JP2002524072A - ヒトプロトロンビン由来の内皮細胞増殖抑制剤 - Google Patents
ヒトプロトロンビン由来の内皮細胞増殖抑制剤Info
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- C12Y304/21005—Thrombin (3.4.21.5)
Abstract
(57)【要約】
抗内皮細胞増殖及び抗腫瘍活性を有するヒトプロトロンビンクリングル−１及び２と、ヒトプロトロンビン由来のヒトプロトロンビンクリングル−１及び２をコードするｃＤＮＡと、このｃＤＮＡを含む組換え型発現ベクターと、ヒトプロトロンビンクリングル−１又は２をコードするｃＤＮＡを含む組換え型発現ベクターで形質転換された組換え型微生物と、ヒト血漿からヒトプロトロンビンクリングル−１及び２、及び組換え型微生物から組換え型ヒトプロトロンビンクリングル−２を製造する方法と、前記タンパク質の薬学的用途を提供する。
Description
【０００１】 本発明は抗内皮細胞増殖性及び抗腫瘍活性を有するヒトプロトロンビンクリン
グル−１及び２に関するもので、より詳しくはヒトプロトロンビン由来のヒトプ
ロトロンビンクリングル−１及び２をコードするｃＤＮＡ、このｃＤＮＡを含む
組換え型発現ベクター、ヒトプロトロンビンクリングル−１又は２をコードする
前記遺伝子を含む組換え型発現ベクターで形質転換された組換え型微生物、ヒト
血漿からヒトプロトロンビンクリングル−１又は２を調合し組換え型微生物から
組換え型ヒトプロトロンビンクリングル−２を製造する方法、及び前記タンパク
質の薬学的適用に関するものである。
グル−１及び２に関するもので、より詳しくはヒトプロトロンビン由来のヒトプ
ロトロンビンクリングル−１及び２をコードするｃＤＮＡ、このｃＤＮＡを含む
組換え型発現ベクター、ヒトプロトロンビンクリングル−１又は２をコードする
前記遺伝子を含む組換え型発現ベクターで形質転換された組換え型微生物、ヒト
血漿からヒトプロトロンビンクリングル−１又は２を調合し組換え型微生物から
組換え型ヒトプロトロンビンクリングル−２を製造する方法、及び前記タンパク
質の薬学的適用に関するものである。
【０００２】 血液の凝固は繊維素プラグの最終形成による血小板及び凝固因子の活性化の原
因となる血管損傷の反応である。幾つかの凝固因子は正常生合成用のビタミンＫ
を必要とするセリンプロテアーゼの酵素前駆体である。これらプロテアーゼの活
性形態とその補因子は、皮膜束縛高分子複合体を形成する。最終段階で、プロト
ロンビンは、プロテアーゼによりトロンビンに活性化される。その後、トロンビ
ンは、フィブリノゲン内の指定ペプチド結合を切断して、不溶性のフィブリンス
トランドに重合されるフィブリンモノマーが形成されるようになる。凝固及び抗
凝固プロテアーゼ、因子VII、IX及びＸ、並びにタンパク質Ｃは、表皮増殖因子
（“ＥＧＦ”）と一致する二つの領域に続くＮ末端部のガンマ−カルボキシグル
タミン酸（“Ｇｌａ”）含有領域をもつ共通領域を有する反面、各タンパク質の
Ｃ末端半分部はトリプシン様セリンプロテアーゼ領域により占有される。
因となる血管損傷の反応である。幾つかの凝固因子は正常生合成用のビタミンＫ
を必要とするセリンプロテアーゼの酵素前駆体である。これらプロテアーゼの活
性形態とその補因子は、皮膜束縛高分子複合体を形成する。最終段階で、プロト
ロンビンは、プロテアーゼによりトロンビンに活性化される。その後、トロンビ
ンは、フィブリノゲン内の指定ペプチド結合を切断して、不溶性のフィブリンス
トランドに重合されるフィブリンモノマーが形成されるようになる。凝固及び抗
凝固プロテアーゼ、因子VII、IX及びＸ、並びにタンパク質Ｃは、表皮増殖因子
（“ＥＧＦ”）と一致する二つの領域に続くＮ末端部のガンマ−カルボキシグル
タミン酸（“Ｇｌａ”）含有領域をもつ共通領域を有する反面、各タンパク質の
Ｃ末端半分部はトリプシン様セリンプロテアーゼ領域により占有される。
【０００３】 プロトロンビン、つまり５８１アミノ酸を有する７２ｋＤａの糖タンパク質は
プロトロンビナーゼのタンパク質分解能と、プロテアーゼ因子Ｘａ、補因子カル
シウム、因子Ｖａ及び膜面からなる酵素複合体により荷電膜上のトロンビンに形
質転換される（マン(Mann), K.G.ら, Ann. Rev. Biochem., 57:915〜956(1988)
；マン(Mann), K.G.ら, Blood, 76:1〜16(1990)参照）。他の凝固及び抗凝固プ
ロテアーゼと同様に、プロトロンビンは他の血漿セリンプロテアーゼで発見され
た領域と相同である幾つかの別個の機能領域に編成される。プロトロンビン内の
機能領域はＧｌａ領域（残基１ないし４４）、二つの隣接クリングル領域（残基
４５ないし１５５及び残基１５６ないし２７３）、及びカルボキシル−末端領域
内のセリンプロテアーゼ触媒領域（残基２７４ないし５８１）からなっている（
マン(Mann), K.G., Methods Enzymol., 45:123-156(1976)参照）。
プロトロンビナーゼのタンパク質分解能と、プロテアーゼ因子Ｘａ、補因子カル
シウム、因子Ｖａ及び膜面からなる酵素複合体により荷電膜上のトロンビンに形
質転換される（マン(Mann), K.G.ら, Ann. Rev. Biochem., 57:915〜956(1988)
；マン(Mann), K.G.ら, Blood, 76:1〜16(1990)参照）。他の凝固及び抗凝固プ
ロテアーゼと同様に、プロトロンビンは他の血漿セリンプロテアーゼで発見され
た領域と相同である幾つかの別個の機能領域に編成される。プロトロンビン内の
機能領域はＧｌａ領域（残基１ないし４４）、二つの隣接クリングル領域（残基
４５ないし１５５及び残基１５６ないし２７３）、及びカルボキシル−末端領域
内のセリンプロテアーゼ触媒領域（残基２７４ないし５８１）からなっている（
マン(Mann), K.G., Methods Enzymol., 45:123-156(1976)参照）。
【０００４】 プロトロンビナーゼ複合体の因子Ｘａは、プロトロンビンを二つのペプチド結
合部、すなわち、一方がＡｒｇ２７３とＴｈｒ２７４との間で、もう一方がＡｒ
ｇ３２２とＩｌｅ３２３との間で切断して、フラグメント１−２と命名されたア
ミノ末端フラグメント（残基１ないし２７３）とカルボキシ末端活性トロンビン
（残基２７４ないし５８１）を生じる。活性化中に形成されたトロンビンは、フ
ラグメント１−２をＧｌａ領域とクリングル−１領域を含むフラグメント１（残
基１ないし１５５）と、クリングル−２を含むフラグメント２（残基１５６ない
し２７３）にさらに切断する（マン(Mann), K.G., Methods Enzymol., 45:123-1
56(1976)；タネダ(Taneda), H. et al., J. Biochem.(Tokyo), 116:589-597(199
4)参照）。
合部、すなわち、一方がＡｒｇ２７３とＴｈｒ２７４との間で、もう一方がＡｒ
ｇ３２２とＩｌｅ３２３との間で切断して、フラグメント１−２と命名されたア
ミノ末端フラグメント（残基１ないし２７３）とカルボキシ末端活性トロンビン
（残基２７４ないし５８１）を生じる。活性化中に形成されたトロンビンは、フ
ラグメント１−２をＧｌａ領域とクリングル−１領域を含むフラグメント１（残
基１ないし１５５）と、クリングル−２を含むフラグメント２（残基１５６ない
し２７３）にさらに切断する（マン(Mann), K.G., Methods Enzymol., 45:123-1
56(1976)；タネダ(Taneda), H. et al., J. Biochem.(Tokyo), 116:589-597(199
4)参照）。
【０００５】 血液凝固におけるプロトロンビンのトロンビンへの形質転換の方法が集中的に
研究されているが、プロトロンビンフラグメント１及び２の正確な役割は、高分
子構築のための認識要素及び構造単位を除き、不明瞭なままである（フーバー(H
oover), G.J.ら, Biochemistry, 32:10936-10943(1993)参照）。
研究されているが、プロトロンビンフラグメント１及び２の正確な役割は、高分
子構築のための認識要素及び構造単位を除き、不明瞭なままである（フーバー(H
oover), G.J.ら, Biochemistry, 32:10936-10943(1993)参照）。
【０００６】 クリングルは、血液凝固及びフィブリン溶解に携わるセリンプロテアーゼにお
いてみられる２次構造の特徴的な三つの二硫化物結合を有する小さいタンパク質
領域である（フーリエ(Furie), B. and フーリエ(Furie), B.C., Cell, 53:505-
518(1988)参照）。また、このクリングル領域は、アポリポタンパク質及び肝細
胞増殖因子（ＨＧＦ）と同様に、プロテアーゼとは異なる生物学的機能を有する
そのほかのタンパク質でも発見された（イケオ(Ikeo), K. ら, J. Mol. Evol.,
40:331-336(1995)参照）。デセラノ(DeSerrano)らは、これらのクリングル領域
が個々のフォールディング単位にみられることを提案したが、クリングルに対す
る一般的な機能役割は知られていない（デセラノ(DeSerrano), V.S.ら, Arch. B
iochem. Biophys., 294:282-290(1992)参照）。プラスミノゲンクリングル−１
及び４領域の場合、これらはプラスミノゲンのフィブリンへの結合に関与される
ことが知られていた（バリ(Vali), Z.ら, J. Biol. Chem., 259:13690-13694(19
84)参照）。これらクリングル領域は、露出したリジン側鎖と結合することによ
