JP2688539B2

JP2688539B2 - ほ乳類サイトカイン、ｉｌ―１１

Info

Publication number: JP2688539B2
Application number: JP3500597A
Authority: JP
Inventors: ヤン、ユーチャング; ベネット、フランシス・ケー
Original assignee: ジェネティックス・インスティテュート・インコーポレイテッド
Priority date: 1989-11-22
Filing date: 1990-11-20
Publication date: 1997-12-10
Anticipated expiration: 2012-12-10
Also published as: CA2069428C; KR920703819A; EP0504177B1; DK66692D0; US5700664A; CA2069428A1; US6066317A; US5215895A; GR3035627T3; WO1991007495A1; DE69033700D1; ES2156852T3; DK66692A; DK0504177T3; DE69033700T2; HU9201712D0; JPH104982A; JPH05504560A; AU6757890A; ATE199096T1

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、免疫および造血系細胞の機能を刺激する新
規サイトカイン、およびこの因子を得る方法および組換
え遺伝子工学技術によるその製法に関するものである。

発明の背景免疫系の細胞間にシグナルを送達する調節蛋白質の増
加しつつある一群が同定された。これらの調節分子はサ
イトカインとして知られている。サイトカイン類の多く
は、造血および免疫系細胞の生長および発達、並びに生
物活性を制御することが見出されている。これらの調節
分子には、コロニー刺激因子（例、GM−CSF、Ｇ−CSF、
Ｍ−CSFおよびマルチCSFまたはインターロイシン−
３）、インターロイシン類（IL−１ないしIL−９）、イ
ンターフェロン類（アルファ、ベータおよびガンマ）、
腫よう壊死因子（アルファおよびベータ）、エリスロポ
イエチン、マクロファージ阻止蛋白質、腫よう増殖因子
および白血球阻止因子（LIF）が全て含まれる。これら
のサイトカインは、骨髄、末梢血、胎児肝臓、および他
のリンパまたは造血器官からの標的細胞による広い範囲
の生物活性を呈する。例えば、F.R.バークウィルおよび
F.パーク、「イミュノロジー・トゥディ」、10（９）:2
99（1989）、G.ウォングおよびS.クラーク、「イミュノ
ロジー・トゥデイ」、９（５）:137（1988）並びにS.C.
クラークおよびR.カーメン、「サイエンス」、236:1229
−1237（1987）参照。

ある種のサイトカイン類の生化学的および生物学的同
定および特定検定は、天然供給源、例えば血液および尿
から入手され得る少量の天然因子により妨害された。最
近、サイトカイン類の多くは、分子クローン化され、異
種的に発現され、均一に精製された。これらの精製因子
の幾つかは、GM−CSF、Ｍ−CSF、Ｇ−CSF、IL−１、IL
−２、IL−３、IL−６、IL−７、TNF、インターフェロ
ン類およびエリスロポイエチンを含め、インビボ造血お
よび免疫系に対して調節作用を示すことが見出されてい
る。

当業界では依然として、免疫応答性および造血細胞の
発達を刺激または促進し、医薬用途に適した、天然供給
源から精製されるかまたは別法により均一形態で製造さ
れる追加的蛋白質が要望されている。

発明の要旨一態様において、本発明は、実質的に他のほ乳類蛋白
質を含まない、IL−11と呼ばれる新規ほ乳類サイトカイ
ンを提供する。この蛋白質は、組換え遺伝子工学技術に
より製造され得る。また、それは、因子を自然にまたは
他の因子により誘導されて産性する細胞供給源から精製
され得る。また、IL−11は、化学技術または上記で列挙
した技術の組み合わせにより合成され得る。

活性を示す成熟ほ乳類IL−11は、ドデシル硫酸ナトリ
ウム・ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動においてIL−
11cDNAトランスフェクションCOS−１細胞から誘導され
た³⁵Sメチオニン標識上清液を分析することにより測定
すると、約20kdの見かけ上の分子量を特徴とする、約17
8アミノ酸蛋白質である。成熟蛋白質について計算され
た分子量もまた約20kdである。

この発明はIL−11蛋白質は様々な検定で生物活性を表
し、様々な造血および免疫機能を一般的刺激因子として
のその役割を示している。この発明のIL−11蛋白質は、
IL−６依存性マウス・プラズマサイトーマ・セルライ
ン、T1165において増殖活性を示す。またIL−11は、予
備検定においてＢ細胞の成熟を直接的または間接的に刺
激する能力を立証した。具体的には、IL−11は、Ｂ細胞
のＴ細胞依存的発達を刺激すると考えられている。さら
にそれは、血小板生成細胞の増殖を刺激する検定でIL−
３との相乗作用を示すが、他の系列にも同様に作用し得
る。

本発明の別の態様は、ほ乳類IL−11蛋白質の発現をコ
ードするDNA配列である。このDNA配列は、上述されてい
るほ乳類IL−11蛋白質の発現をコードする単離されたDN
A配列を含み得る。活性IL−11をコードするDNA配列は、
第１表と同一または実質的に同一のヌクレオチド配列ま
たはそのフラグメントを含むことを特徴とする。このDN
A配列は、IL−11暗号化配列に近接する５′および３′
ほ乳類非暗号化配列を含み得る。また、DNA配列は、ア
ミノ末端シグナルペプチドをコードし得る。第１表は、
これらの非暗号化５′および３′近接配列並びに霊長動
物セルラインPU34から単離され、COS−１細胞で発現さ
れたほ乳類IL−11のシグナル配列を示している。

しかしながら、この発明のDNA配列は、これらのフラ
ンギングまたはシグナル配列の幾つかまたは全部を除外
し得るものと理解される。さらに、生物活性ほ乳類IL−
11蛋白質をコードする本発明のDNA配列はまた、表１の
単離されたDNA配列と、適当な条件下でハイブリダイゼ
ーションし得るか、または遺伝子コードの縮重がなけれ
ば前記条件下でハイブリダイゼーションし得るDNAを含
み得る。すなわち、この発明のDNA配列は、対立遺伝子
的改変、種改変または意図的な修飾に基づいた非暗号化
配列、シグナル配列または暗号化配列における修飾を包
含または含有し得る。

また、本発明は、ベクターDNAを含む組換えDNA分子お
よびほ乳類IL−11をコードするDNA配列を提供する。DNA
分子は、選択された宿主細胞においてIL−11の複製およ
び発現を指図し得る調節配列を機能し得る形で随伴した
IL−11DNAを提供する。また、本発明は、組換えIL−11
蛋白質の発現に使用される、前記DNA分子により形質転
換された宿主細胞を提供する。

本発明のDNA分子および形質転換細胞は、別の態様、
すなわち組換えほ乳類IL−11蛋白質またはそのペプチド
フラグメントの新規製造方法で使用される。この方法に
おいて、蛋白質発現を制御し得る適当な調節または発現
制御配列を機能し得る形で随伴したIL−11蛋白質または
そのフラグメントの発現をコードするDNA配列（または
上記組換えDNA分子）により形質転換されたセルライン
は、組換えDNAの発現を可能にする適当な条件下で培養
される。次いで、この発現されたIL−11蛋白質を、適当
な慣用的手段により宿主細胞または培養培地から採取す
る。この主張されている方法は、蛋白質発現用宿主細胞
として若干の既知細胞を使用し得る。現時点でIL−11の
製造に好ましいセルラインは、ほ乳類セルラインおよび
細菌細胞である。

この発明の別の態様は、ほ乳類IL−11またはその１種
もしくはそれ以上の生物活性ペプチドフラグメントの治
療有効量を含む医薬組成物を提供する。これらの蛋白質
またはペプチドフラグメントは、医薬的に許容し得る賦
形剤により製剤化され得る。これらの医薬組成物は、造
血細胞の数または活性レベルの欠乏を特徴とする疾患状
態の処置方法において、単独または他の適当な薬剤と組
み合わせた形で使用され得る。IL−11を含む医薬組成物
はまた、免疫系の疾患、例えば免疫不全症の処置に使用
され得る。

IL−11含有組成物は、IL−３と相乗作用した状態で血
小板生成細胞の生長および分化を刺激するのに使用され
得る。追加的な使用領域には、血小板形成、後天的な化
学療法または骨髄関連血小板減少症がある。また、IL−
11は、エフェクター分子として作用することにより、他
のサイトカインの機能を改善すると思われる。IL−11組
成物はまた、Ｂ細胞の産生または機能を直接的または間
接的に刺激するのに有用であり得る。すなわち、IL−11
組成物は、癌治療、感染症の処置、創傷治癒の促進およ
び免疫系全般の刺激に使用され得る。IL−11はまた、あ
る種の抗原、特にワクチンに対する免疫応答を強化する
のに使用され得る。

従って、この発明のさらに別の態様は、患者に対し、
適当な医薬用担体と共にIL−11またはそのペプチド・フ
ラグメントの治療有効量を投与することによる、これら
および／または他の病的状態の処置方法である。これら
の治療方法は、IL−11またはそのペプチドフラグメント
と同時またはそれに続いて少なくとも１種の他のサイト
カイン、ヘマトポイエチン、インターロイシン、成長因
子または抗体の有効量を投与することを含み得る。

本発明のさらに別の態様は、ほ乳類IL−11またはその
ペプチドを指向した抗体である。従って、この態様の一
部として、本発明は、前記の抗体を分泌し得るセルライ
ンおびそれらの製法方法を主張している。

本発明の他の態様および利点は、さらに後記の本発明
の好ましい態様の詳細な記載中に記載されている。

図面の簡単な説明第１図は、ネズミ・プラーク−形成検定における、pC
1R6−トランスフェクションcos−１細胞条件培地による
ネズミNP−反応性Ｂ細胞の発達の向上性を描いた図であ
る。

第２図は、ネズミ・フィブリン・クロット検定におけ
る、pC1R6−トランスフェクションcos−１細胞条件培地
によるIL−３依存性ネズミ血小板生成細胞コロニーの発
達の向上性を描いた図である。

発明の詳細な記載本発明は、他のほ乳類蛋白質および蛋白質様物質の随
伴を実質的に含まない形態での、生物活性ほ乳類サイト
カイン、IL−11を提供する。この蛋白質は、治療適用に
有用な純粋活性IL−11の大量生産を可能にする組換え技
術により製造さえ得る。別法として、この蛋白質は、そ
れを分泌または発現するほ乳類セルラインから精製され
た均一蛋白質として入手され得る。さらにIL−11または
その活性フラグメントは、化学的に合成され得る。

ほ乳類IL−11は、最初、長期培養中に健康なマカーク
サルから得られた骨髄細胞を置き、それらをレトロウイ
ルスU19−５で感染させることにより生長させた霊長動
物セルラインから単離された［ドクター・ロジャー・コ
ーン、タフツ・メディカル・スクール］。適当な抗生物
質とのインキュベーション後、PU34と命名された生きた
セルラインを、その生長特性に関して選択し、エシェリ
ヒア・コリで発現させたIL−１アルファにより誘導し
た。条件培地は、IL−６に対する中和性抗体の存在下、
IL−６依存性マウス・プラズマサイトーマ細胞を用いた
増殖検定において活性を示した。例えばG.G.ウォング
等、「サイエンス」、228:810−815（1985）、Y.C.ヤン
グ等、「セル」、47:3−10（1986）、およびA.E.ナーメ
ン等、「ネイチャー」、333:571−573（1988）に既に記
載されている発現クローニング方法に従い、IL−１−刺
激（24時間２μ/ml IL−１）PU34細胞mRNAからcDNAライ
ブラリーを製造した。

