JPH06192124A - 血液細胞増加剤 - Google Patents
血液細胞増加剤Info
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- JPH06192124A JPH06192124A JP4346408A JP34640892A JPH06192124A JP H06192124 A JPH06192124 A JP H06192124A JP 4346408 A JP4346408 A JP 4346408A JP 34640892 A JP34640892 A JP 34640892A JP H06192124 A JPH06192124 A JP H06192124A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 カテプシンＬを有効成分とする新規な血液細
胞増加剤。 【効果】 本発明の血液細胞増加剤は巨核芽球増幅活性
を有するため、造血機能不全の治療剤として用いること
ができる。
胞増加剤。 【効果】 本発明の血液細胞増加剤は巨核芽球増幅活性
を有するため、造血機能不全の治療剤として用いること
ができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、血小板減少症などの疾
患の治療に有用な新規な造血因子および該造血因子を有
効成分として含有する血液細胞増加剤に関する。
患の治療に有用な新規な造血因子および該造血因子を有
効成分として含有する血液細胞増加剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】血小板は、出血時に出血を止めるための
血栓形成や血液凝固の過程において促進的に働く重要な
役割を有している。血小板は骨髄巨核球から産生される
が、その過程に作用する液性因子は、分化初期に作用す
る巨核球コロニー刺激因子（Megakaryocyte-colony sti
mulating factor:Ｍｅｇ−ＣＳＦ）と、ある程度成熟し
た巨核前駆細胞に作用するトロンボポイエチン(Thrombo
poietin:ＴＰＯ）、あるいは巨核球増幅因子（Megakary
ocyte-potentiator:ＰＯＴ）に分けられる。過去２０年
以上の研究にもかかわらず、巨核球血小板系造血に特異
的にかかわる因子は未だ同定されておらず、その発見と
応用が久しく待ち望まれている。
血栓形成や血液凝固の過程において促進的に働く重要な
役割を有している。血小板は骨髄巨核球から産生される
が、その過程に作用する液性因子は、分化初期に作用す
る巨核球コロニー刺激因子（Megakaryocyte-colony sti
mulating factor:Ｍｅｇ−ＣＳＦ）と、ある程度成熟し
た巨核前駆細胞に作用するトロンボポイエチン(Thrombo
poietin:ＴＰＯ）、あるいは巨核球増幅因子（Megakary
ocyte-potentiator:ＰＯＴ）に分けられる。過去２０年
以上の研究にもかかわらず、巨核球血小板系造血に特異
的にかかわる因子は未だ同定されておらず、その発見と
応用が久しく待ち望まれている。
【０００３】近年、分離されたサイトカインのいくつか
は血小板造血系に関与することが明らかにされ、注目さ
れている。
は血小板造血系に関与することが明らかにされ、注目さ
れている。
【０００４】Ｍｅｇ−ＣＳＦ活性は、巨核球前駆細胞
（megakaryocyte colony-forming unit:ＣＦＵ−Ｍｅ
ｇ）の細胞分裂の刺激やコロニーサイズの増加で検出す
ることができ、in vitroではヒトまたはマウスの骨髄細
胞を軟寒天中、あるいはメチルセルロース中で培養する
と巨核球コロニーを形成させる活性として測定される。
現在のところ報告されているＭｅｇ−ＣＳＦとしては、
インターロイキン３（ＩＬ−３）と顆粒球−マクロファ
ージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）であり、Stem c
ell factor（ＳＣＦ＝c-kit ligand）も巨核球前駆細胞
に働く因子とされている。
（megakaryocyte colony-forming unit:ＣＦＵ−Ｍｅ
ｇ）の細胞分裂の刺激やコロニーサイズの増加で検出す
ることができ、in vitroではヒトまたはマウスの骨髄細
胞を軟寒天中、あるいはメチルセルロース中で培養する
と巨核球コロニーを形成させる活性として測定される。
現在のところ報告されているＭｅｇ−ＣＳＦとしては、
