JPH04295500A - 新規な巨核球増幅因子とその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は血小板減少症等の疾患の
治療に有用な巨核球増幅因子、及びその製法に関する。 更に詳しくは、本発明は、ヒト由来細胞の培養によって
得られた培養上清より精製された、巨核球の増幅を活性
化する作用を有する、新規な蛋白質、及びその製法に関
する。

【０００２】本発明はまた、ヒト由来細胞の培養による
該巨核球増幅因子の製造工程において、細胞による該因
子の生産量を増大せしめるために、培地中に該因子産生
促進剤を添加する、新規な巨核球増幅因子の製法に関す
る。本発明はまた、遺伝子工学の技術を応用した、ヒト
巨核球増幅因子の製法に関する。

【０００３】

【従来の技術】血小板は血管の破れによって起こる出血
を、生体が自然に止める血栓形成、及び血液凝固の過程
において、その促進に重要な働きを担っている。血小板
の産生を特異的に促進する因子とされるトロンボポエチ
ン（ＴＰＯ）は、過去２０年以上もの間数多くの研究者
がその取得に情熱を燃やして当たってきているが、いま
だに成功にはいたっていない。

【０００４】血小板減少動物の血しょうを健常動物に投
与すると、血小板産生がこう進し、逆に血小板を輸注す
ると産生が低下することから、血小板の増減に応じてそ
の産生を調節する作用を有するＴＰＯの存在が古くから
提唱されてきた。その後の研究結果から、血小板は骨髄
幹細胞から巨核球前駆細胞より骨髄中で分化・成熟して
生じた巨核球より血液中に放出されることが示され、ま
た　ｉｎｖｉｔｒｏ　の成績から巨核球の分化・増幅過
程の早期には巨核球コロニー刺激因子（Ｍｅｇａｋａｒ
ｙｏｃｙｔｅＣｏｌｏｎｙ　Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　
Ｆａｃｔｏｒ；　Ｍｅｇ−ＣＳＦ）が作用し、後期には
巨核球の成熟を促進させる活性を有するＴＰＯが作用す
ることが明らかにされた。即ち、まずＭｅｇ−ＣＳＦが
作用し、前駆細胞が細胞分裂を繰り返し巨核球コンパー
トメントが増大し、次にＴＰＯが作用してそれぞれの巨
核球前駆細胞は　ｅｎｄｏｍｉｔｏｓｉｓを行ない、そ
の染色体倍数を増大させて行く（〜３２Ｎ）とともに細
胞質が成熟・増大して、血小板産生がなされるようにな
る。ＴＰＯはまた、巨核球増幅因子（Ｍｅｇａｋａｒｙ
ｏｃｙｔｅ　Ｐｏｔｅｎｔｉａｔｏｒ；Ｍｅｇ−ＰＯＴ
）と呼ばれることもある。

【０００５】Ｍｅｇ−ＣＳＦの活性は、　ｉｎ　ｖｉｔ
ｒｏ　のヒトまたはマウスの骨髄細胞の軟寒天培養にお
いて巨核球コロニーを形成させる活性を測定することに
より見積られる。現在Ｍｅｇ−ＣＳＦの活性は、再生不
良性貧血患者及び突発性血小板減少性紫斑病患者の尿中
、骨髄巨核球無形成性血小板減少症患者の血しょう中、
インゲンマメレクチン刺激ヒト白血球培養上清、マウス
白血病細胞株ＷＥＨＩ−３培養上清等に見いだされてい
る。

【０００６】種々のサイトカインのうち、インターロイ
キン３（ＩＬ−３）が巨核球を含む多くの系統に非特異
的に作用するＭｕｌｔｉ−ＣＳＦであることが明らかと
なってきている。またＷＥＨＩ−３培養上清中のＭｅｇ
−ＣＳＦがＩＬ−３と完全に一致するなど、従来の細胞
培養上清中のＭｅｇ−ＣＳＦ活性の多くがＩＬ−３によ
るとされている。しかしながら、血小板系に特異的に作
用することが明らかにされたＭｅｇ−ＣＳＦは未だに知
られていない。

【０００７】一方ＴＰＯの活性は、Ｍｅｇ−ＣＳＦのコ
ロニー形成活性の増強作用及び／または巨核球の成熟促
進作用を測定することにより見積られる。これまでにい
くつかのＴＰＯ様活性を有する因子の調製が試みられて
きた。ヒト胎児腎細胞株の培養上清中より調製される、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの分子量が１５０００、等電点が５
．１の巨核球系の細胞中の蛋白質合成を促進する作用を
有する、巨核球促進因子（Ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅ
　Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ　Ｆａｃｔｏｒ；　ＭＳＦ）
及びその製造方法が報告されている（特開昭６３−２３
９２９８号参照）。しかし、ＭＳＦについては物質の同
定はなされていない。また最近、Ｂ細胞の抗体産生を誘
導する糖蛋白質として見いだされ、免疫系、急性期反応
系及び悪性腫瘍にも関与することが明らかにされている
、多機能サイトカインであるＩＬ−６が、造血系にも関
与しており、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいてＭｅｇ−ＰＯＴ
活性及び巨核球成熟促進活性を示し（Ｉｓｈｉｂａｓｈ
ｉ，　Ｔ．ｅｔ　ａｌ．「Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａ
ｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ」８６，５９５３（１９８
９））、ｉｎ　ｖｉｖｏ　において血小板産生促進作用
を示すことが確認されている（Ａｓａｎｏ，　Ｓ．　ｅ
ｔ　　ａｌ．　「Ｂｌｏｏｄ　」７５，１６０２（１９
９０））。しかしながら、これらの因子の巨核球増幅活
性は微弱なものであり、またこれらが生体に本来備わっ
た構成的な造血因子であるかどうかは不明である。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明者等は、上述の
技術的背景にあって、特異的に且つ強力に巨核球の増幅
を促進する作用及び血小板産生を促進する作用を有する
、新規な巨核球増幅因子を見いだすべく鋭意研究を重ね
た結果、意外にもヒト細胞の培養上清中に全く新規な巨
核球増幅因子を発見すると共に、適当な産生促進剤を添
加し培養細胞と接触させることにより、大量の該因子が
生産されることを見いだした。更に回収した培養上清よ
り、該因子を単離・精製し、その諸性質を明らかにする
と共に、その薬剤としての有用性を示した。また遺伝子
工学的技術を応用し、該巨核球増幅因子を発現させるこ
とに成功した。本発明は、これらの知見に基づいて完成
した。

