋腫の親細
胞の無限増殖性をもった雑種のみが残る。ｊ８養は通常
約３〜５週間を要する。
の他病歴体を包含する。ε帽會で爬モ瑯イ會鋸露樵皐挑
募」（れれこれまでに一部位検定状が使われた多決定基
抗原の特異的な例としては、１汀炎関連の抗原、甲状腺
刺激ホルモン、がん胎児抗に！′、副甲状］Ｉ♀ホルモ
ン、神経成長因子、ヒｌ−ｔ＆長ホルモン、破傷風毒素
、アルブミン、オへｌレブミン、 Ｘ 而Ｆａ、−ｙ
ｘ ＋）チン、ＧＦＡ蛋白Ｙ１． Ｓ−１０ｎ蛋白質、
アルファーフェト蛋白質、抗胸腺リンパ球グ１ ０プリン、血液凝固因子■、ヘモグロビンＦのγ釦、濾
胞成熟ホルモン、及び絨毛膜生殖腺刺激ホルモンがある
。当該の予決定ノ＾抗原のはっきりと識別できる決定ノ
１（に対して方向づけられる異なる区分又は下位メー分
の単一クローン抗体は、コーラ−・シー（Ｋｏｈｌｅｒ
、Ｇ、）及びミ）Ｉｉ７．タイン−シー（Ｍｉｌｓｔｅ
ｉｎ、Ｃ，）、 Ｎａｔｕｒｅ （ロンドア） （１９
７５年）２５６巻４９５〜４８７真に初めて報告された
体細胞雑種形成技術によってつくることができる。この
技術は、雑種細胞形成パートナ−の一方として、抗原で
免疫化された宿主動物、好ましくはハツカネズミからの
抗体産生細胞、例えば牌臓又はリンパ様細胞を、また他
方の雑種細胞形成パートナ−として適当な選択可能なが
ん（骨髄腫）細胞系統を使用する。分子星１，０００な
いしｅ、ｏｏｏダルトンのポリエチレングリコールのよ
うな細胞融合剤を用いて抗体産生細胞を腫瘍細胞と雑種
形成（細胞融合）させる。ＨＡＴ培地リトルフィールド
（Ｌｉｔｔｌｅｆｉｅｌｒｌ ） ５ｃｉｅｎｃｅ（１
９８９年） １４５ 巻７０９〜７１０頁ような選択的
培地に対して感受性があ２ す、効率的に融合し、その雑種細胞形成パートナ−によ
る安定高水準の表現と抗体分泌を維持するので、骨髄腫
細胞類が使用される。任意の種からの骨髄腫細胞を使用
できるが、これらの特徴をもつネズミ骨髄腫系統が広く
入手可能でありｌｌｆましい。このような系統の例には
ンーク研究所細胞流通センター（Ｓａｌｋ Ｔｎｓｔｉ
ｔｕｔｅ Ｃｅ１１口１ｓｔｒｉｈｎｔｉｏｎＧｅ＋ｎ
ｔｅｒ米国９２１１２カリフォルニア州サンディエゴ、
ＰＯＢｏｚ １８０９）から入手できる元のＭＯＰＣ−
２１及びＮＰＣ−１１ハツカネズミ１撞瘍から誘導され
たものがある。約１：ＩＯないし約１０：ｌの範囲の骨
髄腫ＭＩ胞／抗体産生細胞比が通常使われる。個々の細
胞濃度は、融合培地１当たり細胞数的ＩＯないしＩＯｇ
、好ましくは１×１０ ないし５×１０ の範囲が典型
的である。約３０％ないし６０％（ｗハ）、好ましくは
３５％ないし５０％（Ｗ／Ｖ ）の細胞融合剤を含有す
るモ衡［２溶液が、融合培地として使用できる。細胞融
合後、細胞融合剤を除くために細胞融合剤を含まない培
地で細胞を洗う。次にこれらをｊ穴択培地に植え伺けて
培養すると、雑種形成していない親細胞はＩＪｌ除され
、選択培地に耐性があって、しかも骨１ｉ（＋腫の親細
胞の無限増殖性をもった雑種のみが残る。ｊ８養は通常
約３〜５週間を要する。
残ったハイブリドーマを免疫検定により、抗原に対する
抗体産生について検査できる。抗原の識別可能な決定基
に結合する抗体をつくる陽性クローンは、抗原を初めに
クローンの一つから得たラベルしていない抗体と、次に
もう一つのクローンからのラベルされた抗体と一緒に培
養し、ラベルＳれた抗体の結合がラベルしていない抗体
の結合によってブロックされたかどうかを観察すること
で選４７（できる。抗体は、既知の血清学的、又はイし
学的手法によって区分および下位区分に特性化できる。
抗体産生について検査できる。抗原の識別可能な決定基
に結合する抗体をつくる陽性クローンは、抗原を初めに
クローンの一つから得たラベルしていない抗体と、次に
もう一つのクローンからのラベルされた抗体と一緒に培
養し、ラベルＳれた抗体の結合がラベルしていない抗体
の結合によってブロックされたかどうかを観察すること
で選４７（できる。抗体は、既知の血清学的、又はイし
学的手法によって区分および下位区分に特性化できる。
この点で５区分の免疫グロブリン、すなわち ｒｇＧ、
Ｉｇ＾、ＩｇＭ、 ＩｇＤ及びＩｇＥがあり、その太
における血清学的及び生理化学的な差に〕＾づいて、Ｔ
ｇＧｌ、 １ｇＧ２．１ｇＧ３． ｒｇＧ４の４下位区
分に分けられる。ＩｇＭとＩｇＡ区分は、それぞれ同様
に２つの下位区分に分けられる。第二の（ラベルされた
）中−クローン抗体の１価（Ｆａｂ、 Ｆａｂ’ ）又
は２価（Ｆ（ａｂ’）ｚ ）の断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ
）を使用できる。このような断片は、ｍ−クローン抗体
を適当な酵素で消化し、消化物から望んでいる断片を単
離することによってつくられる。従って、ここに使用し
たように、第二の（ラベルされた）単一クローン抗体に
適用された用語と同様抗体という用語は、丸ごとの免疫
グロブリンはもちろん抗原に結合するその断片をも包含
する。
Ｉｇ＾、ＩｇＭ、 ＩｇＤ及びＩｇＥがあり、その太
における血清学的及び生理化学的な差に〕＾づいて、Ｔ
ｇＧｌ、 １ｇＧ２．１ｇＧ３． ｒｇＧ４の４下位区
分に分けられる。ＩｇＭとＩｇＡ区分は、それぞれ同様
に２つの下位区分に分けられる。第二の（ラベルされた
）中−クローン抗体の１価（Ｆａｂ、 Ｆａｂ’ ）又
は２価（Ｆ（ａｂ’）ｚ ）の断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ
）を使用できる。このような断片は、ｍ−クローン抗体
を適当な酵素で消化し、消化物から望んでいる断片を単
離することによってつくられる。従って、ここに使用し
たように、第二の（ラベルされた）単一クローン抗体に
適用された用語と同様抗体という用語は、丸ごとの免疫
グロブリンはもちろん抗原に結合するその断片をも包含
する。
望んでいる特異性、親和力、区分の抗体をつくるハイブ
リドーマのクローンは、限界焉釈技術（ｌｉｍｉｔｉｎ
ｇ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）によっ
てサブクローン化され、既知の手法によって生体外又は