インターロイキン３（ＩＬ−３）と顆粒球−マクロファ
ージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）であり、Stem c
ell factor（ＳＣＦ＝c-kit ligand）も巨核球前駆細胞
に働く因子とされている。
【０００５】一方、Ｍｅｇ−ＰＯＴ活性は、巨核球のサ
イズの増加、巨核球のＤＮＡ量の増加、あるいは巨核球
酵素（アセチルコリンエステラーゼ）量の増加などを指
標とし、in vitroではヒトまたはマウスの骨髄細胞を軟
寒天中あるいはメチルセルロース中で培養し、巨核球コ
ロニー中の細胞のサイズやＤＮＡ量を計測したり、また
液体培養下でアセチルコリンエステラーゼを定量するこ
とで検出される。Ｍｅｇ−ＰＯＴ活性のあるサイトカイ
ンとしては、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１１、エリス
ロポイエチン（ＥＰＯ）、マクロファージコロニー刺激
因子（Ｍ−ＣＳＦ）、Leukemia inhibitory factor（Ｌ
ＩＦ）などが報告されている。
イズの増加、巨核球のＤＮＡ量の増加、あるいは巨核球
酵素（アセチルコリンエステラーゼ）量の増加などを指
標とし、in vitroではヒトまたはマウスの骨髄細胞を軟
寒天中あるいはメチルセルロース中で培養し、巨核球コ
ロニー中の細胞のサイズやＤＮＡ量を計測したり、また
液体培養下でアセチルコリンエステラーゼを定量するこ
とで検出される。Ｍｅｇ−ＰＯＴ活性のあるサイトカイ
ンとしては、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１１、エリス
ロポイエチン（ＥＰＯ）、マクロファージコロニー刺激
因子（Ｍ−ＣＳＦ）、Leukemia inhibitory factor（Ｌ
ＩＦ）などが報告されている。
【０００６】Ｍｅｇ−ＣＳＦおよびＭｅｇ−ＰＯＴ活性
測定法は、具体的には、例えばTanaka et al. の報告
（Blood, 80, 1743-1749, 1992）に詳しく、また各種サ
イトカインの作用の程度については、河北の総説（実験
医学，10, 365-376, 1992 ）に述べられている。
測定法は、具体的には、例えばTanaka et al. の報告
（Blood, 80, 1743-1749, 1992）に詳しく、また各種サ
イトカインの作用の程度については、河北の総説（実験
医学，10, 365-376, 1992 ）に述べられている。
【０００７】上記に述べたＭｅｇ−ＣＳＦあるいはＭｅ
ｇ−ＰＯＴ活性を有する既知のサイトカイン類のほか
に、巨核球血小板系造血に働く因子として、ヒト胎児腎
細胞由来の分子量１５０００［ドデシル硫酸ナトリウム
を含むポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ）による測定］、ｐＩ５．１の巨核球促進因子（特
開昭６３−２３９２９８）、ヒト肺ガン細胞由来の分子
量２４０００、ｐＩ４．５〜５．５の巨核球系コロニー
刺激因子（ＷＯ ９０／０３３９７）、ヒト線維芽細胞
由来の分子量２５０００±８０００（ゲル濾過による測
定）、ｐＩ＞９の巨核球増幅因子（特開平４−２９５５
０）、さらにヒト尿由来の分子量５００００（モノマー
２５０００のホモダイマー）の血小板増殖因子（日経バ
イオテク、１９９２年６月８日号）などが報告されてい
る。
ｇ−ＰＯＴ活性を有する既知のサイトカイン類のほか
に、巨核球血小板系造血に働く因子として、ヒト胎児腎
細胞由来の分子量１５０００［ドデシル硫酸ナトリウム
を含むポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ）による測定］、ｐＩ５．１の巨核球促進因子（特
開昭６３−２３９２９８）、ヒト肺ガン細胞由来の分子
量２４０００、ｐＩ４．５〜５．５の巨核球系コロニー
刺激因子（ＷＯ ９０／０３３９７）、ヒト線維芽細胞
由来の分子量２５０００±８０００（ゲル濾過による測
定）、ｐＩ＞９の巨核球増幅因子（特開平４−２９５５
０）、さらにヒト尿由来の分子量５００００（モノマー
２５０００のホモダイマー）の血小板増殖因子（日経バ
イオテク、１９９２年６月８日号）などが報告されてい
る。
【０００８】しかし、これらの因子が本来生理的に機能
しているＭｅｇ−ＣＳＦあるいはＭｅｇ−ＰＯＴである
かどうかは未だ不明であり、産業上および医療上、有用
な医薬あるいは診断薬となり得るか否かは立証されてい
ない。