りフィブリンと相互作用するものと推定されている。しかし、プロトロンビンク
リングル領域は、非常に類似したアミノ酸配列にもかかわらず、リジン−セファ
ロースカラムに吸着されないと報告された（アーニ(Arni), R.K.ら, Biochemist
ry, 32:4727-4737(1993)参照）。
いてみられる２次構造の特徴的な三つの二硫化物結合を有する小さいタンパク質
領域である（フーリエ(Furie), B. and フーリエ(Furie), B.C., Cell, 53:505-
518(1988)参照）。また、このクリングル領域は、アポリポタンパク質及び肝細
胞増殖因子（ＨＧＦ）と同様に、プロテアーゼとは異なる生物学的機能を有する
そのほかのタンパク質でも発見された（イケオ(Ikeo), K. ら, J. Mol. Evol.,
40:331-336(1995)参照）。デセラノ(DeSerrano)らは、これらのクリングル領域
が個々のフォールディング単位にみられることを提案したが、クリングルに対す
る一般的な機能役割は知られていない（デセラノ(DeSerrano), V.S.ら, Arch. B
iochem. Biophys., 294:282-290(1992)参照）。プラスミノゲンクリングル−１
及び４領域の場合、これらはプラスミノゲンのフィブリンへの結合に関与される
ことが知られていた（バリ(Vali), Z.ら, J. Biol. Chem., 259:13690-13694(19
84)参照）。これらクリングル領域は、露出したリジン側鎖と結合することによ
りフィブリンと相互作用するものと推定されている。しかし、プロトロンビンク
リングル領域は、非常に類似したアミノ酸配列にもかかわらず、リジン−セファ
ロースカラムに吸着されないと報告された（アーニ(Arni), R.K.ら, Biochemist
ry, 32:4727-4737(1993)参照）。
【０００７】 このように、明らかに非常に類似したポリペプチドの異なる様々な特性のため
、最近の成果が組換え型ＤＮＡ技術を適用してクリングル領域を表現し得るよう
にし、かつ、その構造−機能関係を理解しようと試みられるようにした（デサラ
ノ(Desarrano), V.S.ら, Arch. Biochem. Biophys., 294:282-290(1992)参照）
。
、最近の成果が組換え型ＤＮＡ技術を適用してクリングル領域を表現し得るよう
にし、かつ、その構造−機能関係を理解しようと試みられるようにした（デサラ
ノ(Desarrano), V.S.ら, Arch. Biochem. Biophys., 294:282-290(1992)参照）
。
【０００８】 一方、カオ(Cao)らは、ヒトプラスミノゲンクリングルの各領域が抗癌剤とし
て適用できる抗毛細血管内皮細胞増殖活性を示したと報告した（カオ(Cao), Y.
ら, J. Biol. Chem., 271:29461-29467(1996)；ボーエム(Boehm), T.ら, Nature
, 390:404-407(1997)参照）。また、組換え型ウサギのプロトロンビンクリング
ル−２領域はアンギオスタチン（angiostatin）同様の強力な内皮細胞増殖抑制
活性を有することが立証された（リー(Lee), T.H.ら, J. Biol. Chem., 273:288
05-28812(1998)参照）。
て適用できる抗毛細血管内皮細胞増殖活性を示したと報告した（カオ(Cao), Y.
ら, J. Biol. Chem., 271:29461-29467(1996)；ボーエム(Boehm), T.ら, Nature
, 390:404-407(1997)参照）。また、組換え型ウサギのプロトロンビンクリング
ル−２領域はアンギオスタチン（angiostatin）同様の強力な内皮細胞増殖抑制
活性を有することが立証された（リー(Lee), T.H.ら, J. Biol. Chem., 273:288
05-28812(1998)参照）。
【０００９】 その上、アンギオスタチン、すなわち体外での内皮細胞増殖を抑制し体内での
腫瘍の移転を抑制する血管形成抑制剤は、プラスミノゲンの四つの第１クリング
ル領域（１−４クリングル領域）からなると報告された（オーレリィ(O'Reilly)
, M.S.ら, Cell, 79:315-328(1994)参照）。
腫瘍の移転を抑制する血管形成抑制剤は、プラスミノゲンの四つの第１クリング
ル領域（１−４クリングル領域）からなると報告された（オーレリィ(O'Reilly)
, M.S.ら, Cell, 79:315-328(1994)参照）。
【００１０】 内皮細胞の増殖は、血管形成過程（angiogenesis）と密接な関係があり、血管
形成過程は腫瘍の増殖及び維持に非常に必要である（フォルクマン(Folkman), J
., Nat. Med., 1:27-31(1995)参照）。血管形成過程は、現存の血管から新しい
血管が成長する血管形成の過程である。毛細血管は主に生理的条件で成熟した哺
乳動物に正常に静止状態の内皮細胞から構成される。血管形成過程は、胚芽発達
、創傷治癒、組織再生、及び器官再生などの多様な生理的過程に必要である。病
理条件で新たな血管の早期成長は腫瘍増殖、糖尿病網膜症、組織及び器官の奇形
、及び心血管疾患の原因となり得る（フォルクマン(Folkman), J.ら, J. Biol.
Chem., 267:10931-10934(1992)参照）。
形成過程は腫瘍の増殖及び維持に非常に必要である（フォルクマン(Folkman), J
., Nat. Med., 1:27-31(1995)参照）。血管形成過程は、現存の血管から新しい
血管が成長する血管形成の過程である。毛細血管は主に生理的条件で成熟した哺
乳動物に正常に静止状態の内皮細胞から構成される。血管形成過程は、胚芽発達
、創傷治癒、組織再生、及び器官再生などの多様な生理的過程に必要である。病
理条件で新たな血管の早期成長は腫瘍増殖、糖尿病網膜症、組織及び器官の奇形
、及び心血管疾患の原因となり得る（フォルクマン(Folkman), J.ら, J. Biol.
Chem., 267:10931-10934(1992)参照）。
【００１１】 それゆえ、クリングル領域に関連する抗内皮細胞増殖分子についての広い研究
が行われてきた。この点について、腫瘍の内皮細胞に対する抗血管形成療法は、
薬物耐性を殆ど誘発しないため、ヒトプロトロンビンフラグメント１及び２は癌
治療の最も有望な候補として提案された。
が行われてきた。この点について、腫瘍の内皮細胞に対する抗血管形成療法は、
薬物耐性を殆ど誘発しないため、ヒトプロトロンビンフラグメント１及び２は癌
治療の最も有望な候補として提案された。
【００１２】 本発明者らは、ヒトの血漿からヒトプロトロンビンクリングル−１及び２を単
離させ、そのクリングル領域が抗内皮細胞増殖作用を有することを示した。その
後、本発明者らは、ヒトプロトロンビンクリングル−１及び２をコードするｃＤ
ＮＡ、すなわちｃＤＮＡを含む組換え型発現ベクターを構築し、この組換え型ヒ
トプロトロンビンクリングル−２が体内での抗腫瘍活性を有することを立証した
。さらに、本発明者らは、ヒトプロトロンビンクリングル−２のアミノ酸配列を
有するペプチドを合成し内皮細胞増殖抑制のための活性領域を決定した。したが
って、本発明者らは前記タンパク質又はペプチドを抗腫瘍剤の開発に適用され得
ることを見出した。
離させ、そのクリングル領域が抗内皮細胞増殖作用を有することを示した。その
後、本発明者らは、ヒトプロトロンビンクリングル−１及び２をコードするｃＤ
ＮＡ、すなわちｃＤＮＡを含む組換え型発現ベクターを構築し、この組換え型ヒ
トプロトロンビンクリングル−２が体内での抗腫瘍活性を有することを立証した
。さらに、本発明者らは、ヒトプロトロンビンクリングル−２のアミノ酸配列を
有するペプチドを合成し内皮細胞増殖抑制のための活性領域を決定した。したが
って、本発明者らは前記タンパク質又はペプチドを抗腫瘍剤の開発に適用され得
ることを見出した。
【００１３】 したがって、本発明の第１目的は、抗内皮細胞増殖及び抗腫瘍活性を有するヒ
トプロトロンビンクリングル−１及び２を提供することである。
トプロトロンビンクリングル−１及び２を提供することである。
【００１４】 本発明の第２目的は、前記ヒトプロトロンビンクリングル−１及び２をコード
するｃＤＮＡ配列を提供することである。
するｃＤＮＡ配列を提供することである。
【００１５】 本発明の第３目的は、前記ｃＤＮＡを含む組換え型発現ベクターを提供するこ
とである。
とである。
【００１６】 本発明の第４目的は、ヒトプロトロンビンクリングル−２を発現する前記組換
え型発現ベクターで形質転換された組換え型微生物を提供することである。
え型発現ベクターで形質転換された組換え型微生物を提供することである。
【００１７】 本発明の第５目的は、ヒトプロトロンビンのヒトプロトロンビンクリングル−
２から由来した、内皮細胞の増殖を抑制するペプチドを提供することである。
２から由来した、内皮細胞の増殖を抑制するペプチドを提供することである。
【００１８】 本発明の第６目的は、ヒト血漿からヒトプロトロンビンクリングル−１及び２
を、前記組換え型微生物から組換え型ヒトプロトロンビンクリングル−２を製造
する方法を提供することである。
を、前記組換え型微生物から組換え型ヒトプロトロンビンクリングル−２を製造
する方法を提供することである。
【００１９】 本発明の第７目的は、プロトロンビンクリングル−１、２の活性成分又はその
機能的に同等なペプチドを含む抗腫瘍剤を提供することである。
機能的に同等なペプチドを含む抗腫瘍剤を提供することである。
【００２０】 本発明の上記並びにその他の目的及び特徴は添付図面と共に与えられる以後の