生産 体内で成育させる。サブクローンから分泌される庄 単−クローン抗体は、生体内で成育した時に、硫酸アン
モニウム沈殿、ＩＩＥＡＥセルロース・クロマ５ トグラフィ、又は親和クロマＩ・グラフィのような既知
技術によって、培地又は腹水又は血清から分顯できる。
リドーマのクローンは、限界焉釈技術（ｌｉｍｉｔｉｎ
ｇ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）によっ
てサブクローン化され、既知の手法によって生体外又は
生産 体内で成育させる。サブクローンから分泌される庄 単−クローン抗体は、生体内で成育した時に、硫酸アン
モニウム沈殿、ＩＩＥＡＥセルロース・クロマ５ トグラフィ、又は親和クロマＩ・グラフィのような既知
技術によって、培地又は腹水又は血清から分顯できる。
所望により、それ以−にの抗体精製も超は、木質的に水
に不溶の表面、基材（ｌａｔｒｉｘ）又は物体に単一ク
ローン抗体を化学的又は物理的に結合させることによっ
てつくられる。免疫検定技術では、抗体不動化材料は時
に「Ｊｒ！体Ｊ （ｃａｒｒｉｅｒ）又は「支持体Ｊ
（Ｓｕｐｐｏｒｔｓ）と呼ばれることもある。このよう
な媒体の例は、プロティンＡ膜、セルロース及びアガロ
ースのような天然材料、及びセファデックス、架橋され
た多糖類、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリスチ
レン等のような合成材料である。この媒体は表面、粒子
、多孔性基材等の種々の形にある。このような不動化化
媒体へ抗体を共有結合的に又は物理的に結合（固定）さ
せる方法はよく知られている。
に不溶の表面、基材（ｌａｔｒｉｘ）又は物体に単一ク
ローン抗体を化学的又は物理的に結合させることによっ
てつくられる。免疫検定技術では、抗体不動化材料は時
に「Ｊｒ！体Ｊ （ｃａｒｒｉｅｒ）又は「支持体Ｊ
（Ｓｕｐｐｏｒｔｓ）と呼ばれることもある。このよう
な媒体の例は、プロティンＡ膜、セルロース及びアガロ
ースのような天然材料、及びセファデックス、架橋され
た多糖類、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリスチ
レン等のような合成材料である。この媒体は表面、粒子
、多孔性基材等の種々の形にある。このような不動化化
媒体へ抗体を共有結合的に又は物理的に結合（固定）さ
せる方法はよく知られている。
場合によっては、不動化しようとする抗体に対する連結
抗体（弔−クローン性又は多クローン６ 性）を経由して単一クローン抗体を不動化するのがψま
しい。これらの場合、単一クローン抗体を材料と一緒に
培養する前に、単一クローン抗体に対する抗体を不動化
材料に結合させておく。
抗体（弔−クローン性又は多クローン６ 性）を経由して単一クローン抗体を不動化するのがψま
しい。これらの場合、単一クローン抗体を材料と一緒に
培養する前に、単一クローン抗体に対する抗体を不動化
材料に結合させておく。
予めつくっておいた不動化済みの単一クローン抗体を検
定に使用してもよいし、検定の一段階としてその場で不
動化を行なってもよい。
定に使用してもよいし、検定の一段階としてその場で不
動化を行なってもよい。
本発明に使われる直接ラベルされた巾−クローン抗体は
、既知の方法により、望んでいる信号形式と強度を提供
するようなラベルで印をイ・１けることができる。ラベ
ルの性格は限定的ではない。使用できるラベルの例は＋
２１；５ Ｎ、、 ＋４０のような同位元素ラベル、フ
ルオレセインイソチオシアネートとロダニンのような蛍
光ラベル、ルシフェリンのような化学ルミネセンスラベ
ル、ビオチン／アビジン及びワザビダイコンパーオキシ
ダーゼのような酵素ラベル、スピンラベル及びバクテリ
オファージラベルである。間接検定法では、第二の単一
クローン抗体に対するラベルされた抗血清が使われる。
、既知の方法により、望んでいる信号形式と強度を提供
するようなラベルで印をイ・１けることができる。ラベ
ルの性格は限定的ではない。使用できるラベルの例は＋
２１；５ Ｎ、、 ＋４０のような同位元素ラベル、フ
ルオレセインイソチオシアネートとロダニンのような蛍
光ラベル、ルシフェリンのような化学ルミネセンスラベ
ル、ビオチン／アビジン及びワザビダイコンパーオキシ
ダーゼのような酵素ラベル、スピンラベル及びバクテリ
オファージラベルである。間接検定法では、第二の単一
クローン抗体に対するラベルされた抗血清が使われる。
間接検定法用の抗血清をラベルするには、同様な広範囲
の標識技術が使用できる。本発明は間接検定法に特に有
利であり、非特異的結合による背景信号水準を４−ｔ
ＮｔＪ的に増大させずに実質的な信号増幅が可能となる
。この点で、異なる区分又は下位区分の第二単一クロー
ン抗体を使用すると、第二の中−クローン抗体に結合す
るが第一単一クローン抗体を認識しない一つ以上の配位
子（ｌｉｇａｎｄ）を結合させる部位として、第二の単
一クローン抗体を利用できる。増幅は、複数のラベルさ
れた配位子を第二の抗体に結合させるか、又は触媒的に
働く配位子を用いて行なわれる。このような増幅から、
微１−の抗原が検出可能となる。これは、最初の不動化
された三元複合体が多量のラベル又は触媒的に作用する
配位子を結合させる部位として用いられるためである。
の標識技術が使用できる。本発明は間接検定法に特に有
利であり、非特異的結合による背景信号水準を４−ｔ
ＮｔＪ的に増大させずに実質的な信号増幅が可能となる
。この点で、異なる区分又は下位区分の第二単一クロー
ン抗体を使用すると、第二の中−クローン抗体に結合す
るが第一単一クローン抗体を認識しない一つ以上の配位
子（ｌｉｇａｎｄ）を結合させる部位として、第二の単
一クローン抗体を利用できる。増幅は、複数のラベルさ
れた配位子を第二の抗体に結合させるか、又は触媒的に
働く配位子を用いて行なわれる。このような増幅から、
微１−の抗原が検出可能となる。これは、最初の不動化
された三元複合体が多量のラベル又は触媒的に作用する
配位子を結合させる部位として用いられるためである。
この点で、最終のラベルされた配位子を多層複合体へ結
合させる前に、ラベルされていない一つ以−１−の配位
子を初期の三元複合体へ結合させることは、本発明の範