しているＭｅｇ−ＣＳＦあるいはＭｅｇ−ＰＯＴである
かどうかは未だ不明であり、産業上および医療上、有用
な医薬あるいは診断薬となり得るか否かは立証されてい
ない。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】上述してきたように、
巨核球を増殖促進あるいは増幅促進させ、血小板増加を
主作用とする造血因子として、従来よりＭｅｇ−ＣＳＦ
あるいはＭｅｇ−ＰＯＴ活性を有するいくつかの因子が
見出されてきている。しかし、これらの因子の産業上、
医療上の有用性、および各因子間の利用上の優劣も判明
していないのが現状である。したがって、本来生体内で
本質的にＭｅｇ−ＣＳＦあるいはＭｅｇ−ＰＯＴ活性因
子として働いている物質の探索は続けられており、この
ような本質的因子の発見とその利用が産業上および医療
上の解決されるべき重要な課題として残されている。
巨核球を増殖促進あるいは増幅促進させ、血小板増加を
主作用とする造血因子として、従来よりＭｅｇ−ＣＳＦ
あるいはＭｅｇ−ＰＯＴ活性を有するいくつかの因子が
見出されてきている。しかし、これらの因子の産業上、
医療上の有用性、および各因子間の利用上の優劣も判明
していないのが現状である。したがって、本来生体内で
本質的にＭｅｇ−ＣＳＦあるいはＭｅｇ−ＰＯＴ活性因
子として働いている物質の探索は続けられており、この
ような本質的因子の発見とその利用が産業上および医療
上の解決されるべき重要な課題として残されている。
【００１０】本発明はこの課題を解決すべく、産業上お
よび医療上有用な巨核芽球増幅活性を有する造血因子お
よびこの造血因子を有効成分として含有する血液細胞増
加剤を提供することにある。
よび医療上有用な巨核芽球増幅活性を有する造血因子お
よびこの造血因子を有効成分として含有する血液細胞増
加剤を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、強力に巨
核球の増幅を促進する作用を有する新規な巨核芽球増幅
因子を見出すべく鋭意研究を重ねた結果、本発明を完成
した。すなわち本発明によれば、巨核芽球増幅活性を有
するカテプシンＬを有効成分とする血液細胞増加剤であ
る。
核球の増幅を促進する作用を有する新規な巨核芽球増幅
因子を見出すべく鋭意研究を重ねた結果、本発明を完成
した。すなわち本発明によれば、巨核芽球増幅活性を有
するカテプシンＬを有効成分とする血液細胞増加剤であ
る。
【００１２】ヒト・カテプシンＬは、すでにチオール・
プロテアーゼの一種として知られており（Mason ら，Bi
ochemical Journal, 240, 373-377, 1986 ）、エラスチ
ン分解能（Mason ら，Biochemical Journal, 233, 925-
927, 1986 ）やα１−プロテアーゼインヒビターを不活
性化する作用（Johnson ら，Journal of BiologicalChe
mistry, 261, 14748-14751, 1986 ）が報告されてい
る。
プロテアーゼの一種として知られており（Mason ら，Bi
ochemical Journal, 240, 373-377, 1986 ）、エラスチ
ン分解能（Mason ら，Biochemical Journal, 233, 925-
927, 1986 ）やα１−プロテアーゼインヒビターを不活
性化する作用（Johnson ら，Journal of BiologicalChe
mistry, 261, 14748-14751, 1986 ）が報告されてい
る。
【００１３】ヒト・カテプシンＬのプレプロ体は、３３
３個のアミノ酸残基からなり（分子量３８０００）、前
駆体（プロ体）はＮ末端１−１７残基が除去されたもの
である。すなわち、１８−３３３残基を含み（３１６個
のアミノ酸残基で分子量３６０００）、Ｎ末端アミノ酸
配列は配列表の配列番号１の通りである（Josephら、J.
Clinic. Investigation, 81, 1621-1629, 1988 ）。こ
のうち、１８−１１３残基はアクチベーション・ペプチ
ドと言われ、１１４−２８８残基はカテプシンＨ重鎖、
２９２−３３３残基はカテプシンＬ鎖である。
３個のアミノ酸残基からなり（分子量３８０００）、前
駆体（プロ体）はＮ末端１−１７残基が除去されたもの
である。すなわち、１８−３３３残基を含み（３１６個
のアミノ酸残基で分子量３６０００）、Ｎ末端アミノ酸
配列は配列表の配列番号１の通りである（Josephら、J.
