JP2005154440A - プロトロンビンフラグメントf1+2に対する抗体、それらの製造および使用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 本抗体は、プロトロンビンのF2フラグメントのN末端側半分のエピトープに結合するもので、5〜25個のアミノ酸、好ましくは5〜21個のアミノ酸、さらに特に好ましくは5〜12個のアミノ酸からなり、アミノ酸配列Pro−Leu−Glu−Gln−Cysを含むペプチド、殊に、アミノ酸配列Ser−Glu−Gly−Ser−Ser−Val−Asn−Leu−Ser−Pro−Pro−Leu−Glu−Gln−Cys-Val−Pro−Asp−Arg−Gly−Gln−Gln−Tyr−Gln−Glyまたはそれらのフラグメントを有するペプチドである。
【選択図】なし
Description
特に、この目的は、プロトロンビンのF2フラグメントのN末端側半分のエピトープに結合する、プロトロンビンフラグメントF1+2に対するモノクローナル抗体(以下「二次抗体」という)を提供することにより達成される。これら二次抗体は、エピトープがF2およびF1+2フラグメントの4個のカルボキシ末端アミノ酸を含む抗体(以下「一次抗体」という)と組み合わせて、F1+2測定のための改善されたサンドイッチイムノアッセイの基礎を形成する。
本発明の1つの観点は、5〜25個のアミノ酸、好ましくは5〜21個のアミノ酸、さらに特に好ましくは5〜12個のアミノ酸からなり、アミノ酸配列Pro−Leu−Glu−Gln−Cysを含むペプチドである。好ましい本発明のペプチドは、アミノ酸配列Ser−Glu−Gly−Ser−Ser−Val−Asn−Leu−Ser−Pro−Pro−Leu−Glu−Gln−Cys−Val−Pro−Asp−Arg−Gly−Gln−Gln−Tyr−Gln−Glyまたはそれらのフラグメントを有するペプチド、特に、アミノ酸配列Ser−Pro−Pro−Leu−Glu−Gln−Cysを有するペプチドである。
「特異的な結合パートナー」は、特異的な結合対の構成要素を意味する。特異的な結合対の構成要素は、一方が、他方の分子構造に相補的な少なくとも1つの構造を有する2個の分子を含み、この2個の分子は、相補的な構造の結合を介して結合することができる。
用語「分子」はまた、分子複合体を含み、例えば、アポ酵素と補酵素とからなる酵素、複数のサブユニットからなるタンパク質、タンパク質と脂質とからなるリポタンパク質などである。特異的な結合パートナーは、天然に存在する物質でもよいし、または、例えば化学合成、微生物学的技術、および/または、遺伝子操作法により製造された物質でもよい。用語「特異的な結合パートナー」を説明するためにの例を言えば、これらに限定されないが、チロキシン結合グロブリン、ステロイド結合タンパク質、抗体、抗原、ハプテン、酵素、レクチン、核酸、リプレッサー、オリゴおよびポリヌクレオチド、プロティンA、プロティンG、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、補体成分C1q、核酸結合タンパク質などが挙げられる。特異的な結合対は、例えば、抗体−抗原、抗体−ハプテン、オペレーター−リプレッサー、ヌクレアーゼ−ヌクレオチド、ビオチン−アビジン、レクチン−多糖類、ステロイド−ステロイド結合タンパク質、薬物−薬物受容体、ホルモン−ホルモン受容体、酵素−基質、IgG−プロティンA、相補オリゴまたはポリヌクレオチドなどである。
例えば波長シフト、極性化)が挙げられる。構成要素間の相互作用はまた、酵素カスケードを含む。この場合、構成要素は酵素であり、そのうち少なくとも1つは他方の酵素の基質を提供し、それにより最大または最小反応速度で結合した基質の変換が起こる。