囲内にある。このような中間層の配位子を利用すると、
いっそう大きな信号増幅及び／又は特異化がｒｆｆ能と
なる。
合させる前に、ラベルされていない一つ以−１−の配位
子を初期の三元複合体へ結合させることは、本発明の範
囲内にある。このような中間層の配位子を利用すると、
いっそう大きな信号増幅及び／又は特異化がｒｆｆ能と
なる。
先行技術の二部位検定法で使用される培養条件（時間、
温度、ｐｈ、試薬濃度等）を本発明の検定法に使用して
よい。同様に、試薬添加ｊ賄序１分陣（洗詐）手１１σ
（及びその他の方法論は、概して先行技術の手＋＋＋ｎ
に従う。しかし異なる区分又は下位区分の巾−・クロー
ン抗体を使用すると、−Ｊｌ特異的に結合されたラベル
付き抗体の複合体からの除去が改善される。この改善は
、不動化媒体を使用することによって達成され、この媒
体からラベルされたｒｎ−クローン抗体の区分又は下位
区分の抗体が、元の不動化中−クローン抗体の区分又は
ド位区分の抗体を実質的に除去することなく、選択的に
除去できる。
温度、ｐｈ、試薬濃度等）を本発明の検定法に使用して
よい。同様に、試薬添加ｊ賄序１分陣（洗詐）手１１σ
（及びその他の方法論は、概して先行技術の手＋＋＋ｎ
に従う。しかし異なる区分又は下位区分の巾−・クロー
ン抗体を使用すると、−Ｊｌ特異的に結合されたラベル
付き抗体の複合体からの除去が改善される。この改善は
、不動化媒体を使用することによって達成され、この媒
体からラベルされたｒｎ−クローン抗体の区分又は下位
区分の抗体が、元の不動化中−クローン抗体の区分又は
ド位区分の抗体を実質的に除去することなく、選択的に
除去できる。
木検定の培養は、順方向二段階技術では、抗原と不動化
ｆｉｔ−クローン抗体との間の結合、及び生ずる不動化
免疫複合体とラベルされた単一クローン抗体との間の結
合、また逆方向二段階法ではその逆の順序での結合を容
易にするような条件下に行なわれる。温度、ｐｈ及び期
間は、培養での最も９ 重要なプロセス条件である。低目の温度、例えば０°Ｃ
ないし２５℃が、第一の弔−クローン抗体を不動化媒体
へ結合させるのに典型的に使用される。
ｆｉｔ−クローン抗体との間の結合、及び生ずる不動化
免疫複合体とラベルされた単一クローン抗体との間の結
合、また逆方向二段階法ではその逆の順序での結合を容
易にするような条件下に行なわれる。温度、ｐｈ及び期
間は、培養での最も９ 重要なプロセス条件である。低目の温度、例えば０°Ｃ
ないし２５℃が、第一の弔−クローン抗体を不動化媒体
へ結合させるのに典型的に使用される。
抗原とラベルされた抗体との培養は、０℃ないし４０°
Ｃの範囲の温度で行なわれる。便宜上、室温が用いられ
る。ｐｈは通常６ないし９、好ましくは約７とし、結合
反応は関与する特定の抗体と抗原によるが、約１０分な
いし２目で平衡に達するのが普通である。抗体は通常、
過剰融で使用されよう。
Ｃの範囲の温度で行なわれる。便宜上、室温が用いられ
る。ｐｈは通常６ないし９、好ましくは約７とし、結合
反応は関与する特定の抗体と抗原によるが、約１０分な
いし２目で平衡に達するのが普通である。抗体は通常、
過剰融で使用されよう。
ｊ明方向二段階法では、不溶解化された単一クローン抗
体を抗原及びラベルされた試薬と同時に培養できる。ラ
ベルされた試薬及び抗原との培養後。
体を抗原及びラベルされた試薬と同時に培養できる。ラ
ベルされた試薬及び抗原との培養後。
生ずる不溶性培養生成物を液体から分離し、非特穎的に
結合されたラベル伺き単一・クローン抗体を選択的に除
去するような条件下に処理（例えば、洗浄）する。例と
して、プロティンＡ膜又は合成７１１体に結合されたプ
ロティンＡを不動化媒体として使う時は、非特異的に結
合された第二の抗体は次のような適当なｐＨでの洗詐に
よってプロティンＡから選択的に除去できる。
結合されたラベル伺き単一・クローン抗体を選択的に除
去するような条件下に処理（例えば、洗浄）する。例と
して、プロティンＡ膜又は合成７１１体に結合されたプ
ロティンＡを不動化媒体として使う時は、非特異的に結
合された第二の抗体は次のような適当なｐＨでの洗詐に
よってプロティンＡから選択的に除去できる。
０
ＩｇＧ２ａ ＩｇＧ１
１３ＴｇＧ２ａ ＩｇＭ
６−７Ｉ６−７Ｉ
ＩｇＧ１ ４十ＩｇＧ２ｂ
ＩｇＭ ４＋
この岐終分陰に続いて、検定が間接検定かどうか、また
ラベルの性格によっては、なおも処理段階が必要になる
ことがある。間接検定では、培養生成物をラベルされた
抗血清と反応させる追加段階が必要である。酵素ラベル
のように、ある種のラベルでは、生成物を検出可能にす
るために、生成物を適当な基質又は配位子と反応させな
ければならない。
１３ＴｇＧ２ａ ＩｇＭ
６−７Ｉ６−７Ｉ
ＩｇＧ１ ４十ＩｇＧ２ｂ
ＩｇＭ ４＋
この岐終分陰に続いて、検定が間接検定かどうか、また
ラベルの性格によっては、なおも処理段階が必要になる
ことがある。間接検定では、培養生成物をラベルされた
抗血清と反応させる追加段階が必要である。酵素ラベル
のように、ある種のラベルでは、生成物を検出可能にす
るために、生成物を適当な基質又は配位子と反応させな
ければならない。
検定の最終段階は、ラベルされた複合体の検出である。
使用される特定の検出手法は、ラベルの性格、例えば同
位元素ラベルでは放射能計数、蛍光ラベルでは蛍光強度
、酵素ラベルでは分光光度検出による。検定結果は典型
的には標準曲線又は対照群との比較によって評価される
。
位元素ラベルでは放射能計数、蛍光ラベルでは蛍光強度
、酵素ラベルでは分光光度検出による。検定結果は典型
的には標準曲線又は対照群との比較によって評価される
。
以下の実施例は、本発明の二部位免疫検定法を例示した
ものである。本実施例はいかなる形においても未発１．
！ＩＩを限定する意図のものではない。実施例はグアニ
レ−トサイクラーゼに対する二部位放射免疫定１７１法
について述べている。これに使用される方法及び材料は
以下のとおりであった。
ものである。本実施例はいかなる形においても未発１．
！ＩＩを限定する意図のものではない。実施例はグアニ
レ−トサイクラーゼに対する二部位放射免疫定１７１法
について述べている。これに使用される方法及び材料は
以下のとおりであった。