説明から明らかになるであろう。 図１は、ヒト血漿からＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し精製したヒトプロトロンビン
誘導体を示す写真である。図２は、ヒトプロトロンビン及びその誘導体のウェス
タンブロット分析を示す写真である。図３は、ヒトプロトロンビン及びその誘導
体の内皮細胞増殖抑制作用を示すグラフである。図４は、ＣＡＭに対するヒトプ
ロトロンビンクリングル−１及び２の抗血管形成効果を示す。図５はヒトプロト
ロンビンクリングル−２の腫瘍増殖の抑制を示す写真である。図６はヒトプロト
ロンビンクリングル−２の腫瘍増殖の抑制を示すグラフである。
説明から明らかになるであろう。 図１は、ヒト血漿からＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し精製したヒトプロトロンビン
誘導体を示す写真である。図２は、ヒトプロトロンビン及びその誘導体のウェス
タンブロット分析を示す写真である。図３は、ヒトプロトロンビン及びその誘導
体の内皮細胞増殖抑制作用を示すグラフである。図４は、ＣＡＭに対するヒトプ
ロトロンビンクリングル−１及び２の抗血管形成効果を示す。図５はヒトプロト
ロンビンクリングル−２の腫瘍増殖の抑制を示す写真である。図６はヒトプロト
ロンビンクリングル−２の腫瘍増殖の抑制を示すグラフである。
【００２１】 本発明者らは、ヒト血漿からクリングル領域を含むヒトプロトロンビンフラグ
メント１及び２を単離し、このフラグメントが抗内皮細胞増殖活性を有すること
を示した。以下に、クリングル領域を含む前記ヒトプロトロンビンフラグメント
１及び２はそれぞれ“ヒトプロトロンビンクリングル−１”と“ヒトプロトロン
ビンクリングル−２”という。
メント１及び２を単離し、このフラグメントが抗内皮細胞増殖活性を有すること
を示した。以下に、クリングル領域を含む前記ヒトプロトロンビンフラグメント
１及び２はそれぞれ“ヒトプロトロンビンクリングル−１”と“ヒトプロトロン
ビンクリングル−２”という。
【００２２】 ヒトプロトロンビンをクエン酸バリウム沈殿とイオン交換クロマトグラフィで
ヒト血漿から単離した。因子Ｘａで処理した各タンパク質分解フラグメントをモ
ノ−キュー（Mono-Q）カラムクロマトグラフィを用いて均質に精製しＮ−末端ア
ミノ配列分析によって確認した。
ヒト血漿から単離した。因子Ｘａで処理した各タンパク質分解フラグメントをモ
ノ−キュー（Mono-Q）カラムクロマトグラフィを用いて均質に精製しＮ−末端ア
ミノ配列分析によって確認した。
【００２３】 抗ヒトプロトロンビンクリングル−２抗体を使用するウェスタンブロット及び
免疫沈降分析において、ヒトプロトロンビンクリングル−１はヒトプロトロンビ
ンフラグメント２との何の免疫的関係も示していなかった。また、抗アンギオス
タチン抗体も何のプロトロンビンフラグメントとも反応しなかった。
免疫沈降分析において、ヒトプロトロンビンクリングル−１はヒトプロトロンビ
ンフラグメント２との何の免疫的関係も示していなかった。また、抗アンギオス
タチン抗体も何のプロトロンビンフラグメントとも反応しなかった。
【００２４】 精製されたプロトロンビン及びその誘導体の抗増殖効果を評価するため、プロ
トロンビンのタンパク質分解切断後に精製されたヒトプロトロンビンのタンパク
質分解フラグメントをｂＦＧＦにより刺激されたＢＣＥ細胞増殖に対する抑制活
性について検定した。ヒトプロトロンビンクリングル−２だけでなくプロトロン
ビンクリングル−１も用量依存方式で、ｂＦＧＦ刺激された内皮細胞の増殖を抑
制した。さらに、プロトロンビンクリングル−１又は２の除去後、ＢＣＥ細胞に
対する抑制効果は反転できる。しかしアンギオスタチン（クリングル１−４領域
を含むプラスミノゲンのタンパク質分解フラグメント）と同様に、完全なプロト
ロンビンは抗内皮細胞増殖効果を有していなかった。ヒトプロトロンビンクリン
グル−１及び２の血管形成抑制活性もヒヨコの漿尿膜（ＣＡＭ）検定を用いて体
内で立証した。
トロンビンのタンパク質分解切断後に精製されたヒトプロトロンビンのタンパク
質分解フラグメントをｂＦＧＦにより刺激されたＢＣＥ細胞増殖に対する抑制活
性について検定した。ヒトプロトロンビンクリングル−２だけでなくプロトロン
ビンクリングル−１も用量依存方式で、ｂＦＧＦ刺激された内皮細胞の増殖を抑
制した。さらに、プロトロンビンクリングル−１又は２の除去後、ＢＣＥ細胞に
対する抑制効果は反転できる。しかしアンギオスタチン（クリングル１−４領域
を含むプラスミノゲンのタンパク質分解フラグメント）と同様に、完全なプロト
ロンビンは抗内皮細胞増殖効果を有していなかった。ヒトプロトロンビンクリン
グル−１及び２の血管形成抑制活性もヒヨコの漿尿膜（ＣＡＭ）検定を用いて体
内で立証した。
【００２５】 本発明者らは、ヒトプロトロンビン由来のヒトプロトロンビンクリングル−１
及び２をコードするｃＤＮＡを大腸菌発現ベクターｐＥＴ２２ｂ+（ノバーゲン(
Novagen),米国）にクローニングした。プロトロンビンクリングル−１及びプロ
トロンビンクリングル−２をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターをそれぞれ
“ｐＥＦ−ｈｋ１”及び“ｐＥＦ−ｈｋ２”と称した。ｐＥＦ−ｈｋ２で形質転
換された大腸菌を“E.coli BL21(DE3)/pLysS,phEF13”と称し、１９９９年８月
１４日、受託番号ＫＣＣＭ−１０１３９として韓国微生物培養センター（ＫＣＣ
Ｍ、韓国ソウル特別市西大門区延世大学校、工科大学、食品工学科）、国際寄託
当局に寄託した。
及び２をコードするｃＤＮＡを大腸菌発現ベクターｐＥＴ２２ｂ+（ノバーゲン(
Novagen),米国）にクローニングした。プロトロンビンクリングル−１及びプロ
トロンビンクリングル−２をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターをそれぞれ
“ｐＥＦ−ｈｋ１”及び“ｐＥＦ−ｈｋ２”と称した。ｐＥＦ−ｈｋ２で形質転
換された大腸菌を“E.coli BL21(DE3)/pLysS,phEF13”と称し、１９９９年８月
１４日、受託番号ＫＣＣＭ−１０１３９として韓国微生物培養センター（ＫＣＣ
Ｍ、韓国ソウル特別市西大門区延世大学校、工科大学、食品工学科）、国際寄託
当局に寄託した。
【００２６】 組換え型プロトロンビンクリングル−２の精製のため、培養されたE.coli BL2
1(DE3)/pLysS,phEF13の粗抽出物を、ＤＥＡＥ−セファロース(Sepharose)及びセ
ファクリル(Sephacryl) S-200カラムでクロマトグラフィ分析した。組換え型プ
ロトロンビンクリングル−２は体内での腫瘍増殖を抑制することが立証された。
1(DE3)/pLysS,phEF13の粗抽出物を、ＤＥＡＥ−セファロース(Sepharose)及びセ
ファクリル(Sephacryl) S-200カラムでクロマトグラフィ分析した。組換え型プ
ロトロンビンクリングル−２は体内での腫瘍増殖を抑制することが立証された。
【００２７】 ヒトプロトロンビンクリングル−２の内皮細胞増殖抑制のための活性領域を決
定するため、本発明者らは、プロトロンビンクリングル−２の１５個又は９個の
アミノ酸からなる１１個のペプチドを合成した。プロトロンビンクリングル−２
のＮ末端配列から適当なアミノ酸配列を有するペプチドをそのペプチドのＮ末端
及びＣ末端の２個ないし５個のアミノ酸を重複させることにより合成した。その
結果、本発明者らはヒトプロトロンビンクリングル−２の活性領域が第１１番目
のプロリンと第７０番目のアスパラギン酸間に位置することを見つけた。
定するため、本発明者らは、プロトロンビンクリングル−２の１５個又は９個の
アミノ酸からなる１１個のペプチドを合成した。プロトロンビンクリングル−２
のＮ末端配列から適当なアミノ酸配列を有するペプチドをそのペプチドのＮ末端
及びＣ末端の２個ないし５個のアミノ酸を重複させることにより合成した。その
結果、本発明者らはヒトプロトロンビンクリングル−２の活性領域が第１１番目
のプロリンと第７０番目のアスパラギン酸間に位置することを見つけた。
【００２８】 以下、本発明を本発明の範囲を限定しない以下の実施例でさらに説明する。 実施例１：ヒトプロトロンビンの精製及びそのプロトロンビンのタンパク質分
解フラグメント バイスタイン(Weinstein)らの改良方法により、ヒト血漿から完全なヒトプロ
トロンビンが精製された（バイスタイン(Weinstein), R.E. ら, Thromb. Res.,
59:759-772(1990)）。クエン酸ナトリウムを濃度が０．８５％（ｗ／ｖ）となる
まで添加して血液の凝固を防止し得るようにし、１，０００ｘｇで３０分間遠心
分離して残留血液細胞及び溶解されていない材料を除去し得るようにした。その
後、ベンズアミジン−ＨＣｌ及びＰ−ＰＡＣＫ（D-phenylalanyl-L-prolyl-L-ar
ginine chloromethyl ketone）をそれぞれ濃度が５ｍＭ及び１Ｍとなるように添
加し、１０ｇのＱＭＡ Acell（ファルマシア(Pharmacia)、スウェーデン）樹脂
をイオン交換クロマトグラフィのために添加した。この混合物を室温で１時間培
養し２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファ（ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ
、５ｍＭのベンズアミジン−ＨＣｌ及び１μＭのＰ−ＰＡＣＫを含む）で洗浄し
た。単離されたタンパク質を２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５、