不揃いでもよい。微粒子は、球状、回転楕円体、大きいまたは小さい空洞または孔を有する球状が可能である。微粒子は、有機材料または無機材料、または、これら2種の混合物または組み合わせから構成することができる。微粒子はまた、多孔質または非多孔質材料、膨潤性または非膨潤性材料から構成されてもよい。微粒子は、どのような比重を有していてもよいが、水の比重に近い比重(例えば約0.7〜約1.5g/ml)を有する粒子が好ましい。好ましい微粒子は、水性溶液に懸濁可能であり、懸濁液中で最も安定である。微粒子は、透明、半透明、または不透明であり得る。微粒子は、複数の層で構成されてもよく、例えば、コアと、1またはそれ以上の被服層とを有するいわゆるコア・シェル粒子が挙げられる。用語「微粒子」は、例えば色素結晶、金属ゾル、シリカ粒子、ガラス粒子、磁気粒子、ポリマー粒子、油滴、脂質粒子、デキストラン、および、タンパク質集合体を含む。好ましい微粒子は、水性溶液に懸濁可能であり、水不溶性ポリマー材料、特に置換ポリエチレンからなる粒子である。ラテックス粒子は極めて特に好ましく、例えば、ポリスチレン、アクリル酸ポリマー、メタクリル酸ポリマー、アクリロニトリルポリマー、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン、ポリ酢酸ビニル−アクリレート、ポリビニルピリジン、塩化ビニル−アクリレートで構成される。表面に、共有結合(例えば特異的な結合パートナーとラテックス粒子との共有結合)を可能にする反応性基(例えば、カルボキシル、アミノまたはアルデヒド基)を有するラテックス粒子が、特に興味深い。ラテックス粒子の製造は、例えば欧州特許第0080614号、欧州特許第0227054号、および、欧州特許第0246446号で説明されている。
インビトロでの診断補助物において、検出され得る分析物、例えばF1+2は、生きているヒトまたは動物の体外でサンプル中において検出されるか、または、それらの濃度または量が測定される。
イ(luminescent oxygen channeling immunoassay)(「LOCI」,欧州特許第0515194号(A2);Ullman等(1994年)Proc.Natl.Acad.Sci.,91:5426〜5430;Ullman等(1996年)Clinical Chemistry,42:1518〜1526を参照);などが挙げられる。例えば比濁ラテックス分析のような均質なサンドイッチイムノアッセイにおいて、抗体試薬は、サンプルと共にインキュベートされ、測定前に分離または洗浄工程を行うことなく、インキュベート中および/またはインキュベート後にシグナルが測定される。言い換えれば、遊離の分析物または分析物と結合していない抗体から、抗体が結合した分析物を分離しなくてもよい。
ウェスタンブロッティング、ドットブロッティング、免疫電気泳動法、免疫固定電気泳動、電気免疫拡散、免疫沈降、放射免疫拡散、免疫固定、イムノクロマトグラフィー、ラテックス凝集反応、混濁度測定分析または比濁分析、均質なまたは不均質な結合分析、1または2ステップ分析、サンドイッチ分析、間接的な分析、競合的分析、ポイント・オブ・ケア・テストなど。上記およびその他の検出方法は、例えば「Labor und Diagnose」,L.Thomas編,TH−Books Verlags−gesellschaft mbH,フランクフルト,1998年,第60章、または、「Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology−An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques」,T.Chard編,エルゼビア,アムステルダム,1987年に説明されている。
および、F1+2に結合できる標識された抗体(好ましくは二次抗体)を試験片にアプライ
する。適切なラベルの例としては、着色されたラテックス粒子、コロイド金、酵素などが挙げられる。F1+2がサンプル中に存在する場合、F1+2/抗体複合体が形成され得る。これら複合体は、例えば毛細管力によって、他のF1+2エピトープに結合できる抗体(好ましくは一次抗体)が固定されている領域に移動してもよいし、または、試験方法の際に例えばバンド状に固定されてもよい(例えばビオチン−アビジン架橋を介して)。標識されたF1+2/抗体複合体はこの領域に結合し、固定された抗体とサンドイッチ複合体を形成する。この場合、ラベルのシグナルの強度は、F1+2のサンプル濃度に比例する。競合的POC試験方法において、例えばF1+2、および/または、F1+2フラグメントは、試験片の領域に固定されていてもよいし、試験方法の際に固定されてもよい。この固定されたF1+2は、サンプルからのF1+2と、標識された抗F1+2抗体への結合に関して競合し得る。また、その代わりの可能性は、固定された抗F1+2抗体と、標識されたF1+2とを用いて競合的F1+2試験を設計することである。