狸誼性グアニレートサイクラーゼの耐製ルイッキー、ジ
ェイ・エイ（Ｌｅｗｉｃｋｉ 、Ｊ。
ェイ・エイ（Ｌｅｗｉｃｋｉ 、Ｊ。
Ａ、）Ｊ、Ｃｙｃ、Ｎｕｃ、Ｒｅｓ、（１９８１年）Ｂ
ａ２８３〜２９Ｂ頁に記述されているとおり、ラットの
肺の１０５，０００ ｘ ｇ−（−澄液分画から可溶性
グアニレートサイクラーゼを精製した。要約すると、そ
の手順は等電沈澱（ｐＨ５，０） 、）：硫酸アンモニ
ウム（２０〜５ｏｚ）沈澱、グアノシン５°三燐％ （
ＧＴＰ）−アガロースでのクロマトグラフィ、及び７ｚ
ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動分離を行なうもの
である。調製物の純度は、特異活性１Ｍ定法（Ｍｎ
−ＧＴ Ｐでは蛋白質ｍｇ当たり毎分２５０〜４００
ｎｍｏｌｅｓのサイクリックグアノシン５゛−モノフォ
スフニーｌ−（ｃＧＭＰ）生成、 Ｋｇ” −ＧＴＰで
ｍｇ、当たり毎分３０〜Ｂ０ｎｍｏ！ｅｓ）及びドデシ
ル硫酸ナトリウムの存在下での分析用ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動における単一蛋白質バンドの存在によっ
て評価された。精製されたグアニレートサイクラーゼは
１５０，０００ダルＩ・ンであり、７２，０００ダルト
ンの二つの下位単位をもつ。精製酵素は、巾−クローン
抗体生産用ハツカネズミの免疫化と、下記の放射免疫定
敬法における基準として使用された。
ａ２８３〜２９Ｂ頁に記述されているとおり、ラットの
肺の１０５，０００ ｘ ｇ−（−澄液分画から可溶性
グアニレートサイクラーゼを精製した。要約すると、そ
の手順は等電沈澱（ｐＨ５，０） 、）：硫酸アンモニ
ウム（２０〜５ｏｚ）沈澱、グアノシン５°三燐％ （
ＧＴＰ）−アガロースでのクロマトグラフィ、及び７ｚ
ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動分離を行なうもの
である。調製物の純度は、特異活性１Ｍ定法（Ｍｎ
−ＧＴ Ｐでは蛋白質ｍｇ当たり毎分２５０〜４００
ｎｍｏｌｅｓのサイクリックグアノシン５゛−モノフォ
スフニーｌ−（ｃＧＭＰ）生成、 Ｋｇ” −ＧＴＰで
ｍｇ、当たり毎分３０〜Ｂ０ｎｍｏ！ｅｓ）及びドデシ
ル硫酸ナトリウムの存在下での分析用ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動における単一蛋白質バンドの存在によっ
て評価された。精製されたグアニレートサイクラーゼは
１５０，０００ダルＩ・ンであり、７２，０００ダルト
ンの二つの下位単位をもつ。精製酵素は、巾−クローン
抗体生産用ハツカネズミの免疫化と、下記の放射免疫定
敬法における基準として使用された。
ダ１コ玉１ｚ−に九不ノｊ山二Ｙ系」ｂ久汲欠グアニレ
ートサイクラーゼ活性は、０．０２％牛血清アルブミン
、４ｍＭ ＭｎＣｌ２ （又はＭｇＣ１２）及び１ｍＭ
ＧＴＰを含有するトリス−ＭＣＩ（５０＋ｗＭ、ｐＨ７
，６）中で３７°Ｃで酵素を培養することによって決定
された。
ートサイクラーゼ活性は、０．０２％牛血清アルブミン
、４ｍＭ ＭｎＣｌ２ （又はＭｇＣ１２）及び１ｍＭ
ＧＴＰを含有するトリス−ＭＣＩ（５０＋ｗＭ、ｐＨ７
，６）中で３７°Ｃで酵素を培養することによって決定
された。
反応生成物には粗製酵素、テオフィリン（１０ｍＭ）、
クレアチン燐酸（７，５ｍＭ）及びグレアチンホスホキ
ナーゼ（１４ｐＬｇ、１３５Φ位／ｍｇ）が含まれる。
クレアチン燐酸（７，５ｍＭ）及びグレアチンホスホキ
ナーゼ（１４ｐＬｇ、１３５Φ位／ｍｇ）が含まれる。
冷い酢酸ナトリウム（５０ｍＭ、ｐＨ４，０）を加え、
９０６Ｃで３分加３ 熱して培養を停止した。得られる環式ＧＮＰを、シュタ
イナーｏｘイ（Ｓｔｅｉｎｅｒ、Ａ）ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ
、Ｃｈａｍ、（１９７２年）２４７巻！１Ｏｆ３−１１
１３頁に記述された放射免疫定給法によって測定した。
９０６Ｃで３分加３ 熱して培養を停止した。得られる環式ＧＮＰを、シュタ
イナーｏｘイ（Ｓｔｅｉｎｅｒ、Ａ）ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ
、Ｃｈａｍ、（１９７２年）２４７巻！１Ｏｆ３−１１
１３頁に記述された放射免疫定給法によって測定した。
プランドウェイン、エッチ會ジェイ（Ｂｒａｎｄ−ｖｅ
ｉｎ、Ｈ，Ｊ、）ら、ＰＮＡＳ（１９８１年）７８巻４
２４１〜４２４５頁による体細胞雑種形成技術で、可溶
性グアニレ−）・サイクラーゼに対する単一クローン抗
体をつくった。要約すると、Ｂａ１ｂ／ｃ又はＡ／Ｊ
ｘ ０５７８１ ハツカネズミ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａ
ｂｓ）にラフト肺からの精製した可溶性グアニレートサ
イクラーゼ３〜７ＩＬｇを毎月の間隔で数回注射した。
ｉｎ、Ｈ，Ｊ、）ら、ＰＮＡＳ（１９８１年）７８巻４
２４１〜４２４５頁による体細胞雑種形成技術で、可溶
性グアニレ−）・サイクラーゼに対する単一クローン抗
体をつくった。要約すると、Ｂａ１ｂ／ｃ又はＡ／Ｊ
ｘ ０５７８１ ハツカネズミ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａ
ｂｓ）にラフト肺からの精製した可溶性グアニレートサ
イクラーゼ３〜７ＩＬｇを毎月の間隔で数回注射した。
最終の免疫化から４１」後にハツカネズミを層殺し、Ｉ
ＩＩＩＩ［を除去し、細胞融合剤としてポリエチレング
リコールを使用して（コツホ−ライｈ １０００）、Ｓ
Ｐ ２１０骨髄腫細胞に融合した。ハイポキサンチン−
アミノプテリン−チミジン培地でのハイプリドーマ選枳
に続いて、特異性抗グアニレートサイクラーゼ抗体を分
泌す４ るハイブリドーマを不動化酵素プレートコート検定法で
同定した。この手順では、精製された可溶性グアニｌメ
ートサイクラーゼ１０〜＋００ ｎｇをポリ塩化ビニル
微量摘定プレートの個々の容器に結合させた。酵素への
曝露後、プレートへの非特異的結合を、ＴｇＧを含まな
い２０％馬血清で容器を処理することによって減少させ