【０００９】即ち、本発明の目的は、強力な作用を有す
る新規な巨核球増幅因子を提供することにある。また、
本発明の別の目的は、ヒト細胞を培養し、その培養上清
中に該巨核球増幅因子を産生させ、回収した培養上清か
ら該巨核球増幅因子を精製することを含む巨核球増幅因
子の製造方法を提供することにある。

【００１０】更にまた、本発明の他の目的は、培地中に
巨核球増幅因子産生促進剤を添加することにより、産生
される該巨核球増幅因子の量を増大させる、巨核球増幅
因子の製造方法を提供することにある。更にまた、本発
明の他の目的は、巨核球増幅因子を産生する細胞から、
ｍＲＮＡを抽出し、得られた該ｍＲＮＡよりポリＡ＋　
ｍＲＮＡを精製し、適当な発現用ベクター及び該ポリＡ
＋　ｍＲＮＡとからｃＤＮＡライブラリーを調製し、該
ｃＤＮＡライブラリーより適当な宿主細胞を用いて、プ
ラスミドＤＮＡを調製し、該プラスミドＤＮＡを用いて
、更に適当な宿主細胞をトランスフェクトし、該宿主細
胞あるいは該巨核球増幅因子活性を指標に該宿主細胞を
スクリーニングして得た細胞を用いて、該巨核球増幅因
子を発現させ、該巨核球増幅因子を精製することを含む
、該巨核球増幅因子の製造方法を提供することにある。

【００１１】更にまた、本発明の他の目的は、巨核球増
幅因子を有効成分として含有する医薬組成物を提供する
ことにある。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、巨核球
増幅を活性化する活性を有し、且つ末梢血中の血小板を
増加させる活性を有する巨核球増幅因子が提供される。 更に詳しくは、巨核球増幅を活性化する活性を有し、下
記の諸性質を有することを特徴とする、巨核球増幅因子
が提供される。（ａ）分子量：２５０００±８０００（
ゲル濾過で測定） （ｂ）等電点：ｐＩ＞９（等電点クロマトグラフィーで
測定） （ｃ）巨核球コロニー刺激因子活性を有さない。

【００１３】また本発明によれば、ヒト細胞を培養し、
その培養上清中に該巨核球増幅因子を産生させ、回収し
た培養上清から該巨核球増幅因子を精製することを含む
巨核球増幅因子の製造方法が提供される。この本発明の
方法において用いられる細胞は、巨核球増幅を活性化す
る活性を有し、且つ末梢血中の血小板を増加させる活性
を有する巨核球増幅因子を産生する能力を有する、各種
の細胞が対象となる。正常二倍体細胞もまた使用でき、
例えば、ヒトの腎、腸、肺、心臓、輸尿管、皮膚、包皮
、舌、甲状腺、胎盤、子宮由来の細胞を、好ましくはヒ
ト胎児腎、肺、包皮由来の細胞を、更により好ましくは
ヒト胎児肺由来の細胞を使用できる。

【００１４】該巨核球増幅因子は、これらの組織抽出液
から分離精製することも可能であるが、より好ましくは
、これらの細胞を適当な生育培体中で培養し、その培養
上清中に該巨核球増幅因子を産生させ、回収した組織培
養液から分離精製することができる。これらの細胞は、
通常の細胞の培養に用いられる培養方法例えば「組織培
養」（中井準之助他編集昭和５１年刊朝倉書店）記載の
方法で増殖させ、本発明に供することが望ましい。 細胞は炭素類、窒素源及び必要な場合には、無機塩類及
び／またはその他の添加物を含む溶液と接触させること
によって、該巨核球増幅因子を生産せしめることができ
る。また、本発明によれば、培養した細胞を、培地中に
加えた巨核球増幅因子産生促進剤、好ましくは動物肉酵
素分解ペプトンと接触させることにより、培養上清中に
産生される該巨核球増幅因子の量を飛躍的に増大せしめ
ることができる。動物肉酵素分解ペプトンは、一般に細
菌の培養培地に用いられるものであり、通常プロテオー
スペプトン、プロテオーゼペプトン、獣肉ペプトンと呼
ばれるものである。

【００１５】この動物肉酵素分解ペプトンの調製法は公
知であり、例えば「細菌培地学講座第二集」（坂崎利一
著、納谷書店、１９６７年刊）記載の方法に従えばよい
。即ち、動物肉としては、牛、豚、ニワトリ、羊、クジ
ラ等の肉または内蔵が用いられるが、このうち牛肉が最
も普通に用いられる。分解用の酵素としては、トリプシ
ン、パパイン、ペプシン、パンクレアチン等がある。 これらの動物肉は、細挫され、水と混合され、炭酸ナト
リウム、濃塩酸等で酵素分解に適したｐＨに調整される
。これに酵素を加え、２０〜４０℃で１〜２０日間、通
常は３７℃で２〜３日間酵素分解を行う。消化後は分解
酵素を不活性化するためと、未消化の蛋白を熱凝固させ
るために、１００℃以上に加熱し、濾過によってこれを
除去した後、濃縮、乾固、細末化する。濃縮、乾固の方
法には、煮つめて粉末にするのと、真空乾燥装置を用い
て低温で濃縮後、細末化するのがある。市販品としては
、ディフコ社製のプロテオースペプトン（Ｐｒｏｔｅｏ
ｓｅ　Ｐｅｐｔｏｎｅ）、プロテオースペプトン　Ｎｏ
．２　、プロテオースペプトンＮｏ．３　、チオペプト
ン（Ｔｈｉｏｐｅｐｔｏｎｅ　）、オキソイド社製のプ
ロテオースペプトンＬ４６、ペプトンＰＬ４６、ＢＢＬ
社製のチオトン（Ｔｈｉｏｔｏｎｅ）、大五栄養化学社
製のプロテオースペプトン等がある。