０．６ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのベンズアミジン−ＨＣｌ及び１μＭのＰ−ＰＡＣ
Ｋを含む）で溶出させた。この溶出されたタンパク質を塩化バリウムで沈殿させ
、４℃でＴｒｉｓ緩衝液（１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０
ｍＭのＮａＣｌ及び１ｍＭのＣａＣｌ2を含む）に対して一晩透析し、ＳＤＳ−
ＰＡＧＥで分析した（参照：図１）。
解フラグメント バイスタイン(Weinstein)らの改良方法により、ヒト血漿から完全なヒトプロ
トロンビンが精製された（バイスタイン(Weinstein), R.E. ら, Thromb. Res.,
59:759-772(1990)）。クエン酸ナトリウムを濃度が０．８５％（ｗ／ｖ）となる
まで添加して血液の凝固を防止し得るようにし、１，０００ｘｇで３０分間遠心
分離して残留血液細胞及び溶解されていない材料を除去し得るようにした。その
後、ベンズアミジン−ＨＣｌ及びＰ−ＰＡＣＫ（D-phenylalanyl-L-prolyl-L-ar
ginine chloromethyl ketone）をそれぞれ濃度が５ｍＭ及び１Ｍとなるように添
加し、１０ｇのＱＭＡ Acell（ファルマシア(Pharmacia)、スウェーデン）樹脂
をイオン交換クロマトグラフィのために添加した。この混合物を室温で１時間培
養し２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファ（ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ
、５ｍＭのベンズアミジン−ＨＣｌ及び１μＭのＰ−ＰＡＣＫを含む）で洗浄し
た。単離されたタンパク質を２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５、
０．６ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのベンズアミジン−ＨＣｌ及び１μＭのＰ−ＰＡＣ
Ｋを含む）で溶出させた。この溶出されたタンパク質を塩化バリウムで沈殿させ
、４℃でＴｒｉｓ緩衝液（１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０
ｍＭのＮａＣｌ及び１ｍＭのＣａＣｌ2を含む）に対して一晩透析し、ＳＤＳ−
ＰＡＧＥで分析した（参照：図１）。
【００２９】 プロトロンビン誘導体の単離のため、１０ｍｇの精製プロトロンビンを２３℃
の水槽内で一晩因子Ｘａ（シグマケミカル社(Sigma Chemical Co.), 米国）で培
養し、４℃で４時間のうちに１００ｍＭのＮａＣｌ及び１ｍＭのＰＭＳＦを含む
１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌに対して透析した。この溶液を１ｍＭのＰＭＳＦを
含む５０ｍＭのＮａＰｉ、ｐＨ７．０に対してもう一度透析した。各タンパク質
フラグメントを出発緩衝液である５０ｍＭのＮａＰｉ、ｐＨ７．０で予め均衡化
されたＭｏｎｏ−Ｑカラムを使用して均質に精製し、５０ｍＭのＮａＰｉ内で０
．１ＭのＮａＣｌの線形濃度勾配で溶出させ、Ｎ末端アミノ配列分析により確認
した。
の水槽内で一晩因子Ｘａ（シグマケミカル社(Sigma Chemical Co.), 米国）で培
養し、４℃で４時間のうちに１００ｍＭのＮａＣｌ及び１ｍＭのＰＭＳＦを含む
１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌに対して透析した。この溶液を１ｍＭのＰＭＳＦを
含む５０ｍＭのＮａＰｉ、ｐＨ７．０に対してもう一度透析した。各タンパク質
フラグメントを出発緩衝液である５０ｍＭのＮａＰｉ、ｐＨ７．０で予め均衡化
されたＭｏｎｏ−Ｑカラムを使用して均質に精製し、５０ｍＭのＮａＰｉ内で０
．１ＭのＮａＣｌの線形濃度勾配で溶出させ、Ｎ末端アミノ配列分析により確認
した。
【００３０】 図１に示すように、因子Ｘａで一晩消化させた後、四つの主バンド、すなわち
プロトロンビン、トロンビン、プロトロンビンクリングル−１（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１）及びプロトロンビンクリングル−２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）をＳＤＳ
ゲル電気泳動で観察した（図１参照：１：精製プロトロンビン、２：因子Ｘａ
で消化、３：トロンビン、４：プロトロンビンクリングル−１、５：プロトロン
ビンクリングル−２）。アミノ酸配列から計算した分子量と比較してみると（１
７ｋＤａ及び１３ｋＤａ）、プロトロンビンクリングル−１及び２をＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥでそれぞれ３０ｋＤａ及び１９ｋＤａの高分子量で移動させた。この現象
はウサギプロトロンビンクリングル−２及びヒトアンギオスタチンクリングル−
１などのクリングル領域を含む幾つかの抗内皮細胞増殖分子に共通である（リー
(Lee), T.H.ら, J. Biol. Chem., 273:28805-27712(1998)；カオ(Cao), Y.ら, J
. Biol. Chem., 271:29461-29467(1996)参照）。
プロトロンビン、トロンビン、プロトロンビンクリングル−１（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１）及びプロトロンビンクリングル−２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）をＳＤＳ
ゲル電気泳動で観察した（図１参照：１：精製プロトロンビン、２：因子Ｘａ
で消化、３：トロンビン、４：プロトロンビンクリングル−１、５：プロトロン
ビンクリングル−２）。アミノ酸配列から計算した分子量と比較してみると（１
７ｋＤａ及び１３ｋＤａ）、プロトロンビンクリングル−１及び２をＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥでそれぞれ３０ｋＤａ及び１９ｋＤａの高分子量で移動させた。この現象
はウサギプロトロンビンクリングル−２及びヒトアンギオスタチンクリングル−
１などのクリングル領域を含む幾つかの抗内皮細胞増殖分子に共通である（リー
(Lee), T.H.ら, J. Biol. Chem., 273:28805-27712(1998)；カオ(Cao), Y.ら, J
. Biol. Chem., 271:29461-29467(1996)参照）。
【００３１】 実施例２：ヒトプロトロンビンクリングル−１及び２間の免疫関係 トービン(Towbin)らの方法によりウェスタンブロット分析を実施した（トービ
ン(Towbin), H.ら, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 76:4350-4354(1979)参照）
。タンパク質を１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画し、ニトロセルロース膜（アメ
ルシャムファルマシアバイオテック社製(Amersham Pharmacia Biotech, Inc.),
米国）に転送した。ブロットを１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むリン
酸緩衝生理食塩水で１時間ブロッキングさせ、一次抗体として抗プロトロンビン
クリングル−２抗体（１０ｍｇ／ｍｌ）により２時間のうちに室温で培養した。
この開放された一次抗体を洗浄緩衝液（０．５％のnonidet P-40を含むＰＢＳ）
で１０分間３回洗浄した後、各ニトロセルロースフィルタを３０分間ペルオキシ
ダーゼ共役化された抗ネズミIgG（シグマケミカル社(Sigma Chemical Co.), 米
国）で培養した。開放された２次抗体を洗浄緩衝液で洗浄した後、４−クロロ−
１−ナフトール溶液で染色した。
ン(Towbin), H.ら, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 76:4350-4354(1979)参照）
。タンパク質を１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画し、ニトロセルロース膜（アメ
ルシャムファルマシアバイオテック社製(Amersham Pharmacia Biotech, Inc.),
米国）に転送した。ブロットを１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むリン
酸緩衝生理食塩水で１時間ブロッキングさせ、一次抗体として抗プロトロンビン
クリングル−２抗体（１０ｍｇ／ｍｌ）により２時間のうちに室温で培養した。
この開放された一次抗体を洗浄緩衝液（０．５％のnonidet P-40を含むＰＢＳ）
で１０分間３回洗浄した後、各ニトロセルロースフィルタを３０分間ペルオキシ
ダーゼ共役化された抗ネズミIgG（シグマケミカル社(Sigma Chemical Co.), 米
国）で培養した。開放された２次抗体を洗浄緩衝液で洗浄した後、４−クロロ−
１−ナフトール溶液で染色した。
【００３２】 抗ウサギプロトロンビンクリングル−２抗体がウサギプロトロンビンクリング
ル−１と反応しないということは既に知られている（リー(Lee), T.H.ら, J. Bi
ol. Chem., 273:28805-28812(1998)参照）。ウサギプロトロンビンクリングル−