Clinic. Investigation, 81, 1621-1629, 1988 ）。こ
のうち、１８−１１３残基はアクチベーション・ペプチ
ドと言われ、１１４−２８８残基はカテプシンＨ重鎖、
２９２−３３３残基はカテプシンＬ鎖である。
【００１４】しかしながら、これらポリペプチド成分の
造血因子としての生理活性は従来まったく知られておら
ず、本発明によってその巨核芽球増幅活性が初めて明ら
かにされた。すなわち本発明は、巨核芽球増幅活性を有
するカテプシンＬを有効成分として含有する血液細胞増
加剤に関する。
造血因子としての生理活性は従来まったく知られておら
ず、本発明によってその巨核芽球増幅活性が初めて明ら
かにされた。すなわち本発明は、巨核芽球増幅活性を有
するカテプシンＬを有効成分として含有する血液細胞増
加剤に関する。
【００１５】本発明のカテプシンＬには、前駆体（１８
−３３３残基）、成熟体（１１４−３３３残基）、Ｈ鎖
（１１４−２８８残基）、Ｌ鎖（２９２−３３３残基）
いずれも含まれるが、前駆体が好ましく用いられる。
−３３３残基）、成熟体（１１４−３３３残基）、Ｈ鎖
（１１４−２８８残基）、Ｌ鎖（２９２−３３３残基）
いずれも含まれるが、前駆体が好ましく用いられる。
【００１６】本発明において使用されるカテプシンＬ
は、細胞培養によって得ることができるほか、すでにそ
のｃＤＮＡがクローニングされて全塩基配列が決定され
ているので（Josephら，Journal of Clinical Investig
ation, 81, 1621-1629, 1988）、いわゆる遺伝子組換え
技術を応用して組換え型タンパク質として得ることもで
きる。
は、細胞培養によって得ることができるほか、すでにそ
のｃＤＮＡがクローニングされて全塩基配列が決定され
ているので（Josephら，Journal of Clinical Investig
ation, 81, 1621-1629, 1988）、いわゆる遺伝子組換え
技術を応用して組換え型タンパク質として得ることもで
きる。
【００１７】すなわち本造血因子は、ヒト培養細胞培養
上清からの精製分離あるいは本造血因子に対応するｃＤ
ＮＡを用いて、いわゆる遺伝子組換え技術によって作製
された細胞の抽出液あるいは細胞培養上清からの精製分
離、さらには胎児胚に本造血因子に対応するｃＤＮＡを
適当なベクター系にて注入して得られた、いわゆるトラ
ンスジェニック動物の乳などの体液成分からの精製分離
することによって得られる。
上清からの精製分離あるいは本造血因子に対応するｃＤ
ＮＡを用いて、いわゆる遺伝子組換え技術によって作製
された細胞の抽出液あるいは細胞培養上清からの精製分
離、さらには胎児胚に本造血因子に対応するｃＤＮＡを
適当なベクター系にて注入して得られた、いわゆるトラ
ンスジェニック動物の乳などの体液成分からの精製分離
することによって得られる。
【００１８】ヒト培養細胞は、本造血因子を産生する能
力を有する各種の正常組織由来細胞あるいは株化細胞の
いずれでも対象となるが、好ましくは血球系細胞や線維
芽細胞や骨髄ストローマ細胞、線維芽細胞である。
力を有する各種の正常組織由来細胞あるいは株化細胞の
いずれでも対象となるが、好ましくは血球系細胞や線維
芽細胞や骨髄ストローマ細胞、線維芽細胞である。
【００１９】遺伝子組換え技術を利用して本造血因子を
調製する場合には、宿主細胞として、ＣＨＯ（チャイニ
ーズハムスター卵巣）細胞、マウスＣ１２７細胞などの
哺乳動物細胞、カイコ、夜盗蛾などの昆虫細胞、大腸
菌、枯草菌、酵母などの微生物などを用いることができ
る。さらに、トランスジェニック動物を宿主とする場合
には、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ヒ
ツジ、ブタ、ウシなどを用いることができる。
調製する場合には、宿主細胞として、ＣＨＯ（チャイニ
ーズハムスター卵巣）細胞、マウスＣ１２７細胞などの
哺乳動物細胞、カイコ、夜盗蛾などの昆虫細胞、大腸
菌、枯草菌、酵母などの微生物などを用いることができ
る。さらに、トランスジェニック動物を宿主とする場合
には、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ヒ
ツジ、ブタ、ウシなどを用いることができる。
【００２０】このようにして調製された本造血因子を含
む細胞培養上清、虫体抽出液、菌体抽出液、生体体液な
どを原料として種々のクロマトグラフィーにより、本造
血因子を精製分離することができる。用いるクロマトグ
ラフィーは本造血因子に親和性を有するものであればい
ずれでもよいが、例えば、二酸化ケイ素（シリカ）やリ
ン酸カルシウムを吸着素材とするカラム、ヘパリンや色
素や疎水量をリガンドとするカラム、金属キレートカラ
ム、イオン交換カラム、ゲル濾過カラムなどである。
む細胞培養上清、虫体抽出液、菌体抽出液、生体体液な
どを原料として種々のクロマトグラフィーにより、本造
血因子を精製分離することができる。用いるクロマトグ
ラフィーは本造血因子に親和性を有するものであればい