【００１６】該巨核球増幅因子の細胞培養法による生産
の例を示せば、該巨核球増幅因子の生産は、１５℃〜４
５℃、好ましくは２５℃〜４０℃の範囲で行われる。生
産のｐＨは５〜９、好ましくは６〜８に調節される。生
産の日数は通常１〜６０日であるが、６０日を越えるこ
とも可能である。該巨核球増幅因子の生産速度は、生産
の後半においては次第に遅くなるので、工業的生産の場
合には最も効率のよい日数が選ばれる。該巨核球増幅因
子は、前記の条件下で細胞から溶液中に放出される。そ
の生成量の測定は、実施例１（ａ），（ｂ）に示した巨
核球増幅活性測定法で行ない、その巨核球の成熟度合は
、実施例１（ｃ）に示した巨核球ＤＮＡ量測定法で確認
できる。

【００１７】また更に本発明によれば、通常使用される
遺伝子工学的手法を用いて該巨核球増幅因子を適当な宿
主細胞に発現させ、これを回収し、更に精製することを
含む巨核球増幅因子の製造方法が提供される。即ち、巨
核球増幅を活性化する活性を有し、且つ末梢血中の血小
板を増加させる活性を有する巨核球増幅因子を産生する
能力を有する、各種の細胞例えば、ヒトの腎、腸、肺、
心臓、輸尿管、皮膚、包皮、舌、甲状腺、胎盤、子宮由
来の細胞を、好ましくはヒト胎児腎、肺、包皮由来の細
胞を、更により好ましくはヒト胎児肺由来の細胞から全
ｍＲＮＡを抽出し、更にこれよりポリＡ＋　ｍＲＮＡを
精製する。適当な発現用ベクター、好ましくは真核生物
発現用ベクターとポリＡ＋　ｍＲＮＡ及びリンカーを用
いてｃＤＮＡライブラリーを作製し、このライブラリー
を用いて適当な宿主細胞、例えば、大腸菌を形質転換し
、その培養液よりプラスミドＤＮＡを調製する。このプ
ラスミドＤＮＡを用いて適当な宿主細胞を、好ましくは
動物由来の細胞を、更に好ましくは、サル由来のＣＯＳ
細胞をトランスフェクトし、該巨核球増幅因子の遺伝子
を発現させ、これを回収し、更に精製することを含む巨
核球増幅因子の製造方法が提供される。

【００１８】また本発明によれば、この発現細胞を巨核
球増幅因子の活性を指標にその遺伝子をクローニングす
る方法が提供される。更にまた本発明によれば、巨核球
増幅因子の蛋白質一次構造の一部をコードする遺伝子プ
ローブを調製し、これを用いてその遺伝子をクローニン
グする方法が提供される。

【００１９】更にまた本発明によれば、クローニングさ
れた遺伝子を用いて別の宿主細胞を、例えば、大腸菌、
酵母、サルの腎細胞（ＣＯＳ細胞）、チャイニーズハム
スターの卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＣ１２７細胞
、ヒト胎児腎細胞株２９３等をトランスフェクトし、更
に効率的に該巨核球増幅因子を発現させ、これを回収し
、更に精製することを含む巨核球増幅因子の製造方法が
提供される。

【００２０】生産細胞による巨核球増幅因子の産生が、
所望の生成量または日数に達したときに、培養上清を回
収する。該巨核球増幅因子の分離・精製方法としては、
蛋白質化学において通常使用される方法、例えば、担体
による吸着法、塩析法、電気泳動法、およびイオン交換
、ゲル濾過、適当なリガンドへのアフィニティーを応用
した各種のクロマトグラフィー法等を単独で、または組
み合わせて使用できる。クロマトグラフィー法として、
好ましくは、カルボキシメチル基を結合させたセファロ
ースを用いるＣＭセファロースカラムクロマトグラフィ
ー、架橋したデキストランゲル等の粒子をもちいるゲル
濾過カラムクロマトグラフィー、オレンジセファロース
等の色素吸着カラムクロマトグラフィー、疎水性クロマ
トグラフィー、本発明物質と特異的に結合する抗体を結
合させた抗体アフィニティーカラムクロマトグラフィー
を使用できる。

【００２１】かくして得られた新規な巨核球増幅因子は
、巨核球増幅を活性化する活性を有し、且つ末梢血中の
血小板を増加させる活性を有するものである。該巨核球
増幅因子は、骨髄幹細胞あるいは骨髄巨核球前駆細胞か
らの巨核球の分化、増殖並びに巨核球の成熟の研究用試
薬として、また該巨核球増幅因子単独で、あるいは少な
くとも１種の薬剤として投与可能な担体、希釈液または
賦型剤を添加して適当な剤型とし、医薬品としても使用
される。

【００２２】本発明の巨核球増幅因子は、ある種の血小
板減少症、例えば抗癌剤投与後の血小板減少症、放射線
治療後の血小板減少症、巨核球増幅因子欠損による血小
板減少症、再生不良性貧血の血小板減少症、骨髄移植後
の血小板減少症、自己免疫疾患の血小板減少症の治療及
び／または予防に用いることができる。また白血病の治
療にも用いることができる。更に血小板輸血の代替、補
助剤として、あるいは輸血用骨髄細胞の　ｉｎ　ｖｉｔ
ｒｏ　での増殖培養にも用いることができる。

【００２３】本発明の巨核球増幅因子は、注射剤として
用いることができる。この場合には、ショ糖、グリセリ
ン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース等
の増粘剤、各種無機塩のｐＨ調整剤等を添加剤として加
えることができる。本発明の巨核球増幅因子の成人１回
当りの投与量は、年齢、性別、体重、症状などによって
異なるが、一般に約０．１μｇ〜１００ｍｇであり、１
日当り１回または必要に応じて数回投与する。