ほ乳類細胞、例えばCOS−１細胞においてcDNA挿入体
の発現を可能にする発現ベクター中にライブラリーを構
築した。200−500cDNAクローンのプールから製造された
５μｇのDNAでCOS−１細胞をトランスフェクションする
ことにより、ライブラリーのスクリーニングを行った。
T1165検定で活性に関して上清液を検定することによ
り、IL−11活性を発現するcDNAクローンが同定された。

T1165活性を有する単離クローンは、pPU34−TRA（pC1
R6とも呼ばれる）と命名され、配列決定された。表１
は、IL−11ポリペプチドの霊長動物およびヒト・クロー
ンの両方のcDNA配列およびアミノ酸配列（１文字コー
ド）を示す。霊長動物配列における１−721位のヌクレ
オチド配列は、pC1R6から得られた。残りのヌクレオチ
ド721−1102は、pC1R6とのハイブリダイゼーションによ
り単離された第２霊長動物cDNAから配列決定された。IL
−11のプラズマサイトーマ刺激活性をコードするヒトcD
NAは、pPU34−TRA（pC1R6）からの挿入体との直接ハイ
ブリダイゼーションにより、ヒト肺セルラインMRC5［ジ
ャコブス等、「ネイチャー」、227:43（1970）により記
載］から製造されたcDNAライブラリーから単離された。
ヒトIL−11ヌクレオチド配列から見出される差異は、表
１において霊長動物配列の上に示されており、アミノ酸
配列に生じた変化は霊長動物配列における適当なアミノ
酸の下に示されている。

霊長動物ヌクレオチド配列は1100塩基対を含む。霊長
動物配列は、72塩基対の５′非暗号化配列を含む。ま
た、表１の配列は、431塩基の３′非暗号化配列を示
す。同じくヒト・ヌクレオチド配列は、597ヌクレオチ
ドの単一の長い転写解読枠を含んでいた。

霊長動物およびヒト配列は、両方とも、第１表の霊長
動物ヌクレオチド73位から始まる非プロセシング199ア
ミノ酸ポリペプチドを予測させる単一の長い転写解読枠
を特徴とする。霊長動物およびヒト・クローンの両方か
ら得られたIL−11の予測されたアミノ酸配列における
（１）位Metから（21）位Alaまでの最初の21アミノ酸
は、慣用的ほ乳類分泌リーダー配列［D.ペールマン等、
「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー］、
167:391−409（1983）］と類似した疎水性アミノ酸の範
囲を含む。成熟IL−11蛋白質のＮ−末端（表１の下線
部）は、アミノ酸配列PRO−GLY−PRO−PRO−PRO−GLYに
より構成される。当該蛋白質は、まず199個のアミノ酸
から成る前駆体として合成され、このものは21番目と22
番目のアミノ酸の間で蛋白質加水分解酵素的に（proteo
lytically）開裂されることにより、アミノ酸22−23位
の配列Pro−Glyから始まり、ヌクレオチド671−672位の
TGA終止コドンによりアミノ酸199位の後で終わる成熟17
8アミノ酸ポリペルチドを与える。成熟蛋白質の計算さ
れた分子質量は、IL−11cDNAトランスフェクションCOS
−１細胞から誘導された上清液のSDS−PAGE（還元条
件）により現れた新規蛋白質帯の見かけ上の分子量と完
全に対応しており、両場合とも約20kdである。

IL−11cDNAのヌクレオチド配列を、ジェンバンクに記
録されたヌクレオチド配列と比較した。他の蛋白質の公
表されたDNA配列とのヌクレオチド配列の重要な類似性
は、全く見出されなかった。IL−11のリーダー配列およ
びガンマ・インターフェロンおよびIL−６の前記配列間
からは、軽い相同性しか見出されなかった。IL−11の暗
号化配列および他の公表されたポリペプチド配列間から
は、重要な相同性は全く見出されなかった。

さらに、実施例11でさらに詳細に記載されている通
り、IL−11は、始原細胞のIL−３依存性増殖の相乗的因
子である。相乗作用の成果は、幹細胞のG₀期間の短縮で
ある。少なくとも一つの培養システムにおいて、IL−11
は、IL−６と同様、血小板生成細胞コロニー形成の促進
においてIL−３と相乗的に作用する［S.R.パウル等、
「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド
・ステーツ・オブ・アメリカ」、87:7512−7516（199
0）］。すなわち、IL−11、並びにＧ−CSFおよびIL−６
は、初期および後期造血リネッジと相互作用すると思わ
れる。しかしながら、同じく上記の相乗的因子であるIL
−６とは対照的に、IL−11は、貯蔵された芽細胞の二次
培養物においてマクロファージ増殖のみを優先的に刺激
する。すなわち、IL−11は、他の既知リンホカイン類、
因子および蛋白質とは異なると思われる。IL−11はま
た、リンパ様リネッジ内でのある役割を演じる場合に関
与し、その結果、防御系の多重アームを刺激する。すな
わち、IL−11は、実験および臨床目的の両方に関する幹
細胞の操作に有用であると予測される。

この配列によりコードされるほ乳類IL−11の生物活性
は、適当な発現制御配列の制御下、クローン化配列によ
りトランスフェクションされたほ乳類細胞により産生さ
れた機能的ポリペプチドから検出された。表１に記録さ
れた通りプラスミドpPU34−TRA（pC1R6）におけるクロ
ーン化された霊長動物配列は、1989年11月14日付けでメ
リーランド、ロックビル、パークローン・ドライブ1230
1のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションにA
TCCナンバー68172として寄託された。ヌクレオチドおよ
びアミノ酸レベルの両方で霊長動物配列からの修飾によ
り表１に示されたクローン化されたヒト配列は、1990年
３月30日付けでメリーランド、ロックビル、パークロー
ン・ドライブ12301のアメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクションにATCCナンバー68284として寄託され
た。

IL−11ポリペプチドは、下記の通り、T1165検定にお
いて活性を示す。初めの試験において、IL−11は、1:50
0程度の高い最終希釈率でも、標準ネズミひ臓細胞プラ
ーク形成検定において免疫グロブリン分泌性Ｂ細胞の形
成を顕著に向上させることが見出された。このシステム
では、ひ臓の正常な細胞構成成分から成る状況において
特異的抗原、４−ヒドロキシ−３−ニトロフェニル−ア
セチル修飾ウマ赤血球細胞（NP−HRBC）に応答する培養
中におけるＢ細胞の発達が測定される。ひ臓細胞培養物
からのＴ細胞のThy1補体による消耗の結果、応答が完全
に廃棄され、NP−応答性Ｂ細胞の増加は、霊長動物IL−
11の存在下でも、少なくとも部分的にＴ細胞の存在に左
右されることが立証された。従って、Ｂ細胞ミトゲン、
例えばリポ多糖類はＴ細胞の非存在下でNP−特異的プラ
ーク形成細胞の形成を刺激するため、IL−11の活性は、
直接的Ｂ細胞有糸分裂促進作用に帰属し得ない。すなわ
ち、IL−11は、ＴおよびＢリンパ球の増殖、分化および
活性化を調整し得る。

様々な造血培養システムにおけるIL−11の作用の分析
により、血小板生成細胞の発達に対する著しい作用が証
明された。標的としてネズミ骨髄細胞を用いた場合、IL
−11は単独ではほとんど効果を示さないが、IL−３によ
り助けられると血小板生成細胞コロニー形成を３倍促進
した。IL−３およびIL−11によるCFU−Meg形成は、陽性
対照として使用される形成不能性イヌ血清の場合を凌い
でいた。

また、本発明により提供されるIL−11ポリペプチドに
は、表１の組換えIL−11の配列と類似しているが、自然
にまた意図して工学的に修飾が加えられた配列によりコ
ードされる因子が含まれる。すなわち、本発明はまた、
他の霊長動物蛋白質をコードし、IL−11ポリペプチドの
発現をコードするDNA配列の随伴を欠く、これらの新規D
NA配列を包含する。これらのDNA配列には、上記で示し
たDNA配列およびそのフラグメントと同一または実質的
に同一の配列、および厳密なハイブリダイゼーション条
件［T.マニアチス等、「モレキュラー・クローニング
（ア・ラボラトリー・マニュアル）」、コールド・スプ
リング・ハーバー・ラボラトリー（1982）387−389頁参
照］下で表１のDNA配列とハイブリダイゼーションする
配列が含まれる。上記の厳密な一ハイブリダイゼーショ
ン条件の一例は、65℃で4XSSC、次いで65℃で１時間0.1
XSSC中で洗浄を行うハイブリダイゼーションである。別
法として、厳密なハイブリダイゼーション条件の一例
は、42℃で50％ホルムアミド、4XSSCである。

リラックスはハイブリダイゼーション条件下でIL−11
またはその活性フラグメントに対する配列とハイブリダ
イズし、発現に際してIL−11の生物学的特性をもつIL−
11ペプチドをコード化するDNA配列は、また新規なIL−1
1ポリペプチドをコード化している。このような非スト
リンジエントハイブリダイゼーション条件の例は、4XSS
C50℃または42℃で30−40％ホルムアミドを用いるハイ
ブリダイゼーションである。例えば、IL−11配列と顕著
な相同性をもつ領域を共有しIL−11の生物学的性質の１
種以上をもつ蛋白質をコード化するDNA配列は、たとえ
そのDNAが第１表のIL−11配列またはIL−11活性をもつ
ペプチドをコード化するそのフラグメントとストリンジ
エントにハイブリダイズしなくとも、明らかにIL−11ポ
リペプチドをコード化している。

同様に、IL−11ポリペプチドをコード化するが遺伝子
コードの縮重によりコドン配列が異なるDNA配列もまた
この発明に含まれる。IL−11蛋白配列およびIL−11の生
物活性を示すペプチドフラグメントをコード化するDNA
配列におけるアレル性変異体並びにその類似体または誘
導体もまたこの発明に含まれる。点突然変異またはそれ
がコード化するポリペプチドの生物活性、半減期もしく
は産生のようなIL−11蛋白質のある種の特性を増強する
修飾導入により起こったIL−11DNA配列その他の変異体
もこの発明に含まれる。

組換え体技術における上記cDNA配列の使用に加えて、
この発明のIL−11ポリペプチドはまた既知の慣用化学合
成により製造することができる。合成的手段によりこの
発明のポリペプチドを構築する方法は当業者に知られて
いる。合成構築されたIL−11ポリペプチド配列または第
１表のアミン酸残基連続配列を複製しまたは部分的に複
製するフラグメントもまたこの発明の一部をなす。この
合成構築IL−11ポリペプチド配列は、天然IL−11ポリペ
プチドと１次、２次または３次構造的および立体的特性
を共有するため、IL−11の生物特性を共通して有し得
る。すなわち、これらは天然の精製IL−11ポリペプチド
の生物学的に活性なまたは免疫学的な代替物として治療
および免疫学的方法に使用し得る。