１と同様に、ヒトプロトロンビンクリングル−１は抗ヒトプロトロンビンクリン
グル−２抗体を使用するウェスタンブロット分析でヒトプロトロンビンクリング
ル−２と免疫関係が全くないことを示した（図２参照 １：因子Ｘａで消化され
たプロトロンビン、２：トロンビン、３：プロトロンビンクリングル−１ 及び
４：プロトロンビンクリングル−２）。完全なプロトロンビン及びヒトプロトロ
ンビンクリングル−２のみが抗プロトロンビンクリングル−２抗体と反応した。
しかも、抗アンギオスタチン抗体はいずれのプロトロンビンフラグメントとも反
応しなかった。免疫沈降の結果はウェスタンブロット分析でと同じであったが、
これはプロトロンビンクリングル１及び２が免疫的に関係がなく、抗血管形成効
果と密接に関係があることを意味する。
ル−１と反応しないということは既に知られている（リー(Lee), T.H.ら, J. Bi
ol. Chem., 273:28805-28812(1998)参照）。ウサギプロトロンビンクリングル−
１と同様に、ヒトプロトロンビンクリングル−１は抗ヒトプロトロンビンクリン
グル−２抗体を使用するウェスタンブロット分析でヒトプロトロンビンクリング
ル−２と免疫関係が全くないことを示した（図２参照 １：因子Ｘａで消化され
たプロトロンビン、２：トロンビン、３：プロトロンビンクリングル−１ 及び
４：プロトロンビンクリングル−２）。完全なプロトロンビン及びヒトプロトロ
ンビンクリングル−２のみが抗プロトロンビンクリングル−２抗体と反応した。
しかも、抗アンギオスタチン抗体はいずれのプロトロンビンフラグメントとも反
応しなかった。免疫沈降の結果はウェスタンブロット分析でと同じであったが、
これはプロトロンビンクリングル１及び２が免疫的に関係がなく、抗血管形成効
果と密接に関係があることを意味する。
【００３３】 実施例３：内皮細胞増殖検定 精製プロトロンビン及びその誘導体の抗増殖効果を評価するため、ｂＦＧＦに
より刺激されたＢＣＥ細胞増殖に対する抑制活性についてヒトプロトロンビンの
タンパク質分解フラグメントを検定した。
より刺激されたＢＣＥ細胞増殖に対する抑制活性についてヒトプロトロンビンの
タンパク質分解フラグメントを検定した。
【００３４】 オーレリー(O'Reilly)らの方法により内皮細胞増殖検定を実施した（オーレリ
ー(O'Reilly), M.S.ら, Cell, 79:315-328(1994)参照）。１０％のＣＯ2雰囲気
で１０％の熱処理不活性化された子牛血清と３ｎｇ／ｍｌの組換え型ヒトｂＦＧ
Ｆを含むＤＭＥＭに牛の毛細血管内皮（“ＢＣＥ”）細胞を維持した。細胞をゼ
ラチンコーティングされたＴ７５フラスコで培養して３７℃で培養した。０．５
ｍｌ当たりおよそ１２，５００個の細胞をゼラチンコーティングされた２４ウェ
ルプレートの各ウェルに添加し、２４時間３７℃で培養した後、サンプルを各ウ
ェルに添加した。３０分間の培養後、最終体積が５％の子牛血清を含む０．５ｍ
ｌのＤＭＥＭとなるように培地を添加し、１ｎｇ／ｍｌの濃度にｂＦＧＦを添加
した。７２時間の培養後、細胞をトリプシンを用いて消化し、血球計算器を用い
て細胞数を決定した。観察される抑制活性がプレートから細胞が脱離することに
起因したものでないことを確認するため、細胞の計数前の細胞脱離の証として検
定の全てのウェルを反転顕微鏡で検査した。
ー(O'Reilly), M.S.ら, Cell, 79:315-328(1994)参照）。１０％のＣＯ2雰囲気
で１０％の熱処理不活性化された子牛血清と３ｎｇ／ｍｌの組換え型ヒトｂＦＧ
Ｆを含むＤＭＥＭに牛の毛細血管内皮（“ＢＣＥ”）細胞を維持した。細胞をゼ
ラチンコーティングされたＴ７５フラスコで培養して３７℃で培養した。０．５
ｍｌ当たりおよそ１２，５００個の細胞をゼラチンコーティングされた２４ウェ
ルプレートの各ウェルに添加し、２４時間３７℃で培養した後、サンプルを各ウ
ェルに添加した。３０分間の培養後、最終体積が５％の子牛血清を含む０．５ｍ
ｌのＤＭＥＭとなるように培地を添加し、１ｎｇ／ｍｌの濃度にｂＦＧＦを添加
した。７２時間の培養後、細胞をトリプシンを用いて消化し、血球計算器を用い
て細胞数を決定した。観察される抑制活性がプレートから細胞が脱離することに
起因したものでないことを確認するため、細胞の計数前の細胞脱離の証として検
定の全てのウェルを反転顕微鏡で検査した。
【００３５】 図３に示すように、ヒトプロトロンビンクリングル−２だけでなくプロトロン
ビンクリングル−１は投与依存方式でｂＦＧＦ刺激された内皮細胞増殖を抑制し
た（図３参照）。図３において、（■）はヒトプロトロンビンを示し、（◆）は
トロンビン、（×）はプロトロンビンクリングル−１、（▲）はプロトロンビン
クリングル−２をそれぞれ示す。
ビンクリングル−１は投与依存方式でｂＦＧＦ刺激された内皮細胞増殖を抑制し
た（図３参照）。図３において、（■）はヒトプロトロンビンを示し、（◆）は
トロンビン、（×）はプロトロンビンクリングル−１、（▲）はプロトロンビン
クリングル−２をそれぞれ示す。
【００３６】 ＢＣＥ細胞の形態は、調節細胞又はアンギオスタチン処理細胞に似ていると思
われた（リー(Lee), T.H.ら, J. Biol. Chem., 273:28805-28812(1998)；カオ(C
ao), Y.ら, J. Biol. Chem., 271:29461-29467(1996)参照）。その上、ＢＣＥ細
胞に対する抑制効果はプロトロンビンクリングル−１又は２の除去後におていは
可逆的であった。
われた（リー(Lee), T.H.ら, J. Biol. Chem., 273:28805-28812(1998)；カオ(C
ao), Y.ら, J. Biol. Chem., 271:29461-29467(1996)参照）。その上、ＢＣＥ細
胞に対する抑制効果はプロトロンビンクリングル−１又は２の除去後におていは
可逆的であった。
【００３７】 実施例４：ヒヨコ漿尿膜の検定 ヒトプロトロンビンクリングル−１及び２も体内血管形成過程を抑制するかを
調査するため、ヒヨコ漿尿膜（“ＣＡＭ”）検定を用いた。飼鶏の受精卵（韓国
、プーロン(Puluone)社製）を相対湿度７０％で、より屈曲の緩やかな端部を上
にした状態で培養した。３７℃、３％ＣＯ2雰囲気で３日間培養した後、精製プ
ロトロンビンクリングル−１又はプロトロンビンクリングル−２を含むメチルセ
ルロースディスク（フィッシャーサイエンティフィック(Fischer Scientific),
米国）を各胚芽のヒヨコ漿尿膜に適用した。このディスクは、テフロン（登録商 標）棒上でプロトロンビンクリングル−１又は２の存在又は不在下でＨ2Ｏ内の ０．４５％メチルセルロース１０ｍｌを乾燥させることにより製造された。４８ 時間の培養後、２０％の静脈注射用脂肪乳剤をヒヨコ胚芽の漿尿膜内に注射して 、血管の赤色が白色とはっきりと対照されるようにした。この脂肪乳剤の注入後 、実体顕微鏡にて胚芽とＣＡＭを観察した（ギュエン(Nguyen), N.M. ら, Antic
a ncer Res., 13:2143-2147(1993)参照）。
調査するため、ヒヨコ漿尿膜（“ＣＡＭ”）検定を用いた。飼鶏の受精卵（韓国
、プーロン(Puluone)社製）を相対湿度７０％で、より屈曲の緩やかな端部を上
にした状態で培養した。３７℃、３％ＣＯ2雰囲気で３日間培養した後、精製プ
ロトロンビンクリングル−１又はプロトロンビンクリングル−２を含むメチルセ
ルロースディスク（フィッシャーサイエンティフィック(Fischer Scientific),
米国）を各胚芽のヒヨコ漿尿膜に適用した。このディスクは、テフロン（登録商 標）棒上でプロトロンビンクリングル−１又は２の存在又は不在下でＨ2Ｏ内の ０．４５％メチルセルロース１０ｍｌを乾燥させることにより製造された。４８ 時間の培養後、２０％の静脈注射用脂肪乳剤をヒヨコ胚芽の漿尿膜内に注射して 、血管の赤色が白色とはっきりと対照されるようにした。この脂肪乳剤の注入後 、実体顕微鏡にて胚芽とＣＡＭを観察した（ギュエン(Nguyen), N.M. ら, Antic
a ncer Res., 13:2143-2147(1993)参照）。
【００３８】 １０ｍｇ／ディスクの投与に当たって、ヒトプロトロンビンクリングル−１及
び２とも血管形成の強力な抑制効果を表した（図４参照）。しかしながら、プロ
トロンビン及びトロンビンはＢＣＥ細胞増殖に対する効果が殆どないか全くなか
った。図４に示すように、パネルＡは血管形成の減少徴候がないＰＢＳ処理ＣＡ
Ｍを示す。プロトロンビン又はトロンビンを含むメチルセルロースディスクを３
日齢のヒヨコ胚芽のＣＡＭに載せたとき、その結果はＰＢＳと同じであった。し
かし、１０μｇ／ディスクのプロトロンビンクリングル−１（パネルＢ）及びク
リングル−２（パネルＣ）は新たな血管の形成を減少させた。
び２とも血管形成の強力な抑制効果を表した（図４参照）。しかしながら、プロ
トロンビン及びトロンビンはＢＣＥ細胞増殖に対する効果が殆どないか全くなか
った。図４に示すように、パネルＡは血管形成の減少徴候がないＰＢＳ処理ＣＡ
Ｍを示す。プロトロンビン又はトロンビンを含むメチルセルロースディスクを３
日齢のヒヨコ胚芽のＣＡＭに載せたとき、その結果はＰＢＳと同じであった。し
かし、１０μｇ／ディスクのプロトロンビンクリングル−１（パネルＢ）及びク
リングル−２（パネルＣ）は新たな血管の形成を減少させた。
【００３９】 アンギオスタチン（クリングル１−４領域を含むプラスミノゲンのタンパク質
分解フラグメント）と同様に、完全なプロトロンビンの領域としてのプロトロン
ビンフラグメントは抗内皮細胞増殖効果を持っていなかった。しかし、プロトロ
ンビンの活性化のうちに因子Ｘａで切断されたプロトロンビンクリングル−１及