ずれでもよいが、例えば、二酸化ケイ素（シリカ）やリ
ン酸カルシウムを吸着素材とするカラム、ヘパリンや色
素や疎水量をリガンドとするカラム、金属キレートカラ
ム、イオン交換カラム、ゲル濾過カラムなどである。
【００２１】精製された本造血因子は、骨髄機能抑制に
よる造血機能不全の治療剤として用いることができる
が、好ましくは血小板増加用途の治療薬として利用する
ことができる。例えば、抗癌剤投与後の血小板減少症、
放射線治療後の血小板減少症、巨核球増幅因子欠損によ
る血小板減少症、再生不良性貧血の血小板減少症、骨髄
移植後の血小板減少症、自己免疫疾患の血小板減少症の
治療および予防に用いることができる。また、巨核球系
細胞の減少を伴うような一部の白血病の治療、骨髄異形
成症候群の治療、輸血用骨髄細胞のin vitro事前培養時
の増殖剤、さらには血小板輸血の代替剤あるいは補助剤
として用いることができる。
よる造血機能不全の治療剤として用いることができる
が、好ましくは血小板増加用途の治療薬として利用する
ことができる。例えば、抗癌剤投与後の血小板減少症、
放射線治療後の血小板減少症、巨核球増幅因子欠損によ
る血小板減少症、再生不良性貧血の血小板減少症、骨髄
移植後の血小板減少症、自己免疫疾患の血小板減少症の
治療および予防に用いることができる。また、巨核球系
細胞の減少を伴うような一部の白血病の治療、骨髄異形
成症候群の治療、輸血用骨髄細胞のin vitro事前培養時
の増殖剤、さらには血小板輸血の代替剤あるいは補助剤
として用いることができる。
【００２２】本発明の造血因子は、そのままもしくは自
体公知の薬理学的に許容される担体、賦形剤などと混合
した医薬組成物として、経口または非経口的に投与する
ことができる。
体公知の薬理学的に許容される担体、賦形剤などと混合
した医薬組成物として、経口または非経口的に投与する
ことができる。
【００２３】経口投与のための剤形としては、具体的に
は錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、シロップ剤、乳
剤、懸濁剤などが挙げられる。かかる剤形は、自体公知
の方法によって製造され、製剤分野において通常用いら
れる担体もしくは賦形剤を含有するものである。例え
ば、錠剤用の担体、賦形剤としては、ラクトース、マル
トース、サッカロース、澱粉、ステアリン酸マグネシウ
ムなどが挙げられる。
は錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、シロップ剤、乳
剤、懸濁剤などが挙げられる。かかる剤形は、自体公知
の方法によって製造され、製剤分野において通常用いら
れる担体もしくは賦形剤を含有するものである。例え
ば、錠剤用の担体、賦形剤としては、ラクトース、マル
トース、サッカロース、澱粉、ステアリン酸マグネシウ
ムなどが挙げられる。
【００２４】非経口投与のための剤形としては、例え
ば、軟膏剤、注射剤、湿布剤、塗布剤、座剤、経鼻吸収
剤、経肺吸収剤、経皮吸収剤などが挙げられる。溶液製
剤は自体公知の方法、例えば、本発明の造血因子を通
常、注射剤に用いられた無菌の水溶液に溶解、あるいは
抽出液に懸濁、さらには乳化してリポソームに包埋させ
た状態で調製され得る。固体製剤としては、自体公知の
方法、例えば、本発明の造血因子にマンニトール、トレ
ハロース、ソルビトール、ラクトース、グルコースなど
を賦形剤として加え、凍結乾燥物として調製され得る。
ゲル化剤としては、自体公知の方法、例えば、本発明の
造血因子をグリセリン、ポリエチレングリコール、メチ
ルセルロース、カルボキシルメチルセルロースなどの増
粘剤に溶解した状態で調製され得る。
ば、軟膏剤、注射剤、湿布剤、塗布剤、座剤、経鼻吸収
剤、経肺吸収剤、経皮吸収剤などが挙げられる。溶液製
剤は自体公知の方法、例えば、本発明の造血因子を通
常、注射剤に用いられた無菌の水溶液に溶解、あるいは
抽出液に懸濁、さらには乳化してリポソームに包埋させ
た状態で調製され得る。固体製剤としては、自体公知の
方法、例えば、本発明の造血因子にマンニトール、トレ
ハロース、ソルビトール、ラクトース、グルコースなど
を賦形剤として加え、凍結乾燥物として調製され得る。
ゲル化剤としては、自体公知の方法、例えば、本発明の
造血因子をグリセリン、ポリエチレングリコール、メチ
ルセルロース、カルボキシルメチルセルロースなどの増
粘剤に溶解した状態で調製され得る。
【００２５】いずれの製剤においても、安定化剤として
ヒト血清アルブミン、ヒト免疫グロブリン、α２マクロ
クロブリン、アミノ酸などを添加することができ、また
分散剤あるいは吸収促進剤として、本発明の造血因子の
生理活性を損なわない範囲でアルコール、糖アルコー
ル、イオン性界面滑性剤、非イオン性界面活性剤などを
添加することができる。
ヒト血清アルブミン、ヒト免疫グロブリン、α２マクロ
クロブリン、アミノ酸などを添加することができ、また
分散剤あるいは吸収促進剤として、本発明の造血因子の
生理活性を損なわない範囲でアルコール、糖アルコー
ル、イオン性界面滑性剤、非イオン性界面活性剤などを
添加することができる。