IL−11またはその活性フラグメントの蛋白質、ペプチ
ドまたはDNA配列における修飾は、公知技術を用いて当
業者が行なうことができる。IL−11配列において関心が
もたれる修飾には、コード配列中の１種以上の選択アミ
ノ酸の置換、挿入または欠失が含まれる。このような置
換、挿入または欠失の変異誘発技術は当業者に周知であ
る。［例えば、米国特許第4518584号参照。］この明細書に記載するIL−11ポリペプチド配列のその
他の特異的変異は、例えば１種以上のグリコシル化部位
の挿入を含み得る。アスパラギン結合グリコシル化認識
部位をアミノ酸の欠失、置換または付加によりペプチド
配列に、またはヌクレオチドのそれらによりDNA配列
に、挿入し得る。このような変化は、Ｏ−結合炭水化物
の付加により修飾される分子の任意の部位または分子中
の他の部位になし得る。このような変化したヌクレオチ
ドまたはペプチドの発現により、その部位がグリコシル
化され得、薬理学的または生物学的性質が変化または改
善され得る変異体を産生する。

IL−11の活性全体またはその一部を保持すると期待さ
れるその他のIL−11配列の類似体および誘導体も、この
明細書の開示を与えられた当業者は容易に作ることがで
きる。このような修飾の１つは、IL−11配列に存在する
リジン残基へのポリエチレングリコール（PEG）の結
合、または１個以上のリジン残基もしくはPEGもしくはP
EG誘導体と反応する他のアミノ酸残基を配列中に挿入し
てPEG部分の結合を可能にすることである。このような
修飾はこの発明に含まれると考えられる。

この発明はまたIL−11またはその活性フラグメントの
製造法を提供する。この発明の方法は１つは、発現ベク
ターにIL−11ポリペプチドコード化cDNAを導入してIL−
11発現システムを作ることを含む。選択した宿主細胞を
ベクターで形質転換し培養する。それ故、この発明の方
法は、既知の調節配列の制御下にIL−11ポリペプチドま
たはそのフラグメントの発現をコード化するDNA配列で
形質転換した適当な細胞またはセルラインを培養するこ
とを含む。発現された因子に当業者に公知の適当な手段
により培地（または細胞内発現の場合細胞）から採取
し、分離し、精製する。

この方法に適する細胞またはセルラインは、チャイニ
ーズハムスター卵巣細胞（CHO）または3T3細胞のような
哺乳類細胞であり得る。適当な哺乳類宿主細胞および形
質転換法、培養法、増幅法、スクリーニング法および生
成物の産生、精製法の選択は当技術において知られてい
る。例えばゲチングおよびサムブルック、ネイチャー29
3巻620−625頁（1981年）、またはカウフマン等、モレ
キュラー・アンド・セルラー・バイオロジー５巻（７
号）1750−1759頁（1985年）またはハウリー等、米国特
許第4419446号参照。その他の適当な哺乳類セルライン
はさるのCOS−１セルラインおよびCV−１セルラインで
ある。哺乳類宿主細胞の別の例は、特に、形質転換セル
ラインを含めた霊長類セルラインおよびげっ歯類セルラ
インを含む。正常な２倍体細胞、一次組織のインビトロ
培養で得られる細胞株、および一次外植体もまた適当で
ある。候補細胞は、選択遺伝子において遺伝子型として
欠乏しているか、または優勢に作用する選択遺伝子を含
み得る。その他の適当な哺乳類細胞としては、ヒーラ
（Hila）、マウスＬ−929細胞、スイス系由来の3T3、Ba
lb−ｃもしくはNIHマウス、BHKまたはHakハムスターセ
ルラインを含むが、これらに限定されるものではない。

同様に宿主細胞として有用でこの発明に適当な宿主細
胞は細菌細胞である。例えば、エシエリキア・コリの種
々の株（例えばHB101およびMC1061）はバイオテクノロ
ジー分野で宿主細胞として知られている。バチルス・サ
ブチリス、シュードモナス、その他の桿菌の種々の株等
もこの方法で使用し得る。

当業者に公知の酵母細胞の種々の株がこの発明のポリ
ペプチドの発現用宿主細胞として入手できる。さらに、
所望ならば、昆虫細胞もこの発明の宿主細胞として使用
できる。例えば、ミラー等、ジエネティック・エンジニ
アリング８巻277−298頁（プレナム・プレス、1986年）
およびその引用文献参照。

この発明はまた、新規IL−11ポリペプチドの発現に用
いる組換え体DNA分子またはベクターを提供する。これ
らのベクターは、この発明のIL−11ポリペプチドをコー
ド化する新規単離DNA配列を含有する。別法として、上
記のような修飾配列をとり込んだベクターもこの発明の
態様であり、IL−11ポリペプチドの生産に有用である。
この方法で用いるベクターはまた、この発明の配列をコ
ード化するDNAと機能可能に結合し宿主細胞中で複製お
よび発現を指示し得る選択した調節配列を含み得る。

下記の実施例で用いたベクターはpXM［Y.C.ヤング
等、セル47巻３−10頁（1986年）］である。この明細書
に記載する哺乳類細胞発現ベクターは、当業者に周知の
技術により合成することができる。ベクターの成分、例
えばレプリコン、選択遺伝子、エンハンサー、プロモー
ター等は、公知の方法により天然源から得られまたは合
成できる。カウフマン等、ジャーナル・オブ・モレキュ
ラー・バイオロジー159巻511−521頁（1982年）および
カウフマン、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ82
巻689−693頁（1985年）。別法として、ベクターDNA
は、ラレパピローマウイルスゲノム［ラッキー等、セル
36巻391−401頁（1984年）］の全部または一部を含み
得、また安定なエピソーム要素としてC127マウス細胞の
ようなセルライン中にとり込むことができる。適当な宿
主細胞に対するこれらのベクターによる形質転換はIL−
11ポリペプチドの発現をもたらす。

数々の型が哺乳類、昆虫、酵母、真菌および細胞発現
について当技術で知られるその他の適当な発現ベクター
もまたこの目的に用いることができる。

細胞源から均質になるまで精製され、または組換え体
もしくは合成で製造されたIL−11は免疫不全または障害
の処置のための医薬製剤または処方に使用することがで
きる。IL−11はまた、造血始原細胞または幹細胞の不全
または関連障害の処置に使用することができる。IL−11
組成物は、がんおよびその他の疾患、放射線もしくは薬
剤への露出から生ずる病理学的状態であって例えば白血
病、細菌もしくはウイルス感染、貧血、Ｂ細胞もしくは
Ｔ細胞欠乏（骨髄移植後の免疫細胞または造血細胞欠乏
を含む）の処置に使用することができる。IL−11はま
た、種々のワクチンに対する免疫応答を増強し、長期持
続性で効果が大きな免疫を作り出すために用いることが
できる。前述のように、IL−11組成物はＢ細胞および巨
核球の分化刺激に使用することができる。IL−11ポリペ
プチド組成物によるこのような疾患状態の治療処置は、
現在入手できる薬剤による処置で起る望ましくない副作
用を回避するものである。

この発明のポリペプチドは、単独で、または他のサイ
トカイン類、ヘマトポイエチン類、インターロイキン
類、成長因子類または抗体と組合わせて、上記症状の処
置に用いることができる。

この発明はまた、上述の症状の処置用治療法および組
成物を提供する。このような組成物は、この発明のIL−
11ポリペプチドの治療的有効量を、医薬として許容され
る担体と混合して含有する。この組成物は非経口的に全
身投与し得る。別法として、組成物は静脈内投与でき
る。所望ならば、組成物は皮下または局所、例えば傷害
部位に適用できる。全身投与の場合、この発明の治療用
組成物は発熱性物質不含有の非経口投与上許容される水
溶液である。このような医薬として許容されpH、等張
性、安定性等に必要な注意を払った蛋白質溶液の製造法
は当技術の範囲内にある。

上述の状態の処置方法に用いる用量、用法は、薬剤の
作用を修飾する種々の要因、例えば患者の症状、体重、
性別および食事、感染の重度、投与時期およびその他の
臨床的因子を考慮して担当医師により定められる。一般
に、１日用量はポリペプチド１−1000mgまたはポリペプ
チド50−5000単位（１単位はT1165アッセイで最高の50
％の刺激をもたらすポリペプチド濃度）（体重1kg当
り）の範囲内である。

この発明の治療法および組成物はまた、他のひと因子
との同時投与を含み得る。この用途のためのサイトカイ
ンまたはヘマトポイエチンの例としては、公知の因子で
あるIL−１〜IL−９、GM−CSF、Ｍ−CSF、MIF、Meg−CS
F、インターフェロン類、TNFおよびエリスロポイチエン
が含まれる。IL−11療法に関与するに特に望ましい候補
品は、IL−３およびIL−６を含み得る。Ｂ細胞成長因
子、Ｂ細胞分化因子または好酸球分化因子類のような成
長因子もまたIL−11との同時投与に有用であることがわ
かった。上記の用量は治療用組成物の追加的成分と相殺
するように調整することができる。処置される患者の経
過は慣用手段により監視することができる。

これらの新規ポリペプチドの他の用途は、インビトロ
またはインビボ診断および治療法用の標準的方法による
抗体の発生である。このような抗体には、公知方法で製
造したモノクローナルおよびポリクローナル抗体、並び
にキメラ抗体または「組換え体」抗体が含まれる。また
この発明により、選択した哺乳類に抗原としてIL−11ま
たはそのフラグメントを与え、その後その動物細胞を公
知技術によりある種のがん細胞と融合させて不死化細胞
を作ることにより生ずるセルラインが提供される。この
ようなセルラインの生成およびこの発明の哺乳類のIL−
11ポリペプチドの全部または一部に対する抗体の生成に
用いる方法もまたこの発明に包含される。

この発明の抗体は、例えば抗体を検出可能な標識また
は標識系と結合させることにより、インビボおよびイン
ビトロ診断法に用いることができる。別法として、これ
らの抗体は、例えば当業者に公知にある種の毒性または
治療用化合物またはその一部分と結合させることによ
り、インビボおよびインビトロの治療目的に用いること
ができる。

以下に示す実施例は、この発明のクローニング、哺乳
類のIL−11の発現および製造、並びに他の方法および製
品を例示的に記述するものである。これらの実施例は説
明を目的とするもので、この発明の範囲を限定するもの
ではない。