本発明のその他の観点は、本発明の抗体の製造方法であり、本方法は、免疫化のために、5〜25個のアミノ酸、好ましくは5〜21個のアミノ酸、さらに特に好ましくは5〜12個のアミノ酸からなり、アミノ酸配列Pro−Leu−Glu−Gln−Cysを含む1またはそれ以上のペプチドを用いることを含む。特に好ましくは、本発明のこの方法で、抗原で免疫化するのに用いられるペプチドは、アミノ酸配列Ser−Glu−Gly−Ser−Ser−Val−Asn−Leu−Ser−Pro−Pro−Leu−Glu−Gln−Cys−Val−Pro−Asp−Arg−Gly−Gln−Gln−Tyr−Gln−Glyまたはそれらのフラグメントを有するペプチドであり、好ましくは、アミノ酸配列Ser−Pro−Pro−Leu−Glu−Gln−Cysを有するペプチドである。
免疫抗原として用いられるペプチドは、免疫化に用いられる場合、キャリアーに結合していなくてもよいし、および/または、キャリアーに結合していてもよい。定型的なキャリアーの例としては、プロティン(例えば、オバルブミン、アルブミンまたはヘモシニアン)、または、ポリマー(例えば、ポリエチレングリコール、ポリアクリルアミドまたはポリ−d−グルタミン−d−リシン)が挙げられる。このようなペプチドは、例えば、カルボジイミドまたはグルタルアルデヒドの補助により、または、スペーサーとしても作用し得る二官能価の試薬によりこれらのキャリアーに結合できる(例えばカップリング方法に関しては、例えば、Wong S.(1993年)Chemistry of Protein Conjugation and Cross−Linking,CRC Press,Inc,Boca Ratonを参照)。
フィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。
ab’フラグメント)を使用することが有利である。これらは、例えば当業者既知の酵素による切断法により製造することができる(例えば、HarlowおよびLane(1988年)Antibodies:A Laboratory Manual,コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー,コールド・スプリング・ハーバーも参照)。
市販のプロトロンビン製品を免疫抗原を製造するための出発材料として用いることができる。これら製品の純度が不十分な場合、プロトロンビンを免疫化に用いる前にクロマトグラフィーで単離すべきである。プロトロンビンのクロマトグラフィーでの精製は、例えば以下のように行うことができる:
1.クエン酸緩衝液(25mM,pH6)中の陰イオン交換樹脂(モノQ−セファロース)で分画化し、プロトロンビン活性を示す分画を用いる。この工程によりX因子の濃度を減少させる。1M NaClで溶出させる。
2.クエン酸緩衝液(25mM,pH6)中のヘパリン−セファロースで分画化し、プロトロンビン活性を示す分画を用いる。この工程により、X因子の濃度をさらに減少させる。1M NaClで溶出させる。
3.クエン酸緩衝液(25mM,pH6)中のアフィニティークロマトグラフィーで、プロティンCに対するモノクローナル抗体を用いて、プロティンCを除去する。プロトロンビンを含むフロースルー液をさらに用いる。
4.セファデックスG200でのゲルクロマトグラフィーにより、緩衝液を50mMクエン酸塩/150mM NaCl(pH6)と交換する。
5.X因子に対するモノクローナル抗体を用いたアフィニティー精製により、クエン酸緩衝液(25mM,pH6)中でのバッチ法で、残存したX因子を除去する。プロトロンビンを含む上清を、免疫化に用いる。
A)モノクローナル一次抗体
モノクローナル一次抗体は、欧州特許第0303983号および米国特許第6,541/275号に記載の方法で製造することができる。
B)モノクローナル二次抗体
二次抗体は、免疫抗原として精製されたプロトロンビン(実施例1を参照)を用いて製造された(マウス1匹あたり20μg)。
それぞれのBALB/cマウスに、完全フロインドアジュバント中の免疫抗原(プロトロンビン)(20μg)を腹腔内に投与することにより免疫した。ブースターは、それぞれの場合において、4週間後に、不完全フロインドアジュバント(ICNバイオメディカル社(ICN Biomedical GmbH)製,エシュヴェーゲ,ドイツ)中の免疫抗原(20μg)で、および、8週間後に、それぞれの場合において、フロインドアジュバントなしで免疫抗原(20μg)で行われた。融合の前の最後の3日間、マウスは、それぞれの場合において免疫抗原(20μg)で静脈内ブースターを受けた。