【００２６】本発明の造血因子の有効投与量および投与
回数は、投与剤形、投与レート、患者の年齢、体重、治
療すべき症状の性質もしくは重篤度によっても異なる
が、通常、成人一人あたり０．０１〜１００ｍｇを、好
ましくは０．１〜１０ｍｇを一回または数回に分けて投
与することができる。
回数は、投与剤形、投与レート、患者の年齢、体重、治
療すべき症状の性質もしくは重篤度によっても異なる
が、通常、成人一人あたり０．０１〜１００ｍｇを、好
ましくは０．１〜１０ｍｇを一回または数回に分けて投
与することができる。
【００２７】
【実施例】以下、本発明をより詳細に説明するために実
施例を示すが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。
施例を示すが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。
【００２８】実施例１ ヒト線維芽細胞を１×１０6 cell／mlで５％新生仔ウシ
血清を含むイーグルＭＥＭ１リットルに播種し、２リッ
トルのガラス培養槽で、０．３％マイクロキャリー
（“Cytodex 1 ”、ファルマシア社）に接着させて撹拌
しながら、３７℃、５日間培養した。その後、無血清イ
ーグルＭＥＭ培地１リットルに交換し、１００国際単位
／ｍｌでヒト・インターフェロンβを加えた。２４時間
後、さらにポリ（Ｉ）：ポリ（Ｃ）を１０μｇ／ｍｌで
加え、その２時間後、少量のメチルセルロースを含むイ
ーグルＭＥＭ培地に置換し、その後、６日間培養を続け
た。培養終了後、マイクロキャリヤーを沈降させた後、
上清を別の容器に移し、精製原液とした。
血清を含むイーグルＭＥＭ１リットルに播種し、２リッ
トルのガラス培養槽で、０．３％マイクロキャリー
（“Cytodex 1 ”、ファルマシア社）に接着させて撹拌
しながら、３７℃、５日間培養した。その後、無血清イ
ーグルＭＥＭ培地１リットルに交換し、１００国際単位
／ｍｌでヒト・インターフェロンβを加えた。２４時間
後、さらにポリ（Ｉ）：ポリ（Ｃ）を１０μｇ／ｍｌで
加え、その２時間後、少量のメチルセルロースを含むイ
ーグルＭＥＭ培地に置換し、その後、６日間培養を続け
た。培養終了後、マイクロキャリヤーを沈降させた後、
上清を別の容器に移し、精製原液とした。
【００２９】フィルターで濾過して不純物を除去した精
製原液５リットルをシリカビーズカラム（５０ｍｌ、５
０００ｎｍ pore 、富士デビソン社）に流し、２０ｍＭ
リン酸緩衝液（ＰＢ）（ｐＨ７）２００ｍｌで洗浄した
後、２０ｍＭ塩酸（ｐＨ２）で溶出を行った。タンパク
質のピーク画分１００ｍｌに、０．３Ｍリン酸水素２ナ
トリウム溶液を添加してｐＨ６．４に調整し、沈殿物を
遠心分離（３０００ｒｐｍ、３０分）してから“Hepari
n-Cellulofine ”カラム（５ｍｌ、チッソ社）に通液し
た。
製原液５リットルをシリカビーズカラム（５０ｍｌ、５
０００ｎｍ pore 、富士デビソン社）に流し、２０ｍＭ
リン酸緩衝液（ＰＢ）（ｐＨ７）２００ｍｌで洗浄した
後、２０ｍＭ塩酸（ｐＨ２）で溶出を行った。タンパク
質のピーク画分１００ｍｌに、０．３Ｍリン酸水素２ナ
トリウム溶液を添加してｐＨ６．４に調整し、沈殿物を
遠心分離（３０００ｒｐｍ、３０分）してから“Hepari
n-Cellulofine ”カラム（５ｍｌ、チッソ社）に通液し
た。
【００３０】素通り画分１１０ｍｌを“Centricut ”
（カット・オフ分子量１００００、クラボウ社）で１５
ｍｌに濃縮した。この濃縮液をSuperdex pg ２００カラ
ム（２．６×６０ｃｍ、ファルマシア社）で３回に分け
てゲル濾過を行った。展開液は０．３Ｍ ＮａＣｌを含
む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いた。後述
した巨核芽球増幅活性の測定法により検出された活性画
分９０ｍｌを、Ｃ４逆相カラム（１×２５ｃｍ、Vydac
社）に注入し、０．１％トルフルオロ酢酸（ｐＨ２）を
含む水／アセトニトリルの濃度勾配溶離法により、ヒト
・カテプシンＬを溶出した。活性画分２ｍｌをSpeed Va
c 濃縮機で減圧乾固し、１００μｌの蒸留水に溶かし
た。
（カット・オフ分子量１００００、クラボウ社）で１５
ｍｌに濃縮した。この濃縮液をSuperdex pg ２００カラ
ム（２．６×６０ｃｍ、ファルマシア社）で３回に分け
てゲル濾過を行った。展開液は０．３Ｍ ＮａＣｌを含
む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いた。後述
した巨核芽球増幅活性の測定法により検出された活性画
分９０ｍｌを、Ｃ４逆相カラム（１×２５ｃｍ、Vydac
社）に注入し、０．１％トルフルオロ酢酸（ｐＨ２）を
含む水／アセトニトリルの濃度勾配溶離法により、ヒト
・カテプシンＬを溶出した。活性画分２ｍｌをSpeed Va
c 濃縮機で減圧乾固し、１００μｌの蒸留水に溶かし
た。
【００３１】次に、この濃縮活性画分をLaemmli の方法