【００２４】

【実施例】本発明をより詳細に記述するために、実施例
により説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例のみ
に限定されるものではない。 実施例１　　巨核球増幅因子活性測定法本発明により、
ヒト由来細胞を培養して得られる巨核球増幅因子活性は
、下記の２つの方法で測定した。 （ａ）軟寒天培養法によるＭｅｇ−ＰＯＴ活性測定法骨
髄の調製 ６〜８週令のＣ５７ＢＬ／６マウス（雄）の大腿骨を採
取し、その上部を切断し、４〜５ｍｌのＩＭＤＭ液（Ｉ
ｓｃｏｖｅ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｄ
ａｌｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｅｄｉｕｍ）を入れた５ｍｌ
のプラスチック注射器（２２Ｇ針）を用いて、膝関節側
から１５ｍｌのファルコンチューブ中に、勢いよく骨髄
を押しだした。約１０回のピペッティング操作によって
、細胞を分散した後非沈降性の細胞を採り、これを１０
ｍｌのＩＭＤＭ液で２回洗浄し、最後に５ｍｌのＩＭＤ
Ｍ液にサスペンドし、更によく分散させた後実験に供し
た。細胞濃度は、トリパンブルー（フローラボラトリー
ズ社製）染色にて血球計算盤で測定した。なお、ＩＭＤ
Ｍ液は、粉末ＩＭＤＭ１ｌ用（ギブコ社製）に重曹３．
０２４ｇ，β−メルカプトエタノール３．４７μｌを加
え、ｐＨを７．１に調製した後、１ｌにメスアップし、
更に５０ＩＵ／ｍｌペニシリン及び５０μｇ／ｍｌスト
レプトマイシン（いずれもフローラボラトリーズ社製）
を加えて調製した。 コロニーアッセイ １０５　個の骨髄細胞を３５ｍｍプラスチックディッシ
ュ中で、１％牛血清アルブミン、３６０μｇ／ｍｌヒト
トランスフェリン、０．９８μｇ／ｍｌコレステロール
及び１％ＩＬ−３含有ＣＯＳ１細胞培養上清を含む５０
０μｌのＩＭＤＭ液培地中で、０．３％バクトアガー（
ディフコ社製）の条件で軟寒天状態とし、３７℃、７日
間、５％ＣＯ２　の条件下で培養した。なお、有血清状
態で培養を行う際には、牛血清アルブミン、ヒトトラン
スフェリン及びコレステロールの代わりに１５％馬血清
（Ｊ．Ｒ．サイエンティフィック社製）の条件下でこの
培養を行った。また、ＩＬ−３含有ＣＯＳ１細胞培養上
清としては、マウスＩＬ−３ｃＤＮＡをＳＶ−４０のプ
ロモーターに連結したプラスミドを用いて、ＣＯＳ１細
胞（ＡＴＣＣ　　ＣＲＬ１６５０）を形質転換し、特開
昭６４−６２１９号の、実施例２に記載の方法と同様に
して発現させたＩＬ−３含有培養上清を用いた。培養終
了後、アガーディスクをスライドグラス上に移し、乾燥
させた後、２％グルタアルデヒドで固定した。リン酸緩
衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄後、アセチルコリンエス
テラーゼ染色液で巨核球の特異的染色を行った。

【００２５】なおアセチルコリンエステラーゼ染色液と
しては、ヨウ化アセチルチオコリン２００ｍｇ、フェリ
シアン化カリウム６５．９ｍｇを、５ｍＭクエン酸ナト
リウム、３ｍＭ硫酸銅を含む４００ｍｌのｐＨ６．０の
７５ｍＭリン酸緩衝液に溶解したものを用いた。コロニ
ー数はオリンパス社製ＢＨ２落射型顕微鏡で計数した。 （ｂ）液体培養によるアセチルコリンエステラーゼ活性
測定法 上記と同様に調製したマウス骨髄細胞懸濁液に、最終濃
度０．４ｍＭとなるようにジイソプロピルフルオロフォ
スフェート（シグマ社製、ＤＦＰ）を加え、時々攪はん
しながら室温で２０分置き、骨髄細胞の内在性のアセチ
ルコリンエステラーゼ活性を消去した。細胞数は上記と
同様に計数した。

【００２６】測定を無血清条件で行う際には、１．０％
ニュートリドーマーＳＰ（ベーリンガーマンハイム社製
）を含むＩＭＤＭ液を、また有血清条件で行う際には、
あらかじめ２ｍＭとなるようにＤＦＰを加え、室温で２
時間置き血清中に含まれるアセチルコリンエステラーゼ
活性を不活化し、更にＰＢＳに対して４℃で一晩、続い
て生理食塩水に対して４℃で３時間透析、無菌濾過した
馬血清を用いた上記と同様の有血清培地を用いて、下記
の液体培養を行った。

【００２７】骨髄細胞懸濁液の細胞密度を２．５〜５×
１０５　ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように、９６穴培養用
ディッシュ（住友ベークライト社製）に、１穴当り０．
２ｍｌを分注した。ＩＬ−３含有ＣＯＳ１細胞培養上清
を含む試料溶液を２０μｌ加え、３７℃、７日間、５％
ＣＯ２　の条件下で培養した。培養後、遠心で上清を除
去した後、各穴に２０μｌの５．６ｍＭアセチルコリン
イオダイド（シグマ社製）、及び１８０μｌの０．１２
Ｍ食塩、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸、０．２％トリ
トンＸ−１００を含むｐＨ７．５の５０ｍＭＨｅｐｅｓ
緩衝液を加えて、室温で３〜４時間反応させた。反応液
の２０μｌを９０穴の黒プレート（グライナー社製）に
移し、１６０μｌの１ｍＭエチレンジアミン四酢酸、０
．２％トリトンＸ−１００を含むｐＨ５．０の酢酸緩衝
液及び２０μｌの０．４ｍＭＣＰＭ（７−ｄｉｅｔｈｙ
ｌａｍｉｎｏ−３−（４’−ｍａｌｅｉｍｉｄｙｌｐｈ
ｅｎｙｌ）−４−ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｉｎ）（モ
レキュラープローブ社製）のアセトニトリル溶液を加え
て、室温で１時間反応させた。アセチルコリンエステラ
ーゼ活性は、３６５ｎｍの励起光による４５０ｎｍの蛍
光をＰＡＮＤＥＸ　　ＦＣＡ（バクスター社製）を、用
いて測定した。