CO2吸入によりマウスを処置した後、脾臓を摘出し、無血清ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM,CCプロ社(CC Pro GmbH)製,ノイシュタット・アン・デア・ヴァインシュトラーセ(Neustadt/W),ドイツ)で単一細胞懸濁液を製造した。細胞を遠心分離し(652g)、DMEMで2回洗浄した。次に、トリパンブルー染色で細胞数を計数した。2×107個の骨髄腫細胞(Sp2/0)を、約108個の脾臓細胞に加えた。遠心分離(360g)後、上清を捨てて、1mlのポリエチレングリコール溶液(PEG4000,メルク・ユーロラボ(Merck Eurolab)製,ブルフザル,ドイツ;DMEM中、約50%の濃度)を細胞ペレットに加え、再懸濁した後、37℃で1分間インキュベートした。続いて、約10mlのDMEMを滴下して加え、混合物を室温で2〜4分間インキュベートした。融合した細胞を遠心分離し(326g)、DMEM+20%FCS(ウシ胎仔血清,バイオ・ウィタカー・ヨーロッパ(Bio Whittaker Europe)製,ヴェルヴィエ,ベルギー)+HAT溶液(CCプロ社,ノイシュタット・アン・デア・ヴァインシュトラーセ,ドイツ)にペレットを再懸濁し、24ウェルの細胞培養プレート(コースター(Costar)製)に分配した。ウェルあたりのおよその細胞濃度は、5×104〜5×106個の細胞であった。
2〜3週間後、得られた細胞コロニー(ハイブリッド)を除去し、新しい培養プレートに移した。
細胞培養液中に放出された抗体の特異性を、プロトロンビンでコーティングしたマイクロタイタープレート(ヌンク(Nunc)製,タイプB)を用いた第一の試験工程で試験した(コーティングは1μg/ml、すなわち0.15μg/ウェル)。
細胞培養上清(1:2に希釈)100μl をマイクロタイタープレートの各ウェルにピペットで添加し、+15〜+25℃で1時間インキュベートした。プレートをPOD洗浄溶液(OSEW;デイド・ベーリング製,マールブルグ,ドイツ)で2回洗浄した後、100μlの抗マウスIgG/F(ab’)2−POD結合体(デイド・ベーリング製,マ
ールブルグ,ドイツ)を各ウェルに導入し、+15〜+25℃で1時間インキュベートした。プレートを再度2回洗浄した後、100μlのクロモゲンTMB溶液(デイド・ベーリング製,マールブルグ,ドイツ)を各ウェルに導入し、+15〜+25℃でさらに30分間インキュベートした。インキュベート後、100μlのPODストック溶液(デイド・ベーリング製,マールブルグ,ドイツ)を各ウェルに導入し、マイクロタイタープレートをBEPII(ベーリングELISAプロセッサーII,デイド・ベーリング製,マールブルグ,ドイツ)で、450nmで測定した。
第二の試験工程において、単離後のハイブリッドを上述したのと同じ試験様式で再度チェックした。
プロトロンビン特異的抗体を生産するハイブリッドの単一の細胞を、マイクロマニピュレータ(ライツ(Leitz)製,ヴェッツラー,ドイツ)を用いてクローン化した。これらクローンの培養上清を、g)で説明するように精製し、e)、h)、および、i)で
説明するように詳細に特徴付けた。例えばクローン92−195/097により、本発明の抗体(ヒトプロトロンビンフラグメントF2のN末端側半分/領域のエピトープと結合
する)が生産される。このハイブリドーマ細胞株は、DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zeilkulturen GmbH,Mascheroder Weg 1b,38124 Brunswick,Germany)に、寄託番号DSM ACC2607で寄託されている。
イソストリップ(IsoStrip)TMマウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット(ベーリンガー・マンハイム製,ドイツ)を用いて、抗体92−195/097のサブクラスがIgG1であることを決定した。
より大量の抗体を、適切な細胞クローンをローラーボトル(コーニング・コースター(Corning Costar)製,ボーデンハイム,ドイツ)に移し、37℃で望ましい最終容量にすることによって生産した。次に、回転させた培養懸濁液を0.22μmでろ過し、細胞を除去した。細胞を含まない抗体溶液を限外ろ過で(分離限界は30000ダルトン)濃縮し、精製した。