た。ＩｇＧを含まない１ｚ馬血清でプレー１をよく洗っ
た後、分泌するハイブリドーマからの培地をプレートに
加えた。特異的に結合された抗グアニレー１サイクラー
ゼ抗体は２５ （１）−ウサキ杭ハツカネズミＩｇＧを加えることによ
って検出された。対照群の容器には、グアニレートサイ
クラーゼの代わりに２０１１Ｍトリス（ｐＨ７，８）を
加えた。陽性クローンの同定に続いて、細胞を数回サブ
クローン化して弔−クローン性を確かめ、次いで大部゛
の培地中で生育させ、Ｂａ１ｂ／ｃハツカネズミの腹膜
内に注射すると、抗体に富む腹水が得られた。陽性クロ
ーンからつくられる単一クローン抗体の中に、Ｂヶ と
指定ｙれたものと、Ｈ６と指定された別のものがあった
。ＢＩＩ とＩ、 を産生ずるクローンの試料をアメ
リカン ・タイプ・カルチャー・コレクション （Ａｍ
ｅｒｉｃａｎｔｙｐｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃ
ｔｉｏｎ） ２０８５２メリーランド州ロツクウ゛イ
ル、パークローン・ドライブ１２３０１・番ｊｆ！りへ
１９８３年２Ｊ１１５日頃に預託し、それぞれＨＢ−８
２１２とＨＢ−８２１１のＡＴＣＣ番号を受けた。
ＩＩＩＩ［を除去し、細胞融合剤としてポリエチレング
リコールを使用して（コツホ−ライｈ １０００）、Ｓ
Ｐ ２１０骨髄腫細胞に融合した。ハイポキサンチン−
アミノプテリン−チミジン培地でのハイプリドーマ選枳
に続いて、特異性抗グアニレートサイクラーゼ抗体を分
泌す４ るハイブリドーマを不動化酵素プレートコート検定法で
同定した。この手順では、精製された可溶性グアニｌメ
ートサイクラーゼ１０〜＋００ ｎｇをポリ塩化ビニル
微量摘定プレートの個々の容器に結合させた。酵素への
曝露後、プレートへの非特異的結合を、ＴｇＧを含まな
い２０％馬血清で容器を処理することによって減少させ
た。ＩｇＧを含まない１ｚ馬血清でプレー１をよく洗っ
た後、分泌するハイブリドーマからの培地をプレートに
加えた。特異的に結合された抗グアニレー１サイクラー
ゼ抗体は２５ （１）−ウサキ杭ハツカネズミＩｇＧを加えることによ
って検出された。対照群の容器には、グアニレートサイ
クラーゼの代わりに２０１１Ｍトリス（ｐＨ７，８）を
加えた。陽性クローンの同定に続いて、細胞を数回サブ
クローン化して弔−クローン性を確かめ、次いで大部゛
の培地中で生育させ、Ｂａ１ｂ／ｃハツカネズミの腹膜
内に注射すると、抗体に富む腹水が得られた。陽性クロ
ーンからつくられる単一クローン抗体の中に、Ｂヶ と
指定ｙれたものと、Ｈ６と指定された別のものがあった
。ＢＩＩ とＩ、 を産生ずるクローンの試料をアメ
リカン ・タイプ・カルチャー・コレクション （Ａｍ
ｅｒｉｃａｎｔｙｐｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃ
ｔｉｏｎ） ２０８５２メリーランド州ロツクウ゛イ
ル、パークローン・ドライブ１２３０１・番ｊｆ！りへ
１９８３年２Ｊ１１５日頃に預託し、それぞれＨＢ−８
２１２とＨＢ−８２１１のＡＴＣＣ番号を受けた。
アイ、ピーａエル（Ｅｙ、 Ｐ、Ｌ、 ）ら、Ｉｍｍｕ
ｎｏｃｈｅｍ−ｉｓｔｒｙ（１９７８年）１５巻４２９
−４３８頁の手順に従って、巾−クローン抗体与及びＨ
６をプロティンＡ−セファロースカラム（ファーマシア
）で外見上均一になるまで精製した。１００ｍＭ燐酸緩
衝液（ｐＨ８，２）中の腹水なカラムに適用した（流量
＝１５ｍ立／時間）。カラムを同じ緩衝液５０〜１００
ｍ文で洗った。抗体を５０ｍＭ ＜えん酸緩衝液により
、ＰＨ８，０（ＩｇＧ１下位区分の抗体を溶１１ｉＩ
）、ｐＨ４，５（１ｇＧ２ ａを溶＃）及びｐＨ３，０
（ＩｇＧ２ｂを溶＃）で次々に溶離した。この溶離によ
って、Ｈ９，がＩｇＧ１． Ｈ，がＩｇＧ２ａであるこ
とが示された。ＢヶとＨ６の下位区分は、下位区分の特
異的ウサギ抗ハッカネズミ免疫グロブリンを使用して、
ラフタロニー免疫拡散法によって確認した。対照実験で
は、グアニレ−トサイクラーゼに方向づけられていない
単一クローン抗体（ＩｇＧ２ａ）の抗体Ｚ、を上記のよ
うに精製した。
ｎｏｃｈｅｍ−ｉｓｔｒｙ（１９７８年）１５巻４２９
−４３８頁の手順に従って、巾−クローン抗体与及びＨ
６をプロティンＡ−セファロースカラム（ファーマシア
）で外見上均一になるまで精製した。１００ｍＭ燐酸緩
衝液（ｐＨ８，２）中の腹水なカラムに適用した（流量
＝１５ｍ立／時間）。カラムを同じ緩衝液５０〜１００
ｍ文で洗った。抗体を５０ｍＭ ＜えん酸緩衝液により
、ＰＨ８，０（ＩｇＧ１下位区分の抗体を溶１１ｉＩ
）、ｐＨ４，５（１ｇＧ２ ａを溶＃）及びｐＨ３，０
（ＩｇＧ２ｂを溶＃）で次々に溶離した。この溶離によ
って、Ｈ９，がＩｇＧ１． Ｈ，がＩｇＧ２ａであるこ
とが示された。ＢヶとＨ６の下位区分は、下位区分の特
異的ウサギ抗ハッカネズミ免疫グロブリンを使用して、
ラフタロニー免疫拡散法によって確認した。対照実験で
は、グアニレ−トサイクラーゼに方向づけられていない
単一クローン抗体（ＩｇＧ２ａ）の抗体Ｚ、を上記のよ
うに精製した。
デビット、ジー・エイ（Ｄａｖｉｄ、Ｇ、Ａ、）及びラ
イスフェルト、アール・エイ（Ｒｅｉｓｆｅｌｄ、Ｒ，
Ａ、）ＢｉｏｃｈｅＩＩ−ｉｓｔｒｙ（１９７４年）１
３巻１０１４〜１０２＋頁に記述された運動抑制化ラク
トパーオキシダーゼ−グルコースオキシダーゼを使用し
て、単一クローン抗体Ｂ、とＨ６の試料を沃素化した。
イスフェルト、アール・エイ（Ｒｅｉｓｆｅｌｄ、Ｒ，
Ａ、）ＢｉｏｃｈｅＩＩ−ｉｓｔｒｙ（１９７４年）１
３巻１０１４〜１０２＋頁に記述された運動抑制化ラク
トパーオキシダーゼ−グルコースオキシダーゼを使用し
て、単一クローン抗体Ｂ、とＨ６の試料を沃素化した。
この手順では、精製抗体１００＃Ｌｇを全量１００マイ
クロリツトル中のエンザイモビーズ（バイオラド）、Ｎ
ａ”５１（１＋ｅＣ；ｉ）、ＫＴ（１００ＩＬＭ）及び
燐酸緩衝液、ｐＨ７，２（１００ｍＭ）と−緒に培養し
た。β−Ｄグルコース（Ｉ％溶液２５ｇｊｌ）の添加に
よって反応を開始し、室温で２０分続けた。反応を冷い
ＮａＮ５（１００ｇ＋Ｍ）で停止させた。蛋白質に結び
付いた沃化物と遊離沃化物を、ＩｇＧの含んでいない１