び２は非常に強い抑制効果を表した。
分解フラグメント）と同様に、完全なプロトロンビンの領域としてのプロトロン
ビンフラグメントは抗内皮細胞増殖効果を持っていなかった。しかし、プロトロ
ンビンの活性化のうちに因子Ｘａで切断されたプロトロンビンクリングル−１及
び２は非常に強い抑制効果を表した。
【００４０】 実施例５：ヒトプロトロンビンクリングル−１及び２の抑制効果とほかの公知
の抗血管形成分子との比較 表１はヒトプロトロンビンクリングル−１、２とほかの公知の内皮細胞増殖抑
制分子の５０％抑制（ＥＤ50）の濃度を示す。ヒトプロトロンビンクリングル−
１及び２のＥＤ50の濃度はそれぞれおよそ１００ｎＭ及び１２０ｎＭである。ヒ
トプロトロンビンクリングル−１及び２はアンギオスタチン（カオ(CaO), Y.ら,
J. Biol. Chem., 271:29461-29467(1996)参照）及びウサギプロトロンビンフラ
グメント２（リー(Lee), T.H. ら, J. Biol. Chem., 273:28805-28812(1998)参
照）などのほかの公知の内皮細胞増殖抑制分子よりも遥かに強いが、ｂＦＧＦ刺
激されたＢＣＥ細胞増殖抑制に対してはプラスミノゲンクリングル−５（カオ(C
aO), Y.ら, J. Biol. Chem., 272:22924-22928(1997)参照）よりは効果的でない
。しかし、プラスミノゲン及びアンギオスタチンの単一クリングル領域はプロト
ロンビン−１及び２と同様、血液内で独立して存在するということはこれまで報
告されていない。したがって、ヒトプロトロンビンクリングル−１及び２は自然
に生じる単一クリングル分子のなかで最も効果的な内皮細胞増殖抑制剤となり得
る。
の抗血管形成分子との比較 表１はヒトプロトロンビンクリングル−１、２とほかの公知の内皮細胞増殖抑
制分子の５０％抑制（ＥＤ50）の濃度を示す。ヒトプロトロンビンクリングル−
１及び２のＥＤ50の濃度はそれぞれおよそ１００ｎＭ及び１２０ｎＭである。ヒ
トプロトロンビンクリングル−１及び２はアンギオスタチン（カオ(CaO), Y.ら,
J. Biol. Chem., 271:29461-29467(1996)参照）及びウサギプロトロンビンフラ
グメント２（リー(Lee), T.H. ら, J. Biol. Chem., 273:28805-28812(1998)参
照）などのほかの公知の内皮細胞増殖抑制分子よりも遥かに強いが、ｂＦＧＦ刺
激されたＢＣＥ細胞増殖抑制に対してはプラスミノゲンクリングル−５（カオ(C
aO), Y.ら, J. Biol. Chem., 272:22924-22928(1997)参照）よりは効果的でない
。しかし、プラスミノゲン及びアンギオスタチンの単一クリングル領域はプロト
ロンビン−１及び２と同様、血液内で独立して存在するということはこれまで報
告されていない。したがって、ヒトプロトロンビンクリングル−１及び２は自然
に生じる単一クリングル分子のなかで最も効果的な内皮細胞増殖抑制剤となり得
る。
【００４１】
【表１】
【００４２】 実施例６：組換え型プロトロンビンクリングル−１及び２の発現及び精製 プロトロンビンクリングル−１及び２をコードするｃＤＮＡをクローニングさ
せるため、テンプレートとしてヒトプロトロンビンのｃＤＮＡライブラリでポリ
メラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施された。このＰＣＲを遂行するため、それぞ
れヒトプロトロンビンクリングル−１及び２のＮ末端及びＣ末端アミノ酸配列に
基づいて下記のような単一ストランドのオリゴヌクレオチドを合成された。
せるため、テンプレートとしてヒトプロトロンビンのｃＤＮＡライブラリでポリ
メラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施された。このＰＣＲを遂行するため、それぞ
れヒトプロトロンビンクリングル−１及び２のＮ末端及びＣ末端アミノ酸配列に
基づいて下記のような単一ストランドのオリゴヌクレオチドを合成された。
【００４３】 ヒトプロトロンビンクリングル−１： Ｎ−末端プライマー：5'-GAATTCCTTCTGGGCCAAGTACACAGC-3'（SEQ ID NO:3） Ｃ−末端プライマー：5'-AAGCTTTTAGCGTGGAGTCATCGCTAC-3'（SEQ ID NO:4） ヒトプロトロンビンクリングル−２： Ｎ−末端プライマー：5'-CGAATTCCGAAGGCTCCAGTGTG-3'（SEQ ID NO:5） Ｃ−末端プライマー：5'-GAAGCTTCTAACGCCCTTCGATGGC-3'（SEQ ID NO:6）
【００４４】 ９４℃、５７℃、７３℃で１分ずつＰＣＲを３０回実施し、７２℃で５分間予
熱し１０分間最終に延長させた。こうして得たＤＮＡフラグメントを大腸菌発現
ベクターにクローニングした。
熱し１０分間最終に延長させた。こうして得たＤＮＡフラグメントを大腸菌発現
ベクターにクローニングした。
【００４５】 プロトロンビンクリングル−１又はプロトロンビンクリングル−２をコードす
るｃＤＮＡを含む発現ベクター（pET22b'ノバゲン(Novagen),米国）はそれぞれ
“ｐＥＦ−ｋＨ１”又は“ｐＥＦ−ｈＫ２”と称した。ｐＥＦ−ｈＫ２の形質転
換大腸菌は“E.coli BL21(DE3)/pLysS, phEF13”と称し、国際寄託当局である韓
国微生物培養センター（ＫＣＣＭ、韓国ソウル１２０−７４９ 特別市西大門区
延世大学校、工科大学、食品工学科）に寄託番号ＫＣＣＭ−１０１３９として寄
託した。
るｃＤＮＡを含む発現ベクター（pET22b'ノバゲン(Novagen),米国）はそれぞれ
“ｐＥＦ−ｋＨ１”又は“ｐＥＦ−ｈＫ２”と称した。ｐＥＦ−ｈＫ２の形質転
換大腸菌は“E.coli BL21(DE3)/pLysS, phEF13”と称し、国際寄託当局である韓
国微生物培養センター（ＫＣＣＭ、韓国ソウル１２０−７４９ 特別市西大門区
延世大学校、工科大学、食品工学科）に寄託番号ＫＣＣＭ−１０１３９として寄
託した。
【００４６】 ｐＥＦ−ｈＫ２の形質転換大腸菌である“E.coli BL21(DE3)/pLysS, phEF13”
を、ＩＰＴＧ（isopropyl β-D-thiogalactopyranoside）で攻撃する前に、ｍｌ
当たり５０μｇのアンピシリンの存在下で６００ｍＭのＬＢ培地で０．４〜１．
４Ｏ．Ｄ．単位の濁度で培養した。ＩＰＴＧを最終濃度０．１〜５ｍＭまで添加
し、この細胞を更に３時間培養させた。培養期間の終端でバクテリアを１５分間
４００ｘｇの遠心分離によりペレット化させ、５０ｍＭのＮａＣｌ及び１ｍＭの
フェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）を含むｐＨ７．０の最小体
積１０ｍＭのリン酸ナトリウム内で再懸濁させた。その後、細胞を超音波処理（
Sonics Material Inc, Danburg, USA）で分裂させた。細胞砕片は１０分間１３
，５００ｘｇの遠心分離により除去した。
を、ＩＰＴＧ（isopropyl β-D-thiogalactopyranoside）で攻撃する前に、ｍｌ
当たり５０μｇのアンピシリンの存在下で６００ｍＭのＬＢ培地で０．４〜１．
４Ｏ．Ｄ．単位の濁度で培養した。ＩＰＴＧを最終濃度０．１〜５ｍＭまで添加
し、この細胞を更に３時間培養させた。培養期間の終端でバクテリアを１５分間
４００ｘｇの遠心分離によりペレット化させ、５０ｍＭのＮａＣｌ及び１ｍＭの
フェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）を含むｐＨ７．０の最小体
積１０ｍＭのリン酸ナトリウム内で再懸濁させた。その後、細胞を超音波処理（
Sonics Material Inc, Danburg, USA）で分裂させた。細胞砕片は１０分間１３
，５００ｘｇの遠心分離により除去した。
【００４７】 組換え型プロトロンビンクリングル−２の精製のため、粗抽出液を５０ｍＭの
ＮａＣｌを含むｐＨ７．０の１０ｍＭのリン酸ナトリウムを含む緩衝液で予備平
衡化されたDEAE-Sepharoseカラム（２×１２ｃｍ）上でクロマトグラフィ分析し
た。１８０ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液により、結
合されていないタンパク質及び弱く結合されているタンパク質を除去した。洗浄
段階の後、前記緩衝液内で２０ｍｌ／ｈｒの速度で０〜５００ｍＭのＮａＣｌ濃
度勾配でタンパク質を溶出させた。プロトロンビンクリングル−２を含む分画を
貯留しセントリプレップ(Centriprep)装置（アミコン(Amicon), 米国）で濃縮さ
せた。この濃縮されたサンプルを５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．
０）で平衡化されたSephacryl S-200カラム（１．２×１００ｃｍ）にかけ、１
８ｍｌ／ｈの速度で溶出させた。
ＮａＣｌを含むｐＨ７．０の１０ｍＭのリン酸ナトリウムを含む緩衝液で予備平
衡化されたDEAE-Sepharoseカラム（２×１２ｃｍ）上でクロマトグラフィ分析し
た。１８０ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液により、結
合されていないタンパク質及び弱く結合されているタンパク質を除去した。洗浄
段階の後、前記緩衝液内で２０ｍｌ／ｈｒの速度で０〜５００ｍＭのＮａＣｌ濃
度勾配でタンパク質を溶出させた。プロトロンビンクリングル−２を含む分画を
貯留しセントリプレップ(Centriprep)装置（アミコン(Amicon), 米国）で濃縮さ