得られた抗体溶液の緩衝液を、0.14Mリン酸緩衝液(pH8.6)に交換し、その溶液を、rプロティンAセファロース・ファスト・フロー(rProtein A Sepharose Fast Flow)(アマシャム・ファルマシア製)が充填されたクロマトグラフィーカラムにローディングした(精製される抗体10mgあたりrプロティンAセファロース・ファスト・フロー1mlを用いた)。カラムを0.14Mリン酸緩衝液
(pH8.6)で洗浄することにより、全ての未結合の構成要素を除去した。結合した抗
体を、0.1Mクエン酸(pH3.0)でカラムから溶出させ、0.05M酢酸ナトリウム
+0.5M NaCl+0.05Mトリス+0.01%アジ化ナトリウム(pH7.0)に対して透析した。
モノクローナル抗プロトロンビン抗体と、トロンビンおよびF2との反応を調べた。
トロンビンを用いた反応:用いられた固相は、ウサギ抗マウスIgGでコーティングされたマイクロタイタープレートである。培養上清からの抗プロトロンビン抗体をそれに結合させた。洗浄工程の後、精製されたトロンビンとインキュベートした。さらなる洗浄工程の後、抗体のトロンビンへの結合は、モノクローナルマウス抗トロンビン抗体と酵素ペルオキシダーゼとからなる結合体と、それに続く着色反応により検出された。
イクロタイタープレートである。培養上清からの抗プロトロンビン抗体をそれに結合させた。洗浄工程の後、精製されたプロトロンビンフラグメントF2とインキュベートした。
さらなる洗浄工程の後、抗体のF2への結合は、ポリクローナルウサギ抗F2抗体と酵素ペルオキシダーゼとからなる結合体と、それに続く着色反応により検出された。
F2と反応したが、同時にトロンビンとは反応しなかった抗体を選択した。これら抗体
が、F2特異的一次抗体およびF1+2特異的一次抗体を用いたサンドイッチELISAにおいて結合体として使用するのに適しているかどうかを調べた。この目的のために、当業者既知の方法で、精製された抗体をホースラディッシュペルオキシダーゼに結合させた(ナカネ(Nakane)カップリング)。
実施例3a)で説明したように、サンドイッチELISAにおける適性をチェックした。適性について決定するための必須の基準は、最適なシグナル強度、測定範囲の規模、検出の下限、および、キャリブレーションプロットの直線性とした。
クローン92−195/097で生産された抗体は、これらの基準に関して最良の結果を示した。
プロトロンビンフラグメントF1+2を、11個のアミノ酸をそれぞれオーバーラップさ
せ、N末端からC末端へ連続して2−merずつの工程で伸長した13−merのペプチドに分配した。これらペプチドを合成により製造し、膜へ結合させ、分析される抗体のこれらペプチドそれぞれへの結合を調べた:検出のために、調べられる抗体を、前もってホースラディッシュペルオキシダーゼに共有結合させた。それに続く反応において、ホースラディッシュペルオキシダーゼは化学発光基質に変換され、この発光はイメージングシステムを用いてシグナルが定量化された。これは、特定のペプチドに抗体が結合する量が多ければ多いほど、このペプチドを用いて測定されたシグナルはより強くなることを意味する。
適切な二次抗体の検索において収率が低い理由は、プロトロンビンF1+2フラグメント
の遊離のC末端に対する一次抗体と組み合わせるために、二次抗体の特異的な結合部位(好ましくはF2フラグメントのN末端側半分の)が必要であることは明らかである。特に、アミノ酸配列Ser−Pro−Pro−Leu−Glu−Gln−Cysに対する特異的な結合が好ましい:
クローン92−195/097で生産された二次抗体のエピトープマッピングの結果を示す(トータルで180種のペプチド(いずれもアミノ酸配列が各ペプチドあたり2個のアミノ酸で置換されている)から抽出したものを示す):
a)分析方法
サンドイッチの原理による酵素イムノアッセイにおいて、本発明の二次抗体を一次抗体と組み合わせて用いた:最初のインキュベートの際、サンプル中に存在するF1+2抗原は、マイクロタイタープレートのウェル表面に固定されたF1+2に対する一次抗体に結合する。ウェルを洗浄した後、第二の反応において、ペルオキシダーゼが結合した本発明の二次抗体は遊離のF1+2決定基に結合する。過量の酵素が結合した次抗体を洗い流した。次に、ウェル中の結合した酵素の活性を測定した。過酸化水素とテトラメチルベンジジンの酵素による変換を希硫酸を添加して止めた。