ｚ馬血清の存在下、セファデックスＧ−２５ゲルでのク
ロマトグラフィによって分離した。沃素化抗体の特異活
性は定常的に蛋白質ｐＬｇ当り約１＃ＬＣｉであ７ った。沃素化抗体は一２０°Ｃで４週間までの貯蔵に安
定であった。
クロリツトル中のエンザイモビーズ（バイオラド）、Ｎ
ａ”５１（１＋ｅＣ；ｉ）、ＫＴ（１００ＩＬＭ）及び
燐酸緩衝液、ｐＨ７，２（１００ｍＭ）と−緒に培養し
た。β−Ｄグルコース（Ｉ％溶液２５ｇｊｌ）の添加に
よって反応を開始し、室温で２０分続けた。反応を冷い
ＮａＮ５（１００ｇ＋Ｍ）で停止させた。蛋白質に結び
付いた沃化物と遊離沃化物を、ＩｇＧの含んでいない１
ｚ馬血清の存在下、セファデックスＧ−２５ゲルでのク
ロマトグラフィによって分離した。沃素化抗体の特異活
性は定常的に蛋白質ｐＬｇ当り約１＃ＬＣｉであ７ った。沃素化抗体は一２０°Ｃで４週間までの貯蔵に安
定であった。
抗体Ｂｌ、、及びＨ６の決定基特異性は、ラベルしてい
ないＢｑ、の存在下にポリ塩化ビニルプレートに予め吸
着させたグアニレートサイクラーゼと一緒に沃素化Ｈ６
を培養することによって、またその逆の手順によって決
定された。ラベルのない種はいずれも他方のラベルされ
た種の酵素への結合をブロックしなかった。従って、Ｂ
−ヨ可溶性グアニレートサイクラーゼ上でＨ６によって
知覚される部位とは別個の部位に結合する。この結論は
競合的結合と免疫沈降の研究から確認された。
ないＢｑ、の存在下にポリ塩化ビニルプレートに予め吸
着させたグアニレートサイクラーゼと一緒に沃素化Ｈ６
を培養することによって、またその逆の手順によって決
定された。ラベルのない種はいずれも他方のラベルされ
た種の酵素への結合をブロックしなかった。従って、Ｂ
−ヨ可溶性グアニレートサイクラーゼ上でＨ６によって
知覚される部位とは別個の部位に結合する。この結論は
競合的結合と免疫沈降の研究から確認された。
洗浄した黄色ブドウ球菌細胞膜１０ｇ（パンソルビン、
カルバイオケム社）を、０．０２５％牛血清アルブミン
と１ｚツイ一ン２０界面活性剤含有の５０ＩＩＭトリス
（ｐｌ＋７．８）中における精製単一クローン抗体Ｈ５
３００ｐＬｇ（全部１〇−文）と混合した。試料を一夜
４℃で培養した。この培養に続いて、結合していな８ いＨ６抗体を吸引によって除去し、膜／抗体複合体を牛
血清アルブミンの不在下に５０１１Ｍトリス緩衝液（ｐ
Ｈ７，８）としＩ！ツイーン２０界面活性剤で２回洗っ
た。抗体Ｈ０で処理された膜を、同じｔａ＃液中に０．
０２％すＩ・リウムアジドを含有するｌＯχ懸瀾液とし
て、４°Ｇで貯蔵した。調製物は少なくとも４週間安定
であった。
カルバイオケム社）を、０．０２５％牛血清アルブミン
と１ｚツイ一ン２０界面活性剤含有の５０ＩＩＭトリス
（ｐｌ＋７．８）中における精製単一クローン抗体Ｈ５
３００ｐＬｇ（全部１〇−文）と混合した。試料を一夜
４℃で培養した。この培養に続いて、結合していな８ いＨ６抗体を吸引によって除去し、膜／抗体複合体を牛
血清アルブミンの不在下に５０１１Ｍトリス緩衝液（ｐ
Ｈ７，８）としＩ！ツイーン２０界面活性剤で２回洗っ
た。抗体Ｈ０で処理された膜を、同じｔａ＃液中に０．
０２％すＩ・リウムアジドを含有するｌＯχ懸瀾液とし
て、４°Ｇで貯蔵した。調製物は少なくとも４週間安定
であった。
膜／抗体Ｈ６複合体の１０％懸濁液５０＃１．文を精製
されたグアニレートサイクラーゼ標準物質又は粗製試料
５０ＩＬＪ−及び２０，０００〜３０．ＯＯＯｃｐｍの
ＣＩ）−陣と一緒に、平衡条件確保のため一夜培養した
。黄色ブドウ球菌膜に非特異的に吸引された〔１２５１
）−８，を除くために、１駕ツイ一ン２０界面活性剤
を含有する５０ｔａ ＫＬ ＜えん酸緩衝液（ｐＨ１３
，０）３ｍ文を各管に加えた。Ｂタ はＩｇＧ１下位区
分の免疫グロブリンであり、Ｈ６はＩ ｇＧ２ａである
から、吸着されたＢｌ／、だけがこの洗浄手順で除去さ
れた。ハツカネズミＩｇｌｌ；２ａ抗体は、ＴｌＨ４，
５以上では黄色ブドウ球菌に結合されたままであった０
次に試料をベックマンＴＪ−８遠心分離器で２．３０Ｏ
ｒｐｍでの遠心分離にかけ、吸引又はデカンテーション
によって１−澄液分画を除去した。ベレッＩ・をカンマ
線計数によって監視］７た。標準曲線用に精製グアニレ
ートサイクラーゼｌＯ〜１００ｎ ｇを標準管に加えた
。
されたグアニレートサイクラーゼ標準物質又は粗製試料
５０ＩＬＪ−及び２０，０００〜３０．ＯＯＯｃｐｍの
ＣＩ）−陣と一緒に、平衡条件確保のため一夜培養した
。黄色ブドウ球菌膜に非特異的に吸引された〔１２５１
）−８，を除くために、１駕ツイ一ン２０界面活性剤
を含有する５０ｔａ ＫＬ ＜えん酸緩衝液（ｐＨ１３
，０）３ｍ文を各管に加えた。Ｂタ はＩｇＧ１下位区
分の免疫グロブリンであり、Ｈ６はＩ ｇＧ２ａである
から、吸着されたＢｌ／、だけがこの洗浄手順で除去さ
れた。ハツカネズミＩｇｌｌ；２ａ抗体は、ＴｌＨ４，
５以上では黄色ブドウ球菌に結合されたままであった０
次に試料をベックマンＴＪ−８遠心分離器で２．３０Ｏ
ｒｐｍでの遠心分離にかけ、吸引又はデカンテーション
によって１−澄液分画を除去した。ベレッＩ・をカンマ
線計数によって監視］７た。標準曲線用に精製グアニレ
ートサイクラーゼｌＯ〜１００ｎ ｇを標準管に加えた
。
１１６をＢ仏やＺ、と代えて、又は抗体なしで、比較検
定を行なった。全試料を重複又は下回検定し、夫々も代
表する実験からの平均値を測定した。これらの検定結果
を図面に示す。図中、自マルはＨ６が黄色ブドウ珪菌膜
に結合された結果を、黒マルはＨ４を１３．と代えた場
合のもの、白い二角はＨｏをＺ、と代えた場合のもの、
また黒い四角は抗体なしの結果を示す。
定を行なった。全試料を重複又は下回検定し、夫々も代
表する実験からの平均値を測定した。これらの検定結果
を図面に示す。図中、自マルはＨ６が黄色ブドウ珪菌膜
に結合された結果を、黒マルはＨ４を１３．と代えた場
合のもの、白い二角はＨｏをＺ、と代えた場合のもの、
また黒い四角は抗体なしの結果を示す。
２５
図でわかるように、ＣＩ）−Ｂ、結合量は、グアニレ−
トサイクラーゼ膿度範囲にわたっ１２ノ 範囲は（Ｉ：）−Ｂ、抗体の経過時間によって変わるが
、検定は典型的にはグアニレートサイクラーゼ１０〜１