【００２８】本発明による、ヒト由来細胞を培養して得
られる巨核球増幅因子の巨核球成熟促進活性は、以下の
方法で直接確認した。 （ｃ）巨核球染色体ＤＮＡ含量測定法 上述のようにして作製したアセチルコリンエステラーゼ
染色顕微鏡標本を、ＤＡＰＩ（４’−６−ｄｉａｍｉｄ
ｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）染色液に約１
０時間浸漬し、二重染色した。コロニーを形成している
巨核球約２００個を無作為に抽出し、オリンパス社製Ｂ
Ｈ２落射型顕微鏡及びＯＳＰ−１細胞内ＤＮＡ蛍光顕微
測光装置を用いて、それら細胞の染色体倍化数の分布を
測定した。なおＤＡＰＩ染色液は、下記の保存液１、２
、３を０．５：９８．５：１．０ｍｌの割合で混合し、
１００ｍｌとしたものを用いた。

【００２９】保存液１；ＤＡＰＩ１０ｍｇを１０００ｍ
ｌの蒸留水に溶解したもの。 保存液２；０．１Ｍ食塩、１０ｍＭエチレンジアミン四
酢酸を含むｐＨ７．４の１０ｍＭトリスヒドロキシメチ
ルアミノメタン緩衝液 保存液３；１Ｍ２−メルカプトエチルアミン塩酸塩液実
施例２　　ヒト細胞培養法による巨核球増幅因子の生産
ヒト胎児肺細胞を１００ｌ容のガラスボトルに、１０５
　ｃｅｌｌｓ／ｍｌの密度で２．５ｍｇ／ｍｌ濃度のサ
イトデックスＩ（細胞培養用ビーズ担体、ファルマシア
社製）と共に植え込み、３７℃、５％ＣＯ２　を含む空
気中で、生育培地として１０％牛胎児血清を含むメジウ
ムＭＥＭ培地を６０ｌ添加し、６０ｒｐｍの回転数で攪
はんしながら懸濁培養した。８日間培養し、細胞を充分
に増殖させた後、生理食塩液で細胞が接着したビーズ担
体を洗浄し、血清を含まない０．７５％のプロテオース
ペプトン　Ｎｏ．３　を含む、あるいは含まない、メジ
ウム１９９培地６０１に置き換え、６０ｒｐｍの回転数
で攪はんしながら培養した。３日目毎にこの培地を交換
しながら、本発明物質を含む培養液（ｃｏｎｄｉｔｉｏ
ｎｅｄ　ｍｅｄｉｕｍ；　ＣＭ）を回収した。ＣＭをセ
ントリコンで１０倍に濃縮し、その中に含まれる巨核球
増幅因子活性を、軟寒天培養法によるＭｅｇ−ＰＯＴ活
性測定法によって評価した結果を表１に示す。なお参考
までに、いくつかの他の細胞の培養液についてもこれを
評価した。ヒト胎児肺細胞は巨核球増幅因子を産生する
能力を有すること、またプロテオースペプトン存在下で
培養すると、著しく巨核球増幅因子活性の産生量が増大
することが示された。 実施例３　　巨核球増幅因子の精製 ヒト胎児肺細胞培養上清１７０ｌに、酢酸約１．１１を
添加し、ｐＨを４に調製した後、濾過によって細胞断片
及び生じた不溶物を除去した。予め０．２Ｍ食塩を含む
ｐＨ４．０の２０ｍＭ酢酸緩衝液で充分に平衡化した、
カルボキシメチルセファロース（ＣＭセファロース；フ
ァルマシア社製）カラム（直径９ｃｍ×高さ２３．５ｃ
ｍ）に吸着させ、同平衡化緩衝液１３．５１及び０．４
Ｍ食塩を含むｐＨ４．０の２０ｍＭ酢酸緩衝液６ｌで洗
浄後、０．７５Ｍ食塩及び１０ｍＭ塩酸リジンを含むｐ
Ｈ４．０の２０ｍＭ酢酸緩衝液１２ｌで吸着している蛋
白を溶出させた。本操作によって、巨核球増幅因子活性
を含む粗精製液Ｉとして約５ｌの溶出液を得た。培養上
清中に多量に含まれるプロテオースペプトン成分は、１
％以下にまで減少した。

【００３０】溶出液には通常、多量の組織プラスミノー
ゲンアクチベーター（ｔＰＡ）が含まれているので、こ
れを特異的に除去した。即ち、５Ｍ水酸化ナトリウム溶
液を加え、ｐＨを７．０に調整した後、予め０．５Ｍ食
塩を含むｐＨ７．５の２０ｍＭトリス塩酸緩衝液で充分
に平衡化した、ｔＰＡに対するモノクローナル抗体をセ
ファロースに結合させた（３ｍｇ／ｍｌゲル）抗体カラ
ム（直径９ｃｍ×高さ２９ｃｍ）を素通りさせた。本操
作によって、粗精製液ＩＩとして約６ｌの素通り液を得
た。通常、本カラムクロマトグラフィーによって、巨核
球増幅因子活性はほぼ定量的に回収された。また粗精製
液Ｉに多量に含まれるｔＰＡ活性は除去されると共に、
プロテオースペプトン成分は、更に約１／２にまで減少
した。

【００３１】粗精製液ＩＩ６ｌを限外濾過モジュールＳ
ＩＰ−１０１３（旭化成社製）で３００ｍｌにまで濃縮
し、１０倍容の約０．１Ｍ食塩を含むｐＨ７．６の２０
ｍＭリン酸緩衝液を加え、再び３００ｍｌにまで濃縮し
、緩衝液交換を行った。試料を直前にｐＨ＝５に調製し
た後、予め０．０５Ｍ食塩を含むｐＨ５．０の２０ｍＭ
クエン酸・リン酸緩衝液で充分に平衡化した、ＣＭセフ
ァロースカラム（直径５ｃｍ×高さ５ｃｍ）に吸着させ
、４００ｍｌの同緩衝液で洗浄した後、同緩衝液中で０
．０５〜０．５Ｍの食塩濃度の直線濃度勾配による溶出
を行った。流速は６０ｍｌ／時間で行った。巨核球増幅
因子活性は食塩濃度が約０．２〜０．４Ｍの間にピーク
を有する画分、即ち約１００ｍｌの粗精製液ＩＩＩ　と
して、３０〜５０％の回収率で回収された。