着色強度(F1+2濃度に比例する)は、光度測定により測定され、別途提供された標準
から得られたキャリブレーションプロットにより定量した。
このような本発明のサンドイッチイムノアッセイは、以下の特性に関して、既知のF1+2分析に比べて改善された結果を示す。
20個の分析プレートにおいてそれぞれ96回の測定によって測定されたサンプルの均一性は、CV(変動係数)=5.2%であった。
Claims (21)
- 5〜25個のアミノ酸、好ましくは5〜21個のアミノ酸、さらに特に好ましくは5〜12個のアミノ酸からなり、アミノ酸配列Pro−Leu−Glu−Gln−Cysを含むペプチド。
- アミノ酸配列Ser−Glu−Gly−Ser−Ser−Val−Asn−Leu−Ser−Pro−Pro−Leu−Glu−Gln−Cys-Val−Pro−Asp−A
rg−Gly−Gln−Gln−Tyr−Gln−Glyまたはそれらのフラグメントを有し、特に、アミノ酸配列Ser−Pro−Pro−Leu−Glu−Gln−Cysを有するペプチドである、請求項1に記載のペプチド。 - 固相、および/または、シグナル発生システムの構成要素に結合した、請求項1または2に記載のペプチド。
- 免疫化および/または抗体を精製するための、請求項1または2に記載のペプチドの使用。
- 分析物、好ましくはF1+2を定量検出または定性検出する方法における、請求項1〜3のいずれか一項に記載のペプチドの使用。
- プロトロンビンのF2フラグメントのN末端側半分でエピトープに特異的に結合する抗体。
- モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である、請求項6に記載の抗体。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載のペプチドに特異的に結合する、請求項6または7に記載の抗体。
- ハイブリドーマ細胞株DSM ACC2607で生産された、請求項6〜8のいずれか一項に記載の抗体。
- 固相、および/または、シグナル発生システムの構成要素に結合した、請求項6〜9のいずれか一項に記載の抗体。
- 製薬上許容できる滅菌注射用液中の、請求項6〜9のいずれか一項に記載の抗体。
- 分析物、好ましくはF1+2を定量検出または定性検出する方法における、請求項6〜9のいずれか一項に記載の抗体の使用。
- アフィニティークロマトグラフィーにおける、請求項6〜9のいずれか一項に記載の抗体の使用。
- 診断補助物または診断補助物の成分としての、請求項6〜9および11のいずれか一項に記載の抗体の使用。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載の1つまたはそれ以上のペプチド、および/または、請求項6〜11のいずれか一項に記載の1またはそれ以上の抗体を含む試薬。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載の1つまたはそれ以上のペプチド、および/または
、請求項6〜11のいずれか一項に記載の1つまたはそれ以上の抗体、および/または、請求項15に記載の試薬を含む試験キット。 - 請求項6〜9のいずれか一項に記載の抗体を生産する、動物、植物または原核細胞、および、単離されたヒト細胞。
- 請求項17に記載のハイブリドーマ細胞株。
- DSMZに、寄託番号DSM ACC2607で寄託された、請求項18に記載のハイブリドーマ細胞株。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載の1つまたはそれ以上のペプチド、および/または、請求項6〜11のいずれか一項に記載の1つまたはそれ以上の抗体を用いて、サンプル中のプロトロンビンのフラグメントF1+2および/またはF2を定量検出または定性検出する方法。
- 請求項6〜11のいずれか一項に記載の抗体を、エピトープがF2およびF1+2フラグメントの4個のカルボキシ末端アミノ酸を含む抗体と組み合わせて用いる、請求項20に記載の方法。
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