実施例１−mRNAの単離およびcDNAライブラリーの構築霊長類セルライン、pU34を成長させると、実施例７の
T1165検定においてIL−６に対する中和抗体の存在下、
有意な活性を生じるのが見出された。PU−34間質セルラ
インは、両方向性欠損形質転換レトロウィルスベクター
（a defective amphotropic transforming retroviral
vector）で不死化することにより、長期間の霊長類骨髄
培養より得られた。U19レトロウィルスプラスミドは以
前に報告されたように構築し［P.S.ジャットら、ジャー
ナル・オブ・ビロロジー59巻746−750頁（1986年）］、
SV40ラージＴ抗原配列およびG418−耐性をコードしモロ
ネイ・ネズミ白血病ウィルス末端反復配列から離れて発
現するネオーホスホトランスフェラーゼ配列を含有す
る。両方向性産生クローンは、パッケージング・セルラ
インψAM［R.コーンら、プロシーディング・オブ・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ジ・ユ
ナイテッド・ステーツ・オフ・アメリカ81巻6349−6353
頁（1984年）］をψ2U19−５［P.S.ジャット、上記で引
用］からのエコトロピック・ウィルスの収穫物で感染さ
せ、続いて0.75mg/mlのG418中で選別することにより産
生した。

１個のクローンψAMU19−BLは、NIH/3T3細胞で検定し
た場合、５×10³G418−耐性CFU/mlの力価の組換えSV40
ウィルスを産生する。長期骨髄培養物（LTMC）は常法で
完成され、10％ウシ胎仔血清、10％ウマ血清、100単位/
mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシン（シ
グマ・ケミカル・カンパニー、セント・ルイス・ミズー
リー州）完全長期培養培地を補充したイスコフ改変ダル
ベッコ培地（IMOM）中で維持した。

LTMC付着層は、完成後７および10日にψAMU19−BLウ
ィルス貯蔵物2mlで、８μg/mlポリブレーン（アルドリ
ッヒ・ケミカル・カンパニー・インコーポレーティッ
ド、ミルウォーキー、ウィスコンシン州）の存在下33℃
で2.5時間感染させた。感染後最初の３日間は、培養物
を0.5mg/mlG418中で選別した。感染後14日にG418耐性コ
ロニーをとり、マルチウェルプレート（コーニング・グ
ラスウェア、コーニング、ニューヨーク）に広げた。

PU−34と称する１個のセルラインのならし培地を長期
培養物中の始原細胞に保持する能力に基づいて広範に分
析した。このセルラインは多分化能ヒトおよび霊長類始
原細胞を、培養中３週間まで維持する能力があることを
示した。IL−６、IL−７、GM−CSF、Ｍ−CSF、Ｇ−CSF
およびLIF/HILDAを含む既知の成長因子活性に加え、IL
−１で刺激したPU−34ならし培地は、T1165ネズミ・プ
ラズマ細胞腫セルラインの増殖を刺激する能力があるこ
とが判明したが、これは通常IL−６に反応する［R.P.ノ
ールダンら、上記で引用］のだが、ヒトIL−６に対する
中和抗血清の存在下でさえも反応する。この生物検定
は、PU−34から得られたcDNAライブラリーの発現クロー
ニングの間に用いられた。生物検定についての詳細は以
下の実施例７で記載する。

PU−34細胞のcDNAライブラリーは以下のように調製し
た。PU−34細胞をIL1−αで、２単位/mlの濃度で24時間
刺激した。ポリアデニル化RNA（ポリＡ＋RNA）を常法に
よりこれらの細胞から調製した。全RNAをチルグウィン
ら、バイオケミストリー18巻5294−5299頁（1976年）の
方法に準じて、刺激したpU34細胞から抽出した。mRNA
は、オリゴ（dT）−セルロース・クロマトグラフィーに
より調製した［H.アビブら、プロシーディング・オブ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ジ
・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ69巻1408−
1412頁（1972年）］。

mRNAを５μｇ用いて、ウォングら、（上記で引用）に
より報告されたように、DNAポリメラーゼＩで、および
２本目の鎖の反応においてはRANアーゼＨで［T.マニア
ティスら、上記で引用］、二本鎖cDNAを合成した。Cos
−１細胞発現ベクターpXM［Y.C.ヤングら、セル47巻３
−10頁（1986年）］を独特なXho I部位で直線可し、同
等モル量のセミ−Xho I適合cDNAを連結した。連結反応
を用いてエシエリキア・コリ形質転換能細胞（HB101
株）に形質転換し［Y.C.ヤングら、上記で引用］、約50
0000個のアンピシリン耐性コロニーのライブラリーを得
た。

実施例２−DNAの調製およびCos−１細胞のトランスフェ
クション G.G.ウォングら（上記で引用）により以前に報告され
た発現クローニング系を用いて、以下のようなIL−11活
性をコード化するcDNAを単離した。

細菌性コロニーをニトロセルロース膜上に写した。各
膜からコロニーをＬ−ブロース中にかきとり、プラスミ
ドDNAを前述の方法［J.A.メイヤーズら、ジャーナル・
オブ・バクテリオルジー127巻1529−1536頁（1976
年）］により単離した。各々の最初のDNA試料を200−50
0コロニーのプールから調製した。

各プラスミドDNAの５μｇを用いて、0.1mMクロロキン
を添加したジエチルアミノエチル−デキストラン（DEA
E）試験計画によりCos−１細胞をトランスフェクトした
［L.M.ソンパイラックら、プロシーディング・オブ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ジ・
ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ78巻7575−75
78頁（1981年）およびH.ルースマンら、タクル．アシッ
ズ・レス・11巻1295−1308頁（1983年）;Y.C.ヤング
ら、上記で引用］。トランスフェクトしたCos−１細胞
の培養上清を、トランスフェクション後72時間に収穫
し、T1165刺激剤活性を検定した（実施例７参照）。

ふるい分けした317回のプールのうち、検出可能な量
のIL−６（抗1L−６抗体で中和することにより測定）を
含有し、T1165検定において抗IL−６抗体の存在下に活
性が残存する２個の陽性プールからのプラスミドDNA
を、Cos−１細胞中に再びトランスフェクトし、トラン
スフェクトした上清をT1165検定において活性を再びふ
るい分けした。このような活性を有する１個のプールを
選別し、含有するクローンの数がより少なくなるように
さらに分割した。この群から、検定においてプールを全
て集めたものよりも高い活性を示すプールを選別した。
このプールから個々のクローンを取り出した。これらの
DNAを調製し、トランスフェクトし、トランスフェクト
した上清をT1165検定において活性を試験した。２個の
陽性のクローンを固定した。１個はIL−６活性を発現
し、もう１個は抗IL−６抗体により中和されない活性を
発現した。この後者のプールをさらに分割し、択一的に
pC1R6かまたはpPU34−TRAと称する、新規なT1165増殖活
性をコードする単一の陽性プラスミドが得られるまでト
ランスフェクションを繰り返した。このクローンを実施
例７の検定において再び試験した。

pC1R6−トランスフェクトしたCos−１細胞のならし培
地の活性をもまた、その他のサイトカイン、例えばネズ
ミおよびヒトIL−６、並びにネズミGM−CSFと比較し
た。ならし培地はT1165細胞による測定可能な3H−チミ
ジンの取り込みを、最終的に1:1000まで希釈した時でさ
え刺激した。至適濃度では、新規なサイトカインは基底
値の100倍以上の取り込みを助けた。

このcDNAの挿入物を、ジデオキシ鎖終結法により、超
螺旋鋳型上で合成オリゴヌクレオチドプライマーを用い
て配列決定した。［F.サンガーら、プロシーディング・
オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オ
ブ・ジ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ74巻
5463−5467頁（1977年）］。表Ｉに示すpC1R6のcDNAの
ヌクレオチド配列は予想される199アミノ酸ポリペプチ
ドをコードする597ヌクレオチドの単一の長い転写解読
枠を含有する。17−20個の疎水性アミノ酸の広がりが推
定上の開始コドンに直ぐ近接して存在し、これは通常の
タンパク分泌性先導配列に類似している。

初期cDNAクローンであるpC1R6は不完全であることが
判明したが、さらにcDNAを分析し、この転写物がサイト
カイン遺伝子発現の重要な制御要素であると考えられる
RNA不安定配列、ATTTAの多重コピーを有する約420塩基
対の３′非コード化配列を含有することが明らかになっ
た｛G.シャウら、セル46巻659−667頁（1986年）］。

実施例３−タンパク分析 pPU34−TRAのcDNAによりコードされるポリペプチドを
パルス標識化実験を用いて同定した。クロロキンで誘導
後48時間に、IL−11クローンの組み換えDANでトランス
フェクトしたCos−１細胞の培養上清を除去し、細胞を
1.0mlのDMEM中の0.5mCi［³⁵S］メチオニンで、37℃で４
時間パルス標識化した。放射線標識した上清で試料10μ
ｌを回収し、ラエムリ緩衝液系で12％ゲルの15％SDS−P
AGE［U.K.ラエムリ、ネイチャー227巻680−685頁（1970
年）］に供した。電気泳動後、ゲルを蛍光光度法増強溶
液（エンハンス；ニュー・インブランド・ニュークレ
ア、ボストン、マサチューセッツ州）中に浸し、乾燥
し、Ｘ戦フィルムに爆露した。

³⁵S−メチオニン標識化pC1R16−トランスフェクトし
たCos−１細胞のならし培地のSDS−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動（SDS−PAGE）分析により、約180個のアミ
ノ酸分泌タンパクに予想される分子量に合致する偽トラ
ンスフェクトした対照には存在しない、主に20キロダル
トンの種が存在することが示された。

この大きさの予測および発現タンパクの異質性の欠如
は、アスパラギン結合炭水化物の添加するためのコンセ
ンサス配列（Asn−Ｘ−Thr/Ser）R.J.ウィンツラー、
「ホルモナル・プロテインズ・アンド・ペプタイスセ」
リー,C.H.編（アカデミック・プレス・ニューヨーク）
１頁〜（1973年）］が存在しないことに一致する。成熟
タンパクの予期されるアミノ酸配列にはシステイン残基
は含まれず、これはその他の任意のサイトカイン遺伝子
では見られない様相である。

実施例４−IL−11を発現するヒト・セルライン２個のヒト・セルラインを、少なくとも１種のIL−11
の源泉として同定した。具体的には、ヒト肺線維芽細胞
セルライン、MRC−５［アメリカン・タイプ・カルチャ
ー・コレクションより受け入れ番号ATCC CCL 171で入手
可能］を、１単位/mlの組み換えヒトIL−１−アルファ
（ジェネティックス・インスティテュート、インコーポ
レーテッド）および10^-7Mフォルボール12−13ジブチレ
ート（シグマ）で誘導して、T1165検定で試験した。誘
導したならし培地が、IL−６の飽和量より大きなカウン
ト／分を呈する、すなわちPU34の誘導ならし培地により
呈するのと類似の活性が観察された。IL−11が存在すれ
ば低IL−６信号を増強するであろうということは注目さ
れている。さらに、以下に詳細に記載するように、この
セルラインのノーザン・ブロットにより、IL−11のメッ
セージが存在することが示される。

さらに、ヒト栄養芽層セルライン、TPA30−１（ATCC
より、受け入れ番号CRL1583で入手可能）もまた、ノー
ザン・ブロットにおいてIL−11メッセージの存在を誘導
しないことが示される。