【００３２】粗精製液ＩＩＩ　１００ｍｌを上記限外濾
過中空糸を用いて５倍に濃縮し、これを予めＰＢＳで充
分に平衡化したセファクリルＳ−２００（ファルマシア
社製）カラム（直径２．６ｃｍ×高さ９２ｃｍ）でゲル
濾過した。巨核球増幅因子活性は溶出分子量が約２５ｋ
ｄ付近にピークを有する画分、即ち約５０ｍｌの粗精製
液ＩＶとして、４０〜６０％の回収率で回収された。

【００３３】粗精製液ＩＶを、予めＰＢＳで平衡化した
１０ｍｌ容のオレンジセファロース（アミコン社製）カ
ラムに吸着させ、ＰＢＳで洗浄後１Ｍの食塩濃度で溶出
して粗精製液Ｖとして活性を有する画分２５ｍｌを分取
した。粗精製液Ｖ２５ｍｌに硫酸アンモニウム粉末を添
加し１Ｍとした後、予め１Ｍ硫酸アンモニウムを含むＰ
ＢＳで平衡化した５ｍｌのフェニルセファロース（ファ
ルマシア社製）カラム（直径１．６ｃｍ×高さ２．５ｃ
ｍ）に吸着させ、ｐＨ７．０の２０ｍＭリン酸緩衝液で
洗浄後５０％のエチレングリコール濃度で溶出し、活性
画分を分取した。この画分から巨核球増幅因子の精製標
品として約３ｍｇが得られた。

【００３４】各精製工程に於ける精製度を表２に示す。 各試料の蛋白質濃度は、粗精製液ＩＶ，粗精製液Ｖ及び
精製標品については、２８０ｎｍにおける紫外吸光系数
Ａ２８０．１％＝１０と仮定して算出した。またそれ以
外の試料については、ローリー法で測定した。また精製
１段目ＣＭ、３段目ＣＭ、４段目ゲル濾過の各プロフィ
ールを図１〜３に示す。

【００３５】本精製標品をマウス（雄、１０週令、一群
６匹）の腹腔内に単回投与したところ、９６時間後に末
梢血の血小板数が有意に上昇したことが確認された。 実施例４　　遺伝子工学的手法による、巨核球増幅因子
の生産 ポリＡ＋　ｍＲＮＡの調製 ヒト胎児肺細胞１０８　ｃｅｌｌｓより、インビトロン
社製のＲＮＡアイソレーションキット（カタログ　Ｎｏ
．Ｋ１５９２−０１）を用いて、付属のマニュアルに従
い全ＲＮＡをグアニジンイソチオシアネート法により抽
出（２０３μｇ）し、オリゴデックス−ｄＴ３０（日本
合成ゴム社製）を用い、常法にしたがってポリＡ＋　ｍ
ＲＮＡ（１．６μｇ）を精製した。 ｃＤＮＡの合成 岡山−バーグの方法（ファルマシア社製、Ｏｋａｙａｍ
ａ−Ｂｅｒｇ　ｃＤＮＡ　Ｍａｎｕａｌ（１９８５））
に従い、真核生物発現用ベクター　ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）
−ｔａｉｌｅｄ　ｐＣＤＶ−１（ファルマシア社製　Ｎ
ｏ．２７−４９５５−０１）と上記で得たポリＡ＋　ｍ
ＲＮＡ及び　ｏｌｉｇｏ−ｄＧ−ｔａｉｌｅｄｐＬ１リ
ンカーを用い、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。 大腸菌の形質転換 ｃＤＮＡライブラリーを含む溶液を７０等分し、それぞ
れについて横田らの方法（医学のあゆみ、別冊細胞・遺
伝子・免疫バイオテクノロジーの基本　ｐ７５（１９８
６））に従い、大腸菌ＭＣ１０６１（ＡＴＣＣ５３３３
８）への形質転換を行った。形質転換した大腸菌をアン
ピシリン存在下で一晩培養した。この培養液より、キア
ゲン−ｔｉｐ−１００（キアゲン社製）を用い、付属の
マニュアルに従いプラスミドＤＮＡを調製した。 ＣＯＳ１細胞へのトランスフェクション及び巨核球増幅
因子の発現 上記のようにして得た組換え体ＤＮＡを、ジエチルアミ
ノエチル−デキストラン法（ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴ
ＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧ
Ｙ　９．２．１−９．２．６）により、ＣＯＳ１細胞（
ＡＴＣＣ，ＣＲＬ１６５０）に導入した後、特開昭６４
−６２１９号の、実施例２に記載の方法とほぼ同様にし
て遺伝子を発現させた。即ち、１０％牛胎児血清含むＤ
−ＭＥＭ培地（フローラボラトリー社製）で、３７℃、
４０時間、５％ＣＯ２　の条件で培養後、無血清のＤ−
ＭＥＭ培地に交換し、２日毎に３回培養液を回収した。 回収したそれぞれの培地３０ｍｌをセントリコンで２０
倍に濃縮した後、液体培養によるアセチルコリンエステ
ラーゼ活性測定法で巨核球増幅因子活性の測定を行った
ところ、１プールのみが陽性であった。 ｃＤＮＡライブラリーの絞り込み 巨核球増幅因子活性陽性であったＤＮＡについて、再度
大腸菌の形質転換を行ない、約２０００個のコロニーに
得た。このコロニーの１０個を一まとめとして培養し、
上記と同様にしてＤＮＡの調製、ＣＯＳ１細胞への導入
、発現及びアセチルコリンエステラーゼ活性測定を行な
い、ｃＤＮＡライブラリーの絞り込みを行った。本方法
を再度繰り返すことにより、該巨核球増幅因子活性を発
現するｃＤＮＡプラスミドを持つ大腸菌を単離した。 実施例５　　巨核球増幅因子の性質 分子量 本物質を予め同緩衝液で充分に平衡化したセファクリル
Ｓ−２００ＨＲ（ファルマシア社製）カラム（直径２．
６ｃｍ×高さ９４ｃｍ）を用い、ＰＢＳで展開した（流
速２７．６ｍｌ／ｈ）。これを４．６ｍｌずつ分画した
。各画分の巨核球増幅因子活性は、予めゲル濾過用低分
子量マーカー蛋白質キット（ファルマシア社製、ＢＳＡ
；６７ｋｄ、オブアルブミン；４３ｋｄ、キモトリプシ
ノーゲン；２５ｋｄ、リボヌクレアーゼＡ；１４ｋｄ）
及びブルーデキストラン２０００の溶出位置を確認し、
これらとの溶出位置の比較から分子量を測定した。 本物質は、２５ｋｄ付近に溶出された。 等電点 精製標品１ｍｌを下記の開始溶媒に置換した後、等電点
クロマトグラフィーを用いて、下記条件で等電点を測定
したところ、本物質はｐＩ＞９と見積られた。図４にこ
の等電点クロマトグラフィーの結果を示す。 カラム；モノＰ　　ＨＲ５／２０（ファルマシア社製）
開始溶媒；ｐＨ９．３の０．０７５Ｍトリス−酢酸緩衝
液 展開溶媒；１０％ポリバッファー９６（ファルマシア社
製）、酢酸でｐＨを６．０とした。 流速　　　　；１．０ｍｌ／分 熱、及びトリプシン処理に対する安定性本物質をＰＢＳ
中で１００℃、１０分間処理し、残存する巨核球増幅因
子活性から安定性を評価した。本物質の活性は、５％以
下に失活し、不安定であった。また本物質は、０．１２
５ｍｇ／ｍｌのトリプシンで３７℃、１時間の処理に対
しても感受性が高かった。 抗原性 本物質がＩＬ−１及びＩＬ−６と免疫学的に区別できる
かどうか、検討した。粗精製液ＩＶを抗ＩＬ−１及び６
抗体カラム（エンドジェン社製）に通したところ、活性
は素通り画分に回収された。従って本物質はこれらサイ
トカインの抗体とは反応しないことが示唆された。 巨核球増幅因子活性 本物質の巨核球増幅因子活性を軟寒天培養法で検討した
。結果を表３に示す。ＩＬ−６（ゼンザイム社製）の活
性は、２００ｎｇ／ｍｌの高濃度を用いても、ＩＬ−３
のみの時のわずか約２倍であったが、本物質の精製標品
は、ＩＬ−３のみの時の約２０倍の活性を示した。また
ＩＬ−３のみの時に比べ、本物質の精製標品は、１コロ
ニー当りのアセチルコリンエステラーゼ活性を強く示す
細胞の数が多数観察された。また本物質単独では、巨核
球増幅因子活性を示さないことから、本物質にはＭｅｇ
−ＣＳＦ活性がないことがわかった。