（Nature, 227, 680-685, 1970）に準じて、非還元条件
下でドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含むポリアク
リルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を行い、さらに精
製した。泳動後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを２ｍｍ幅でス
ライスし、スライス片（１×２×４ｍｍ）あたり０．５
ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で
４℃、一晩浸漬し、ゲル中のタンパク質を溶出した。活
性画分の溶出液中の巨核芽球増幅因子活性は、２００単
位／ｍｌであった。
（Nature, 227, 680-685, 1970）に準じて、非還元条件
下でドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含むポリアク
リルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を行い、さらに精
製した。泳動後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを２ｍｍ幅でス
ライスし、スライス片（１×２×４ｍｍ）あたり０．５
ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で
４℃、一晩浸漬し、ゲル中のタンパク質を溶出した。活
性画分の溶出液中の巨核芽球増幅因子活性は、２００単
位／ｍｌであった。
【００３２】巨核芽球増幅因子活性を有する画分を、再
度、非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥし、銀染色したと
ころ、分子量３７０００±３０００の位置に単一のバン
ドが検出された。この画分の精製タンパク質５μｇを、
プロテイン・シーケンサー（Applied Biosystams社４７
０型）でアミノ酸配列を分析したところ、Ｎ末端１０個
のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１の通りであり、
ヒト・カテプシンＬ前駆体であることを確認した。
度、非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥし、銀染色したと
ころ、分子量３７０００±３０００の位置に単一のバン
ドが検出された。この画分の精製タンパク質５μｇを、
プロテイン・シーケンサー（Applied Biosystams社４７
０型）でアミノ酸配列を分析したところ、Ｎ末端１０個
のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１の通りであり、
ヒト・カテプシンＬ前駆体であることを確認した。
【００３３】巨核芽球増幅因子活性は以下の方法により
検出した。巨核芽球系株化細胞であるＣＭＫ細胞（Sato
ら，British Journal of Haematology, 72, 184-190, 1
989 ）を１×１０4 cell／０．５ml medium／wellで２
４ウェルプラスチックプレートに播種した。培養液は５
％胎児ウシ血清（ＦＣＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地
を用いた。これに被験サンプル５０μｌを加え、３７
℃、５日間培養した。培養後、細胞数と細胞直径を細胞
計数機（コールター・カウンターＺＭ型）で測定し、細
胞直径が１５μｍ以上に達した細胞の存在比率を算出し
た。対象群の存在比率に対する被験群の存在比率を巨核
球増幅活性比率として算出した。活性比率５０％を増加
する力価を１単位とした。
検出した。巨核芽球系株化細胞であるＣＭＫ細胞（Sato
ら，British Journal of Haematology, 72, 184-190, 1
989 ）を１×１０4 cell／０．５ml medium／wellで２
４ウェルプラスチックプレートに播種した。培養液は５
％胎児ウシ血清（ＦＣＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地
を用いた。これに被験サンプル５０μｌを加え、３７
℃、５日間培養した。培養後、細胞数と細胞直径を細胞
計数機（コールター・カウンターＺＭ型）で測定し、細
胞直径が１５μｍ以上に達した細胞の存在比率を算出し
た。対象群の存在比率に対する被験群の存在比率を巨核
球増幅活性比率として算出した。活性比率５０％を増加
する力価を１単位とした。
【００３４】
【発明の効果】本発明の血液細胞増加剤は巨核芽球増幅
活性を有するため、骨髄機能抑制による造血機能不全の
治療剤として用いることができる。好ましくは巨核球系
細胞の減少を伴う疾患の治療や血小板減少症の治療に利
用することができる。
活性を有するため、骨髄機能抑制による造血機能不全の
治療剤として用いることができる。好ましくは巨核球系