その他のIL−11のヒト源泉もまた、本発明の教示によ
り入手でき、容易に同定できる。

実施例５−RNA分析 A.PU34 細胞性IL−１アルファ誘導PU34細胞の全細胞性RNA5μ
ｇを、2.2Mホルムアルデヒド含有1.2％アガロースゲル
を通して電気泳動した［H.レーラッハら、バイオケミス
トリー16巻4743頁（1977年）］。ホルムアルデヒド−変
成RNAを報告されたとおりナイロン膜（ゼータバイン
ド；クノー、メリーデン、コネチカット州）に移し［E.
M.サザーン、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオ
ロジー98巻503−514頁（1975年）］、³²P標識化cDNAプ
ローブでプローブした。

cDNAプローブはベクターからcDNA挿入物をXho Iで制
限酵素で開裂することにより作り、プライマーとして無
作為なオリゴヌクレオチドを用いて、DNAポリメラーゼ
Ｉの大きな断片の存在下³²P−dCTPで挿入物を標識化し
た［A.P.フェイルベルグら、アナリティカル・バイオケ
ミストリー132巻６−13頁（1983年）］。ナイロン膜を6
5℃で４時間予めハイブリダイズし、４×SSC、0.5％SDS
5×デンハート溶液および100μg/ml変性サケ精子DNAか
らなるハイブリダイゼーション溶液中65℃で16時間、³²
P−dCTP標識化cDNAプローブでハイブリダイズした。そ
の他の用いたプロープには、ヒト（rh）IL−１α、rh I
L−２、rh IL−３、rh IL−４、rh IL−５、rh IL−
６、rh IL−７、rh IL−９、rhGM−CSF、rhM−CSF、LIF
−HILDAおよび霊長類IL−11がある。

ハイブリダイゼーションの後、膜を２×SSC/0.1％SDS
で65℃で30分間、次に0.2×SSC/0.1％SDSで65℃で30分
間の２回洗浄した。ついで膜を乾燥し、−70℃でカルシ
ウム・タングステート・インテンシファイング・スクリ
ーンの存在下Ｘ線フィルムに適用した。

このノーザン・ブロット分析により、PU34 mRNAが約
2.5キロベースおよび約1.5キロベースの大きさのメッセ
ージを有し、pC1R6プローブでハイブリダイズされる２
重のIL−11転写物を含有することが示された。上記表Ｉ
のcDNA配列の大きさは、より小さいメッセージとよく相
関する。この違いは、さらにcDNAクローンを単離および
分析することにより示されるように、別々にスプライシ
ングして大きな転写物中さらに３′非コード化配列を生
じる結果である。PU34細胞による２個の転写物の存在
は、IL−１α誘導がない場合は明白な転写物がないの
で、IL−１α制御されるようである。

レクチン刺激ヒト末梢血リンパ球からまたはヒト胎盤
からのヒトＴセルラインC10−MJ2［レアリーら、ブラッ
ド69巻953頁（1987年）］、C5−MJ2［アリアら、サイエ
ンス223巻1086頁（1984年）］およびMo［ゴルデら、プ
ロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンス・オブ・ジ・ユナイテッド・ステーツ・オ
ブ・アメリカ77巻593頁（1980年）］からのmRNA調製物
中、RNAブロット分析により同定される転写物はない。
従って、唯一同定されるIL−11の源泉は、間充組織由来
の付着細胞である。

B.MRC−５ヒト胎児肺線維芽細胞セルライン（MRC−５）は、ヤ
コブスら、ネイチャー227巻43頁（1970年）に報告され
るように、50ng/mlの酢酸フォルバール・ミリステート
（PMA）および１単位/mlのIL−１αで刺激後、両方の転
写物を発現することが見出された。

上記でPU34RNAに関して記載されるように、２種の転
写物は、このセルラインにおいて、約2.5キロベースお
よび約1.5キロベースの同一の大きさのメッセージで同
定された。MRC−５セルラインから単離されるヒトcDNA
配列の分析により、霊長類およびヒトのコード化部域
は、ヌクレオチドレベルで約95％の同一性を共有するこ
とが示された。

C.TPA30−１ヒトSV40−形質転換栄養芽層セルライン、TPA30−１
に関して、同じプローブを用い、同じ方法を実施した場
合、大きな約2.3キロベースのIL−11メッセージのみが
同定された。

実施例６−DNA配列分析 pPU34−TRAのcDNAクローンのヌクレオチド配列を、報
告されるように［G.G.ウォングら、およびY.C.ヤング
ら、上記で引用］、Bal31ヌクレアーゼ消化による重複
断片の順序をもった組の生成およびM13ベクターへのサ
ブクローニングにより決定した［M.ポンクツら、プロシ
ーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンス・オブ・ジ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・
アメリカ79巻4298−4302頁（1982年）；およびJ.メッシ
ングら、ジーン、19巻269−276頁（1982年）］。１本鎖
DNAを調製し、ヌクレオチド配列をジデオキシヌクレオ
チド鎖終結法により決定した［F.サンガーら、プロシー
ディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンス・オブ・ジ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・ア
メリカ、74巻5463−5467頁（1977年）］。このヌクレオ
チド配列は上記表Ｉに示す。

実施例７−検定における生物学的活性 A.T1165増殖検定 T1165 IL−６依存性ネズミプラズマ細胞腫細胞［R.P.
ノルダンら、サイエンス233巻566頁（1986年）；ドクタ
ー・ノルダン、ナショナル・インスティテューツ・オブ
・ヘルスより入手］は10％加熱不活性ウシ胎仔血清、2m
Mグルタミン、100単位/mlペニシリン、100μg/mlストレ
プトマイシン（全てギブコ、グランド・アイランド、ニ
ューユーク）５×10^-5Mベーター・メルカプトエタノー
ル（シグマ・ケミカル・カンパニー、セント・ルイス、
ミズーリー州）を補充し、およびCHO細胞で産生させた1
0−20単位/mlの組み換えヒトIL−６（ジェネティックス
・インスティテュート・インコーポレーテッド）を補充
したRPMI中て通常どおり成長させる。２−４日経過後、
細胞を培養から取り出し、洗浄して残留1L−６を除去
し、7.5×10⁴−１×10⁵セル/mlの濃度で再懸濁する。

検定試料（PU34ならし培地かまたはpC1R6−トランス
フェクトしたCos細胞ならし培地）を96ウェルマイクロ
タイタープレート上、IL−６不含培養培地100μｌで２
検体ずつ連続希釈する。次に上記細胞懸濁液を各ウェル
に加え、プレートを37℃で２−３日間恒温培養する;³H
−チミジンの0.5μCi［デュポント、ウィルミントン、
デルウェア州］を検定の最後の６時間、各ウェルに加え
る。細胞をGFC型Ｃ濾紙（LKB）上に収穫し、水およびエ
タノールで洗浄し、乾燥する。濾紙を次にシンチレーシ
ョン用液中に浸し、LKB平面シンチレーションカウンタ
ーで計数する。³H−チミジンの取り込みにより増殖を測
定する。

PU34細胞から誘導したならし培地は、IL−６の飽和量
よりも多いT1165細胞の増殖を引き起こし、それは別の
因子の存在を示唆している。ヒトIL−６に対する抗体の
存在下で検定した場合、低いか有意な活性がならし培地
に残存する。非常に低量のIL−６を含有するIL−１誘導
PU34のならし培地の分画化試料をもまたヒトIL−６に対
する抗体の存在下および不在下で検定し、その結果は、
程度は低いが単独で増殖でき、低量のIL−６とで相乗す
る能力がある因子の存在が示唆された。

PU34ライブラリーのトランスフェクションからのCos
細胞上清もまた、単独およびヒトIL−６に対する抗体＋
至適量内のネズミIL−６のカクテルの存在下、活性を検
定した。抗体はPU34細胞により産生される霊長類IL−６
を中和できるが、ネズミIL−６を中和することができな
い。従って相乗因子はライブラリーに存在するPU34 IL
−６からの干渉をうけることなくふるい分けできる。

表Ｉの成熟IL−11タンパクは、この検定において、10
0希釈単位/mlの最大活性の半分であるという特徴があ
る。

B.Bセルプラーク形成検定Ｂセルプラーク形成検定を、R.M.オハラら、ジャーナ
ル・オブ・イムノロジー141巻2935−2842頁（1988年）
に報告されている方法に準じてIL−10発現Cos細胞に関
して実施した。ネズミプラーク形成検定は、本来のC57B
1/6マウスからの7.5×10⁶脾臓細胞を３×10⁶4−ヒドロ
キシ−３−ニトロフェニル−アセチル改変ウマ赤血球
（NP−HRBC）と共に0.75mlの５％ウシ胎仔血清を補充し
たミッシェル−ダットン培地［R.I.ミッシェルら、ジャ
ーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン126巻4
23−442頁（1967年）中、試験試料（IL−11含有Cos細胞
ならし培地）と共に、または伴なわずに５日間恒温培養
することにより実施した。NP−共役ウマ赤血球（Ｈ−RB
C）またはヒツジ赤血球（Ｓ−RBC）を、以前に報告され
たように［P.B.ハウスマンら、ジャーナル・オブ・イム
ノロジー134巻1388−1396頁（1985年）］、1mlのパック
したＨ−RBCまたはＳ−RBC（コロラド・セリューム・カ
ンパニー、デンバー、コロラド州）と共に、ジメチルホ
ルムアミド（シグマ・ケミカル・カンパニー、セントル
イス、ミズーリー州）中、10mgのNP−サクシンイミド
（ケンブリッジ・バイオケミカル、インコーポレーティ
ッド、ケンブリッジ、英国）を反応させることにより調
製した。

これらの培養物に、５％ウシ胎仔血清を含有するが試
験試料（ならし培地）を含まない補充用培地を、毎日さ
らに0.1ml供給した。NP−反応性Ｂセルは、ドレッサー
ら、「ハンドブック・イン・エクスペリメンタル・イム
ノロジー」（D.W.ワイヤー、ブラックウェル、オックス
フォード）、271頁（1973年）に報告されるようにNP−
共役−ヒツジRBCプラーク検定を用いて培養期間の最後
に同定し、IL−11含有ならし培地で支持される培養物か
ら得られるプラークの数を培地のみを補充した培養物か
ら得られるプラークの数を、比較することにより、反射
率を算出した。典型的な実験では、外来性因子の欠如し
た基底反応では、プレートした7.5×10⁶セルあたり、60
00NP−特異性プラーク形成細胞を産生した。

このような検定の結果を図１に示す。対照反応のパー
セントは、NP−HRBCで刺激し、pC1R6−トランスフェク
トしたCos−１細胞ならし培地の規定の希釈により支持
される本来の脾細胞の５日間の培養中のNP−反応性Ｂセ
ルの成長の増強を、培地のみを補充した対照培養物と比
較する。Cos産生哺乳動物IL−11は、この検定において
プラーク形成単位／培養物が2 1/2−３倍に増強され、
このことは、IL−11がＢセル刺激および分化に直接的に
働くか、またはＴセル刺激に間隔的に働き、Ｂセルの反
応に影響を及ぼすその他のサイトカインを分泌する。