せた。この濃縮されたサンプルを５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．
０）で平衡化されたSephacryl S-200カラム（１．２×１００ｃｍ）にかけ、１
８ｍｌ／ｈの速度で溶出させた。
【００４８】 組換え型ヒトプロトロンビンクリングル−２のｃＤＮＡ配列が忠実に翻訳され
たことを確認するため、アミノ酸配列分析を実施した。
たことを確認するため、アミノ酸配列分析を実施した。
【００４９】 実施例６：プロトロンビンクリングル−２の体系的投与による腫瘍増殖の抑制 プロトロンビンクリングル−２が体内での新たな血管形成を防止するため、本
発明者らは皮下に埋め込まれた１次ルイス（Lewis）肺癌細胞を有する体系的に
処理されたＣ５７ＢＬ６ネズミにプロトロンビンクリングル−２の抗腫瘍作用が
適用されることを調査した。
発明者らは皮下に埋め込まれた１次ルイス（Lewis）肺癌細胞を有する体系的に
処理されたＣ５７ＢＬ６ネズミにプロトロンビンクリングル−２の抗腫瘍作用が
適用されることを調査した。
【００５０】 ６〜８週齢のＣ５７ＢＬ６／Ｊ雄ネズミ（三育実験室：韓国）を使用した。ネ
ズミを慣らし４匹以下の群に入れ、それらの背中の毛を剃った。６週齢の雄ネズ
ミを仕切り保護設備内に格納させた。全てのネズミに任意に動物飼料と水を供給
した。ネズミは２０ｇのネズミ当たり２ｍｇの塩酸ケタミンと０．１ｍｇの塩酸
キシラジンで麻酔させた。ネズミを致死量のメトキシフルランで殺した。
ズミを慣らし４匹以下の群に入れ、それらの背中の毛を剃った。６週齢の雄ネズ
ミを仕切り保護設備内に格納させた。全てのネズミに任意に動物飼料と水を供給
した。ネズミは２０ｇのネズミ当たり２ｍｇの塩酸ケタミンと０．１ｍｇの塩酸
キシラジンで麻酔させた。ネズミを致死量のメトキシフルランで殺した。
【００５１】 ６００〜１２００ｍｍ3の腫瘍のルイス肺癌を病んでいるネズミを殺し、腫瘍
の皮膚をベタジン及びエタノールで洗浄した。無菌条件の下で層流食物内で腫瘍
組織を切り取った。篩及び２６ゲージの順次小さくなる皮下注射器を通じて生腫
瘍組織を通過させることで、０．９％の正常食塩水に腫瘍細胞が懸濁された懸濁
液を作った。最終濃度を１×１０7ｃｅｌｌ／ｍｌに調整し、懸濁液を氷上に置
いた。エタノールで洗浄したうえで、ネズミの皮下背面（subcutaneous dorsa）
の中線（midline）に０．１ｍｌの食塩水内の１×１０6セルを注入した。
の皮膚をベタジン及びエタノールで洗浄した。無菌条件の下で層流食物内で腫瘍
組織を切り取った。篩及び２６ゲージの順次小さくなる皮下注射器を通じて生腫
瘍組織を通過させることで、０．９％の正常食塩水に腫瘍細胞が懸濁された懸濁
液を作った。最終濃度を１×１０7ｃｅｌｌ／ｍｌに調整し、懸濁液を氷上に置
いた。エタノールで洗浄したうえで、ネズミの皮下背面（subcutaneous dorsa）
の中線（midline）に０．１ｍｌの食塩水内の１×１０6セルを注入した。
【００５２】 腫瘍の大きさが１５００ｍｍ3となったとき、つまり移植されてからおよそ１
４日後、ネズミを２群に任意に抽出した。１群は腫瘍を手術で除去した。切開部
は簡単な結節縫合で縫合させた。ほかの群は麻酔させたうえで、腫瘍を損なわな
く操作する模造手術過程を行った。１４日あと、全てのネズミを解剖し、４倍率
で実体顕微鏡により肺面転移を計数した。
４日後、ネズミを２群に任意に抽出した。１群は腫瘍を手術で除去した。切開部
は簡単な結節縫合で縫合させた。ほかの群は麻酔させたうえで、腫瘍を損なわな
く操作する模造手術過程を行った。１４日あと、全てのネズミを解剖し、４倍率
で実体顕微鏡により肺面転移を計数した。
【００５３】 １５００ｍｍ3の腫瘍を切除した後、ネズミの腹部に毎日食塩水又は多様な濃
度の組換え型プロトロンビンクリングル−２（０．５ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋ
ｇ）を皮下注入した群に任意に抽出したが、各ネズミの背面中線で皮下腫瘍が成
長した。１群の腫瘍ネズミは模造過程のみを取り食塩注射で処理した。１４日間
処理し続けた後、全てのネズミを殺し解剖した。
度の組換え型プロトロンビンクリングル−２（０．５ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋ
ｇ）を皮下注入した群に任意に抽出したが、各ネズミの背面中線で皮下腫瘍が成
長した。１群の腫瘍ネズミは模造過程のみを取り食塩注射で処理した。１４日間
処理し続けた後、全てのネズミを殺し解剖した。
【００５４】 図５に示すように、毎日プロトロンビンクリングル−２を体系的に投与した結
果、１４日処理のうちに２次腫瘍の成長がかなり抑制された（参照：図５：１、
正常肺；２、食塩水で処理；３、０．５ｍｇ／ｋｇの組換え型プロトロンビンク
リングル−２；４、１ｍｇ／ｋｇの組換え型プロトロンビンクリングル−２）。
図６は組換え型プロトロンビンクリングル−２で処理された肺の重量減少を示す
グラフである。
果、１４日処理のうちに２次腫瘍の成長がかなり抑制された（参照：図５：１、
正常肺；２、食塩水で処理；３、０．５ｍｇ／ｋｇの組換え型プロトロンビンク
リングル−２；４、１ｍｇ／ｋｇの組換え型プロトロンビンクリングル−２）。
図６は組換え型プロトロンビンクリングル−２で処理された肺の重量減少を示す
グラフである。
【００５５】 処理してから１４日後、１ｍｇ／ｋｇのプロトロンビンクリングル−２で処理
されたネズミでは１次腫瘍増殖の平均９０％以上が抑制されたものが観察された
（ｎ＝１０）。これとは対照的に、同じに１４日処理期間のうちに食塩水で処理
したネズミでは腫瘍が急速に成長した（ｎ＝８）。
されたネズミでは１次腫瘍増殖の平均９０％以上が抑制されたものが観察された
（ｎ＝１０）。これとは対照的に、同じに１４日処理期間のうちに食塩水で処理
したネズミでは腫瘍が急速に成長した（ｎ＝８）。
【００５６】 実施例７：プロトロンビンクリングル−２のペプチドの抗内皮細胞増殖活性 ヒトプロトロンビンクリングル−２の内皮細胞増殖抑制活性領域を決定するた
め、プロトロンビンクリングル−２の１５又は９アミノ酸からなる１１ペプチド
をペプトロンコープ（Peptron Corp.韓国）で合成した。プロトロンビンクリン
グル−２のＮ末端配列から適当なアミノ酸配列を有するペプチドをペプチドのＮ
末端及びＣ末端の５アミノ酸を重ね合わせることで合成させたが（表２参照）、
一方で２アミの酸の合成及び重ね合わせでの問題のため、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１
２のペプチドは合成して９アミノ酸のみを含み得るようにする。合成されたペプ
チドは高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）で精製させた。
め、プロトロンビンクリングル−２の１５又は９アミノ酸からなる１１ペプチド
をペプトロンコープ（Peptron Corp.韓国）で合成した。プロトロンビンクリン
グル−２のＮ末端配列から適当なアミノ酸配列を有するペプチドをペプチドのＮ
末端及びＣ末端の５アミノ酸を重ね合わせることで合成させたが（表２参照）、
一方で２アミの酸の合成及び重ね合わせでの問題のため、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１
２のペプチドは合成して９アミノ酸のみを含み得るようにする。合成されたペプ
チドは高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）で精製させた。
【００５７】
【表２】
【００５８】 実施例３の方法にしたがって内皮細胞増殖検定を実施した。 表２に示すように、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８〜１３のペプチドはｂＦＧＦ刺激さ
れた内皮細胞増殖を抑制し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の抑制活性が最も効果的で
ある。したがって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２のペプチドが抗内皮細胞増殖効果を
示すのに重要な役割を果たすことがはっきりと決定された。
れた内皮細胞増殖を抑制し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の抑制活性が最も効果的で
ある。したがって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２のペプチドが抗内皮細胞増殖効果を
示すのに重要な役割を果たすことがはっきりと決定された。
【００５９】 投与及び有効投与量 ヒトプロトロンビンクリングル−１、２又はこれと機能的に同等なペプチドの
有効投与量は患者の年齢、体重及び病気の進展によって違うが、１回の投与に０
．８〜２．０ｍｇ／ｋｇ／日で非経口で投与することが好ましいが、これは当業
者の経験によって個別化され得る。
有効投与量は患者の年齢、体重及び病気の進展によって違うが、１回の投与に０
．８〜２．０ｍｇ／ｋｇ／日で非経口で投与することが好ましいが、これは当業
者の経験によって個別化され得る。
【００６０】 急性毒性 ヒトプロトロンビンクリングル−１、２又はこれと機能的に同等なペプチドの
急性毒性を検査するため、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄ネズミにヒトプロトロンビンクリ
ングル−１、２又はペプチドを皮下注入し、死んだものを計数して７日間のＬＤ 50 を決定した。その結果、ＬＤ50はおよそ５ｇ／ｋｇと決定されたが、これはヒ