細胞の減少を伴う疾患の治療や血小板減少症の治療に利
用することができる。
【００３５】
配列番号：１ 配列の長さ：１０ トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 フラグメント型：Ｎ末端フラグメント 配列 Thr Leu Thr Phe Asp His Ser Leu Glu Ala 1 5 10
Claims (2)
- 【請求項１】 カテプシンＬを有効成分として含有する
血液細胞増加剤。 - 【請求項２】 カテプシンＬがヒト線維芽細胞由来であ
る請求項１記載の血液細胞増加剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4346408A JPH06192124A (ja) | 1992-12-25 | 1992-12-25 | 血液細胞増加剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4346408A JPH06192124A (ja) | 1992-12-25 | 1992-12-25 | 血液細胞増加剤 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06192124A true JPH06192124A (ja) | 1994-07-12 |
Family
ID=18383223
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4346408A Pending JPH06192124A (ja) | 1992-12-25 | 1992-12-25 | 血液細胞増加剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06192124A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6274364B1 (en) * | 1997-08-29 | 2001-08-14 | Societe L'oreal S.A. | Isolated cathepsin L type cysteine proteases and reducing intercorneocyte cohesion/promoting desquamation therewith |
| JP2011517318A (ja) * | 2008-03-06 | 2011-06-02 | ハロザイム インコーポレイテッド | 可活性化型マトリックス分解酵素の生体内一時的制御 |
-
1992
- 1992-12-25 JP JP4346408A patent/JPH06192124A/ja active Pending
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6274364B1 (en) * | 1997-08-29 | 2001-08-14 | Societe L'oreal S.A. | Isolated cathepsin L type cysteine proteases and reducing intercorneocyte cohesion/promoting desquamation therewith |
| US6737055B2 (en) | 1997-08-29 | 2004-05-18 | Societe L'oreal S.A. | Isolated cathepsin L type cysteine proteases and reducing intercorneocyte cohesion/promoting desquamation therewith |
| EP0899330B1 (fr) * | 1997-08-29 | 2004-05-19 | L'oreal | Polypeptide isolé de l'épiderme et son utilisation |
| JP2011517318A (ja) * | 2008-03-06 | 2011-06-02 | ハロザイム インコーポレイテッド | 可活性化型マトリックス分解酵素の生体内一時的制御 |
| JP2014043449A (ja) * | 2008-03-06 | 2014-03-13 | Halozyme Inc | 可活性化型マトリックス分解酵素の生体内一時的制御 |
| US9775889B2 (en) | 2008-03-06 | 2017-10-03 | Halozyme, Inc. | Methods of treatment of cellulite |
| US9833498B2 (en) | 2008-03-06 | 2017-12-05 | Halozyme, Inc. | Methods of treatment of collagen-mediated diseases and conditions |
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