【００３６】さらにまた、上述の軟寒天培養法において
、１％ＩＬ−３含有ＣＯＳ１細胞培養上清の代わりに精
製ＩＬ−３（ゼンザイム社製）を用いた以外は同じ方法
にて本物質の巨核球増幅因子活性を評価したところ、上
記と同様の結果が得られた。またＩＬ−３のみ、ＩＬ−
３＋ＩＬ−６（１５０ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ−３＋本物
質（１０μｌ）の試料について、巨核球染色体ＤＮＡ含
量測定法により、染色体倍数の測定を行ったところ、Ｉ
Ｌ−３のみの時には４ｎ〜８ｎの細胞が最も多かったの
に対し、ＩＬ−６では１６ｎ以上の細胞が約５０％、本
物質では８０％以上に達し、本物質の強い巨核球増幅因
子活性が示された。

【００３７】更にまた、本物質の巨核球増幅因子活性を
液体培養によるアセチルコリンエステラーゼ活性測定法
により評価した。結果を図５，６に示す。無血清条件下
でも本物質の強い巨核球増幅因子活性が示された。これ
らの巨核球増幅因子活性は、ＩＬ−３としてＩＬ−３含
有ＣＯＳ１細胞培養上清の代わりにｒｈＩＬ−３（ゼン
ザイム社製）を用いたときも同様に観察された。 適用例 以下に本発明の巨核球増幅因子の適用例を応用例をもっ
て説明するが、本発明はそれら応用例をもって何ら限定
されるものではない。 応用例１ 精製した本発明の巨核球増幅因子　　　　　　　　　　
　　　　１ｍｇ精製ゼラチン　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０ｍｇマンニ
トール　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　１００ｍｇ塩化ナトリウム　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　７．８ｍｇリ
ン酸ナトリウム　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　１５．４ｍｇ上記成分を注射用蒸留水２ｍｌに
溶解し、無菌バイアルに入れ、−３５℃で真空度０．０
７５Ｔｏｒｒで３５時間一次乾燥し、次いで３０℃、真
空度０．０３Ｔｏｒｒで５時間二次乾燥して、注射用バ
イアルを製造した。得られた組成物は、投与直前に生理
食塩水もしくはブドウ糖注射液５００ｍｌに溶解して点
滴静注するのに用いられる。 応用例２ 精製した本発明の巨核球増幅因子　　　　　　　　　　
　　１０μｇアルブミン　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５ｍｇマン
ニトール　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　２５ｍｇ塩化ナトリウム　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．９５ｍｇ
リン酸ナトリウム　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　３．８５ｍｇ上記成分にて、応用例１と実質
的に同様の方法により注射用バイアルを製造した。

【００３８】

【表１】

【００３９】

【表２】

【００４０】

【表３】

【００４１】

【発明の効果】本発明によれば、巨核球増幅を活性化す
る活性を有し、且つ末梢血中の血小板を増加させる活性
を有する、新規な巨核球増幅因子が提供される。本発明
の巨核球増幅因子は、種々の血小板減少症の治療や予防
を可能にする。

【図面の簡単な説明】

【図１】精製１段目のＣＭカラムクロマトグラムを示す
。

【図２】精製３段目のＣＭカラムクロマトグラムを示す
。

【図３】精製４段目のゲル濾過のカラムクロマトグラム
を示す。

【図４】本発明による巨核球増幅因子の等電点クロマト
グラフィーの結果を示す。

【図５】無血清条件での液体培養によるアセチルコリン
エステラーゼ活性測定法により評価した、本発明による
巨核球増幅因子及びＩＬ−６の巨核球増幅因子活性測定
の結果を示す。

【図６】１５％のＤＦＰ処理した馬血清を含む条件での
液体培養によるアセチルコリンエステラーゼ活性測定法
により評価した、本発明による巨核球増幅因子及びＩＬ
−６の巨核球増幅因子活性測定の結果を示す。