トプロトロンビンクリングル−１、２及びその機能的に同等なペプチドを含む抗
腫瘍剤が有効投与量の範囲内で十分に安全であることを示す。
急性毒性を検査するため、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄ネズミにヒトプロトロンビンクリ
ングル−１、２又はペプチドを皮下注入し、死んだものを計数して７日間のＬＤ 50 を決定した。その結果、ＬＤ50はおよそ５ｇ／ｋｇと決定されたが、これはヒ
トプロトロンビンクリングル−１、２及びその機能的に同等なペプチドを含む抗
腫瘍剤が有効投与量の範囲内で十分に安全であることを示す。
【００６１】 ヒトプロトロンビンクリングル−１、２又はこれと機能的に同等なペプチドの
活性成分と薬学的に許容できるキャリヤを含む本発明の薬学的組成は注射方式で
投与できる。この注射方式は、さらに等張性水溶液又は懸濁液、及び薬学的に許
容できるキャリヤカバー防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧を変化させる
塩又は緩衝液を含むことができる。
活性成分と薬学的に許容できるキャリヤを含む本発明の薬学的組成は注射方式で
投与できる。この注射方式は、さらに等張性水溶液又は懸濁液、及び薬学的に許
容できるキャリヤカバー防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧を変化させる
塩又は緩衝液を含むことができる。
【００６２】 以上、本発明を試験腫瘍としてルイス肺癌を用いる特定実施態様を参照して例
示及び説明したが、本発明の抗腫瘍剤は皮膚癌、喉頭癌、子宮癌、結腸癌、肺癌
及び骨髄癌などの多様な腫瘍にも効果的である。
示及び説明したが、本発明の抗腫瘍剤は皮膚癌、喉頭癌、子宮癌、結腸癌、肺癌
及び骨髄癌などの多様な腫瘍にも効果的である。
【００６３】 以上、明らかに例示及び立証したように、本発明は抗内皮細胞増殖効果を有す
るヒトプロトロンビンクリングル−２のアミノ酸配列を有するヒトプロトロンビ
ンクリングル−１、２及びこれと機能的に同等なペプチドと、ヒトプロトロンビ
ン由来のヒトプロトロンビンクリングル−１及び２をコードするｃＤＮＡと、こ
のｃＤＮＡを含む組換え型発現ベクターと、ヒトプロトロンビンクリングル−２
を表す組換え型発現ベクターで形質転換された組換え型微生物と、ヒト血漿から
ヒトプロトロンビンクリングル−１及び２を、組換え型微生物から組換え型ヒト
プロトロンビンクリングル−２を製造する方法と、前記タンパク質の薬学的適用
を提供する。腫瘍の内皮細胞に対する抗血管療法は薬物耐性を殆ど又は全く誘発
しないようにすべきであるため、抗内皮細胞増殖分子、ヒトプロトロンビンクリ
ングル−１、２及びこれと機能的に同等なペプチドは癌治療の最も信頼できる候
補である。
るヒトプロトロンビンクリングル−２のアミノ酸配列を有するヒトプロトロンビ
ンクリングル−１、２及びこれと機能的に同等なペプチドと、ヒトプロトロンビ
ン由来のヒトプロトロンビンクリングル−１及び２をコードするｃＤＮＡと、こ
のｃＤＮＡを含む組換え型発現ベクターと、ヒトプロトロンビンクリングル−２
を表す組換え型発現ベクターで形質転換された組換え型微生物と、ヒト血漿から
ヒトプロトロンビンクリングル−１及び２を、組換え型微生物から組換え型ヒト
プロトロンビンクリングル−２を製造する方法と、前記タンパク質の薬学的適用
を提供する。腫瘍の内皮細胞に対する抗血管療法は薬物耐性を殆ど又は全く誘発
しないようにすべきであるため、抗内皮細胞増殖分子、ヒトプロトロンビンクリ
ングル−１、２及びこれと機能的に同等なペプチドは癌治療の最も信頼できる候
補である。
【配列表】
【図１】 ヒト血漿からＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し精製したヒトプロトロ
ンビン誘導体を示す写真である。
ンビン誘導体を示す写真である。
【図２】 ヒトプロトロンビン及びその誘導体のウェスタンブロット分析
を示す写真である。
を示す写真である。
【図３】 ヒトプロトロンビン及びその誘導体の内皮細胞増殖抑制作用を
示すグラフである。
示すグラフである。
【図４】 ＣＡＭに対するヒトプロトロンビンクリングル−１及び２の抗
血管形成効果を示す。
血管形成効果を示す。
【図５】 ヒトプロトロンビンクリングル−２の腫瘍増殖の抑制を示す写
真である。
真である。
【図６】 ヒトプロトロンビンクリングル−２の腫瘍増殖の抑制を示すグ
ラフである。
ラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 21/02 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:19） //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:19） Ａ６１Ｋ 37/475 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (72)発明者 キム スン ス 大韓民国、ソウル 159−050、ヤンチョン ク、モクドン、モクドン アパート 313 −1103 (72)発明者 イム テ ヨン 大韓民国、ソウル 137−070、ヨンサン ク、イチョンドン 407、ハンガラン ア パート 214−1906 (72)発明者 パク チャン ス 大韓民国、ソウル 135−921、カンナン ク、ヨクサンドン 728−48、301 (72)発明者 キム ウン キョン 大韓民国、ギョンギド 411−815、コヤン シ、イルサンク、ベクソクドン 1161−１ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA04 DA06 EA04 GA11 HA03 4B064 AG01 CA02 CA19 CA21 CB06 CC24 CE07 CE11 DA01 4B065 AA26X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 4C084 AA02 AA07 BA44 CA18 DC12 NA14 ZB26 4H045 AA10 AA20 AA30 BA13 BA14 BA15 BA16 BA17 CA42 DA65 EA28 FA72 FA73 FA74 GA22 GA23
Claims (14)
- 【請求項１】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として表されるヒトプロトロンビンク
リングル−１のアミノ酸配列。 - 【請求項２】 請求項１のヒトプロトロンビンクリングル−１をコードする
ｃＤＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）。 - 【請求項３】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２として表されるヒトプロトロンビンク
リングル−２のアミノ酸配列。 - 【請求項４】 請求項３のヒトプロトロンビンクリングル−２をコードする
ｃＤＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）。 - 【請求項５】 ヒトプロトロンビンクリングル−１を発現するｃＤＮＡ（Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）を含む組換え型発現ベクターｐＥＦ−ｈＫ１。 - 【請求項６】 ヒトプロトロンビンクリングル−２を発現するｃＤＮＡ（Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）を含む組換え型発現ベクターｐＥＦ−ｈＫ２。 - 【請求項７】 請求項６の組換え型発現ベクターｐＥＦ−ｈＫ２で形質転換
された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳ、ｐｈＥＦ１３（ＫＣＣＭ−１０
１３９）。 - 【請求項８】 ヒトプロトロンビンのヒトプロトロンビンクリングル−２由
来の、内皮細胞の増殖を抑制するペプチド。 - 【請求項９】 ヒトプロトロンビンクリングル−２の１１番目のプロリンか
ら７０番目のアスパラギン酸の適当な５〜２０アミノ酸の配列の有する請求項８
のペプチド。 - 【請求項１０】（i）ヒト血漿からヒトプロトロンビンを単離し、精製する
段階と、 （ii）ヒトプロトロンビンを因子Ｘａで処理してプロトロンビンクリングル−
１及び２を提供する段階と、 （iii）プロトロンビンクリングル−１及び２をイオン交換クロマトグラフィ
により単離する段階とを含む、ヒト血漿からプロトロンビンクリングル−１及び
２を製造する方法。 - 【請求項１１】（i）請求項４のｃＤＮＡを含む発現ベクターで形質転換さ
れた組換え型微生物を培養する段階と、 （ii）前記培養物にイオン交換及びゲル濾過クロマトグラフィを適用して組換
え型ヒトプロトロンビンクリングル−２を得る段階とを含む、組換え型プロトロ
ンビンクリングル−２の製造方法。 - 【請求項１２】 前記組換え型微生物は大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＬｙ
ｓＳ、ｐｈＥＦ１３（ＫＣＣＭ−１０１３９）である請求項１１の製造方法。 - 【請求項１３】 ヒトプロトロンビンクリングル−１若しくは２の活性成分
、又はこれと機能的に同等なペプチド及び薬学的に許容できるキャリヤを含む抗
腫瘍剤。 - 【請求項１４】 皮膚癌、喉頭癌、子宮癌、結腸癌、肺癌及び骨髄癌に効果
的である請求項１３の抗腫瘍剤。
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