C.ネズミ・フィブリン・クロット検定 Cos細胞産生哺乳動物IL−11もまた、巨核球コロニー
形成検定においてS.クリアら、エクスプ．ヘマトール.1
5巻896−901頁（1987年）に報告されるように実質的に
行い、および２％仔ウシ血清を添加して改変した方法
で、活性を試験した。簡単に記載すると、ネズミコロニ
ー形成単位巨核球（CFU−Meg）検定は、2.5×10⁵ネズミ
骨髄細胞を20％ウシ胎仔血清を補充したIMDMの0.4ml
中、６ウェル皿にプレートして実施した。クロット形成
は0.25mgフィブリノーゲンおよび0.25単位のスロンビン
（シグマ・ケミカル・カンパニー、セントルイス、モン
タナ州）を37℃で添加することにより開始した。種々に
希釈した試験試料をフィブリンクロットに加え、続いて
培養物を37℃で６日間、恒温培養した。クロットをS.ク
リヤら、上記で引用、およびA.ナケフら、プロシーディ
ング・オブ・ザ・ソサイエティー、フォー・エクスペリ
メンタル・バイオロジー・アンド・メディスン151巻587
−590頁（1976年）に報告されるように、2.5％グルター
ルアデヒドで固定し、0.5mg/mlのアセチルチオコリン・
ヨーダイドで染色した。陽性のコロニー（巨核球のみを
含有）は直接検鏡して数えた。コロニー数は２検体ずつ
評価した。

図２に結果を示す。コロニー数は、（１）イヌ無形成
貧血血清の1:10希釈；（２）150単位/mlのネズミIL−3;
（３）刺激剤なし；および（４）1:10もしくは（５）1:
50希釈のpC1R6−トランスフェクトしたCos−１細胞なら
し培地のみ、または（６）1:10もしくは（７）1:50希釈
の150単位/mlのネズミIL−３を補充したpC1R6−トラン
スフェクトしたCos−１細胞ならし培地により支持され
るマウス骨髄細胞の６日間培養物中の巨核球コロニー
（アセチルコリンエステラーゼが陽性細胞）の全数を表
す。

IL−11をこの検体で単独で試験した場合、反応はほと
んど検出されなかった。しかしながら、この検定ではIL
−11を組み換えネズミIL−３の存在下試験した場合、検
定結果は、IL−11およびIL−３の組み合わせによりこの
検体において巨核球細胞の産生および成熟を有意に刺激
することを示した。この検定は、哺乳動物IL−11が巨核
球の成長の刺激において、IL−３と相乗効果を有するこ
とが示された。

実施例８−ヒトIL−11の獲得ヒトIL−11のクローン化配列を得るために、上記実施
例５においてヒトIL−11 mRNAとハイブリダイズしたPU3
4 IL−11cDNAを用いて、前述のヒト肺線維芽細胞セルラ
イン、MRC−５から調製したcDNAライブラリーをふるい
分けした。このライブラリーからの組み換え体をプレー
トし、２連のニトロセルロース・レプリカーゼをプレー
トから作る。これらのレプリカーゼは機会的プライミン
グ標識化法［A.P.フェインベルグ、上記で引用］を用い
て³²P−dCTPで標識化した哺乳動物のIL−11 cDNAと共
に、標準的なハイブリダイゼーション溶液（４×SSC）
中65℃で一晩ハイブリダイズした。次に膜を0.2×SSC
で、同温で、放射活性の基底値が特異的なハイブリダイ
ジング配列の検出を可能にする値まで低下するまで洗浄
した。重複膜上で哺乳動物のIL−11プローブにハイブリ
ダイズするのが見出されたコロニーを取り、プラスミド
DNAの調製に用いた。

ヒトIL−11の全配列は、PU34セルラインから哺乳動物
IL−11を単離するための前述の方法と同様の方法に準じ
て決定した。ヒト配列もまた表Ｉに示す。ヒト配列ヌク
レオチドが霊長類の配列と異なる場合は、表Ｉでヒトヌ
クレオチドを霊長類のヌクレオチド配列の上に記す。

別法として、オリゴヌクレオチドを、サブクローニン
グの目的で適当な制限部位を有する表Ｉの配列、および
IL−11のヒトDNA配列を得るために用いられるポリメラ
ーゼ連鎖反応から構築してもよい。例えば以下のオリゴ
ヌクレオチドが合成される：５′オリゴヌクレオチド:5′ATGGATCCACATGAACT GTGTTTGCCG3′ ３′オリゴヌクレオチド:5′TCAAGCTTTCACAGCCG AGTCTTCAGC3′ 次にこれらのオリゴヌクレオチドをMRC−５まではTPA
30−１のcDNAライブラリーにおけるポリメラーゼ連鎖反
応を用い、そこからヒトIL−11のDNA配列を得る。PCR法
は、現在当業界で標準的な方法に準じて実施する。得ら
れたPCR産生物を次に適当に消化したpXM、またはその他
の発現ベクターにサブクローン化する。上記のオリゴヌ
クレオチドに関しては、pXMベクターサブクローニング
するためにBamH IおよびHind IIIで消化する。

ヒトIL−11の配列を得るための第３の方法としては、
プローブとして表Ｉの配列を用いてヒトゲノムライブラ
リーをふるい分けする方法がある。

実施例９−組みかえIL−11の発現ヒト因子を含む組み換え哺乳動物IL−11を産生するた
めに、それをコード化するcDNAを適当な発現ベクターに
移す。この発現ベクターは標準的な分子生物学的技術に
よる哺乳動物、昆虫、酵母、菌類および細菌類の発現用
に非常に多くの型が当業界で公知である。例えばY.C.ヤ
ングら、セル47巻３−10頁（1986年）を参照されたい。

哺乳動物のIL−11に関して以前に報告されているよう
に、ヒトIL−11のcDNAは標準的な技法を用いて合成さ
れ、発現ベクター、pXMでクローン化される（ヤング
ら、上記で引用）。このベクターは哺乳動物細胞、例え
ばCos−１細胞でcDNA挿入物の発現を可能にする。pXMは
SV40エンハンサー、主要アデノウィルス後期プロモータ
ー、３部分先導配列、および小さなハイブリッド介在配
列、DHFRコード化配列、SV40後期メッセージポリＡ添加
部位並びにアデノウィルスVa I遺伝子を含有する。この
ベクターをエンドヌクレアーゼ酵素Xho Iで直線化し、
相補的な付着末端を生じる合成オリゴヌクレオチドを添
加して予め改変したIL−11 cDNAの同等モル量に連結す
ることができる。このようなオリゴヌクレオチドは市販
により入手できる［コラボラティブ・リサーチ・レキシ
ントン、マサチューセッツ州］。

CHO細胞中でサイトカインをよく発現することが認め
られているもう１つのベクターは、pEMC2B1である。こ
のベクターはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ション（ATCC）、ロックビル、メリーランド州（米国）
に受け入れ番号ATCC40348で寄託されているpMT2pcから
誘導できる。DNAは、プラスミドをPst Iで消化すること
により直線化する。次にDANをT₄DNAポリメラーゼを用い
てブラントする。オリゴヌクレオチド５′TGCAGGCGAGCC
TGAATTCCTCGA3′を次にDNAに連結し、５′末端にPst I
部位を再生し、DHFR cDNAのATGの前にEcoR I部位および
Xho I部位をつけ加える。このプラスミドをpMT21と称す
る。pMT21を、プラスミドを２個の隣接するクローニン
グ部位で開裂するEcoR IおよびXho Iで切断する。508塩
基対のEMCV断片を制限酵素EcoR IおよびTaqα IでpMT₂E
CAT₁［S.K.ジョングら、ジャーナル・オブ・ビロロジー
63巻1651−1660頁（1989年）］から切断した。68ヌクレ
オチドの長さの１対のオリゴヌクレオチドを合成し、AT
GまでEMCV配列を重複させた。ATGをATTに変え、Ｃを１
個加え、３′末端でXho I部位を作る。Taqα I部位は
５′末端に位置する。オリゴヌクレオチドの配列は：５′CGAGGTTAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTT
TTCCTTTGAAAAACACGATTGC3′ およびこれらの相補的鎖であった。

pMT21 EcoR IからXho Iまでの断片をEMCV EcoR Iから
Taqα Iまでの断片およびTaqα I/Xho Iオリゴヌクレオ
チドに連結し、ベクターpEMC2B1を産生した。このベク
ターはSV40の複製開始点およびエンハンサー、アデノウ
ィルス主要後期プロモーター、アデノウィルス３部分先
導配列の大部分のcDNAコピー、小さなハイブリッド介在
配列、SV40ポリアデニル化信号およびアデノウィルスVA
I遺伝子、DHFRおよびβ−ラクタマーゼマーカー、並び
にEMC配列を、哺乳動物細胞中望ましいcDNAを高量発現
させるのに適当な関係で含有する。EMC2B1ベクターはエ
ンドヌクレアーゼ酵素EcoR Iで直線化し、続いて発現を
構築するEcoR I相補的末端を生じる合成オリゴヌクレオ
チドを加えることにより予め改変したIL−11をコードす
るcDANに同等モル量で別々に連結する。

IL−11を含有する望ましいベクターを次に、通常の遺
伝子工学の技術により適当な宿主細胞に導入する。標準
的な技法を用いて形質転換した細胞を培養し、発現した
IL−11を回収し、培養培地から精製する。

A.哺乳動物細胞の発現哺乳動物の宿主細胞中にIL−11ポリペルチドの発現を
得るために、IL−11 DNA配列を含有するpXMベクターを
実施例２に記載のとおりCos細胞にトランスフェクトす
る。トランスフェクトしたCos細胞のならし培地は、T11
65検定で測定されるIL−11生物学的活性を含有する。同
様にIL−11のcDNAを含有するpEMC−2B1の構築物をCHO細
胞にトランスフェクトする。

当業界はまた、例えば各々のプラスミドからのIL−11
のDNA配列をXho Iで挿入し、周知の組み換え遺伝子工業
の技術並びにpJL3およびpJL4［ゴーフら、エンボ．ジェ
イ.4巻645−653頁（1985年）］およびpMT2（pMT2−VW
F、ATCC＃67122で出発;PCT出願PCT/US87/00033参照）の
ようなその他の既知ベクターを用いて、pXM/IL−11ベク
ターに匹敵するその他の哺乳動物発現ベクターを構築す
ることもできる。

これらのベクターを適当な宿主細胞に形質転換するこ
とにより、結果的にIL−11ポリペプチドを発現させるこ
とができる。Cos細胞以外の哺乳動物宿主細胞も、IL−1
1の発現に用いることができる。例えば、共に共通の方
法によりベクターDNAを安定して完成させ、完成したベ
クターDNAを続いて増幅させるのが好ましく、そのため
に選り抜きの哺乳動物宿主細胞としてCHO細胞を用いる
ことができる。

一度ベクターおよび宿主細胞を選択し形質転換する
と、標準的な免疫学的なまたは酵素検定により、安定し
た形質転換体を、IL−11の発現に関してふるい分ける。
IL−11ポリペプチドをコードするDNAまたはmRNAの存在
は、標準的な方法、例えばサザーンまたはノーザンブロ
ッティングにより検出できる。発現ベクターDNAを適当
な宿主細胞に導入御数日間、ポリペプチドをコードする
DNAの一過性の発現は、培養培地のタンパクの活性また
は免疫学的検定、例えばT1165検定により、選別せずに
測定される。