ｏｏｎ ｇの範囲にわたってリニアーであった。より高
い酵素濃度では、曲線の勾配が減少した（図示していな
い）。
トサイクラーゼ膿度範囲にわたっ１２ノ 範囲は（Ｉ：）−Ｂ、抗体の経過時間によって変わるが
、検定は典型的にはグアニレートサイクラーゼ１０〜１
ｏｏｎ ｇの範囲にわたってリニアーであった。より高
い酵素濃度では、曲線の勾配が減少した（図示していな
い）。
この試験によって、グアニレートサイクラーゼ蛋白質の
Ｘ１ｌｌ定が記述された順序での抗体ＢやとＨ６の使用
に依存していることも確認された。黄色ブドウ球菌 −
８９１、黄色ブドウ球菌−Ｚ、又は黄色ブドウ球菌膜の
みを使用すると、（” Ｉ ）−８≠結合は検出されな
かった。黄色ブドウ球菌膜−Ｈ６複合体の使用時にだけ
、特異的結合が見られた。これは本方法の特異性を立証
するものであり、更に装色ブドウ球菌−抗体複合体への
（１２５１）−ｓ＝又はグアニレ−Ｉ・サイクラーゼの
非特異的結合が、はとんど又は全くないことを示してい
る。
Ｘ１ｌｌ定が記述された順序での抗体ＢやとＨ６の使用
に依存していることも確認された。黄色ブドウ球菌 −
８９１、黄色ブドウ球菌−Ｚ、又は黄色ブドウ球菌膜の
みを使用すると、（” Ｉ ）−８≠結合は検出されな
かった。黄色ブドウ球菌膜−Ｈ６複合体の使用時にだけ
、特異的結合が見られた。これは本方法の特異性を立証
するものであり、更に装色ブドウ球菌−抗体複合体への
（１２５１）−ｓ＝又はグアニレ−Ｉ・サイクラーゼの
非特異的結合が、はとんど又は全くないことを示してい
る。
この検定法の有効性を検証するため、多くの対照実験を
行なった。例えば所定部のグアニレートサイクラーゼ蛋
白質を含有するラット肺の和製−１−澄液の存在ｔ゛、
不在下に標準曲線の実験を行なった。粗製肺−１−澄液
の添加は標準曲線の勾配を変えなかった（図示していな
い）。更に重要な点としては、ｔｌｌ製上澄液の存在下
に測定された酵素借は、 ２１１製上澄液分画中に存在
するグアニレ−トサイクラーゼ検定皐による各標準を集
約して予測さ１ れるものとよく一致していた。これらの実験は、和製組
織抽出液中のグアニレートサイクラーゼをｌｌ１１升了
す６ために本検定法が適用できることを立証している。
行なった。例えば所定部のグアニレートサイクラーゼ蛋
白質を含有するラット肺の和製−１−澄液の存在ｔ゛、
不在下に標準曲線の実験を行なった。粗製肺−１−澄液
の添加は標準曲線の勾配を変えなかった（図示していな
い）。更に重要な点としては、ｔｌｌ製上澄液の存在下
に測定された酵素借は、 ２１１製上澄液分画中に存在
するグアニレ−トサイクラーゼ検定皐による各標準を集
約して予測さ１ れるものとよく一致していた。これらの実験は、和製組
織抽出液中のグアニレートサイクラーゼをｌｌ１１升了
す６ために本検定法が適用できることを立証している。
本発明の直接画工部位免疫検定法を実施するための試験
キラｉ・は、不動化媒体に第一の単一クローン抗体を組
み合せたもの又は予め不動化された第一の巾−クローン
抗体と、ラベルされた第二の弔−クローン抗体を包含す
る。間接的免疫検定法を実施するためのキットは、不動
化媒体に第一のｔｐｔ −、クローン抗体を組み合せた
もの又は予め不動化された第一の単一クローン抗体、ラ
ベルしていない第二の単一クローン抗体、及び第二の単
一クローン抗体に対するラベルされた抗体を包含する。
キラｉ・は、不動化媒体に第一の単一クローン抗体を組
み合せたもの又は予め不動化された第一の巾−クローン
抗体と、ラベルされた第二の弔−クローン抗体を包含す
る。間接的免疫検定法を実施するためのキットは、不動
化媒体に第一のｔｐｔ −、クローン抗体を組み合せた
もの又は予め不動化された第一の単一クローン抗体、ラ
ベルしていない第二の単一クローン抗体、及び第二の単
一クローン抗体に対するラベルされた抗体を包含する。
これらの試薬の適当喰が、個々に適当な容器に包装され
るのが普通である。′これらの主成分のほか、キットは
典型的には、緩衝液、対照又は標準試薬、説り１書、及
び使われているラベルの性質によっては、検出可能な生
成物をつくりだすのに必要な反応体を包含するであろう
。これらのキラトは、慣用の試験キット製造手順を使用
して’Ａ 端され包装されてよい。
るのが普通である。′これらの主成分のほか、キットは
典型的には、緩衝液、対照又は標準試薬、説り１書、及
び使われているラベルの性質によっては、検出可能な生
成物をつくりだすのに必要な反応体を包含するであろう
。これらのキラトは、慣用の試験キット製造手順を使用
して’Ａ 端され包装されてよい。
図面は、実施例に記述された検定の結果を示すグラフで
ある。 出願人 ザ・ボード・オブ・！・ラスティーズ・オブ争
ザ・レランド・スタンフォード ・ジュニア・ユニパーシティ 代理人 ｊｔ理十 加 藤 ω１ 道
ある。 出願人 ザ・ボード・オブ・！・ラスティーズ・オブ争
ザ・レランド・スタンフォード ・ジュニア・ユニパーシティ 代理人 ｊｔ理十 加 藤 ω１ 道
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）試料中の抗原を、 （ａ） 抗原決定基の一つに対して方向づけられる運動
抑制ないし不動化された単一クローン抗体、及び （ｂ）（ｉ）その抗原のもう一つの異なる快足基に対し
て方向づけられ、かつ（ｉｉ）直接又は間接にラベルさ
れている第二の単一クローン抗体、と反応ｙせて試料の
多決定基抗原の存在又は濃度を検出するための二部位免
疫検定法であって、第二の単一クローン抗体が運動抑制
ないし不動化された単一クローン抗体とは異なる免疫グ
ロブリン区分又は下位区分のものであることを特徴とす
る検定法。 ２）試料中の多決定基抗原の存在又は濃度を検出するた
めの直接二部位免疫検定法であって、（、ａ）抗原決定
基の−っに対する運動抑制ないし不動化された第一の単
クローン抗体と試料を一緒に培養し、 （ｂ）（ａ：＋の培養生成物を抗原のもう−っの異なる
決定基に対する第二の、ラベルされた抗体と一緒に培養
し、 （ｃ）（ｂ）の培養生成物中におけるラベルされた複合
体の存在を検出する各段階を含み、前記第二の巾−クロ
ーン抗体が第一の単一 クローン抗体とは異なる免疫グ