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　巨核球増幅を活性化する活性を有し、
   且つ末梢血中の血小板を増加させる活性を有する巨核球
   増幅因子。
2. 【請求項２】　　巨核球増幅を活性化する活性を有し、
   下記の諸性質を有することを特徴とする、巨核球増幅因
   子。 （ａ）分子量：２５０００±８０００（ゲル濾過で測定
   ） （ｂ）等電点：ｐＩ＞９（等電点クロマトグラフィーで
   測定） （ｃ）巨核球コロニー刺激因子活性を有さない。
3. 【請求項３】　　該巨核球増幅因子がヒト細胞由来であ
   る請求項２に記載の巨核球増幅因子。
4. 【請求項４】　　ヒト細胞が正常二倍体細胞である請求
   項３に記載の巨核球増幅因子。
5. 【請求項５】　　正常二倍体細胞が肺由来である請求項
   ４に記載の巨核球増幅因子。
6. 【請求項６】　　請求項１に記載の巨核球増幅因子を産
   生する細胞を培養し、その培養上清中に巨核球増幅因子
   を産生させ、回収した培養上清から巨核球増幅を活性化
   する活性を有し、下記の諸性質を有する巨核球増幅因子
   を精製することを含む巨核球増幅因子の製造方法。 （ａ）分子量：２５０００±８０００（ゲル濾過で測定
   ） （ｂ）等電点：ｐＩ＞９（等電点クロマトグラフィーで
   測定） （ｃ）巨核球コロニー刺激因子活性を有さない。
7. 【請求項７】　　巨核球増幅因子を産生する細胞がヒト
   細胞である請求項６に記載の巨核球増幅因子の製造方法
   。
8. 【請求項８】　　ヒト細胞が正常二倍体細胞である請求
   項７に記載の巨核球増幅因子の製造方法。
9. 【請求項９】　　正常二倍体細胞が肺由来の細胞である
   請求項８に記載の巨核球増幅因子の製造方法。
10. 【請求項１０】　　請求項２に記載の巨核球増幅因子を
    産生する細胞を培養し、その培養上清中に巨核球増幅因
    子を産生させ、回収した培養上清から巨核球増幅を活性
    化する活性を有し、下記の諸性質を有する巨核球増幅因
    子を精製することを含む巨核球増幅因子の製造方法。 （ａ）分子量：２５０００±８０００（ゲル濾過で測定
    ） （ｂ）等電点：ｐＩ＞９（等電点クロマトグラフィーで
    測定） （ｃ）巨核球コロニー刺激因子活性を有さない。
11. 【請求項１１】　　巨核球増幅因子を産生する細胞がヒ
    ト細胞である請求項１０に記載の巨核球増幅因子の製造
    方法。
12. 【請求項１２】　　ヒト細胞が正常二倍体細胞である請
    求項１１に記載の巨核球増幅因子の製造方法。
13. 【請求項１３】　　正常二倍体細胞が肺由来の細胞であ
    る請求項１２に記載の巨核球増幅因子の製造方法。
14. 【請求項１４】　　培養した細胞を、培地中に添加した
    巨核球増幅因子産生促進剤と接触させることにより、培
    養上清中に産生される該巨核球増幅因子の量を増大せし
    めることを特徴とする請求項６または請求項１０に記載
    の巨核球増幅因子の製造方法。
15. 【請求項１５】　　巨核球増幅因子産生促進剤が獣肉ペ
    プトンである請求項１４に記載の巨核球増幅因子の製造
    方法。
16. 【請求項１６】　　請求項１に記載の巨核球増幅因子を
    産生する細胞から （ａ）ｍＲＮＡを抽出し、（ｂ）得られた該ｍＲＮＡよ
    りポリＡ＋　ｍＲＮＡを精製し、（ｃ）適当な発現用ベ
    クター及び（ｂ）で得られたポリＡ＋　ｍＲＮＡとから
    ｃＤＮＡライブラリーを調製し、（ｄ）得られたｃＤＮ
    Ａライブラリーより適当な宿主細胞を用いて、プラスミ
    ドＤＮＡを調製し、（ｅ）得られたプラスミドＤＮＡを
    用いて、更に適当な宿主細胞をトランスフェクトし、（
    ｆ）該宿主細胞あるいは該巨核球増幅因子活性を指標に
    該宿主細胞をスクリーニングして得た細胞を用いて、該
    巨核球増幅因子を発現させ、これを回収し、（ｇ）該巨
    核球増幅因子を精製することを含む該巨核球増幅因子の
    製造方法
17. 【請求項１７】　　請求項２に記載の巨核球増幅因子を
    産生する細胞から（ａ）ｍＲＮＡを抽出し、（ｂ）得ら
    れた該ｍＲＮＡよりポリＡ＋　ｍＲＮＡを精製し、（ｃ
    ）適当な発現用ベクター及び（ｂ）で得られたポリＡ＋
    　ｍＲＮＡとからｃＤＮＡライブラリーを調製し、（ｄ
    ）得られたｃＤＮＡライブラリーより適当な宿主細胞を
    用いて、プラスミドＤＮＡを調製し、（ｅ）得られたプ
    ラスミドＤＮＡを用いて、更に適当な宿主細胞をトラン
    スフェクトし、（ｆ）該宿主細胞あるいは該巨核球増幅
    因子活性を指標に該宿主細胞をスクリーニングして得た
    細胞を用いて、該巨核球増幅因子を発現させ、これを回
    収し、（ｇ）該巨核球増幅因子を精製することを含む該
    巨核球増幅因子の製造方法。
18. 【請求項１８】　　巨核球増幅因子を産生する細胞が、
    ヒトの肺由来の細胞である請求項１６または請求項１７
    に記載の巨核球増幅因子の製造方法。
19. 【請求項１９】　　請求項１に記載の巨核球増幅因子；
    及び少なくとも１種の薬剤として投与可能な担体、希釈
    液または賦形剤を含有する医薬組成物。
20. 【請求項２０】　　請求項２に記載の巨核球増幅因子；
    及び少なくとも１種の薬剤として投与可能な担体、希釈
    液または賦形剤を含有する医薬組成物。