B.細胞性発現系同様に、当業者はコード化配列をフランキングするあ
らゆる哺乳動物の制御配列を排除し、細菌の配列を挿入
して細菌性ベクターを作ることによりIL−11の配列を操
作し、細菌細胞により本発明のIL−11ポリペプチドを細
胞内または細胞外に発現させることができる。

因子をコード化するDNAはさらに、細菌性の発現のた
めの種々コドンを含有するように改変でき、これは当業
界で公知である。成熟IL−11配列（表Ｉで21−199アミ
ノ酸をコードするヌクレオチド）は、分泌性リーダーポ
リペプチドをコードするヌクレオチド配列に効果的に枠
内で結合し、成熟した種々タンパクの細胞性発現、分泌
および加工を可能にするのが好ましく、これも当業界で
公知である。次に細胞宿主細胞で発現される化合物を全
て既知の方法により回収し、精製し、並びに／または物
理化学的、生化学的および／もしくは臨床パラメータに
関して特性化できる。

別法として、IL−11はエシエリキア・コリ中に細胞質
タンパクとして発現させてもよい。この場合、分子は塩
酸グアニジンで完全に変性した後、必ず再び折りたたま
なければならないようであるが、この方法も当業界で公
知である。現在のところエシエリキア・コリにおいて、
IL−11を発現させる好ましい方法では、ヒトIL−11配列
の最初の31コドンを除去する。次に以下の配列：を成熟したヒトIL−11のコドン32に付ける。

C.昆虫または酵母細胞の発現昆虫細胞で発現させるために昆虫ベクターを構築する
［例えば発行欧州特許出願第155476号に記載された方法
を参照されたい］ために同様の操作を行うことができ
る。酵母細胞により本発明のタンパクを細胞内または細
胞外に発現させるために、酵母制御配列を用いて酵母ベ
クターをも構築できる。［例えば、発行PCT出願WO第86/
00639号および欧州特許出願EP第123289号に記載されて
いる方法を参照されたい。］実施例10−IL−11を高量発現するCHOセルラインの構築哺乳動物から本発明のIL−11ポリペプチドの高量を産
生する１つの方法は、異種のIL−11遺伝子の多重コピー
を含有する細胞の構築が含まれる。カウフマン・アンド
・シャープ、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオ
ロジー、上記（1982年）の方法に準じて異種遺伝子を増
幅可能なマーカー例えば、増加した遺伝子コピーを含有
する細胞をメソトレキセート（MTX）の濃度上昇中に伸
長用に選別できるためのジヒドロホレート・リダクター
ゼ（DHFR）に結合できる。この方法は多種細胞型で用い
ることができる。別法として、IL−11 cDNAおよび薬剤
耐性選別遺伝子（例えばDHFR）を同じベクターに導入す
ることができる。この方法で好ましいベクターはpEMC2B
1である。

例えば、その他のプラスミド配列と有効に関連し、そ
れのおよびDHFR発現プラスミドpAdA2bSV（Ａ）３［カウ
フマン・アンド・シャープ・モル・セル・ビオール、３
巻９号1598−1608頁（1983年）］の発現を可能にするIL
−11遺伝子含有pXMベクターは、リン酸カルシウム共沈
およびトランスフェクションによりDHFR欠損CHO細胞、D
UKX−BIIに同時導入できる。

別法として、その他のプラスミド配列と有効に関連
し、それの発現を可能にするIL−11遺伝子含有pEMC−2B
1ベクターを、原形質体融合およびトランスフェクショ
ンによりDHFR−欠損CHO細胞に導入する。IL−11遺伝子
およびDHFRマーカー遺伝子は共に、IL−９をpEMC2B1に
導入した場合に効果的に発現する。IL−11遺伝子を前述
のとおりpMT2に導入でき、その結果できたベクターはpX
M/IL−11およびpAdA26SV（Ａ）３の代わりに用いること
ができる。

DHFR発現形質転換は、透析ウシ胎仔血清を有するアル
ファー培地中の成長から選択する。形質転換体を生物検
定、免疫検定またはRNAブロッティングによりIL−９の
発現に関して検査し、続いて陽性プールを選択して、カ
ウフマンら、モル．セル．ビオール５巻1750頁（1983
年）に報告されるように、MTXの濃度上昇中（逐次的に
0.02、0.2、1.0および５μM MTX）に成長を増幅させ
る。増幅した系列をクローニングし、生物学的に活性な
IL−11ポリペプチド発現をT1165検定により監視する。I
L−11ポリペプチド発現はMTX耐性の水準の増強と共に増
加することが予想される。

前述の任意の発現系において、結果的に得られたセル
ラインは適当な薬剤を選択することによりさらに増幅で
き、結果的に得られたセルラインを再びクローニング
し、発現量を本明細書で記載したT1165検定を用いて評
価できる。

IL−11発現CHOセルラインは血清不含培地中成長する
ように適合させることができる。レクチン親和クロマト
グラフィー、逆相HPLC FPLC等のような技術を含む当業
界でよく用いられる方法を用いて、セルラインのならし
培地から、同一のIL−11が単離できる。

実施例11−初期ネズミ始原細胞培養中の増殖に対するIL
−11の作用メチルセルロース細胞培養物を35mmラックス懸濁培養
皿（＃5221R、ヌンク、インコーポレイテッド、ネイパ
ービル、IL）中で確立した。

５−フルオロウラシル（５−FU）（アドリア・ラボラ
トリーズ、コロンビア、OH）を、10〜15週令雌BDF₁マウ
ス（ARSスプラーク・ドーリー、インディアナポリス、I
N）に尾静脈から150mg/kg体重を静脈注射により投与し
た（ツダら、ジャーナル・オフ・セルラー・フィジオロ
ジー、117:308〜318（1983）およびG.S.ホジソンら、ネ
イチャー、281:381〜382（1979））。三匹のマウスから
集めた大腿または脾臓から単一の細胞懸濁液を調製し
た。低密度（＜1077）単核細胞を400g.にて遠心分離
後、フィゴル−パクの界面から集めた。これらの細胞を
プラスチック製皿に一夜付着させた後、非付着単核（骨
髄および脾臓）細胞を５−FU注射後、各２日および５日
に採取した。

培養物1mlは、正常マウスの骨髄細胞２×10⁴個、５−
FU−処理マウスの骨髄細胞５×10⁴個または脾臓細胞１
×10⁶個、α−培地（フロー・ラボラトリーズ、インコ
ポレイテッド、マックリーン、VA）、1.2％1500cpsメチ
ルセルロース（フィッシャーサイエンチフィク・コーポ
レーション、ノルクロス、GA）、30％胎子牛血清（FC
S）（ハイクロン・ラボラトリーズ、インコーポレイテ
ッド、ロガン、UT）、１％脱イオン化フラクション・Ｖ
・ウシ血清アルブミン（BSA）（シグマ・ケミカル・コ
ーポレーション、セントルイス、MO）、１×10^-4M2−メ
ルカプトエタノール（イーストマン・オーガニック・ケ
ミカルズ、ロチェスター、NY）および造血因子を含有し
た。皿を37℃にて５％CO₂を通気した加湿雰囲気中でイ
ンキュベートした。血小板生成細胞を除いて、細胞50個
以上からなるコロニーをインキュベーション後の所定の
日に倒立顕微鏡で計数した。４個以上の血小板生成細胞
が含まれるときは血小板生成細胞を計数した。コロニー
の型の省略記号を下記に記載する:GM、顆粒球／マクロ
ファージ;Mast、乳房細胞コロニー;E、赤血球バースト;
M、血小板生成細胞コロニー;GEMM、顆粒球／マクロファ
ージ／血小板生成細胞コロニー［T.ナカタら、ジャーナ
ル・オブ・セルラー・ファジオロジー、111:239−246
（1982）］;GMM、顆粒球／赤血球／マクロファージ／血
小板生成細胞コロニー［T.ナカタら、上掲；およびA.A.
フォーザーら、ブラッド、52:1243−1248（1979）］；
およびBl、芽球細胞コロニー［T.ナカタら、プロシーデ
ィング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンス、79:3843−3847（1982）；およびT.スダら、上
掲］。

芽球細胞（blast cell）の造血能力を未分化細胞コロ
ニー再平板培養により測定した。インキュベーション５
〜15日間に、50〜150個の細胞を含む個々の芽球細胞コ
ロニーをエッペンドルフピペットで取り上げ、ヒト尿エ
リスロポイエチン（Ep）［1mg当り370Uの活性、カワキ
タ・マコト博士より入手、熊本医科大学、熊本、日本］
2U/ml、WEHI−３細胞の１％濃縮（×20）培養物上清を
含む二次メチルセルローズ培養物中に再平板培養した。

芽球細胞はまた、観察されたIL−11の効果が直接的で
あるのか、または他の因子によるものかを調査するため
の造血細胞の純粋標的集団として用いた。組換えネズミ
IL−３の100U/mlの存在下、５−FU後４日の脾臓細胞100
万個を培養した。遺伝子工学的に高い力価（約30000U/m
lまで、ネズミIL−３を産生するように計画されたチャ
イニーズ・ハムスター卵巣（CHO）細胞によって調製さ
れた。培養８日目に、各芽球細胞コロニー（50〜150個
の細胞）を培養物から取り上げ、集め、培地で２度洗浄
し、種々の因子の組合わせを含む各二次培養物中に再平
板培養した。

４×10⁶U/mg蛋白の比活性を有する組換えヒトIL−６
をエシェリキァ・コリ中に発現させた。ネズミ形質細胞
腫−刺激活性をコード化したcDNAで形質導入されたCOS
−１細胞により訓化された培地（CM）あった。［S.R.ポ
ールら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンス、USA印刷中（1990）］ A.正常マウスの骨髄細胞からのコロニー形成正常骨髄細胞からのコロニー形成をIL−11により維持
した。Ep2U/mlの存在下または不存在下で、IL−11は投
与量−依存的にコロニーを生じさせた。1:100稀釈のIL
−11は最大のコロニー形成を維持した。しかしながら、
IL−11とのインキュベーション８日目または16日目に検
出されたコロニーの総数は、IL−３との培養物中よりも
顕著に低かった。IL−11−含有培養物中に見られたコロ
ニーはGM型優勢であったが、数種の多系統（GMMおよびG
EMM）コロニーも観察された。1:100稀釈のIL−11は、イ
ンキュベーション16日目に３個の芽球細胞コロニーの形
成を維持した。

B.5−FU−処理マウスの骨髄細胞からのコロニー形成 IL−11、IL−６、IL−３、単独および各種組合わせの
存在下で確立された培養物中150mg/kgの５−FU［T.スダ
ら、上掲およびG.S.ホジソンら、上掲］の注射後２日目
に採取された骨髄細胞からのコロニー形成を検討し、IL
−11が初期の始原細胞の増殖の維持においてIL−３と相
乗的に働くかどうかを調べた。