ロブリン区分又は下位ｒＫ分のものであることを特徴と
する検定法。 ３）運動抑制ないし不動化された単一クローン抗体がプ
ロティンＡによって連動抑制ないし不動化され、段階（
ｂ）のあとで段階（Ｃ）の前にプロティンＡが（ｂ）の
培養混合物から分離され、非特異的に結合きれた第二の
単一・クローン抗体をプロティンＡ複合体から選択的に
除去するようなｐＨをもつ水性媒体で洗浄される、請求
の範囲第２項の免疫検定法。 ４）試料中の多決定基抗原の存在又は濃度を検出するた
めの以下の各段階： （ａ）抗原決定基の一つに対する運動抑制ないし不動化
された第一の単一クローン抗体と試料を一緒に培養する
。 （ｂ）（ａ）の培養生成物を抗原のもう一つの異なる決
定基に対する第二の単一クローン抗体と一緒に培養する
。 （ｃ）（ｂ）の培養生成物を第二の単一クローン抗体に
対するラベルされた抗体と一緒に培養する。 からなるｆｆｉ目と二部位免疫検定法であって、第二の
単一クローン 抗体が第 −の単一クローン抗体とは％
なる免疫グロブリン区分又は下位区分のものであること
を特徴とする検定法。 ５）第二の屯−クローン抗体が、連動抑制ないし不動化
された弔−クローン抗体と結び付いた運動質的に除去さ
れないでいる、請求の範囲第１項、第２項又は第４項の
−に記載の免疫検定法。 ６）連動抑制ないし不動化された単一クローン抗体がプ
ロティンＡによって運動抑制ないし不動化きれる、請求
の範囲第１項、第２項又は第４項の−に記載の免疫検定
法。 ７）試料中の多決定基抗原の存在又は濃度を検出するた
めの直接二部位免疫検定法実施用の試験キットであって
、 （ａ）抗原決定ノ、（の一つに対して方向づけられる連
動抑制ないし不動化された単一クローン抗体と、 （ｂ） （ｉ）抗原のもう一つの異なる決定基に単一し
て方向づけられ、（ｉｉ）ラベルされている、第二の弔
−・クローン抗体からなり、 この第二の巾−クローン抗体が運動抑制ないし不動化さ
れた中−クローン抗体とは異なる免疫グロブリン区分又
は下位区分のものであることを特徴とする試験キット。 ８）試料中の多決定基抗原の存在又は濃度を検出するた
めの直接二部位免疫検定法実施用の試験キ・ントであっ
て、 （ａ）抗原決定基の一つに対して方向づけられる第一の
弔−クローン抗体、 （ｂ）第一の単一クローン抗体の運動抑制ないし不動化
媒体、及び （ｃ）（ｉ）抗原のもう一つの異な る決定基に対して
方向づけられ、（ｉｉ）ラベル されている、第二の
単一クローン抗体からなり、 この第二の単一クローン抗体が第一の単一クローン抗体
とは異なる免疫グロブリン区分又は下位区分のものであ
ることを特徴とする試験キット。 ９）試ネ；［中の多決定基抗原の存在又は濃度を検出す
るための間接二部免疫検定法実施用の試験キットであっ
て、 （ａ）抗原決定基の一つに対して方向づけられる連動抑
制ないし不動化された単一クローン抗体、（ｂ）抗原の
もう一つの異なる決定基に対して方向づけられる第ニー
の弔−クローン抗体、及び、（Ｃ）第二の単一クローン
抗体に対するラベルされた抗体からなり、 この第二の巾−・クローン抗体が運動抑制ないし不動化
された巾−クローン抗体とは異なる免疫グロブリン区分
又は下位区分のものであることを特徴とする試験キット
。 １０）試料中の多決定基抗原の存在又は濃度を検出する
ための間接二部免疫検定法実施用の試験キットであって
、 （ａ）抗原決定基の一つに対して方向づけられる第一の
単一クローン抗体、 （ｂ）第一の巾−クローン抗体の連動抑制ないし不動化
媒体、 （Ｃ）抗原のもう一つの異なる決定基に対して方向づけ
られる第二の弔−クローン抗体、及び（ｄ）第二のＣ１
−クローン抗体に対するラベルされた抗体からなり、 この第二の単一クロー〉′抗体が第一・の単一クローン
抗体とは異なる免疫グロブリン区分又は下位区分のもの
であることを特徴とする試験キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AU50096/85A AU573162B2 (en) | 1984-02-15 | 1985-11-20 | Method of manufacturing a seat |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/466,798 US4474892A (en) | 1983-02-16 | 1983-02-16 | Two-site immunoassays using monoclonal antibodies of different classes or subclasses and test kits for performing same |
| US466798 | 1983-02-16 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59157569A true JPS59157569A (ja) | 1984-09-06 |
Family
ID=23853140
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59025318A Pending JPS59157569A (ja) | 1983-02-16 | 1984-02-15 | 異なる区分又は下位区分の単一クロ−ン抗体を用いる二部位免疫検定法及びその試験キツト |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4474892A (ja) |
| EP (1) | EP0119736A3 (ja) |
| JP (1) | JPS59157569A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| JP2008055331A (ja) * | 2006-08-31 | 2008-03-13 | Toyota Boshoku Corp | エアクリーナ用フィルタ及びエアクリーナ |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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