最終稀釈1:100および1:1000のIL−11の、IL−３の最
適濃度への添加はコロニー形成を顕著に増強した。特
に、IL−11の1:100稀釈およびIL−３の存在下で、コロ
ニー形成の動態は各種因子により維持される動態に比較
すると促進された。コロニー形成の時間的経過および維
持されたコロニーの総数はIL−６およびIL−３の組合わ
せで観察されたのと類似している。1:100稀釈中のIL−1
1単独は長期のインキュベーション後わずかなコロニー
形成を維持した。これらの結果はIL−11が初期の始原細
胞のIL−３依存性増殖を促進することを示している。各
相乗的因子の作用に関連する５−FU後２日の骨髄細胞か
らのコロニー形成の動力学に対するIL−11およびIL−６
の組合わせの効果を別に検討した。IL−６およびIL−11
はIL−３依存性コロニー形成を顕著に促進した。しかし
ながら、IL−６およびIL−11の組合わせの効果は別個の
効果と異ならなかった。

C.5−FU投与後４日の脾臓細胞からの芽球細胞のコロニ
ー発達の連続的観察各種芽球細胞コロニーの成長率を培養図研究法により
連続的にプロットした。結果は、IL−11の相乗的効果は
幹細胞が休眠状態にある時期中に減少し、成長率がこれ
らの培養系で統計学的に異ならないから、IL−６または
Ｇ−CSFで観察された効果と非常に類似した作用をもた
らすことを示した。

D.芽球細胞コロニーの再平板培養能力の比較 IL−11およびIL−６に対応する芽球細胞コロニーの増
殖能力を再平板培養実験により検討した。すでに報告さ
れたように［K.イケブチら、ブラッド、72:2007−2014
（1988）］、各球細胞のコロニーのうち、二次再平板培
養効率中に顕著な変化が見られた。しかし、３種の異な
る一次培養条件で生長させた芽球細胞コロニーの再平板
培養効率には顕著な差はなかった。

先の報告［K.イケブチら、上掲］と同様に、二次コロ
ニー中の二次GEMMコロニーの百分率および未分化細胞胚
芽細胞コロニー当りの二次GEMMコロニーの発生率は、IL
−３単独を含む培養物中に見られる一次未分化細胞コロ
ニーよりも、IL−11またはIL−６を含む培養物中に確認
された一次未分化細胞コロニーからの方が著しく高かっ
た。これらのパラメーターは、IL−11＋IL−３を含む培
養物およびIL−６＋IL−３を含む培養物間に顕著な差は
なかった。

これらの結果はIL−11およびIL−６の相乗的活性が類
似しており、二次GEMMコロニーの発生率の増加は、芽球
細胞コロニー形成中の幹細胞のG.期間の短縮によるかも
しれないことを示す［K.イケブチら、上掲］。

E.集めた芽球細胞の再平板培養の検討 IL−３により維持された初期段階の培養物からの芽球
細胞を集めて得られた標的細胞をGMコロニー形成に対す
るIL−11およびIL−６の直接的効果を比較するために用
いた。集めた芽球細胞は間質細胞を欠き、非常に高い平
板培養効率を示した。

IL−３を含む培地で確認された細胞50〜150個を含む
芽球細胞を取り、集め、Ep2U/mlの存在中、IL−11、IL
−６、またはIL−３を含む二次培地に再平板培養する。
これらのデータは芽球細胞の少なくとも70％が造血始原
細胞であることを示す。

IL−３とEpの組合せが種々の単一系統および多系統の
コロニー形成を維持したが、IL−11およびEpはマクロフ
ァージコロニーのみの産生を維持した。IL−６およびEp
の組合せほぼ同数数の純粋マクロファージコロニーだけ
でなく、好中球／マクロファージのコロニーの形成を維
持した。IL−11により維持されたマクロファージコロニ
ーはIL−６により維持されたマクロファージコロニーよ
り小さかった。

これらの結果は、IL−11とIL−６が異なる始原細胞サ
ブセットを除いて重複して相互に作用すること、および
優先的にマクロファージ始原細胞群を維持することを示
した。

F.IL−11の相乗作用効果に対する抗IL−６抗体中和効果 IL−11とIL−６間の直接コロニー維持活性がCos細胞C
Mのそのものの性質の結果でなかったことを確認するた
めに、Cos−由来IL−６を阻害することで知られる抗IL
−６抗体の中和を、休止始原細胞からのIL3−依存増殖
に対するIL−11およびIL−６の相乗効果の検討を用い
た。

IL−６またはIL−11の存在中および抗体の不在中で、
5FU投与後５日の脾臓細胞からのコロニーの発達は８日
目のコロニー数により示されるように顕著に促進され
た。抗IL−６抗体が存在したとき、IL−６の相乗効果を
完全に消失したが、IL−11の効果は消失しなかった。抗
体の効果は16日まで持続した。これらの結果は、Cos細
胞のCM中の明白な相乗効果がIL−６により仲介されると
いう可能性を全く退けた。

IL−11cDNAを形質導入されたCos細胞の馴化培地（C
M）は、培養中の多効能性始原細胞のIL−３−依存増殖
を促進することが判明し、活性は独自にIL−６に関連し
た。促進の機構は休止幹細胞のG.期間の短縮と思われ
る。

前述の記載はこの発明の現在の好ましい実施態様を詳
述したものである。この発明の実施において多数の修飾
および変更が当技術の熟練者に考えられることと思われ
る。そのような修飾および変更もまたこの発明の範囲に
含まれる。

この発明によって下記の各事項が可能となる。

（１）実施的に他の蛋白質様物質の随伴を欠くほ乳類IL
−11蛋白質。

（２）第１表のアミノ酸＃22−アミノ酸＃199のアミノ
酸配列またはその生物活性フラグメントを含む、１記載
の蛋白質。

（３）ヒトIL−11アミノ酸配列を含む、２記載の蛋白
質。

（４）第１表に示されたDNA配列と同じかまたは実質的
に同じDNA配列、そのフラグメントまたはそこにハイブ
リダイズし得るDNA配列の全部または一部によりコード
される、１記載の蛋白質。

（５）下記特性：１）SDS−PAGEにおける還元条件下での見かけ上の分子
量が約20kd、２）計算された分子量が約20kd、３）T1165検定における生物活性、４）IL−３の存在下での血小板生成細胞コロニー形成検
定における生物活性、５）Ｂ細胞プラーク形成検定における生物活性のうちの一つまたはそれ以上を有する、１記載の蛋白
質。

（６）IL−11の複製および発現を指図し得る発現制御配
列を機能し得る形で随伴した10記載のDNA配列により形
質転換された細胞を培養し、IL−11蛋白質をその条件培
地から回収することにより製造されるIL−11蛋白質。

（７）実質的に他の蛋白質様物質の随伴を欠くヒトIL−
11蛋白質。

（８）ヒトIL−11蛋白質の複製および発現を指図し得る
発現制御配列を機能し得る形で随伴した、ヒトIL−11蛋
白質またはそのフラグメントの発現をコードするcDNA配
列により形質転換されたセルラインを培養することを含
む、ヒトIL−11蛋白質またはそのフラグメントの製造方
法。

（９）IL−11をコードし、第１表に示されたヌクレオチ
ド塩基配列と同じかまたは実質的に同じ配列、そのフラ
グメントまたはそこにハイブリダイズし得るDNA配列の
全部または一部を含むDNA配列。

（10）発現制御配列を機能し得る形で随伴した９または
19記載のDNA配列により形質転換された細胞。

（11）ほ乳類または細菌細胞を含む、10記載の細胞。

（12）９または19記載のDNA配列を含むプラスミド・ベ
クター。

（13）さらに追加的なサイトカイン、ヘマトポイエチ
ン、生長因子または抗体の治療有効量を含む、12記載の
医薬。

（14）さらに追加的なサイトカイン、ヘマトポイエチ
ン、生長因子または抗体の治療有効量を含む、13記載の
組成物。

（15）サイトカインが、IL−１ないしIL−９、GM−CS
F、Ｇ−CSF、Ｍ−CSF、インターフェロン類、Mge−CS
F、MIF、LIF、TNFおよびエリスロポイエチンから成る群
から選択される、14記載の組成物。

（16）サイトカインがIL−３またはIL−６である、15記
載の組成物。

（17）免疫系または造血系の刺激またはそれに関連した
疾患の処置に適した医薬組成物の製造における２または
３記載のIL−11蛋白質の用途。

（18）IL−６の非存在下でのT1165検定における生物活
性を有する均一ほ乳類IL−11。

（19）発熱物質不含有の非経口投与に関して許容し得る
水性賦形剤中に２または３記載のIL−11蛋白質の有効量
を含む、免疫系または造血系の刺激またはその疾患の処
置を目的とする注射可能製剤。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＡ６１Ｋ 37/02 ＡＢＤＣ１２Ｐ 21/02 ＡＢＹ

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）下記のいずれかの塩基配列を有する
DNA: 又は（ｂ）（ａ）のDNAとストリンジェントな条件下でハイ
ブリダイズし得るDNA 及び（ｃ）（ａ）又は（ｂ）のDNAと縮重の関係にあるDNA のいずれかのDNAによりコードされている蛋白質であっ
て、かつ、T1165検定において活性を示す蛋白質。
【請求項２】（Ａ）下記のいずれかのアミノ酸配列を有
する蛋白質：又は及び（Ｂ）（Ａ）の蛋白質のアレル変異体蛋白質のいずれかである、請求項１記載の蛋白質。
【請求項３】哺乳類IL−11蛋白質である、請求項１記載
の蛋白質。
【請求項４】ひとIL−11蛋白質である、請求項１記載の
蛋白質。
【請求項５】さるIL−11蛋白質である、請求項３記載の
蛋白質。
【請求項６】実質的に他の蛋白質様物質の随伴を欠く、
請求項１〜５のいずれかに記載の蛋白質。
【請求項７】（ａ）下記のいずれかの塩基配列を有する
DNA: 又は（ｂ）（ａ）のDNAとストリンジェントな条件下でハイ
ブリダイズし得るDNA 及び（ｃ）（ａ）又は（ｂ）のDNAと縮重の関係にあるDNA のいずれかのDNAであって、かつ、T1165検定において活
性を示す蛋白質をコードするDNA。
【請求項８】哺乳類IL−11蛋白質をコードする、請求項
７記載のDNA。
【請求項９】ひとIL−11蛋白質をコードする、請求項８
記載のDNA。
【請求項１０】さるIL−11蛋白質をコードする、請求項
８記載のDNA。
【請求項１１】請求項７〜10のいずれかに記載のDNAを
有するベクター。
【請求項１２】請求項11記載のベクターで形質転換され
た宿主細胞。
【請求項１３】請求項１〜６のいずれかに記載の蛋白質
を含む、免疫系又は造血系を刺激するか若しくはそれに
関連した疾患を処置するための薬剤。
【請求項１４】請求項１〜６のいずれかに記載の蛋白質
とサイトカイン、ヘマトポイエチン、生長因子及び抗体
の少なくとも一種を含む、免疫系又は造血系を刺激する
か若しくはそれに関連した疾患を処置するための薬剤。
【請求項１５】請求項１〜６のいずれかに記載の蛋白質
と水性賦形剤を含む、免疫系又は造血系を刺激するか若
しくはそれに関連した疾患を処置するための注射用薬
剤。